CN112586744B - 一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品领域，公开了一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法。该益生菌片剂包括发酵乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、绿咖啡豆提取物、蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁；所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，所述植物乳杆菌命名为1701。在本发明的益生菌片剂中，植物乳杆菌1701与发酵乳杆菌WHH3906之间具有协同作用，复配后能发挥较好的降脂减肥效果；蓝莓粉和生姜粉能缓解慢性炎症，减少肠道中的致病菌，有利于植物乳杆菌和发酵乳杆菌的生长和定植；菊粉和赤藓糖醇可以作为植物乳杆菌和发酵乳杆菌的能源物质，促进其生长，有利于乳杆菌发挥控制体重的功能。

Description

一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法。
背景技术
肥胖作为一种全球性的公共卫生问题，据2016年的世界卫生组织统计数据显示，在全球有超过19亿成年人面临肥胖问题。肥胖主要表现为体内脂肪异常或过量积累，以至引发一系列相关并发症并威胁人们的身体健康。肥胖主要受遗传、生活与饮食习惯、环境与社会关系、情绪与心理认知、生理和代谢等多因素影响，与许多慢性代谢疾病有相关性，比如高血压、血脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病、冠心病等。肥胖作为一种慢性代谢性疾病，从多方面影响着人们的健康，还可以导致多种其它代谢性疾病的发展。目前由于人们生活、饮食习惯的变化，在当代，肥胖患者越来越多。
肥胖患者的肠道微生物群和正常人相比表现为菌群多样性和丰度降低，菌群在门水平的改变与肥胖紧密相关，其中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的相对丰度显著增加，而拟杆菌门相对丰度显著降低。这些菌群的改变导致丁酸盐产生减少，进而降低肠道屏障完整性、增加黏液降解及氧化应激。研究发现，益生菌可以通过抑制脂类的合成、吸收，促进胆固醇排出等途径降低血脂从而减重。相较于常规减肥药而言，益生菌制剂副作用小，不会影响机体免疫力和正常代谢机能，因此，从食疗的角度，从食品用微生物入手，搭配具有广泛群众认可度的降脂减肥食品原料，开发一款安全、可靠、有效的可控制体重的益生菌复合片剂，具有良好的市场价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法。在该益生菌片剂中，植物乳杆菌1701与发酵乳杆菌WHH3906之间具有协同作用，复配后能发挥较好的降脂减肥效果；蓝莓粉和生姜粉能缓解慢性炎症，减少肠道中的致病菌，有利于植物乳杆菌和发酵乳杆菌的生长和定植；菊粉和赤藓糖醇可以作为植物乳杆菌和发酵乳杆菌的能源物质，促进其生长，有利于乳杆菌发挥控制体重的功能。
本发明的具体技术方案为：
一种可控制体重的益生菌片剂，包括发酵乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉、白芸豆提取物、绿咖啡豆提取物、蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁；所述发酵乳杆菌冻干粉由发酵乳杆菌和/或其突变体制得；所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，已在2020年3月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物保藏编号为CGMCC NO.19472，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum；所述突变体为对所述发酵乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
本发明配方中，以特定的发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701为主要功能物，白芸豆提取物、绿咖啡豆提取物、蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇、直压型辅料、维生素C和硬脂酸镁为辅料。
其中，发酵乳杆菌WHH3906是一种从中国西藏地区采集的传统发酵食品中所分离得到的益生菌菌株，经过动物实验验证，其具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能降低瘦素水平，降低血脂，改善肥胖相关慢性炎症，缓解非酒精性脂肪肝，可用于预防和治疗肥胖。此外，在动物实验过程中，未发现实验动物死亡、精神不振、食欲不振等不良状态，说明该菌种具有较高的安全性。
具体而言，上述发酵乳杆菌WHH3906具有以下优点：
(1)具有良好的耐酸耐胆盐能力和黏附性，可以顺利通过胃肠道，并定殖于肠道中，发挥益生功能：在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达7.01±0.86，分别是对照商业菌株LcS和LGG的4.64倍和1.34倍；在pH 2.5环境下孵育4h存活率为97.48％，在0.3％胆盐浓度下孵育8h存活率为79.85％，优于对照商业菌株LcS和LGG；
(2)能够有效降低体重，减少脂肪堆积：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达8.18％，体重增加量降低22.03％，脂肪重量降低19.13％，体脂比降低13.25％；
(3)能够显著降低血清总胆固醇和甘油三酯水平；
(4)能够显著降低血清瘦素水平，使肥胖个体恢复对瘦素的敏感性，因而能有效促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。而目前尚未发现具有降低血清瘦素功能的发酵乳杆菌。
上述发酵乳杆菌WHH3906能缓解非酒精性脂肪肝，具体表现在以下方面：
(1)能够显著降低肝脏重量和脏器比：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，肝脏重量降低16.88％，脏器比降低6.25％；
(2)能够显著减轻肝脏组织细胞的脂肪变性，减少脂肪空泡，且空泡更小；
(3)具有较强的抗氧化能力，具有较高的清除DPPH能力和清除羟自由基能力：清除DPPH和羟自由基的能力分别是对照商业菌株的2.10倍和1.69倍，能够缓解肝脏由于氧化应激引起的损伤；
(4)能够显著降低肝脏中总胆固醇和甘油三酯的水平：服用活菌株剂量在1×109CFU/d具有显著效果，肝脏中总胆固醇降低15.15％，甘油三酯降低7.07％。
上述发酵乳杆菌WHH3906能缓解慢性炎症，具体表现在以下方面：
(1)能够有效促进脾淋巴细胞增殖；
(2)能够有效促进脾淋巴细胞分泌抑炎因子(即具有抑制炎症作用的细胞因子)IL-10，且能够促进IL-12的分泌；
(3)能够有效促进巨噬细胞分泌抑炎因子IL-10，抑制其分泌促炎因子(即具有促进炎症作用的细胞因子)IL-6、TNF-α和NO；
(4)能够显著降低血清中LPS的水平：服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，长期肥胖的大鼠血清中LPS的水平降低21.27％；
(5)能够显著降低血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平；
(6)能够显著降低肝脏中促炎因子L-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的水平。
植物乳杆菌1701(已在公开号为CN111254089A的中国专利文献中公开)是一种从中国西藏地区采集的传统发酵食品中所分离得到的益生菌菌株，经过动物实验验证，其具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖，而且，在其灭活后也具有减肥功能。此外，在动物实验过程中，未发现实验动物死亡、精神不振、食欲不振等不良状态，说明该菌种具有较高的安全性。
本发明将发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701复配后，两者在减肥上表现出协同增效的作用：在大鼠实验中发现，相较于单独服用而言，将两种菌复配后，高脂饮食的大鼠体重以及肝脏和脂肪重量增加明显减缓，粪便中排出的甘油三酯和总胆固醇量明显增加。
本发明中的各辅料具有以下作用：
(1)白芸豆提取物富含α-淀粉酶抑制剂，其通过非竞争性抑制消化道内的唾液及胰α-淀粉酶与淀粉特异性结合的糖苷位点，从而抑制α-淀粉酶活性，阻断食物中部分淀粉分解，减少葡萄糖吸收，起到降低餐后血糖的升高，降低脂肪合成等作用，可以有效配合减肥者和糖尿病人的饮食治疗。并且，淀粉酶抑制剂通过对淀粉酶的抑制作用而发挥减肥效应，并经胃肠道排出体外，因此不必进入血液循环系统，不作用于大脑中枢，减肥的同时不抑制食欲，使用剂量很高时也无副作用，符合世界卫生组织的减肥原则。
(2)绿咖啡豆提取物中富含绿原酸，绿原酸可以特异性抑制葡萄糖-6-磷酸，下调葡萄糖-6-磷酸mRNA的表达，减少肝糖的输出；绿原酸还可以抑制小肠对葡萄糖的吸收，1mM的绿原酸可使葡萄糖运输能力降低80％。
(3)蓝莓粉富含丰富的多酚物质，能够改善高脂饮食诱导的肥胖和代谢综合症，例如高血糖和胰岛素抵抗，调节肠道微生物菌群结构，维持肠道菌群平衡。蓝莓中还富含花青素，花青素可以通过激活AMPK来改善高血糖和胰岛素敏感性，AMPK的激活伴随着脂肪组织和骨骼肌中葡萄糖转运蛋白4的上调以及抑制葡萄糖产生和肝脏中脂质的增加，缓解脂肪肝。并且花青素可以显著抑制由脂多糖诱导的促炎性介质，比如一氧化氮、肿瘤坏死因子等，通过影响NF-κB通路来发挥其抗炎作用，改善由于长期肥胖引发的慢性炎症。
(4)生姜粉富含植物化学物质，如姜辣素、姜烯酚类和姜油酮，具有抗氧化活性、抗炎、抗癌、降胆固醇、降低体重和改善肥胖相关代谢综合征等作用。
