CN116083325A - 一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用，所述改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株，保藏编号为CGMCC No.24281。该菌株能够显著降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附，即有效预防幽门螺杆菌的定植感染；能够产丰富细菌素发挥抑菌作用，抑制Hp及其脲酶活性，从而提高其根除率；能够显著预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01及其应用，具体涉及一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01及其在制备预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致的胃炎的药物中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种革兰阴性菌，常定植于人体胃部及十二指肠内，与急胃炎、胃溃疡、胃癌及十二指肠球部溃疡等疾病相关。Hp通过对胃黏膜释放毒素发生炎症，从而促进IL-8、IL-1β、IL-6等炎性因子的释放，最终导致肠上皮化生及胃黏膜萎缩等病理变化。Hp感染所导致的胃炎初起于机体胃窦，经发展扩展到整个胃体，Hp感染后机体难以自发清除，如不进行治疗往往造成终身感染，即长期存在慢性活动性胃炎。
研究发现，患胃炎时Hp检出率很高，大部分胃溃疡和十二指肠溃疡患者的胃窦部可检出Hp，而胃粘膜正常者则不能检出此菌，当针对Hp进行根除治疗时，胃炎患者胃粘膜也会发生明显改善。然而，当前Hp耐药是全球面临的重要难题，传统方案根除率呈下降趋势，Hp感染的治疗迎来诸多挑战，包括抗生素耐药性、治疗副作用、患者依从性、再感染等方面。铋剂四联方案作为主要的Hp根除方案，然而患者出现不良反应、根除率降低、相关性胃炎的发生概率依然较高。因此许多研究者开始关注益生菌在Hp根除中的作用，以期通过益生菌干预实现对Hp根除率的提高、降低不良反应发生率及相关症状的缓解，改善胃肠道健康。
相关研究表明，益生菌可能有助于增强屏障作用，提高胃内抵御病原菌的第一道防线胃酸和胃黏膜黏液屏障能力；肠道有益菌可分泌抗菌物质，比如乳酸、短链脂肪酸(SCFAs)、细菌素等抑制Hp和Hp脲酶活性，破坏Hp的活性；另外益生菌可以干扰Hp的定植，Hp在胃上皮细胞的定植是其感染致病的关键因素。有益菌通过竞争黏附位点、与Hp结合形成共聚物以促进其排出体内等作用，干扰Hp在胃黏膜上皮细胞的定植，减轻Hp阳性患者相关性胃炎的症状。
因此，如何提供一种可以有效根除Hp，改善或治疗Hp相关性胃病问题的微生物制剂，使用者可尝试使用含有特定益生菌的药品，解决因幽门螺杆菌感染引起的胃肠疾病问题给患者带来的不良生活体验，消退胃粘膜炎症、预防胃病复发，能在无形中降低了消化道肿瘤的风险，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01及其应用，具体提供一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01及其在制备预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致的胃炎的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌，所述改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus LRa01菌株，保藏编号为CGMCC No.24281，保藏日期为2022年1月10日。
本发明从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善Hp相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌，将其命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株，该菌株能够根除Hp，改善Hp相关性胃炎和不良反应症状，具体体现在：(1)显著降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附，即有效预防幽门螺杆菌的定植感染；(2)能够产丰富细菌素发挥抑菌作用，抑制Hp及其脲酶活性，从而提高其根除率；(3)能够显著预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状。因此，此鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株能用于制备预防、改善或治疗Hp感染所致胃炎的产品(如药品等)。
另外，鼠李糖乳杆菌是一种益生菌，因此，本发明筛选得到的鼠李糖乳杆菌LRa01用于预防、改善或治疗Hp感染相关性胃炎的产品(如药品等)中时，安全性高；且其不会产生抗药性，改善常规Hp感染患者因抗生素用药所带来消化不良、恶心等不良反应发生，可长期用于预防、改善或治疗Hp感染相关性胃炎的产品中。
本发明所涉及的鼠李糖乳杆菌的筛选步骤如下：
(1)选取分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在38℃培养48h后，挑取出不同形态的3株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为35％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的3株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株抑制幽门螺杆菌生长能力、耐胃酸和胆盐能力(人工模拟)、产SCFA(短链脂肪酸)量更优的单菌株，对其进行鉴定。
