CN116445360A - 一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用，所述鼠李糖乳酪杆菌命名为WHH2557，已在2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，微生物保藏编号为GDMCC No：63222，微生物分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。该鼠李糖乳酪杆菌具有抗氧化、缓解酒精损伤小肠细胞和保护肠上皮细胞屏障能力，还能够显著降低血清中ALT和AST的活性，并恢复肝脏甘油三脂水平，改善肝脏重量和肝脏系数，减少肝脏脂肪空泡和炎症细胞浸润，具有缓解酒精性肝损伤功效。

Description

一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌及其应用。
背景技术
酒精性肝损伤属化学性肝损伤之一，主要是由于长期大量饮酒而引发的一系列肝脏病变，最初表现为肝脏脂肪变性和酒精性脂肪肝，进而发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至肝功能衰竭。在我国，酒精导致的肝脏损伤性疾病已经成为仅次于病毒性肝炎之后的第二大肝脏疾病，严重威胁到我国国民的健康。目前，酒精性肝损伤的防治措施包括戒酒、药物治疗、营养支持以及肝脏移植。其中药物治疗作用机制大多为解酒降脂、抗氧化以及清除自由基，但由于肝病患者肝功能减退，许多药物在肝中代谢又会进一步损伤肝脏。鉴于药物治疗存在的缺陷，针对酒精性肝损伤病症寻找一种健康有效的干预或治疗途径显得意义重大。
乳酸菌通常是指一类能发酵碳水化合物且代谢产物主要为乳酸的细菌，是在世界范围内被公认为安全的食品级益生菌。文献调研结果发现，针对酒精性肝损伤病症的菌种的研究较少，虽然王玉华等人发现鼠李糖乳酪杆菌B10发酵液具有一定的降低酒精引起的HIF基因表达从而修复肠道上皮保护功能的作用，但是其研究没有提及鼠李糖乳酪杆菌B10活菌体在预防或治疗酒精性肝损伤中的作用。因此，通过筛选得到我国具有自主知识产权的菌种，并开发相关益生菌制品显得意义重大。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌，该鼠李糖乳酪杆菌具有显著的缓解酒精性肝损伤功效，可广泛用于开发缓解酒精性肝损伤相关益生功能产品。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌，所述鼠李糖乳酪杆菌命名为WHH2557，已在2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，微生物保藏编号为GDMCC No：63222，微生物分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
本发明所述的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557由发明人从中国新疆福海林牧区采集的酸奶中分离得到。该鼠李糖乳酪杆菌具备良好的黏附特性、耐酸耐胆盐特性、抗氧化能力和肠道屏障保护功能，能够显著降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性，并恢复肝脏甘油三脂水平；改善肝脏重量和肝脏系数，减少肝脏脂肪空泡和炎症细胞浸润，具有显著的缓解酒精性肝损伤功效。
一种含有上述鼠李糖乳酪杆菌的菌体培养物，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
一种组合物，含有上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物，以及生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
作为优选，所述组合物为具有预防和/或治疗酒精性肝损伤功能的食品、药品或保健品。
作为优选，所述药品或保健品为口服形式。
作为更优选，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬，所述药品为胶囊、粉剂或片剂，所述保健品为胶囊、粉剂或片剂。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备降低酒精对小肠细胞损伤产品中的应用。
在酒精诱导的HT-29细胞模型实验中，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557可提高HT-29细胞的存活率，降低酒精对小肠细胞的致死作用。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备修复酒精性损伤肠道的屏障保护功能产品中的应用。
在酒精诱导的IPEC-J2细胞模型实验中，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够降低IPEC-J2细胞电阻值降低率，恢复酒精诱导的IPEC-J2细胞的损伤。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备降低酒精性损伤肝的肝重和肝脏指数的产品中的应用。
在酒精性肝损伤小鼠模型实验中，口服剂量为2×108CFU/d的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够显著降低酒精性肝损伤小鼠的肝重和肝脏指数，维持小鼠的正常体重。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的产品中的应用。
在酒精性肝损伤小鼠模型实验中，口服剂量为2×108CFU/d的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)的水平，具有缓解酒精性肝损伤的作用，且效果优于口服剂量为100mg/kg阳性药物水飞蓟素。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备降低肝脏甘油三酯水平产品中的应用。
