CN111254089A - 一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用，本发明的植物乳杆菌1701菌株分离自我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中。该菌株已于2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.18728。本发明植物乳杆菌1701兼具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖的药品、保健品或健康食品。此外，本发明菌株灭活后也具有减肥功能，因此该菌株的产品形式更加丰富，其应用范围更广，产品稳定性和保质期更长。

Description

一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
肥胖主要是由于机体能量代谢平衡发生紊乱，导致能量摄入大于能量消耗，引起体内脂肪过多积累，所产生的代谢类疾病。肥胖不仅受遗传、环境、代谢、生理等多因素影响，同时还与高血脂、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、高尿酸血症、非酒精性脂肪肝、冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病紧密相关。目前，肥胖及其并发症已经成为全球范围内主要的公共卫生问题，其不仅影响个体的外表体征，还对人类的健康造成着严重的危害。
目前，大量研究表明肥胖与肠道微生物菌群有着密切的联系。而益生菌能够通过其良好的耐受性和黏附性，定植于肠道，达到调节肠道菌群结构，维持肠道菌群平衡，从而发挥出相应的益生功能。肥胖会引起体内脂肪堆积，甘油三酯、总胆固醇的含量升高，而甘油三脂、胆固醇水平偏高，会增加肥胖相关疾病高血脂、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝的患病风险。研究表明，益生菌能够降低高脂饮食诱导的肥胖模型鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，改善脂质代谢，减少体内脂肪堆积，降低体重，减少肥胖相关疾病患病风险。
已有商业化益生菌菌株能够减少脂肪堆积或降低体重。森永乳业的短双歧杆菌B-3有助于降低亚肥胖成年人的体脂水平。杜邦丹尼斯克的动物双歧杆菌B420能够控制体重，增加AKK(Akkermansia muciniphila)菌的定植。雪印乳业的加氏乳杆菌SP株具有减少内脏脂肪积累，减脂、控制体重功效。可尔必思的噬淀粉乳杆菌CP1563能够通过减少胆固醇含量，改善脂质代谢，达到降低体脂的功效。然而，这些不同益生菌的作用是具有菌株特异性的，并且个体肠道菌群及生理状态差异明显，同一种益生菌不一定能够对所有个体都适用。因此，仍然需要开发有更多具有控制体重、减少脂肪堆积的其它益生菌新菌株来填补现有菌株的空白(虽然多数新菌株自身也具有特异性，但是可能存在这种情况：现有菌株对某个体无效而新菌株却刚好有效)。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株具有减肥功能的植物乳杆菌及其应用，本发明植物乳杆菌1701兼具有良好的耐受性和黏附性，能够显著降低大鼠体重、减少体内脂肪堆积、降低脏器比和体脂比，并能减少瘦素水平，降低血脂，可用于预防和治疗肥胖的药品、保健品或健康食品。此外，本发明菌株灭活后也具有减肥功能，因此该菌株的产品形式更加丰富，其应用范围更广，产品稳定性和保质期更长。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一株具有减肥功能的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
上述菌株是从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离得到的。上述菌株的生物学性质如实施例1所示。
上述菌株具有良好的耐受性和黏附性，能顺利到达肠道，与肠道上皮细胞发生黏附，发挥益生功效。
上述活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
上述活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清总胆固醇和甘油三酯水平，降低血脂。
上述菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积。服用剂量在1×107CFU/d-1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.50-8.69％，脂肪重量降低10.53-14.86％，体脂比降低4.79-10.06％。
上述菌株灭活后的菌株及其组合物能够有效降低体重，减少脂肪堆积。服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低水平达5.92％，脂肪重量降低12.22％，体脂比降低7.24％。
上述菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量。服用剂量在1×107CFU/d-1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达12.34-14.63％，脏器比降低4.52-9.04％。
上述菌株灭活后的菌株及其组合物能够有效降低肝脏重量。服用剂量在1×109CFU/d具有显著效果，降低水平达11.68％，脏器比降低6.38％。
第二方面，本发明提供了一种具有减肥功能的植物乳杆菌的突变体，所述突变体为所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，本发明提供了一种含有所述植物乳杆菌或含有所述突变体的菌体培养物。
进一步地，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第四方面，所述植物乳杆菌或所述突变体或所述菌体培养物在食品、药品或保健品制备中的应用。
第五方面，本发明提供了一种组合物，含有所述植物乳杆菌和/或所述突变体和/或所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
进一步地，所述赋形剂和/或稀释剂为食品、药品或保健品。
进一步地，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬。
进一步地，所述药品和保健品为胶囊、粉剂或片剂。
进一步地，所述组合物为口服形式并用于减肥或控制体重。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所提供的植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素、总胆固醇和甘油三酯水平，能够抑制脂肪合成，降低血脂。
(2)本发明所提供的植物乳杆菌1701菌株经大鼠体内试验表明可有效降低大鼠体重，减少体内脂肪堆积。服用活菌株剂量在1×107-1×109CFU/d范围内都具有显著效果，体重降低5.50-8.69％，脂肪重量降低10.53-14.86％；服用灭活菌株剂量在1×109CFU/d具有显著效果，体重降低5.92％，脂肪重量降低12.22％。
(3)本发明所提供的植物乳杆菌1701菌株经大鼠体内试验表明可有效降低肝脏重量。服用活菌株剂量在1×107-1×109CFU/d范围内都具有显著效果，肝脏重降低12.34-14.63％；服用灭活菌株剂量在1×109CFU/d具有显著效果，肝脏重降低11.68％。