(5)菊粉作为一种天然可溶性膳食纤维，不仅具有独特的凝胶特性和类似脂肪的口感，还具有降脂减肥、降糖、调节肠道益生菌、增强胃肠功能、促进维生素及矿物质吸收等多种生理功能。同时，可以被肠道内微生物代谢利用产生短链脂肪酸，并能促进胰岛素分泌，提高机体能量消耗，抑制脂肪堆积。
(6)赤藓糖醇是天然零热量的甜味剂，甜味特点与蔗糖非常接近，而且不能被人体消化，不会引起人体血糖和胰岛素变化。并且赤藓糖醇吸湿性极低，是非常理想的用于维持组合物低水分、低水分活度的食品原料，有利于货架期益生菌的活性稳定。
(7)维生素C天然存在于新鲜蔬菜、水果中，是维持生物正常生长发育必需的一类微量营养物质，有清爽愉悦的酸味，是非常良好的食品酸味来源，在改善口味的同时，可以补充人体所需的营养。
(8)硬脂酸镁是现代食品工业中，特别是片剂生产中最常用的辅料之一，能够改变物料颗粒间的结合力，具有助留作用及润滑作用。
白芸豆提取物和绿咖啡豆提取物主要是减少机体对葡萄糖的吸收，从而降低脂肪的形成。长期肥胖易引发机体慢性炎症，蓝莓粉和生姜粉富含多种能够缓解机体慢性炎症的物质，能够有效改善机体慢性炎症状态。菊粉和赤藓糖醇作为膳食纤维，一方面可作为乳酸菌的能源物质，有利于其生长；另一方面可以调节肠道菌群结构，对机体健康有利。植物乳杆菌和发酵乳杆菌主要是通过降低体内脂肪含量控制体重，其能够促进机体对脂肪的消耗。由此可见，植物乳杆菌和发酵乳杆菌与上述辅料配合使用后，具有以下作用：(1)白芸豆提取物和绿咖啡豆提取物减少体内脂肪的生成，植物乳杆菌和发酵乳杆菌能够增加体内脂肪消耗，蓝莓粉和生姜粉能够改善长期肥胖引发的慢性炎症，几种物质配合能使本发明控制体重的作用更加全面，并且，慢性炎症的缓解能减少肠道中的致病菌，有利于植物乳杆菌和发酵乳杆菌的生长和定植；(2)菊粉和赤藓糖醇可以作为植物乳杆菌和发酵乳杆菌的能源物质，促进其生长，更好地发挥益生功能。
作为优选，按重量份包括发酵乳杆菌冻干粉1-10份、植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物1-10份、绿咖啡豆提取物1-10份、蓝莓粉1-10份、生姜粉1-10份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-40份、直压型辅料10-30份、维生素C 0.05-0.3份和硬脂酸镁0.2-1份。
作为优选，所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖、直压型微晶纤维素中的一种或多种。
作为优选，所述发酵乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g，植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
作为优选，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备；
2)菌株保护剂的制备；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养；
4)发酵结束后取发酵产物，离心；
5)将离心获得的沉积物与菌株保护剂混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉；
所述发酵乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括以下步骤：将步骤3)中的植物乳杆菌和/或其突变体换成发酵乳杆菌和/或其突变体，重复步骤1)-7)，得到发酵乳杆菌冻干粉。
本发明采用生物工程恒pH高密度发酵技术、冷冻干燥技术、粉碎过筛工艺制备发酵乳杆菌冻干粉和植物乳杆菌冻干粉，获得的冻干粉具有活菌数高，且水分含量低、水分活度低，能保证其中的发酵乳杆菌、植物乳杆菌的活性稳定，此外还具有粒径分布合理、与其他物料的混合性能良好等特点。
作为优选，步骤1)中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-801-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2。
作为优选，步骤2)中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳60-100g/L，海藻糖80-120g/L，甘油15-25g/L。
作为优选，步骤3)中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h，发酵pH为4.5-6.0。
本发明采用的是高密度发酵工艺，需要对发酵pH进行调控。发酵乳杆菌WHH3906在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到4.2×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH5.5时，发酵液活菌数达到7.7×109CFU/mL，达到不控制pH时的1.83倍。植物乳杆菌1701在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH5.5时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍。
作为优选，步骤4)中，离心转速4000-10000rpm，离心时间3-10min。
作为优选，步骤5)中，所述离心获得的沉积物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合。
作为优选，步骤7)中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
一种所述益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取各原料备用；
(2)将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料；
(3)将除硬脂酸镁外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到初混合物；
(4)将步骤(3)所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；
(5)将步骤(4)所得总混合半成品用压片机压片，即得益生菌片剂。
作为优选，步骤(2)中，各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％时，加入直压型辅料，使重量之和达到总配方用料量的2％，再进行混合。
作为优选，步骤(3)中，混合转速为15-35rpm，混合时间为10-20min。
进一步地，步骤(3)中，混合转速为30rpm，混合时间为15min。
作为优选，步骤(4)中，混合转速为10-25rpm，混合时间为5-20min。
进一步地，步骤(4)中，混合转速为15rpm，混合时间为10min。
作为优选，步骤(5)中，压片过程中压片压力为7kN-18kN之间。
作为优选，步骤(1)-(5)全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18-26℃，湿度为25-40％。
作为优选，步骤(6)所得益生菌片剂的水分含量为2-5％(质量)，水分活度为0.1-0.4aW。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明中采用的发酵乳杆菌WHH3906具有良好的耐酸耐胆盐能力和黏附性，能够显著降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能降低瘦素水平，降低血脂，改善肥胖相关慢性炎症，缓解非酒精性脂肪肝，可用于预防和治疗肥胖；
(2)本发明将发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701复配后，两者在减肥上表现出协同增效的作用，能更有效地促进甘油三酯和胆固醇排出，更好地控制体重以及肝脏和脂肪重量；(3)白芸豆提取物和绿咖啡豆提取物能够减少体内脂肪的生成，植物乳杆菌和发酵乳杆菌能够增加体内脂肪消耗，蓝莓粉和生姜粉能够改善长期肥胖引发的慢性炎症，故相较于各成分单独使用而言，本发明控制体重的作用更加全面；并且，慢性炎症的缓解能减少肠道中的致病菌，有利于植物乳杆菌和发酵乳杆菌的生长和定植；
(4)菊粉和赤藓糖醇可以作为植物乳杆菌和发酵乳杆菌的能源物质，促进其生长，有利于乳杆菌发挥控制体重的功能。
附图说明
图1为本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。
图2为本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的生长曲线。
图3为本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的黏附实验镜检结果图。其中，左图为对照商业菌株LcS的黏附实验镜检结果图，中间图为对照商业菌株LGG的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的黏附实验镜检结果图。
图4为大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图5为大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图6为大鼠脂肪重和体脂比的变化。A图为脂肪重，B图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图7为大鼠血清总胆固醇和甘油三酯的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图8为大鼠血清瘦素的变化。*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