优选地，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株的培养方法包括：将鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株接种于培养基中在35-38℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃等)下培养18-22h(例如18h、19h、20h、21h、22h等)；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、L-半胱氨酸。
具体地，所述培养基(液体)的配方组成包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乳糖10g、酵母浸膏5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO4 0.01g、L-半胱氨酸1g。
本发明优选上述培养条件，鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、松三糖、甘露糖等)利用能力。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01在制备预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致的胃炎的药物中的应用。
本发明所涉及的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。
第三方面，本发明提供一种具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂，所述具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株。
优选地，在所述益生菌剂中，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g，例如1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、5×108CFU/mL、8×108CFU/mL、1×109CFU/mL、5×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型可以为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂等剂型。
优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
所述保护剂包括脱脂乳粉。
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，所述复合益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株；所述嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株的保藏编号为CGMCCNo.23546，2021年10月9日。
本发明还创造性地发现上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株能够与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗Hp感染所致胃炎，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LRa01菌株与LA05菌株在降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附、提高Hp根除率、预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状方面具有协同增效作用。
优选地，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株的质量比为(3-5):1，例如3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
优选地，所述复合益生菌剂中的菌株还包括植物乳杆菌Lactobacillusplantarum Lp05菌株；所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的保藏编号为CGMCC No.23547，2021年10月9日。
本发明还创造性地发现在上述复合益生菌剂中添加植物乳杆菌Lactobacillusplantarum Lp05菌株得到的复合益生菌剂具有进一步优化的效果，且与单一菌剂或两者复配方式相比，三种菌株的复合菌剂具有更显著的降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附、提高Hp根除率、预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状的效果，说明LRa01菌株、LA05菌株与Lp05菌株在上述功效方面具有协同增效作用。
优选地，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的质量比为(3-5):1:(1-2)，例如3:1:1、4:1:1、5:1:1、3:1:2、4:1:2、5:1:2等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合益生菌剂中，三种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。
优选地，所述复合益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
所述保护剂包括脱脂乳粉。
