CN115029270B - 一株能够降低肠道促炎细胞因子的清酒乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够降低肠道促炎细胞因子的清酒乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的清酒乳杆菌CCFM1267保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62426；该菌株具有缓解结肠炎的作用，具体体现在：显著降低DSS诱导结肠炎期间小鼠的疾病活动指数，减轻结肠的缩短，降低结肠组织的损伤；显著提高DSS干预后小鼠结肠组织Z0‑1、Occludin、Claudin‑1和Claudin‑3等紧密连接蛋白的表达；显著降低促炎因子IL‑6、IL‑17、IL‑1β和TNF‑α的含量；显著促进DSS干预后小鼠肠道中短链脂肪酸的浓度；有效改善结肠炎小鼠肠道菌群结构；代谢产生吲哚‑3‑乙酸，有效维护肠道健康。因此，清酒乳杆菌CCFM1267在制备预防和/或治疗炎症的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株能够降低肠道促炎细胞因子的清酒乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能够降低肠道促炎细胞因子的清酒乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一种慢性、复发性以及无法治愈的疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，影响了全球1120万人。临床表现为慢性出血性腹泻、腹部绞痛疼痛、肠道穿孔、肠梗阻等，严重影响患者的生活质量。虽然IBD的发病机制尚未明确，但越来越多的报道表明，IBD涉及遗传易感性和环境因素之间的复杂相互作用，这些因素触发对肠道微生物的异常免疫反应，导致黏膜屏障功能受损。目前治疗IBD常见药物为柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂如艾迪莎、美沙拉嗪等；皮质类固醇常用药为强的松或地塞米松，但长期使用上述药物可能会导致高血压、糖尿病等症状。因此，寻求一种可以替代传统方法缓解结肠炎的方案显得尤为重要。目前研究表明，益生菌能够通过调节宿主的免疫系统和改善肠上皮屏障功能为宿主肠道健康提供益处，是治疗肠道疾病如炎症性肠病的有效介质。
清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)是近年来研究较多的益生菌，常见于发酵泡菜、鱼肉制品及人体胃肠道、粪便中，2014年被批准为可食用菌种。已有研究表明，清酒乳杆菌在缓解结肠炎方面显示出一定的优越性。该菌能够通过改善肠道菌群(公开于Rather I A，Bajpai V K，Ching L L，et al.Effect of a bioactive product SEL001from Lactobacillus sakei probio65 on gut microbiota and its anti-colitiseffects in a TNBS-induced colitis mouse model[J].Saudi Journal of BiologicalSciences，2020，27(1):261-270.论文中)，调节肠道免疫反应(公开于Jang S-E，Min S-W.Lactobacillus sakei S1 Improves Colitis Induced by 2，4，6-TrinitrobenzeneSulfonic Acid by the Inhibition of NF-kappaB Signaling in Mice[J].Journal ofMicrobiology and Biotechnology，2020，30(1):71-78.论文中)，保护肠道屏障(公开于Ghoneum M，Abdulmalek S.KDP，a Lactobacilli Product from Kimchi，EnhancesMucosal Immunity by Increasing Secretory IgA in Mice and ExhibitsAntimicrobial Activity[J].Nutrients，2021，13(11):3936.论文中)及缓解氧化应激(公开于Seo S，Shin J-S，Lee W-S，et al.Anti-colitis effect of Lactobacillus sakeiK040706 via suppression of inflammatory responses in the dextran sulfatesodium-induced colitis mice model[J].Journal of Functional Foods，2017，29:256-268.论文中)等方式有效缓解结肠炎。
因此，一株可有效的缓解结肠炎的清酒乳杆菌具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267，所述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62426，保藏日期为2022年04月26日。
所述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267来源于四川省发酵泡菜水样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为清酒乳杆菌，命名为清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267。
所述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267在MRS固体培养基上的菌落呈乳白色，半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