图9为各组别大鼠的肝脏组织HE染色切片图。切片放大倍数为200倍，其中，左图为对照组，中间为模型组，右边为实验组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种可控制体重的益生菌片剂，包括发酵乳杆菌冻干粉1-10份、植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物1-10份、绿咖啡豆提取物1-10份、蓝莓粉1-10份、生姜粉1-10份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-40份、直压型辅料10-30份、维生素C 0.05-0.3份和硬脂酸镁0.2-1份。所述发酵乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖、直压型微晶纤维素中的一种或多种。
所述发酵乳杆菌冻干粉由发酵乳杆菌和/或其突变体制得；所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，已在2020年3月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.19472，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum；所述突变体为对所述发酵乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌和/或其突变体制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC NO.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备：所述培养基为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；调整其pH为6.5±0.2；
2)菌株保护剂的制备：所述菌株保护剂的配方为脱脂乳80g/L、海藻糖100g/L、甘油20g/L；
3)以5％-10％接种量将植物乳杆菌和/或其突变体接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h，发酵过程pH控制于pH4.5-6.0；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，去除上清液；离心转速4,000-10,000rpm，离心时间3-10min；
5)将离心获得的沉积物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，筛网选择15-80目标准筛，得到植物乳杆菌冻干粉；
所述发酵乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括以下步骤：将步骤3)中的植物乳杆菌和/或其突变体换成发酵乳杆菌和/或其突变体，重复步骤1)-7)，得到发酵乳杆菌冻干粉。
一种上述益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用；
(2)将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1％的原料混合均匀，得到混合小料；当各含量重量比小于1％的原料的重量之和小于总配方用料量的2％时，加入直压型辅料，使其达到总配方用料量的2％，再进行小料混合；
(3)将除硬脂酸镁外的各辅料与混合小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速控制在15-35rpm，优选30rpm，混合时间控制在10-20min，优选15min；
(4)将步骤(3)所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在10-25rpm，优选15rpm，混合时间控制在5-20min，优选10min；
(5)将步骤(4)所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力控制在7kN-18kN之间；
(6)将步骤(5)所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
其中，步骤(1)-(6)中，操作过程全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在18-26℃，湿度控制在25-40％。所得成品水分、水分活度需要控制，水分控制在2-5％(质量)，水分活度控制在0.1-0.4aW。
实施例1：高密度发酵工艺的优化
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701经二代活化后，按2％接种量接种于含有5L MRS培养基的发酵罐中，培养条件：37℃，150rpm，pH5.5或者不控pH，连续培养16h。取16h菌液，用稀释涂布计数法测定活菌数。培养基的制备：所述MRS培养基其配方为葡萄糖20g、牛肉膏13g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨7g、酵母粉6g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.2g，水1000mL；调整其pH为6.5。
由表1可知，发酵乳杆菌WHH3906在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到4.2×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH5.5时，发酵液活菌数达到7.7×109CFU/mL，达到不控制pH时的1.83倍。植物乳杆菌1701在不控制发酵过程pH时，发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL；而在发酵过程pH控制于pH5.5时，发酵液活菌数达到3.5×109CFU/mL，达到不控制pH时的3.18倍。
表1发酵乳杆菌WHH3906和植物乳杆菌1701高密度发酵工艺优化结果
Figure BDA0002826931180000101
实施例2：可控制体重的益生菌片剂
一种可控制体重的益生菌片剂，包括发酵乳杆菌冻干粉10份、植物乳杆菌冻干粉10份、白芸豆提取物5份、绿咖啡豆提取物5份、蓝莓粉5份、生姜粉5份、菊粉20份、赤藓糖醇20份、直压型辅料18.95份、维生素C 0.05份和硬脂酸镁1份。所述发酵乳杆菌冻干粉植物乳杆菌冻干粉中的活菌数均为3×109CFU/g。所述直压型辅料为直压型麦芽糖醇。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备，所述培养基，为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏13g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨7g、酵母粉6g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.2g，水1000mL；调整其pH为6.5；
2)菌株保护剂的制备，所述菌株保护剂配方为脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L；
3)以5％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为38℃，发酵时间为15h，发酵过程pH控制于pH5.0；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，去除上清液；离心转速5,000rpm，离心时间8min；
5)将离心获得的沉积物与菌株保护剂混合，离心获得的沉积物与菌株保护剂的混合重量比例为1:1.5；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干菌粉；筛网选择15目标准筛。
所述发酵乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括以下步骤：将步骤3)中的植物乳杆菌1701换成发酵乳杆菌WHH3906，重复步骤1)-7)，得到发酵乳杆菌冻干粉。
一种上述益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用；
(2)将维生素C 0.05份与直压型麦芽糖醇1.95份混合均匀，得到混合后小料；
(3)将发酵乳杆菌冻干粉10份、植物乳杆菌冻干粉10份、白芸豆提取物5份、绿咖啡豆提取物5份、蓝莓粉5份、生姜粉5份、菊粉20份、赤藓糖醇20份、直压型麦芽糖醇17份与混合后小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速为35rpm，混合时间为20min；
(4)将所得初混合物与硬脂酸镁1份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速为25rpm，混合时间为20min；
(5)将所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力为16kN；
(6)将步所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
其中，步骤(1)-(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18℃，湿度为40％。
所得片剂成品进行关键指标检测，所得检测结果如表2。
表2实施例2所得成品的检测结果
Figure BDA0002826931180000111
实施例3：可控制体重的益生菌片剂
一种可控制体重的益生菌片剂，包括发酵乳杆菌冻干粉5份、植物乳杆菌冻干粉5份、白芸豆提取物10份、绿咖啡豆提取物10份、蓝莓粉10份、生姜粉10份、菊粉10份、赤藓糖醇10份、直压型辅料29.5份、维生素C 0.3份和硬脂酸镁0.2份。所述发酵乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉中的活菌数均为1×1011CFU/g。所述直压型辅料为直压型山梨糖醇。