(4)本发明所提供的植物乳杆菌1701菌株具备良好的耐酸耐胆盐特性。在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％，在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％。
(5)本发明所提供的植物乳杆菌1701菌株具备良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达4.90±0.65，是对照商业菌株的1.9倍以上。
(6)本发明所提供的植物乳杆菌1701菌株灭活菌株也具有减肥功能，因此该菌株的产品形式更加丰富，其应用范围更广，产品稳定性和保质期更长。
附图说明
图1为本发明菌株的菌落特征(左图)和革兰氏染色显微镜观察特征(右图)。
图2为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左侧两图为对照商业菌株的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株植物乳杆菌1701(图中标示为植物乳杆菌WHH1701)的黏附实验镜检结果图。
图3为Wistar大鼠体重和总增重的变化。A图为体重，B图为总增重。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图4为Wistar大鼠摄食量和摄入总能量的变化。A图为摄食量，B图为摄入总能量。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图5为Wistar大鼠肝脏重和脏器比的变化。A图为肝脏重，B图为脏器比。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图6为Wistar大鼠脂肪重和体脂比的变化。A图为脂肪重，B图为体脂比。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图7为Wistar大鼠血清瘦素的变化。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
图8为Wistar大鼠血脂四项的变化。A图为总胆固醇，B图为甘油三酯，C图为高密度脂蛋白，D图为低密度脂蛋白。*：表示与模型组相比，差异显著，p＜0.05；**：表示与模型组相比，差异极显著，p＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
本发明所提供的菌株经鉴定属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为1701，于2019年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.18728。
本发明所提供的菌株是发明人从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的酸奶粉样中分离得到。
本发明菌株植物乳杆菌1701的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色、不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起的菌落。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈长杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50 CHL系统。表1中列出了本发明菌株植物乳杆菌1701菌株的API 50 CHL测试的结果。
表1 API 50结果
Figure BDA0002346189250000041
Figure BDA0002346189250000051
生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例2
本发明植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、4h、8h后菌数的变化。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0×100％。
N1为菌株孵育后活菌数，N0为菌株孵育0h活菌数。
结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在pH2.5环境下，孵育4h存活率为98.72％；在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为81.68％，与具有优秀耐受特性的商业菌株相似。
表2耐受性结果
Figure BDA0002346189250000052
Figure BDA0002346189250000061
实施例3
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株植物乳杆菌1701、对照商业菌株鼠李糖乳杆菌GG(LGG)和干酪乳杆菌代田株(LcS)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取2×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。
于光学显微镜下进行观察，结果如表3和图2所示，植物乳杆菌1701的单细胞黏附数达4.90±0.65，显著优于对照商业菌株(2.58±0.36，1.46±0.25)。
表3黏附性结果
菌株编号 黏附性(菌数/细胞数)
LGG 2.58±0.36
LcS 1.46±0.25
植物乳杆菌1701 4.90±0.65<sup>**</sup>
与对照商业菌相比，**：p＜0.01。
实施例4
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用Wistar大鼠，在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白来诱发Wistar大鼠肥胖症。同时灌胃植物乳杆菌1701菌株菌粉(活菌数1×107-1×109CFU/mL)和植物乳杆菌1701菌株灭活菌粉(菌数1×109CFU/mL，105℃处理10min)，其间每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行检测，最后检测Wistar大鼠体重、附睾和肾周脂肪重量，来判断该菌株是否具有减轻大鼠体重的功能。
将健康的SPF级雄性Wistar大鼠(6-8周龄，200±20g)，适应7天后，随机分为6组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，其配伍、主要营养成分及能量如表4、表5和表6所示。基础饲料主要由鱼粉、小麦、玉米、豆粕、麸皮等组成，总能：3616kcal/kg；高脂饲料是在基础饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白，组成如表5所示，总能：4334kcal/kg。动物实验分组如下：
对照组：基础饲料喂养；
模型组：高脂饲料喂养造模，诱导肥胖模型；
实验组1：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×107CFU/d；
实验组2：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×108CFU/d；
实验组3：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d；
实验组4：高脂饲料喂养造模，同时灌胃本发明灭活菌株悬液，灌胃剂量为1×109CFU/d。