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明分离获得并保藏了一株新的能够改善Hp相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌，将其命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株，该菌株能够根除Hp，改善Hp相关性胃炎和不良反应症状，具体体现在：(1)显著降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附，即有效预防幽门螺杆菌的定植感染；(2)能够产丰富细菌素发挥抑菌作用，抑制Hp及其脲酶活性，从而提高其根除率；(3)能够显著预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状。因此，此鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株能用于制备预防、改善或治疗Hp感染所致胃炎的产品(如药品等)。
本发明还创造性地发现上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株能够与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗Hp感染所致胃炎，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明LRa01菌株与LA05菌株在降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附、提高Hp根除率、预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的症状方面具有协同增效作用。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述涉及的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24281，保藏日期为2022年01月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23546，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的植物乳杆菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23547，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
胃黏膜上皮细胞GES1细胞购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清、PBS和胰蛋白酶购自Thermo公司；BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司；哥伦比亚培养基购自英国OXOID公司；BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司。
下述涉及的鼠李糖乳杆菌LRa01菌悬液：将鼠李糖乳杆菌接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到鼠李糖乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
下述涉及的嗜酸乳杆菌LA05菌悬液：将嗜酸乳杆菌LA05接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到嗜酸乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
下述涉及的植物乳杆菌Lp05菌悬液：将植物乳杆菌Lp05接种于MRS液体培养基中，38℃下培养20h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养20h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到植物乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。
实施例1
本实施例筛选一株改善Hp相关性胃炎的鼠李糖乳杆菌，步骤如下：
(1)选取分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在38℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为35％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：
A.耐酸和胆盐能力测试：
使用MRS液体培养基、MRS固体培养基和分离培养基(在固体CMRS重加0.5％CaCO3)，主要试剂有胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆酸钠和CaCO3等。把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2％的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化ΔOD600值；在MRS培养基中添加0.3％的牛胆盐，121℃下15min灭菌后按2％的接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养24h后测定其在24h过程中吸光度的变化ΔOD600值，最后选取两个ΔOD600值相对大的大约10个菌株做下一步实验。
耐酸性实验：以pH＝7.0的PBS缓冲液为基础，再用37％的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10％接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。
耐胆盐实验：菌种活化两代后的液体培养物以2％接种量接入含有不同胆盐浓度的MRS培养基中(培养基中分别喊0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、2％胆盐)，同时以不含胆盐的MRS培养基为对照，在37℃恒温培养24h后取样测定活菌数，结合上一个实验结果筛选出耐酸耐胆盐的优良菌株。