所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1)培养基的制备，所述培养基，为改良MRS培养基，其配方为葡萄糖20g、牛肉膏10g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、酵母粉5.5g、醋酸钠4g、柠檬酸氢二铵1.5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1mL、一水合硫酸锰0.23g，水1000mL；调整其pH为6.5；
2)菌株保护剂的制备，所述菌株保护剂配方为脱脂乳80g/L，海藻糖100g/L，甘油20g/L；
3)以10％接种量将植物乳杆菌1701接种于发酵基质中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵时间为16h，发酵过程pH控制于pH5.5；
4)发酵结束后取发酵产物，离心，去除上清液；离心转速8,000rpm，离心时间10min；
5)离心获得的沉积物与菌株保护剂混合，离心获得的沉积物与菌株保护剂的混合重量比例为1:2；
6)冻干；
7)冻干产物粉碎、过筛，得到发酵乳杆菌WHH3906冻干粉、植物乳杆菌1701冻干菌粉；筛网选择60目标准筛。
所述发酵乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括以下步骤：将步骤3)中的植物乳杆菌1701换成发酵乳杆菌WHH3906，重复步骤1)-7)，得到发酵乳杆菌冻干粉。
一种上述益生菌片剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份配比称取各原料备用；
(2)将维生素C 0.3份与直压型山梨糖醇1.7份混合均匀，得到混合后小料；
(3)将发酵乳杆菌冻干粉5份、植物乳杆菌冻干粉5份、白芸豆提取物10份、绿咖啡豆提取物10份、蓝莓粉10份、生姜粉10份、菊粉10份、赤藓糖醇10份、直压型辅料27.8份与混合后小料一起混合均匀，即得初混合物；混合转速为30rpm，混合时间为15min；
(4)将所得初混合物与硬脂酸镁0.2份混合均匀，得到总混合半成品；混合转速为15rpm，混合时间为10min；
(5)将所得总混合半成品用压片机压片，即得片剂；压片过程中压片压力为14kN；
(6)将所得片剂用包装瓶包装，即得成品；包装所用包装瓶采用内置干燥剂的高密度聚乙烯(HDPE)包装瓶。
其中，步骤(1)-(6)中，操作过程全部在十万级GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为20℃，湿度为30％。
所得片剂成品进行关键指标检测，所得检测结果如表3。
表3实施例3所得成品的检测结果
Figure BDA0002826931180000121
Figure BDA0002826931180000131
实施例4：减肥效果
本实施例根据国家保健食品检验与评价技术规范进行，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发雄性大鼠肥胖。同时灌胃植物乳杆菌1701和发酵乳杆菌WHH3906、除2株菌外的所有辅料以及完整减肥组合物，其间每周对大鼠摄食量和体重进行监测，最后检测大鼠体重、肝脏和脂肪重量、粪便中甘油三脂和总胆固醇的含量，来判断该组合物是否具有减轻大鼠体重的功效。
1实验和分组
本实施例将大鼠分成9组，各组的大鼠数量和处理方式见表4。其中，实验组1、实验组3、实验组4和实验组5采用的植物乳杆菌冻干菌粉和发酵乳杆菌冻干菌粉与实施例3中的相同；实验组2和实验组3采用的辅料中，各辅料的配比与实施例3相同；实验组1-9中，灌胃液体中的溶剂均为0.85％生理盐水。
表4实验分组及组别处理方式
Figure BDA0002826931180000132
Figure BDA0002826931180000141
2实验方法
选择6-8周龄的SPF级雄性大鼠(200±20g)作为实验对象。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30％-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白。
适应期结束后先随机分成2组，10只大鼠给予正常饲料作为空白组，150只给予高脂饲料作为模型组，每周监测摄食量和体重。饲喂2周后，将模型组大鼠按体重增重排序，淘汰体重增重较低的1/3肥胖抵抗大鼠。将剩余的100只肥胖大鼠按体重随机分成10组，分别为模型组和9个实验组。
模型组和实验组给予高脂饲料，空白组给予正常饲料。9个实验组分别灌胃相应的受试样品，模型组和空白组均给予等量的生理盐水。灌胃时间为10周，期间监测每周的摄食量和体重。
试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g BW)麻醉，解剖称取肾周围脂肪、睾丸周围脂肪以及肝脏组织。取粪便，用试剂盒检测粪便中TC和TG的含量。
3实验结果
3.1造模期间大鼠的体重变化
根据表5可知，与模型组相比，第2周空白组大鼠的体重显著低于模型组(p<0.01)，说明大鼠肥胖模型建立成功。
表5造模期间大鼠体重变化
Figure BDA0002826931180000142
Figure BDA0002826931180000151
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
3.2大鼠每日摄食量和能量摄入量
根据表6可知，实验期间，空白组大鼠的每日摄食量显著高于模型组(p<0.05)，但空白组大鼠的每日能量摄入量显著低于模型组(p<0.05)；而模型组和9个实验组之间无显著差异(p>0.05)，表明摄入植物乳杆菌和发酵乳杆菌、减肥组合物中的辅料、各辅料与乳杆菌的组合以及完整减肥组合物均不影响高脂饮食大鼠每日的摄食量和能量摄入量。
表6每日摄食量和能量摄入的变化
组别 摄食量(g/d) 日能量摄入(kcal/d)
空白组 20.45±0.49** 73.95±1.78*
模型组 18.25±0.62 80.08±2.67
实验组1 18.84±0.32 79.07±1.38
实验组2 18.93±0.42 79.45±0.32
实验组3 18.57±0.32 80.49±0.32
实验组4 18.53±0.47 80.23±1.21
实验组5 18.41±0.33 79.72±1.27
实验组6 18.65±0.50 80.22±0.97
实验组7 18.73±0.36 80.13±1.23
实验组8 18.55±0.43 80.05±1.08
实验组9 18.70±0.38 79.87±1.53
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
3.3实验期间大鼠的体重变化
实验期间，各个组别大鼠的体重变化如表7所示，从中可以看出：
(1)空白组(第10周时达到421.60±18.21g)的大鼠体重始终显著低于模型组(第10周时达到515.38±18.78g，p<0.01)；
(2)实验组2、4、5的大鼠体重从第5周开始低于模型组(p<0.05)，且两者差异逐渐增大，其体重在第10周时分别达到477.78±21.07g、479.13±19.14g和481.80±19.11g，表明植物乳杆菌1701、发酵乳杆菌WHH3906或是除菌以外的辅料亦具有良好的减肥效果；
(3)实验组1的大鼠体重在第5周时显著低于实验组4和5，且体重差异逐渐增大，至第10周时平均体重为463.56±17.85g，表明植物乳杆菌1701与发酵乳杆菌WHH3906配合使用后，在控制体重增长上能发挥协同作用，其作用效果优于单株菌；
(4)实验组3的大鼠体重在第5周开始低于实验组1和2，且差距逐渐增大，表明辅料与两株菌配合使用后，在控制体重增长上能发挥协同作用，其作用效果优于两株菌或者所有辅料单独使用；
(5)实验组6、7、8、9的大鼠体重从第5周开始显著低于模型组(p＜0.05)，且2者差异逐渐增大，其体重在第10周时分别达到443.61±18.94g、446.39±19.58g、447.50±18.67g和445.21±17.66g，表明植物乳杆菌1701、发酵乳杆菌WHH3906与不同单一辅料复合使用亦具有良好的减肥效果；而实验组6、7、8、9的大鼠体重在第10周时均明显低于实验组1(p＜0.01)，表明蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇这四种辅料与两株菌配合使用后，在控制体重增长上均能发挥协同作用；
(6)实验组3的大鼠体重从第4周开始显著低于模型组(p＜0.05)，并从第6周开始，两者之间差距拉大(p＜0.01)，其平均体重在第10周时达到439.00±16.49g，说明本发明中两株菌与其余辅料的完整组合物能减缓高脂饮食的大鼠体重增长；并且，实验组3的效果较实验组1、2、4、5、6、7、8、9更佳，减肥效果最好，完整组合物表现出菌株与菌株之间、菌株和其余辅料之间的协同增效作用。
表7大鼠的体重变化
组别 第0周(g) 第5周(g) 第10周(g)
空白组 275.70±11.22* 363.00±19.32** 421.60±18.21
模型组 306.10±9.88 428.44±15.35 515.38±18.78
实验组1 306.40±10.53 402.71±18.33* 463.56±17.85**
实验组2 306.60±11.08 411.13±20.34* 477.78±21.07**
实验组3 306.20±11.23 398.22±16.78* 439.00±16.49**
实验组4 306.70±9.87 404.71±17.32* 479.13±19.14**
实验组5 306.30±10.04 406.55±18.56* 481.80±19.11**
实验组6 305.98±10.56 401.10±18.33* 443.61±18.94**
实验组7 306.00±10.47 399.95±19.73* 446.39±19.58**
实验组8 306.55±11.00 400.55±17.91* 447.50±18.67**
实验组9 306.21±10.29 400.46±19.11* 445.21±17.66**
*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
3.4大鼠的肝脏、脂肪重量变化