在酒精性肝损伤小鼠模型实验中，口服剂量为2×108CFU/d的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够显著降低肝脏中甘油三酯(TG)水平，改善酒精引起的肝脏脂肪积累，从而防治酒精性脂肪肝的发展。
上述鼠李糖乳酪杆菌或上述菌体培养物或上述组合物用于制备减少酒精性损伤肝的肝脏脂肪空泡和炎症细胞浸润产品中的应用。
在酒精性肝损伤小鼠模型实验中，口服剂量为2×108CFU/d的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够有效减少肝脏脂肪空泡和炎症细胞浸润，进而有效缓解动物肝脏病理损伤。
与现有技术相比，本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的耐酸耐胆盐能力、黏附特性明显优于商业菌LGG和常规菌株，该鼠李糖乳酪杆菌可通过口服进入肠道，并且与其他菌群的竞争能力强，可在肠道表面长时间定植，改善菌群；鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的抗氧化能力明显强于商业菌LGG，可有效缓解酒精损伤小肠细胞能力和修复肠上皮细胞屏障能力；并且鼠李糖乳酪杆菌WHH2557还可降低由酒精损伤肝脏的重量、肝脏指数和TG含量，减轻肝脏组织细胞的脂肪变性，减少炎症细胞浸润，从而降低血清中AST和ALT水平，达到了缓解酒精性肝损伤，预防酒精性脂肪肝的效果；本发明的有益效果具体说明如下：
(1)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具备良好的耐酸耐胆盐特性。在pH2.5环境下，孵育4h存活率为96.84％，在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为67.54％；
(2)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具备良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中，单细胞黏附菌数为8.97～10.27，是对照商业菌株LGG的2.68倍以上；
(3)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具有较强的抗氧化能力，其清除DPPH为54.61±1.12％，清除羟自由基的能力为46.38±3.54％，分别是对照商业菌株LGG的2.21倍和1.58倍；
(4)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具备较强的减少酒精损伤小肠细胞的能力，在酒精损伤HT-29细胞模型试验中，2×108CFU/mL菌株使细胞存活率升高至54.36±1.89％，是对照商业菌株LGG的1.26倍以上；
(5)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具备较强的保护肠上皮细胞屏障能力，在酒精损伤IPEC-J2细胞模型试验中，1×108CFU/mL菌株孵育细胞6h，受损单层细胞电阻值的降低率为52.24±1.10％，显著优于对照商业菌株LGG；
(6)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557经小鼠体内实验表明可有效缓解肝脏损伤性病变，使小鼠肝脏重量降低17.39％，肝脏指数降低19.93％；血清中AST水平降低33.23％，ALT水平降低31.03％；肝脏中TG含量降低30.19％；减轻肝脏组织细胞的脂肪变性，减少炎症细胞浸润，从而缓解酒精性肝损伤，预防酒精性脂肪肝；
(7)本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557所属的鼠李糖乳酪杆菌是被囊括于卫生部2022年更新的《可用于食品的菌种名单》。
附图说明
图1为本发明菌株的菌株外观特性。其中，菌落特征如左图，革兰氏染色显微镜观察特征如右图。
图2为本发明菌株的黏附实验镜检结果图。其中，左图为对照商业菌株LGG的黏附实验镜检结果图，右图为本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的黏附实验镜检结果图。
图3为本发明菌株的肠道屏障电阻值动态结果图。其中，**表示与LGG组相比p<0.01。
图4为实施例2中各组别大鼠的肝脏组织HE染色切片图，切片放大倍数为10倍。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方法对本发明做进一步的描述。
实施例1一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌：该鼠李糖乳酪杆菌命名为WHH2557，已在2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，微生物保藏编号为GDMCC No：63222，微生物分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
上述鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色菌落，不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生理特征：使用API 50CHL系统，表1中列出了本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的API 50CHL测试的结果。
表1API 50结果。
生物学鉴定：针对16S rRNA基因序列测序，结果如SEQ ID NO:1所示，将序列于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
上述鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的耐酸耐胆盐性能如下：