B.产酸能力测试：
采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养24h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度/(g·L-1)＝(V1-V2)·c·100·V0-1(V1为样品消耗NaOH溶液的体积，mL；V2为空白对照消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为稀释液的总体积，mL；c为标准NaOH的浓度，mol/L)。
C.抑制幽门螺杆菌生长能力测试：
将幽门螺杆菌从-80℃取出，涂布于含5％绵羊血(v/v)的哥伦比亚血琼脂培养基中活化培养，在微需氧环境中，37℃培养48h；将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到上清液；使用PBS重悬菌体，得到菌悬液。下一步进行抑菌圈实验：将100μL幽门螺杆菌的菌液(密度为109CFU/mL)涂布到不含抗生素且已打孔的含5％绵羊血的哥伦比亚血琼脂培养基(培养基体积为20mL)表面，分别加入以下任一组液体，从而形成不同的实验组别：待测菌悬液100μL；待测上清液100μL；阳性对照(质量浓度为0.025％的甲硝唑溶液)100μL；阴性对照(PBS缓冲液)100μL；空白对照(MRS液体培养基100μL)。用牛津杯法测定其在48h和72h抑制幽门螺杆菌生长的效果，以抑菌圈的大小评价其抑制幽门螺杆菌生长的能力。
综合上述筛选实验，选择对幽门螺杆菌抑制能力最好、产酸量最多且胃酸胆盐耐受能力最强的一株菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
(1)形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于38℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落为乳白色，圆润透亮的圆点。挑选对数生长期的该菌株，进行光学显微镜检测，经涂片和革兰染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为杆状，无芽孢无鞭毛。
(2)16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2％比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在38℃下培养18h后进行离心分离，8000rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌。
SEQ ID No:1：
CGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTCACTCAATTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTTCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTTTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCA。
基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株。
实施例3
本实施例对鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株的培养条件进行优化，步骤如下：
将鼠李糖乳杆菌LRa01接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如表1所示：
表1
| 2h | 4h | 8h | 12h | 20h | 24h | 30h | 40h | 48h | |
| 10℃ | 0.547 | 0.550 | 0.558 | 0.561 | 0.567 | 0.567 | 0.568 | 0.569 | 0.569 |
| 20℃ | 0.551 | 0.575 | 0.580 | 0.582 | 0.586 | 0.590 | 0.591 | 0.594 | 0.595 |
| 30℃ | 0.575 | 0.590 | 0.622 | 0.687 | 0.934 | 1.987 | 2.535 | 2.640 | 2.646 |
| 35℃ | 0.610 | 0.673 | 0.720 | 1.025 | 3.621 | 3.647 | 3.618 | 3.574 | 3.488 |
| 40℃ | 0.593 | 0.651 | 0.705 | 0.950 | 3.571 | 3.628 | 3.609 | 3.565 | 3.554 |
| 45℃ | 0.590 | 0.600 | 0.670 | 0.711 | 2.437 | 2.536 | 2.557 | 2.620 | 2.635 |
| 50℃ | 0.500 | 0.505 | 0.519 | 0.624 | 0.673 | 1.330 | 1.354 | 1.370 | 1.385 |
结果显示，LRa01在35-38℃，培养18-22h即可达到生长稳定期。
根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基(基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成)和API 50CH试验条对检测菌株LRa01进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。
最后结果得到，菌株LRa01可利用碳源葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、松三糖、海藻糖等多种糖源。
实施例4
本实施例验证LRa01的耐胃酸能力，步骤如下：
(1)制备人工胃液：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