根据表8可知：
(1)由于高脂饮食的影响，大鼠的肝脏和脂肪重量显著升高(p＜0.05，p＜0.01)；
(2)9个实验组的处理均有助于减少肝脏和脂肪重量的增加，其中灌胃完整组合物的实验组3的效果最佳，表明2株菌和其余辅料结合的完整组合物显示出最强的减少脂肪堆积、降低脏器比和体脂比的作用；
(3)实验组1的大鼠肝脏重、脏器比、脂肪重和体脂比明显低于实验组4和5，表明植物乳杆菌1701与发酵乳杆菌WHH3906配合使用后，在减少脂肪堆积、降低脏器比和体脂比上能发挥协同作用；
(4)实验组3的大鼠肝脏重、脏器比、脂肪重和体脂比明显低于实验组1和2，表明辅料与两株菌配合使用后，在减少脂肪堆积、降低脏器比和体脂比上能发挥协同作用；
(5)实验组6、7、8、9的大鼠肝脏重、脏器比、脂肪重和体脂比明显低于实验组1，表明蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇这四种辅料与两株菌配合使用后，在减少脂肪堆积、降低脏器比和体脂比上均能发挥协同作用。
表8大鼠的肝脏和脂肪重量
组别 肝脏重(g) 脏器比(％) 脂肪重(g) 体脂比(％)
空白组 14.25±0.84** 3.38±0.11** 22.30±1.90** 5.29±0.34**
模型组 22.32±1.12 4.33±0.14 43.29±2.77 8.40±0.35
实验组1 17.29±1.30** 3.73±0.17** 32.72±2.19** 7.06±0.39*
实验组2 18.20±1.23** 3.81±0.13** 33.15±1.96** 6.94±0.38**
实验组3 14.88±0.97** 3.39±0.11** 29.93±1.33** 6.82±0.34**
实验组4 18.30±1.03** 3.82±0.14** 34.73±1.21** 7.25±0.30*
实验组5 18.65±0.84* 3.87±0.11** 35.26±1.02* 7.32±0.23*
实验组6 15.88±0.78** 3.58±0.12** 30.52±1.52** 6.88±0.33*
实验组7 15.84±0.92** 3.55±0.14** 30.76±1.11** 6.89±0.25*
实验组8 16.11±1.08** 3.60±0.13** 30.74±1.23** 6.87±0.37*
实验组9 15.89±0.97** 3.57±0.11** 30.54±1.64** 6.86±0.29*
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
3.5大鼠粪便中甘油三脂(TG)和总胆固醇(TC)含量的变化
根据表9可知：
(1)空白组大鼠粪便中的TC含量显著低于模型组(p<0.01)，且TG含量显著高于模型组(p<0.01)，这与摄入饲料的脂质含量不同有关；
(2)对于粪便中排出的TC含量，实验组3和实验组1、4、5、6、7、8、9的大鼠粪便中其含量显著高于模型组(p<0.01和p<0.05)，且实验组3的排出量高于其余7个实验组，而实验组2的TC排出量虽高于模型组，但未达到显著性差异(p>0.05)。而对于TG排出量，发现实验组3和实验组1、2、4、6、7、8、9粪便中的TG含量显著高于模型组(p<0.05)，且实验组5的TG排出量虽有所升高，但未达到显著差异(p>0.05)。这表明单独服用辅料对促进体内TC和TG外排有较大的效果，并且植物乳杆菌和发酵乳杆菌的结合使用、2株菌与辅料结合的完整组合物均具有促进摄入的脂质外排的作用，但完整组合物的效果更好，显示出菌株与其他辅料协同作用，促进脂质外排；
(3)实验组1的大鼠TC排出量明显高于实验组4和5，表明植物乳杆菌1701与发酵乳杆菌WHH3906配合使用后，在促进TC排出上能发挥协同作用；
(4)实验组3的大鼠TC排出量明显高于实验组1和2，表明辅料与两株菌配合使用后，在促进TC排出上能发挥协同作用；
(5)实验组6、7、8、9的大鼠TC排出量接近于实验组1，由于辅料不具有明显的促进TC排出的作用(根据实验组2的结果可知)，因而能表明蓝莓粉、生姜粉、菊粉、赤藓糖醇这四种辅料均能提高两株菌促进TC排出的效果。
表9大鼠粪便中甘油三脂和总胆固醇的含量
组别 TC(μmol/g) TG(μmol/g)
空白组 4.47±0.96** 4.86±0.56**
模型组 14.67±1.17 3.30±0.74
实验组1 19.71±0.79* 3.89±0.39*
实验组2 16.67±0.94 4.00±0.35*
实验组3 21.33±1.06** 4.10±0.52*
实验组4 17.47±1.21* 3.91±0.43*
实验组5 17.34±0.89* 3.86±0.25
实验组6 19.99±0.64* 4.02±0.31*
实验组7 19.85±1.17* 3.95±0.29*
实验组8 19.91±0.87* 3.92±0.33*
实验组9 19.89±0.91* 3.99±0.49*
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01。
综上所述，植物乳杆菌1701和发酵乳杆菌WHH3906、减肥菌剂中的辅料均表现出降低体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比以及促进脂质外排的作用。2株菌之间以及菌株与辅料之间具有协同作用，相较于单独服用而言，复配后能够表现出更好的减肥效果。
实施例5：发酵乳杆菌WHH3906的生物学性质
本发明所提供的菌株经鉴定属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为WHH3906菌株，于2020年3月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.19472。
本发明所提供的菌株发酵乳杆菌WHH3906是从我国西藏自治区采集的酥油中分离得到。
本发明所提供的菌株发酵乳杆菌WHH3906的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色圆形菌落，表面光滑湿润、边缘整齐、不透明、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50 CHL系统。表10中列出了本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906的API 50 CHL测试的结果。
表10 API 50结果
甘油 ─ 甘露醇 ─ D-松三糖 ─
赤藻糖醇 ─ 山梨醇 ─ D棉子糖 +
D-阿拉伯糖 ─ 甲基-αD吡喃甘露糖苷 ─ 淀粉 ─
L-阿拉伯糖 ─ 甲基-αD吡喃葡萄糖苷 ─ 糖原 ─
D-核糖 + N-乙酰葡萄糖胺 ─ 木糖醇 ─
D-木糖 + 苦杏仁苷 ─ D-龙胆二糖 ─
L-木糖 ─ ARBULIN ─ D-土伦糖 ─
D-侧金盏花醇 ─ 七叶灵柠檬酸铁 ─ D-来苏糖 ─
甲基-βD吡喃木糖苷 ─ 水杨苷 ─ D-塔格糖 ─
D-半乳糖 + D-纤维二糖 ─ D-岩藻糖 ─
D-葡萄糖 + D-麦芽糖 + L-岩藻糖 ─
D-果糖 + D-乳糖 + D-阿拉伯醇 ─
D-甘露糖 + D-密二糖 + L-阿拉伯醇 ─
L-山梨糖 ─ D-蔗糖 + 葡萄糖酸钾 +
L-鼠李糖 ─ D-海藻糖 ─ 2酮基葡萄糖酸钾 ─
卫茅醇 ─ 菊粉 ─ 5酮基葡萄糖酸钾 +
肌醇 ─  
生物学鉴定：针对16S rRNA基因序列测序，结果如SEQ ID NO:1所示，将序列于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
实施例6：发酵乳杆菌WHH3906的培养本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906经二代活化后，按1％接种量接种于MRS培养基中，在37℃温度下培养24h，每隔1h取样一次，测定在600nm波长的光密度(OD)值，绘制生长曲线，设置三次重复。
结果如图2所示，发酵乳杆菌WHH3906在经过0-2h的迟缓期后，从2h开始快速生长进入对数生长期，13h结束对数期进入稳定期。
实施例7：发酵乳杆菌WHH3906的耐酸耐胆盐性能本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906、对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、8h后菌数的变化，设置三次重复。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0*100％。
N1为菌株孵育后活菌数的log10值，N0为菌株初始活菌数的log10值。
结果如表11所示，本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906具有良好的耐受特性。在pH 2.5环境下，孵育2h存活率为98.97％，孵育4h存活率为97.48％，显著优于对照商业菌株LcS，与对照商业菌株LGG相当。在0.3％胆盐浓度下，孵育4h存活率为80.38％，孵育8h存活率为79.85％，且4-8h活菌数基本没有变化，而对照商业菌株LcS和LGG未检测到活菌数。说明发酵乳杆菌WHH3906具有良好的胃酸和胆盐耐受特性，优于对照商业菌株LcS和LGG。
表11耐受性结果
Figure BDA0002826931180000201
-：未检测到。
实施例8：发酵乳杆菌WHH3906的黏附性
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906、对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，设置三次重复，每个片子随机选取10个视野计数。
结果如表12和图3所示，发酵乳杆菌WHH3906的单细胞黏附数达7.01±0.86，显著优于对照商业菌株LcS和LGG(1.51±0.30，5.25±0.78)。
表12黏附性结果
菌株编号 黏附率(菌数/细胞数)
LcS <![CDATA[1.51±0.30<sup>a</sup>]]>
LGG <![CDATA[5.25±0.78<sup>b</sup>]]>