本发明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557、对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，分别进行如下操作：①加入相同体积pH 2.5的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、1h、2h、4h后菌数的变化；②加入相同体积的含0.3％胆盐的MRS溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定孵育0h、4h、8h后菌数的变化。菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)＝N1/N0×100％。
N1为菌株孵育后活菌数的log10值，N0为菌株孵育0h活菌数的log10值。
结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在pH 2.5环境下，孵育4h存活率为96.84％；在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为67.54％，优于商业菌株LGG。
表2耐受性结果。
上述鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的粘附性能如下：
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以约1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557、对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取1×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述12孔细胞培养板中，于37℃，5％ CO2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用PBS洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，设置三次重复，每个片子随机选取10个视野计数。
结果如表3和图2所示，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的单细胞黏附数达9.62±0.65，显著优于对照商业菌株LGG(3.58±0.40)。
表3黏附性结果
菌株编号 黏附性(菌数/细胞数)
LGG 3.58±0.40
WHH2557 9.62±0.65**
与对照商业菌LGG相比，**：p<0.01，差异极显著。
上述鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的抗氧化能力与清除羟自由基的能力如下：
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557和对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，菌悬液OD600调至0.5±0.1。在反应体系中加入鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的菌悬液1mL，再加入1mL 0.1mmol/L DPPH的无水乙醇溶液，充分混匀后，室温下避光反应30min，然后经过6000rpm离心10min，取上清液，测定510nm处的吸光度(OD值)。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算DPPH自由基的清除率：
DPPH自由基清除率＝(A0-A1)/A0×100％。
A0：对照的OD510值，A1：鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌液的OD510值。
如表4所示，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的DPPH自由基清除率达54.61±1.12％，显著高于对照商业菌株LGG，是对照商业菌株的2.21倍。表明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具有较强的抗氧化能力。
表4菌株的DPPH自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH2276
DPPH自由基清除率(％) 24.70±0.89 54.61±1.12**
与商业对照菌LGG相比，**：p<0.01，差异极显著。
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557和对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，PBS(pH＝7.4)洗涤2次，测定菌悬液OD600。在反应体系中加入OD值约为5的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌悬液1mL，再加入1mL生理盐水和1mL FeSO4(3mmol/L)。混匀后，加入1mL H2O2(3mmol/L)，室温静置10min后加入1mL水杨酸(3mmol/L，乙醇溶解)，混匀，37℃水浴20min，离心取上清测定510nm处的吸光值。以等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算羟自由基的清除率：
羟自由基清除率＝(As-Ap)/As×100％
Ap：鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌液的OD510值，As：菌悬液换成生理盐水的OD510值。
如表5所示，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的羟自由基清除率达46.38±3.54％，显著高于对照商业菌株LGG，是对照商业菌株的1.58倍。说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具有较强的抗氧化能力。
表5菌株的羟自由基清除能力结果
菌株编号 LGG WHH2557