(2)耐胃酸能力测试：
取1.0mL鼠李糖乳杆菌LRa01菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，
其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表2。
表2
| 人工胃液pH | 活菌数N0(0h) | 活菌数N1(3h) | 存活率(％) |
| 2.0 | <![CDATA[(5.70±0.15)×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[(4.46±0.10)×10<sup>8</sup>]]> | 78.4 |
| 2.5 | <![CDATA[(5.73±0.23)×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[(5.39±0.21)×10<sup>8</sup>]]> | 94.0 |
| 3.0 | <![CDATA[(5.71±0.28)×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[(5.49±0.18)×10<sup>8</sup>]]> | 96.2 |
由表2可以看出，本发明所述的鼠李糖乳杆菌LRa01具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达78.4％；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达94.0％；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达96.2％。良好的耐酸能力为其在胃肠道定植，根除Hp以及制备预防、改善或治疗Hp相关性慢性胃炎的产品创造了条件。
实施例5
本实施例验证鼠李糖乳杆菌LRa01对幽门螺杆菌的生长抑制作用，步骤如下：
幽门螺杆菌从-80℃取出，涂布于含5％绵羊血(v/v)的哥伦比亚血琼脂培养基中活化培养，在微需氧环境中，37℃培养48h；
参考文献常用抑菌测定方法牛津杯法，将100μL幽门螺杆菌的菌液(密度为109CFU/mL)涂布到不含抗生素且已打孔的20mL 5％绵羊血的哥伦比亚血琼脂培养基表面，分别加入以下任一组液体，从而形成不同的实验组别：1)待测LRa01菌悬液100μL(浓度为109CFU/mL)；2)阳性对照(质量浓度为0.025％的甲硝唑溶液)100μL；3)阴性对照(PBS缓冲液)100μL；4)空白对照(MRS液体培养基100μL)；5)待测Lp05菌悬液100μL(浓度为109CFU/mL)；6)待测LA05菌悬液100μL(浓度为109CFU/mL)；7)待测LRa01+Lp05联合菌悬液100μL(总浓度为109CFU/mL，浓度比例3:1)；8)待测LRa01+Lp05+LA05联合菌悬液100μL(总浓度为109CFU/mL，浓度比例3:1:1)；9)待测ATCC53103+Lp05联合菌悬液100μL(总浓度为109CFU/mL，浓度比例3:1)。测定其在48h和72h抑制幽门螺杆菌生长的效果，结果如表3所示。
表3
由表3可知，对比空白对照、阴性对照，MRS液体培养基和PBS缓冲液对Hp均无抑制作用，而LRa01、Lp05、LA05菌悬液对Hp的生长均具有抑制作用，且LRa01菌悬液的抑制效果最好，培养48h时，LRa01菌悬液的抑菌圈直径可达18.6±2.9mm以上；培养72h时，LRa01菌悬液的抑菌圈直径可达25.4±1.8mm以上。这可能与菌株LRa01所产的一些次生代谢产物有关，比如细菌素等，能够特异作用幽门螺杆菌，至其死亡，从而抑制其生长。另外，意外发现当LRa01、Lp05两菌联合使用或LRa01、Lp05、LA05三菌联合使用时，抑制Hp生长能力发挥地最好，抑菌效果明显。
实施例6
本实施例测试LRa01对幽门螺杆菌细胞粘附力的影响，操作如下：
(1)空白对照(GES-1)：取胃黏膜上皮细胞GES-1细胞，使用PBS稀释调整GES-1细胞浓度至1×104/mL，添加至96孔板中，培养24h(37℃恒温、5％CO2)，至GES-1细胞处于贴壁状态后，用PBS洗涤GES-1细胞3次，得洗涤后的胃黏膜上皮细胞GES-1。
(2)Hp感染组(Hp组)：使用Hp感染胃上皮细胞GES-1，首先使用无菌生理盐水对Hp菌悬液进行稀释至其浓度为2×107CFU/mL时，吸取1mL Hp菌悬液的稀释液添加至如(1)中的GES-1细胞中，然后培养2h(37℃恒温、5％CO2)，再用PBS洗涤3次，将未吸附的幽门螺杆菌清洗干净，制备得到Hp感染的GES-1细胞。
(3)益生菌后干预组(LRa01、Lp05、LA05、LRa01+Lp05、LRa01+Lp05+LA05组)：在幽门螺杆菌感染的胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中分别加入10μL的LRa01、Lp05、LA05、LRa01+Lp05(浓度比例3:1)、LRa01+Lp05+LA05(浓度比例约3:1:1)重悬液(麦氏比浊管总浓度均为2.0×109CFU/mL)，在37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，得到经各组菌株处理的Hp感染的GES-1细胞。
(4)益生菌前干预组(LRa01、Lp05、LA05、LRa01+Lp05、LRa01+Lp05+LA05组)：将10μL 2.0×109CFU/mL的LRa01、Lp05、LA05、LRa01+Lp05(浓度比例3:1)、LRa01+Lp05+LA05(浓度比例约3:1:1)重悬液(麦氏比浊管总浓度均为2.0×109CFU/mL)加入洗涤后的GES-1细胞中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，PBS洗涤3次，洗去未吸附的各组菌株，得到洗涤后的经各菌株处理的GES-1细胞。用无菌生理盐水稀释HP菌悬液至浓度为2×107CFU/mL，取1mL添加至洗涤后的经各菌株处理的GES-1细胞中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养2h后，用PBS洗涤3次，将未吸附的幽门螺杆菌清洗干净，得到经各菌株处理的感染Hp的胃黏膜上皮细胞GES-1。