WHH3906 <![CDATA[7.01±0.86<sup>c</sup>]]>
a，b，c：p<0.05。
实施例9：发酵乳杆菌WHH3906的减肥功效
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发大鼠肥胖症。同时灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌株，活菌数1×109CFU/mL，其间每周对大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测大鼠体重和脂肪含量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功效。
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为3组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料，试验周期为8周。分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型；
实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906菌悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；
饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，总能：4334kcal/kg。
试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中总胆固醇、甘油三酯和瘦素含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，并称重，计算脏器比和体脂比。
由图4可知，实验组的摄食量(图4A)和能量摄入量(图4B)同模型组之间无显著差异，说明发酵乳杆菌WHH3906并不是通过减少摄食量和能量摄入降低体重。
由图5A可知，高脂饮食饲喂一周后，与对照组相比，模型组体重显著高于对照组(p<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，第0-6周实验组体重低于模型组，但没有显著性差异，第6-8周实验组体重显著低于模型组(p<0.05，p<0.01)，第8周时，体重降低水平达8.18％。由图5B可知，与模型组相比，实验组体重总增重显著低于模型组(p<0.01)，比模型组低22.03％。说明发酵乳杆菌WHH3906服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重。
由图6可知，与模型组相比，实验组脂肪重和体脂比显著低于模型组(图6A和B，p<0.05，p<0.01)，分别比模型组降低19.13％和13.25％。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著减少脂肪堆积和降低体脂比。
由图7可知，与模型组相比，实验组血清中总胆固醇(图7A)和甘油三酯(图7B)显著低于模型组(p<0.01，p<0.05)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血脂水平。
由图8可知，与模型组相比，实验组血清中瘦素含量显著下降(p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
总之，发酵乳杆菌WHH3906菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低体脂比、血脂和血清瘦素，促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，是一株具有减肥功能的新菌株。
实施例10：发酵乳杆菌WHH3906缓解非酒精性脂肪肝的功效
1清除DPPH自由基的能力
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，菌悬液OD600调至0.5±0.1。在反应体系中加入发酵乳杆菌WHH3906的菌悬液1mL，再加入1mL0.1mmol/L DPPH的无水乙醇溶液，充分混匀后，室温下避光反应30min，然后经过6000rpm离心10min，取上清液，测定517nm处的吸光度(OD值)。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算DPPH自由基的清除率：
DPPH自由基清除率＝(A0-A1)/A0×100％。
A0：对照的OD510值，A1：植物乳杆菌1701菌液的OD510值。
如表13所示，发酵乳杆菌WHH3906的DPPH自由基清除率达96.24±1.06％，显著高于对照商业菌株LGG(清除率为45.90±0.89％)，是对照商业菌株的2.10倍。说明发酵乳杆菌WHH3906具有较强的抗氧化能力。
表13菌株的DPPH自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH3906
DPPH自由基清除率(％) 45.90±0.89 96.24±1.06**
与商业对照菌相比，**：p<0.01。
2清除羟自由基的能力
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，测定菌悬液OD600。在反应体系中加入OD值为5的发酵乳杆菌WHH3906菌悬液1mL，再加入1mL生理盐水和1mL FeSO4(3mmol/L)。混匀后，加入1mL H2O2(3mmol/L)，室温静置10min后加入1mL水杨酸(3mmol/L，乙醇溶解)，混匀，37℃水浴20min，离心取上清测定510nm处的吸光值。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算羟自由基的清除率：
羟自由基清除率＝(As-Ap)/As×100％
Ap：发酵乳杆菌WHH3906菌液的OD510值，As：菌悬液换成0.9％的生理盐水的OD510值。
如表14所示，发酵乳杆菌WHH3906的羟自由基清除率达95.01±3.54％，显著高于对照商业菌株LGG(清除率为56.29±2.13％)，是对照商业菌株的1.69倍。说明发酵乳杆菌WHH3906具有较强的抗氧化能力。
表14菌株的羟自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH3906
羟自由基清除率(％) 56.29±2.13 95.01±3.54**
与商业对照菌相比，**：p<0.01。
3对肝脏重量以及肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量的影响
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为3组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型，使大鼠发生非酒精性脂肪肝；
实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；试验周期为10周，试验结束后，称取体重，1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，备用。脱颈处死后，解剖取肝脏并称重，按照下式计算肝重系数：
肝重系数＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％。
肝脏称重后用PBS缓冲液制成匀浆，用试剂盒测定肝脏中甘油三酯、总胆固醇的含量。另取同一部位肝脏以1:9体积比，用4％多聚甲醛固定，用于石蜡包埋切片，随后进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织形态变化。
由表15可知，与对照组相比，模型组大鼠的体重、肝脏重量以及肝重系数均显著高于对照组(p<0.001)，肝脏重比对照组高出46.17％，表明大鼠已经形成非酒精性脂肪肝。与此同时，实验组的体重、肝重显著低于模型组(p<0.01)，计算得到的肝重指数亦显著低于模型组(p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906在摄入剂量为1×109CFU/d时，具有显著改善非酒精性脂肪肝的作用。
表15大鼠的体重、肝重及肝重系数
组别 体重(g) 肝脏重(g) 肝重系数(％)
对照组 361.41±15.60*** 12.93±0.94*** 3.58±0.22***
模型组 437.01±11.19 18.90±0.98 4.62±0.14
实验组 386.50±37.25** 15.71±2.44** 4.05±0.25**
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01；***：表示与模型组相比，差异极极显著，p<0.001。
由表16可知，与对照组相比，模型组大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量显著高于对照组(p<0.001)，说明高脂饮食会导致大鼠肝脏中脂质的增加，造成非酒精性脂肪肝。同时，实验组大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量显著低于模型组(p<0.05和p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可以有效减少肝脏中甘油三酯和总胆固醇含量的增加。
表16大鼠肝脏中的甘油三酯和总胆固醇含量
组别 甘油三酯(mmol/L) 总胆固醇(mmol/L)
对照组 21.78±4.68*** 0.34±0.03***
模型组 258.53±14.94 0.66±0.08
实验组 240.25±17.15* 0.56±0.07**
*：表示与模型组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p<0.01；***：表示与模型组相比，差异极极显著，p<0.001。