羟自由基清除率(％) 29.37±2.13 46.38±3.54**
与商业对照菌LGG相比，**：p<0.01，差异极显著。
上述鼠李糖乳酪杆菌WHH2557缓解酒精对HT-29细胞的损伤能力如下：
建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以约1×106细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养2d。
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557、对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％酒精和10％胎牛血清的DMEM完全培养基，取1×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述96孔细胞培养板中，于37℃，5％ CO2培养箱中孵育30min。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用新鲜DMEM完全培养基洗涤一次，再次加入新鲜DMEM培养液后，用MTT法检测细胞存活率。试验设置正常对照组、酒精模型组、菌株对照组。
结果图2和表6所示，与酒精处理模型组对比，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557使细胞存活率升高至54.36±1.89％，显著高于对照商业菌株LGG(43.03±2.30％)，说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对酒精诱导的HT-29细胞活性损伤具有保护作用。
表6细胞存活率结果
菌株编号 细胞存活率(％)
模型组 25.78±1.20a
LGG组 43.03±2.30b
WHH2557组 54.36±1.89c
a，b，c：p<0.05，各组间差异显著。
鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对肠上皮细胞屏障的保护作用如下：
建立IPEC-J2细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化，获得单细胞悬液，细胞以约1×106细胞/孔的密度接种于24孔Transwell细胞(膜面积0.33cm2，小室孔径0.4μm)培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养约15d，待IPEC-J2细胞在小室底部形成类似肠上皮样的完整致密的单层时用于试验。
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557和对照商业菌株鼠李糖乳酪杆菌GG(LGG)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％酒精和10％胎牛血清的DMEM完全培养基(不加双抗)中，取1×108CFU/mL的菌液1mL接种于上述24孔Transwell小室内(呈上下、左右轻微振荡混匀)，于37℃，5％CO2培养箱中孵育6h。试验于0、0.5、1、3和6h分别将Transwell细胞板取出，采用Millicell ERS-2电阻仪对不同细菌处理后肠道屏障小室的电阻值进行检测，试验设置三次重复。根据公式对电阻值进行数据统计。
电阻值TEER计算公式：
TEER＝(电阻值-空白电阻值)×膜面积
TEER变化率(％)＝(TEER/初始TEER)×100-100。
结果如图3所示。图3中，**：表示与LGG组相比，p<0.01，差异极显著。
从图3中可以看出，IPEC-J2细胞暴露于10％酒精6小时，TEER水平降低至初始值的75.67％左右，表明酒精导致了IPEC-J2细胞单层屏障完整性受损。鼠李糖乳酪杆菌WHH2557孵育6h后，细胞电阻值降低率为52.24±1.10％，显著优于对照商业菌株LGG(64.00±2.34％)。说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557能够有效缓解酒精暴露导致的肠道屏障损伤。
不同鼠李糖乳酪杆菌的益生特性比较：
将下述表7中所述的菌株如上文所述方式进行各项益生特性的测定，与本发明的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的结果对比如表7所述。
表7对比试验结果。
从表7中可以看出，本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557具备良好的耐酸耐胆盐特性和黏附特性，显著高于鼠李糖乳酪杆菌LGG、鼠李糖乳酪杆菌01和鼠李糖乳酪杆菌02。此外，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的抗氧化能力明显优于另外3株菌。同时，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557在缓解酒精损伤HT-29细胞方面更为突出，具有良好的肠道屏障保护功能。此对比试验更能说明，本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557在缓解酒精性肝损伤方面具有突出优势，同时其所具有的优良益生特性为缓解酒精性肝损伤相关益生功能产品的开发提供保障。
实施例2鼠李糖乳酪杆菌WHH2557缓解酒精性肝损伤的功效如下：
本发明采用健康的SPF级雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄，22±0.2g)，建立慢性酒精性肝损伤小鼠模型。小鼠随机分为4组，每组10只。分组如下：
对照组：正常小鼠，灌胃200μL无菌生理盐水
模型组：酒精性肝损伤小鼠，灌胃200μL无菌生理盐水
药物组：酒精性肝损伤小鼠，灌胃200μL无菌水飞蓟素液(100mg/kg/d)
WHH2557组：酒精性肝损伤小鼠，灌胃200μL本发明菌株悬液(2×108CFU/d)