(5)尿素酶活性快速测定法：各孔用PBS液洗涤5次后，在各组细胞中分别加入200μL尿素酚红试剂，培养2h(37℃恒温、5％CO2)，得到培养液，通过酶标仪测定不同组的培养液在波长550nm处的吸光度，通过Hp的尿素酶活力来表征幽门螺杆菌的粘附能力。测定结果见表4(每组平行测定3次取平均值)。
Hp粘附率计算公式：Hp粘附率＝(菌株处理组的OD值-空白组的OD值)/(Hp组的OD值-空白组的OD值)×100％
表4
| 组别 | Hp粘附率％ |
| Hp感染组 | 100 |
| LRa01后干预组 | 57.0 |
| Lp05后干预组 | 68.1 |
| LA05后干预组 | 66.2 |
| LRa01+Lp05后干预组 | 53.1 |
| LRa01+Lp05+LA05后干预组 | 52.0 |
| LRa01前干预组 | 52.7 |
| Lp05前干预组 | 60.5 |
| LA05前干预组 | 57.8 |
| LRa01+Lp05前干预组 | 48.5 |
| LRa01+Lp05+LA05前干预组 | 43.6 |
由表4可知，以Hp感染组的粘附率为100％作为参照标准，与Hp感染组相比，各益生菌前或后干预组的Hp粘附率均呈现显著的下降情况，其中LRa01的前/后干预组均出现较明显的竞争粘附优势，能够显著降低Hp对胃黏膜上皮细胞的粘附率，可降低40％以上的粘度率。同时，我们发现，当对LRa01、Lp05、LA05三株菌按比例进行组合后进行干预，能够较为有效地抑制Hp细胞的粘附能力，可降低50％以上的粘附率。另外前干预组效果均优于后干预组，即提前补充益生菌可有效预防幽门螺杆菌的定植感染，进而预防因幽门螺杆菌感染出现相关性胃炎等疾病。
实施例7
本实施例探究LRa01对Hp相关性慢性胃炎小鼠的影响，步骤如下：
(1)试验小鼠：C57BL/6SPF级雄性小鼠56只(每组8只)，6周龄左右，体重20g±2g，由上海市实验动物研究中心提供，小鼠运输前抽取部分小鼠进行胃部PCR检测，确认小鼠未感染鼠源性幽门螺杆菌。
(2)分组和给药：
制备Hp菌体：将冻存的Hp菌株从-80℃取出，涂布于含5％绵羊血(v/v)的哥伦比亚血琼脂培养基中活化培养，于37℃的三气培养箱(85％ N2、10％ CO2和5％ O2)中培养3d，得到单菌落；挑取单菌落接种于含5％胎牛血清的BHI培养基中，于37℃的三气培养箱中培养4d，得到种子液；将种子液以2％的接种量接种于BHI培养基中，于37℃的三气培养箱中培养4d，得到幽门螺杆菌菌液；将幽门螺杆菌菌液在8000g下离心10min，得到幽门螺杆菌菌体，将其用PBS重悬至浓度为1×108CFU/mL，得到幽门螺杆菌菌悬液。
Hp感染方法：取出Hp菌液，0.25mL/只灌胃小鼠，每只3次，隔天一次，每次灌胃Hp前禁食12小时，灌胃完成后2小时再进食。小鼠给予2％的无菌生理盐水直至开始Hp感染，以增强细菌感染能力。
经口服Hp确认感染成功(灌胃感染结束后1周，随机取2只模型组小鼠进行感染检测。检测前小鼠禁食1天，小鼠处死后，使用无菌工具取出胃组织，剪开胃部，清洗，取胃腺部置于快速尿素酶试剂内：在37℃恒温箱中孵育6小时，颜色变为红色则为感染成功)后再继续饲养5周，建立Hp相关性慢性胃炎动物模型(饲养6周，随机处死2只小鼠，同样的方法取胃腺部，进行HE染色观察，小鼠胃黏膜层显示出现单核细胞密集和浸润的慢性胃炎病理学变化，同时可见Hp感染，则为Hp相关性慢性胃炎)，造模成功后，将模型小鼠随机分成MC组：8只小鼠，正常饲养；益生菌干预组(LRa01组、Lp05组、LA05组、LRa01+Lp05联合组(比例3:1)、LRa01+Lp05+LA05联合组(比例3:1:1))每组8只小鼠：正常饲养+对应益生菌菌悬液(1×109CFU/天)连续4周，同时设空白对照组(CTL组)8只。
病理学分析：饲养结束后，处死小鼠，采用无菌无酶处理后的手术工具解剖取胃部，沿胃大弯剪开，清洗去内容物，剪取胃窦到胃体组织，分成3份，一份用于HE染色观察胃炎程度，一份通过硼砂美兰染色观察Hp感染情况，另一份于液氮中速冻，后移至-70℃冰箱备用。进行相关胃组织切片慢性炎症程度和幽门螺杆菌定植情况评分(参考文献：Aydin,O.,Egilmez,R.,Karabacak,T.,&Kanik,A.(2003).Interobserver variation inhistopathological assessment of Helicobacter pylori gastritis.World journalof gastroenterology,9(10),2232.)；进行氧化应激指标的表达测定(使用髓过氧化物歧化酶MPO、超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MNA、过氧化氢酶CAT检测试剂盒方法，单位：U/mgprot，取平均值)；进行相关促炎因子表达测定(依据细菌基因DNA提取试剂盒(天根生物)说明书操作提取DNA，货号：DP302，取平均值)。结果如表5-8所示：
表5
(注：分数：无＝0；轻度＝1；中度＝2；重度＝3)
表6
(注：分数：无＝0；轻度＝1；中度＝2；重度＝3)
表7
| MDA | CAT | SOD | MPO | |
| CTL组 | 0.090 | 20.13 | 5.58 | 0.030 |
| MC组 | 0.149 | 10.59 | 4.35 | 0.070 |
| LRa01组 | 0.097 | 18.50 | 5.21 | 0.039 |
| Lp05组 | 0.105 | 15.27 | 5.00 | 0.045 |
| LA05组 | 0.101 | 15.10 | 5.06 | 0.042 |
| LRa01+Lp05组 | 0.092 | 18.96 | 5.31 | 0.036 |
| LRa01+Lp05+LA05组 | 0.091 | 20.02 | 5.35 | 0.033 |