表4基础饲料组成
原料名称 配方比(％) 原料名称 配方比(％)
鱼粉 6 维生素和矿物质 4.4
小麦 13 谷朊粉 2
玉米 41.6 石粉 1
麸皮 17 色拉油 2
豆粕 13
表5高脂饲料组成
原料名称 配方比(％) 原料名称 配方比(％)
基础维持鼠饲料 54.7 维生素和矿物质 2
蔗糖 15 磷酸氢钙 2
猪油 15 胆固醇 1
酪蛋白 10 胆酸钠 0.3
表6基础饲料和高脂饲料基本营养和能量组成
Figure BDA0002346189250000071
试验期间，每周对Wistar大鼠摄食量和体重进行监测和记录；试验结束后，对Wistar大鼠进行称重，用1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g BW)麻醉，采用心脏穿刺取血的方法获取大鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4000rpm，4℃离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测血清中瘦素、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量。脱颈处死后，解剖取肝脏、肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，称重，计算脏器比和体脂比。
由图3可知，与对照组相比，模型组第2到第10周体重显著高于对照组(p＜0.05，p＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，实验组3在第6到第10周大鼠体重显著低于模型组(p＜0.05，p＜0.01)，总增重显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组4在第7到第10周大鼠体重显著低于模型组(p＜0.05)，总增重显著低于模型组(p＜0.01)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重、控制体重增加，具有减肥功能。
由图4可知，与模型组相比，不同处理组大鼠摄食量和摄入能量没有显著性差异，说明植物乳杆菌1701菌株不是通过降低大鼠摄食量和摄入能量来减轻体重。
由图5可知，与模型组相比，对照组肝脏重和脏器比均显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组((p＜0.01)，实验组4大鼠肝脏重和脏器比显著低于模型组(p＜0.01，p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低肥胖个体肝脏重量，减少肝脏脂肪堆积。
由图6可知，与模型组相比，对照组脂肪重和体脂比均显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3大鼠脂肪重显著低于模型组((p＜0.05)，实验组3大鼠体脂比显著低于模型组((p＜0.01)，实验组4大鼠脂肪重和体脂比显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体内脂肪堆积，减轻体重。
由图7可知，与模型组相比，对照组血清瘦素水平显著低于模型组(p＜0.01)；实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清瘦素水平显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血清瘦素水平，从而促进脂解和脂肪细胞凋亡，抑制脂肪合成，减少体内脂肪堆积，减轻体重。
由图8A可知，与模型组相比，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清总胆固醇水平显著低于模型组(p＜0.01)。由图8B可知，与模型组相比，对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4血清甘油三酯水平显著低于模型组(p＜0.05)。说明植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低血脂水平。
总之，植物乳杆菌1701活菌株服用浓度在1×107CFU/d-1×109CFU/d、灭活菌株服用浓度在1×109CFU/d能够显著降低体重，减少脂肪堆积，降低脏器比和体脂比，减少血清瘦素，降低血脂，是一株具有减肥功能的新菌株。
应用实施例
实施例1植物乳杆菌1701冻干菌粉的制作
本发明菌植物乳杆菌1701以1％的接种量接种于10mL液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养16h(一代种子液)。一代种子液以1％的接种量接种于100mL液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养16h(二代种子液)。二代种子1％的接种量接种于10L含有液体MRS培养基的发酵罐中，150rpm，pH6.0，37℃培养16h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1×1011CFU/g，可用于含有植物乳杆菌1701的具有减肥功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。
实施例2植物乳杆菌1701发酵乳的制作
准确称取脱脂乳粉125g，45-50℃纯净水875g，50℃温水溶解，剪切20min，50℃水化30min，均质，95℃杀菌5min，降温后，按1％接种量接入应用实施例1中的植物乳杆菌1701发酵剂37℃发酵12h，4℃后熟8-12h，即可制得具有感官良好，口感细腻、丝滑，无不良气味，风味良好，具有减肥功能的发酵乳。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一株具有减肥功能的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌命名为1701，已在2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 18728，微生物分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
2.一种具有减肥功能的植物乳杆菌的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
3.一种含有如权利要求1所述植物乳杆菌或含有如权利要求2所述突变体的菌体培养物。
4.如权利要求3所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
5.如权利要求1所述植物乳杆菌或权利要求2所述突变体或权利要求3所述菌体培养物在食品、药品或保健品制备中的应用。
6.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述植物乳杆菌和/或权利要求2所述突变体和/或权利要求3所述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述赋形剂和/或稀释剂为食品、药品或保健品。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述药品和保健品为胶囊、粉剂或片剂。
10.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物为口服形式并用于减肥或控制体重。
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