试验共7周：第1周为小鼠适应期，小鼠饲养于室温26±0.5℃、湿度50-60％、昼夜明暗交替时间(12/12h)的洁净环境中，饲料为基础日粮饲料(斯莱康P1101F-25)。第2周为酒精饲料梯度适应期，对照组小鼠饲喂LieberDeCarli对照液体饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司TP 4020C)，到实验结束；模型组小鼠、药物组小鼠、WHH2557组小鼠饲喂LieberDeCarli酒精液体饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司TP 4020A)进行适应性饲喂，酒精含量梯度增加为1.6％-2.4％-3.2％-4％(wt/v)，即第1-2天给予含量比1.6％的酒精液体饲料、第3-4天给予含量比2.4％的酒精液体饲料、第5-6天给予含量比3.2％的酒精液体饲料、第7天给予含量比4％的酒精液体饲料，适应性喂养共7天。第3至7周为实验期，模型组、药物组、WHH2557组小鼠饲喂酒精含量比4％的酒精液体饲料。
小鼠所食用的液体饲料每日更换为新配置饲料，期间根据模型组Lieber-DeCarli酒精液体模型饲料摄入量调整空白组对照液体饲料的重量。每周记录小鼠的体重，检测变化。试验结束后，小鼠使用1％戊巴比妥腹腔注射进行麻醉，获取小鼠血液样本，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用试剂盒检测血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和甘油三酯含量。处死后小鼠进行解剖，取完整肝脏拍照观察后称重，计算肝脏指数。肝脏称重后用PBS缓冲液制成匀浆，用试剂盒测定肝脏中甘油三酯含量，BCA法测定肝脏组织蛋白含量。另取同一部位肝脏以1:9体积比，用4％多聚甲醛固定，用于石蜡包埋切片，随后进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织形态变化。
2.1鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对小鼠体重、肝重及肝脏指数的影响：
由表7可知，对照组、模型组、药物组和WHH2557组小鼠体重均无显著差异(p>0.05)。与对照组相比，模型组小鼠肝脏重量和肝重系数均显著高于对照组(p<0.05)，肝脏重是对照组的1.55倍，说明模型组肝脏发生病变。鼠李糖乳酪杆菌WHH2557组小鼠的肝重和肝重系数均显著低于模型组(p<0.05)，肝脏指数比模型组降低19.93％，说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557服用浓度在2×108CFU/d能够显著降低肝脏重量，维持肝脏健康状态。
由表8可知，与药物组相比，WHH2557组小鼠肝脏重和肝脏指数显著低于药物组(p<0.05)，表明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557服用浓度在2×108CFU/d具有缓解酒精性肝损伤功效，且优于药物水飞蓟素(100mg/kg)。
表8小鼠的体重、肝重及肝重系数
组别 体重(g) 肝脏重(g) 肝脏指数(肝脏/体重，％)
对照组 24.52±1.21a 0.89±0.11c 3.65±0.38d
模型组 24.35±1.32a 1.38±0.11a 5.67±0.40a
药物组 24.69±1.41a 1.27±0.14a 5.15±0.54b
WHH2557组 25.10±0.82a 1.14±0.10b 4.54±0.36c
a，b，c：p<0.05，各组间差异显著。
2.2鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对小鼠血清AST和ALT活性的影响：
外周血中丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量是评估肝脏损伤的重要指标。由表9可知，长期慢性饮酒导致模型组小鼠血清AST和ALT含量(84.85±11.70U/L、47.28±5.32U/L)较正常组小鼠(43.95±9.96U/L、21.71.52±6.02U/L)显著升高(p<0.05)，表明肝损伤模型建立成功。与模型组小鼠相比，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557组小鼠血清中AST和ALT的活性显著降低，分别降低了33.23％和31.03％，且AST活性与正常组相比无差异(p>0.05)。同时，WHH2557组中这两种酶活性显著低于药物组(p<0.05)。说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557服用浓度在2×108CFU/d能够有效抑制慢性酒精导致的小鼠肝脏损伤，且优于药物水飞蓟素(100mg/kg)。
表9小鼠血清的AST、ALT活性
组别 AST(U/L) ALT(U/L)
对照组 43.95±9.96c 21.71.52±6.02c
模型组 84.85±11.70a 47.28±5.32a
药物组 71.36±6.54b 43.82±4.34a
WHH2557组 51.62±8.73c 32.61±7.64b
a，b，c：p<0.05，各组间差异显著。
2.3鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对小鼠肝脏TG含量的影响：
甘油三酯是人体内含量最多的脂质，也是极低密度脂蛋白和乳糜微粒的重要组成部分。如表10所示，与对照组相比，慢性酒精摄入显著增加了小鼠肝脏中的TG含量(p<0.05)，模型组肝脏TG含量(52.23±2.12μmoL/g prot)是对照组(30.59±1.15μmoL/gprot)的1.7倍。与模型组相比，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557组小鼠肝脏中的TG含量显著降低(p<0.05)，降低了30.19％。说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557服用浓度在2×108CFU/d能够有效抑制慢性酒精导致的小鼠肝脏脂质堆积。
表10小鼠肝脏的TG含量