表8
| iNOS | COX-2 | TNF-α | IL-1β | |
| CTL组 | 1.05 | 1.12 | 1.08 | 1.09 |
| MC组 | 6.77 | 5.76 | 2.56 | 6.30 |
| LRa01组 | 1.39 | 1.43 | 1.30 | 1.92 |
| Lp05组 | 1.98 | 1.90 | 1.47 | 2.36 |
| LA05组 | 1.95 | 1.90 | 1.45 | 2.10 |
| LRa01+Lp05组 | 1.32 | 1.35 | 1.12 | 1.65 |
| LRa01+Lp05+LA05组 | 1.22 | 1.19 | 1.10 | 1.55 |
由表5和6可知，相比CTL组，模型组小鼠出现hp相关性慢性胃炎，且每只小鼠均出现hp感染定植的情况，经过益生菌的干预治疗，均能在一定程度上缓解小鼠Hp感染相关性慢性胃炎的程度，同时Hp在胃肠道的定植率也发生显著改变，即有效降低Hp的定植率。另外，我们意外发现当LRa01+Lp05协同搭配作用或LRa01+Lp05+LA05协同搭配作用时，基本上可以治愈因Hp感染导致的慢性胃炎且根除Hp。
由表7和表8可知，与CTL组小鼠对比，模型组小鼠感染Hp引起慢性胃炎同时，小鼠胃组织中氧化应激相关指标表达的变化，其中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的含量呈现下降情况，且丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的表达提高了。而益生菌干预治疗后，HP感染相关性慢性胃炎小鼠的氧化应激程度显著下降，修复机体的氧化-抗氧化平衡，单菌株组LRa01组的效果较显著，另外LRa01+Lp05+LA05三菌株搭配其效果能发挥到最好。同样的，观察HP慢性胃炎小鼠胃组织中的炎症因子表达情况，对比CTL组，模型组胃组织中促炎因子iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β基因的表达强度均显著提高，与Hp感染呈正相关，浸润的炎性细胞变多，活性增强，造成胃黏膜炎症损伤，但经过益生菌的干预治疗，使其炎症反应有所缓解，尤其是单菌株组LRa01的效果较为显著，另外LRa01+Lp05+LA05三菌株搭配可以较大程度上恢复机体炎症因子水平至正常。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌LRa01及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusLRa01菌株，保藏编号为CGMCC No.24281，保藏日期为2022年1月10日。
2.如权利要求1所述的改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌在制备预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致的胃炎的药物中的应用。
3.一种具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂，其特征在于，所述具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂中的菌株包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株。
4.如权利要求3所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
5.如权利要求3所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂；
所述保护剂包括脱脂乳粉；
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
6.一种具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂中的菌株包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus LRa01菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株；所述嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株的保藏编号为CGMCC No.23546，2021年10月9日。
7.如权利要求6所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株与嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株的质量比为(3-5):1。
8.如权利要求6所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂中的菌株还包括植物乳杆菌Lactobacillus plantarumLp05菌株；所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的保藏编号为CGMCCNo.23547，2021年10月9日。
9.如权利要求8所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa01菌株、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株的质量比为(3-5):1:(1-2)。
10.如权利要求6所述的具有预防、改善或治疗幽门螺杆菌感染所致胃炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂；
所述保护剂包括脱脂乳粉；
所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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