组织形态学观察结果如图9所示，对照组大鼠的肝脏组织结构完整，细胞界限清晰，细胞核位于中央，未发现脂肪空泡。而模型组大鼠的肝脏细胞结构被破坏，胞内存在大量大小不等的脂滴聚集，细胞间隙不清，脂肪沉积明显，可见大量肝细胞脂肪空泡，说明高脂饮食会诱导大鼠非酒精性脂肪肝的发生。同时，我们发现实验组大鼠的肝脏细胞脂肪变性减少，脂肪空泡减少，且空泡变小。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可以有效缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
综上所述，发酵乳杆菌WHH3906菌株在摄入剂量为1×109CFU/d时，可有效缓解高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝，减少肝脏中甘油三酯和胆固醇的积累，减轻肝脏组织脂肪变性，是一株具有缓解非酒精性脂肪肝功能的菌株。
实施例11：发酵乳杆菌WHH3906缓解慢性炎症的功效
1对脾淋巴细胞增殖的影响
昆明小鼠饲养温度为22±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮用水。昆明小鼠饲养1周后，断颈处死，无菌取小鼠脾脏，用无菌的玻璃注射器芯将其碾碎，200目金属筛网过滤后，经ACK细胞裂解液裂解5min，加入含10％胎牛血清的无菌Hank’s液终止裂解，1000rpm，4℃离心5min，沉淀重悬于5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。用台盼蓝染色，血细胞计数板计数，计算活细胞数和活细胞率。调整细胞浓度为5×106cells/mL。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，调节菌浓度为1×107CFU/mL。
将细胞悬液加至96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，诱导剂组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mLCon A或10μg/mL LPS)，菌处理组(细胞培养基+细胞悬液+诱导剂10μg/mL Con A或10μg/mLLPS+菌悬液1×107CFU/mL)。37℃条件下，CO2培养箱中培养72h。培养结束后，加入MTT溶液(2.5mg/mL)，37℃共孵育4h后，吸出上清，再加入100μL DMSO，最后于490nm下测定吸光值。
结果如表17所示，在不加诱导剂的情况下，对照商业菌株LcS和WHH3906均可以显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖(分别为p<0.01和p<0.05)。在添加诱导剂ConA的条件下，对照商业菌株LcS和WHH3906均可以有效提高小鼠脾淋巴细胞中T淋巴细胞的增殖能力(p<0.01)，并且在添加诱导剂LPS的条件下，WHH3906在一定程度上可以促进小鼠脾淋巴细胞中B淋巴细胞的增殖，但是对照商业菌株LcS效果不是很明显。表明本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906在体外可以有效促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。
表17菌株对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响结果
处理方式 空白对照 LcS WHH3906
不加诱导剂 0.176±0.006 0.246±0.021** 0.227±0.010*
ConA(10μg/mL) 0.804±0.058 0.901±0.050** 0.870±0.040**
LPS(10μg/mL) 0.803±0.014 0.797±0.014 0.829±0.026
*：与空白对照相比，差异显著，p<0.05；**：与空白对照相比，差异极显著，p<0.01。
2对脾淋巴细胞分泌炎症因子的影响
按照实施例7“1对脾淋巴细胞增殖的影响”中小鼠脾淋巴细胞的制备方法制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为5×106cells/mL。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，调整均浓度到1×107CFU/mL。将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每个处理5个重复，分为调零组(细胞培养基)，空白对照组(细胞培养基+细胞悬液)，菌处理组(细胞培养基+细胞悬液+菌悬液1×107CFU/mL)，37℃条件下，CO2培养箱中培养48h。培养结束后，1500rpm离心10min，吸取上清，0.22μm滤膜过滤，采用ELISA试剂盒测定IL-10和IL-12含量。
结果如表18所示，与空白对照组相比，WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-10，到达353.75±2.25pg/mL，显著高于商业对照菌株(305.82±4.26pg/mL)，是对照商业菌株的1.16倍；同时，WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-12，到达218.28±1.47pg/mL，显著高于商业对照菌株(171.96±3.68pg/mL)，是对照商业菌株的1.27倍。说明发酵乳杆菌WHH3906能够显著促进脾淋巴细胞分泌细胞因子，且分泌IL-10的能力更强，具有抗炎活性。
表18菌株对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-10和IL-12的影响结果
组别 IL-10 IL-12
空白对照 192.73±2.59 97.24±2.28
LcS 305.82±4.26*** 171.96±3.68***
WHH3906 353.75±2.25***### 218.28±1.47***###
***：与空白对照相比，差异极极显著，p<0.001；###：与LcS相比，差异极极显著，p<0.001。
3对巨噬细胞分泌炎症因子的影响
建立RAW264.7细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906和对照商业菌株干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，制成1×109CFU/mL的菌液。非炎症模型组每孔加入100μL菌悬液(1×109CFU/mL)，炎症模型组每孔加入100μL菌悬液(1×109CFU/mL)和100μL LPS(10μg/mL)，于37℃，5％CO2培养箱中共孵育24h。然后，1500rpm离心10min，吸取上清，0.22μm滤膜过滤，采用ELISA试剂盒测定NO、IL-10、IL-6和TNF-α含量。
结果如表19所示，在没有炎症诱导剂LPS的条件下，与商业菌株相比，发酵乳杆菌WHH3906促进RAW264.7细胞分泌IL-10的量显著高于商业菌株(p<0.01)，分泌IL-6和NO的量显著低于商业菌株(p<0.01)，TNF-α分泌量与商业菌株相当。在LPS诱导的炎症条件下，与商业菌株相比，发酵乳杆菌WHH3906促进RAW264.7细胞分泌IL-10的量显著高于商业菌株(p<0.001)，分泌IL-6的量显著低于商业菌株(p<0.05)，NO和TNF-α分泌量与商业菌株相当。表明在炎症条件下，本发明菌株发酵乳杆菌WHH3906能够促进IL-10分泌，抑制IL-6、TNF-α和NO分泌，具有改善炎症的功能。
表19菌株对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响
Figure BDA0002826931180000271
*：与空白对照相比，差异显著，p<0.05，**：与空白对照相比，差异极显著，p<0.01，***：与空白对照相比，差异极极显著，p<0.001；#：与LcS相比，差异显著，p<0.05，##：与LcS相比，差异极显著，p<0.01，###：与LcS相比，差异极极显著，p<0.001。
4对大鼠血清中细胞因子的影响
将健康的SPF级雄性大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为5组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型，使大鼠发生炎症；
实验组：高脂饲料喂养造模，灌胃发酵乳杆菌WHH3906菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d。
试验周期为10周，试验结束后，称体重，1％戊巴比妥钠(0.5mL/100g体重)麻醉，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量。脱颈处死后，解剖取肝脏，用ELISA试剂盒检测肝脏中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量。
由表20可知，与对照组相比，模型组大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著高于对照组(p<0.05，p<0.01)，说明大鼠体内已经发生炎症。
由表20可知，与模型组相比，实验组大鼠血清中抑炎因子IL-10水平显著高于模型组(p<0.01)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著低于模型组(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。说明发酵乳杆菌WHH3906能够显著降低大鼠体内炎症水平，具有缓解慢性炎症的功能。
表20大鼠血清中细胞因子的浓度变化
Figure BDA0002826931180000281
与模型组相比，*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。