组别 TG(μmoL/g prot)
对照组 30.59±1.15c
模型组 52.23±2.12a
药物组 38.34±1.09b
WHH2557组 36.46±3.08b
a，b，c：p<0.05，各组间差异显著。
2.4鼠李糖乳酪杆菌WHH2557对小鼠肝脏组织病理损伤的影响：
由图4可知，对照组小鼠肝脏组织小叶结构完整，细胞界限清晰，末见脂肪空泡。模型组小鼠肝脏组织细胞结构被破坏，肝脏脂肪变性明显，出现脂肪空泡和炎症细胞浸润，肝细胞肿胀变形，说明模型组小鼠已经形成酒精性脂肪肝，且肝脏组织严重受损。鼠李糖乳酪杆菌WHH2557组小鼠肝脏组织细胞的脂肪变性减轻，脂肪空泡减少。病理学结果同肝脏TG指标的结果一致，说明鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌株服用浓度在2×108CFU/d能够有效改善肝脏脂肪变性和炎症细胞浸润，能够缓解酒精性脂肪肝。
综上所述，鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌株服用浓度在2×108CFU/d能够显著降低肝重和肝脏指数，降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，降低肝脏甘油三酯水平，减少肝脏脂肪堆积和变性，即鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌株可缓解酒精性肝损伤。
实施例3
一种鼠李糖乳酪杆菌WHH2557冻干菌粉，其制作步骤如下：
本发明菌株鼠李糖乳酪杆菌WHH2557以1％的接种量接种于10mL液体MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中培养12h(一代种子液)，以此传至两代。二代种子1％的接种量接种于10L含有液体MRS培养基的发酵罐中，37℃培养10h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1×1011～5×1011CFU/g，可用于含有鼠李糖乳酪杆菌WHH2557的具有缓解酒精性肝损伤功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。
实施例4
一种由鼠李糖乳酪杆菌WHH2557制备功能性发酵酸奶，工艺流程为原料→预热→均质→调配→杀菌→冷却→制备接种→发酵→后熟→冷藏制备得到，具体步骤如下：(1)预热：将2L全脂UHT灭菌乳或鲜牛乳放入容器中加热至63℃；(2)均质：倒入均质机中均质，混合液倒入铁罐中，同时加入100g白糖，于90℃水浴环境杀菌10min；(3)调配：牛乳中加入配料，并溶解；(4)杀菌：加糖牛乳在90℃水浴里杀菌10min；(5)冷却：杀菌后的牛乳，冷却至40℃备用；(6)制备发酵剂：鼠李糖乳酪杆菌WHH2557菌种在无菌环境下，接种于装有灭菌脱脂乳(12％，w/v)的试管中，于37℃条件下培养20小时，每次传代接种量为2-4％(v/v)，传代2～3次以恢复活力，放置于4℃冰箱中保存；(7)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的鼠李糖乳酪杆菌WHH2557，接种量为2％(v/v)，在42℃条件下恒温发酵10h；(8)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中后熟12h；(9)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250mL的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。

Claims (10)

1.一株具有缓解慢性酒精性肝损伤功效的鼠李糖乳酪杆菌，其特征是，所述鼠李糖乳酪杆菌命名为WHH2557，已在2023年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，微生物保藏编号为GDMCC No：63222，微生物分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
2.一种含有如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌的菌体培养物，其特征是，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
3.一种组合物，其特征是，含有如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或权利要求2所述的菌体培养物，以及生理上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
4.根据权利要求3所述的一种组合物，其特征是，所述组合物为具有预防和/或治疗酒精性肝损伤功能的食品、药品或保健品。
5.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备降低酒精对小肠细胞损伤产品中的应用。
6.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备修复酒精性损伤肠道的屏障保护功能产品中的应用。
7.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备降低酒精性损伤肝的肝重和肝脏指数的产品中的应用。
8.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的产品中的应用。
9.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备降低肝脏甘油三酯水平产品中的应用。
10.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌或如权利要求2所述的菌体培养物或如权利要求3所述的组合物用于制备减少酒精性损伤肝的肝脏脂肪空泡和炎症细胞浸润产品中的应用。
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