由表21可知，与对照组相比，模型组肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著高于对照组(p<0.05，p<0.01)，说明肝脏已经发生炎症。
由表21可知，与模型组相比，实验组大鼠肝脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和NO的含量显著低于模型组(p<0.05，p<0.01)。说明发酵乳杆菌WHH3906菌株能够显著降低大鼠肝脏组织炎症水平，具有缓解炎症的功能。
表21肝脏炎症指标
处理 IL-1β(ng/L) IL-6(ng/L) TNF-α(ng/L) MCP-1(ng/L) NO(ng/μL)
对照组 17.05±0.99* 229.89±9.82* 296.18±10.54* 399.56±12.85* 0.52±0.04**
模型组 26.81±1.39 263.59±11.26 325.33±10.41 490.65±15.37 0.97±0.05
实验组 19.19±3.51* 222.09±16.15* 307.59±7.27* 424.05±6.20* 0.64±0.04**
与模型组相比，*：p<0.05；**：p<0.01。
综上所述，发酵乳杆菌WHH3906能够综合调节体内多种炎症因子水平，使抑炎因子水平提高、促炎因子水平降低，从而缓解机体慢性炎症。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司
<120> 一种可控制体重的益生菌片剂及其制备方法
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌WHH3906(Lactobacillus fermentum WHH3906)
<400> 1
gcggctggct cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc gacttcgtgc aggcgagttg cagcctgcag tccgaactga gaacggtttt 180
aagagatttg cttgccctcg cgagttcgcg actcgttgta ccgtccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcataagggg catgatgatc tgacgtcgtc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt ctcactagag tgcccaactt aatgctggca actagtaaca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacgacca tgcaccacct 420
gtcattgcgt tcccgaagga aacgccctat ctctagggtt ggcgcaagat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
ttagctccgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta gcactcatcg tttacggcat 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt tcgagtctca gcgtcagttg 720
cagaccaggt agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca ttccaccgct 780
acacatggag ttccactacc ctcttctgca ctcaagttat ccagtttccg atgcacttct 840
ccggttaagc cgaaggcttt cacatcagac ttagaaaacc gcctgcactc tctttacgcc 900
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ccgtgacttt ctggttaaat accgtcaacg tatgaacagt tactctcata cgtgttcttc 1020
tttaacaaca gagctttacg agccgaaacc cttcttcact cacgcggtgt tgctccatca 1080
ggcttgcgcc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagta tgggccgtgt 1140
ctcagtccca ttgtggccga tcagtctctc aactcggcta tgcatcatcg ccttggtagg 1200
ccgttacccc accaacaagc taatgcaccg caggtccatc cagaagtgat agcgagaagc 1260
catcttttaa gcgttgttca tgcgaacaac gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca 1320
aatgttgtcc cccgcttctg ggcaggttac ctacgtgtta ctcacccgtc cgccactcgt 1380
tggcgaccaa aatcaatcag gtgcaagcac catcaatcaa ttgggctcaa cgcgttcgac 1440

Claims (9)

1.一种可控制体重的益生菌片剂，其特征在于，由发酵乳杆菌冻干粉1-10份、植物乳杆菌冻干粉1-10份、白芸豆提取物1-10份、绿咖啡豆提取物1-10份、蓝莓粉1-10份、生姜粉1-10份、菊粉20-40份、赤藓糖醇20-40份、直压型辅料10-30份、维生素C 0.05-0.3份和硬脂酸镁0.2-1份组成；
所述发酵乳杆菌冻干粉由发酵乳杆菌制得；所述发酵乳杆菌命名为WHH3906，已在2020年3月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.19472，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum；
所述植物乳杆菌冻干粉由植物乳杆菌制得；所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCCNO.18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
2.如权利要求1所述的益生菌片剂，其特征在于，所述直压型辅料包括直压型麦芽糖醇、直压型山梨糖醇、直压型乳糖、直压型淀粉糖、直压型微晶纤维素中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的益生菌片剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g，植物乳杆菌冻干粉中的活菌数为1×107CFU/g-1×1012CFU/g。
4.如权利要求1所述的益生菌片剂，其特征在于，所述植物乳杆菌冻干粉的制备方法包括以下步骤：
1）培养基的制备；
2）菌株保护剂的制备；
3）以5%-10%接种量将植物乳杆菌接种于发酵基质中进行发酵培养；
4）发酵结束后取发酵产物，离心；
5）将离心获得的沉积物与菌株保护剂混合；
6）冻干；
7）冻干产物粉碎、过筛，得到植物乳杆菌冻干粉；
所述发酵乳杆菌冻干菌粉的制备方法包括以下步骤：将步骤3）中的植物乳杆菌换成发酵乳杆菌，重复步骤1）-7），得到发酵乳杆菌冻干粉。
5.如权利要求4所述的益生菌片剂，其特征在于：
步骤1）中，所述培养基为改良MRS培养基；所述培养基包括以下成分：葡萄糖20-30g、牛肉膏10-13g、胰蛋白胨5-7g、大豆蛋白胨5-7g、酵母粉5-6g、醋酸钠3-5g、柠檬酸氢二铵1-2g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁0.4-0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.7g、吐温-80 1-2mL、一水合硫酸锰0.2-0.25g、水1000mL；所述培养基的pH为6.5±0.2；和/或
步骤2）中，所述菌株保护剂包括以下成分：脱脂乳60-100g/L，海藻糖80-120g/L，甘油15-25g/L；和/或
步骤3）中，发酵温度为34-38℃，发酵时间为13-18h，发酵pH为4.5-6.0；和/或
步骤5）中，所述离心获得的沉积物与菌株保护剂以1:1.5-3的重量比混合；和/或
步骤7）中，过筛时，筛网选择15-80目标准筛。
6.一种如权利要求1-5之一所述益生菌片剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取各原料备用；
（2）将除硬脂酸镁外的各含量重量比小于1%的原料混合均匀，得到混合小料；
（3）将除硬脂酸镁外的剩余原料与步骤（2）所得混合小料混合均匀，得到初混合物；
（4）将步骤（3）所得初混合物与硬脂酸镁混合均匀，得到总混合半成品；
（5）将步骤（4）所得总混合半成品用压片机压片，即得益生菌片剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，各含量重量比小于1%的原料的重量之和小于总配方用料量的2%时，加入直压型辅料，使重量之和达到总配方用料量的2%，再进行混合。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中，混合转速为15-35rpm，混合时间为10-20min；和/或
步骤（4）中，混合转速为10-25rpm，混合时间为5-20min；和/或
步骤（5）中，压片过程中压片压力为7kN-18kN之间；和/或
步骤（1）-（5）全部在GMP车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18-26℃，湿度为25-40%。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所得益生菌片剂的水分含量为2-5wt%，水分活度为0.1-0.4aW。
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