所述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267能够发酵生成吲哚-3-乙酸。吲哚-3-乙酸由色氨酸代谢生成，是调节肠道功能的有益代谢产物。该物质能被芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)识别(公开于Chowdhury M M I，Kurata K，YuasaK，et al.Suppression of TNFalpha expression induced by indole-3-acetic acid isnot mediated by AhR activation in Caco-2cells[J].Bioscience Biotechnology andBiochemistry，2021，85(4):902-906.论文中)，从而增加IL-22的分泌，保护肠上皮屏障功能，有效缓解炎症(公开于Yang C，Du Y，Ren D，et al.Gut microbiota-dependentcatabolites of tryptophan play a predominant role in the protective effectsof turmeric polysaccharides against DSS-induced ulcerative colitis[J].Food&Function，2021，12(20):9793-9807.论文中)。
本发明的第二个目的是提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中，含有上述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267，或含有清酒乳杆菌(Latilactobacillussakei)CCFM1267的发酵液，或含有清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267的冻干粉，或含有清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267灭活的菌体，或含有清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267的裂解物，或含有清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267的含量不低于5×109CFU/mL或5×109CFU/g。
本发明的第三个目的是提供了一种产品，所述产品中含有上述清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267或其发酵液，或清酒乳杆菌(Latilactobacillussakei)CCFM1267的裂解物，或清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267的提取物，或上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，清酒乳杆菌(Latilactobacillussakei)CCFM1267的活菌数为不低于5×109CFU/mL或5×109CFU/g。
本发明的第四个目的是提供了一种预防和/或治疗结肠炎的药品，所述药品中含有上述清酒乳杆菌CCFM1267或上述微生物菌剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述清酒乳杆菌(Latilactobacillussakei)CCFM1267、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的第五个目的是提供了上述清酒乳杆菌CCFM1267，或上述微生物菌剂在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、饲料或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，清酒乳杆菌的活菌数为不低于5×109CFU/mL或5×109CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述清酒乳杆菌(Latilactobacillussakei)CCFM1267、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
有益效果
1、本发明筛选出了一株清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267，此清酒乳杆菌CCFM1267具有缓解结肠炎症的作用，具体体现在：
(1)显著降低DSS诱导结肠炎期间小鼠的疾病活动指数，减轻结肠的缩短，降低结肠组织的损伤。
(2)显著提高DSS干预后小鼠结肠组织Z0-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-3等紧密连接蛋白的表达。
(3)显著降低降低促炎因子IL-6、IL-17、IL-1β和TNF-α的含量。
(4)显著促进DSS干预后小鼠肠道中短链脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸的浓度。
(5)有效改善结肠炎小鼠肠道菌群结构。
(6)代谢产生吲哚-3-乙酸，有效维护肠道健康。
2、清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)是益生菌的一种，可见，本发明的清酒乳杆菌CCFM1267以及有效成分为清酒乳杆菌CCFM1267的产品长期使用不会导致患者产生副作用，安全性较高。
生物材料保藏
一株清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267，分类学命名为Latilactobacillus sakei，已于2022年04月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62426，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1：清酒乳杆菌CCFM1267菌落形态图。
图2：不同组别小鼠结肠长度。
图3：不同组别小鼠体重变化。
图4：不同组别小鼠DAI疾病活动指数变化。
图5：不同组别小鼠结肠H&E染色。
图6：不同组别小鼠结肠组织中紧密连接蛋白含量；其中：A为不同组别小鼠结肠组织中Occludin的含量；B为不同组别小鼠结肠组织中Claudin-1的含量；C为不同组别小鼠结肠组织中ZO-1的含量；D为不同组别小鼠结肠组织中Claudin-3的含量。
图7：不同组别小鼠结肠组织中细胞因子含量；其中：A为不同组别小鼠结肠组织中TNF-α的含量；B为不同组别小鼠结肠组织中IL-17的含量；C为不同组别小鼠结肠组织中IL-6的含量；D为不同组别小鼠结肠组织中IL-1β的含量。
图8：不同组别小鼠粪便中短链脂肪酸含量；其中：A为不同组别小鼠粪便中总短链脂肪酸含量；B为不同组别小鼠粪便中乙酸含量；C为不同组别小鼠粪便中丙酸含量；D为不同组别小鼠粪便中异丁酸含量；E为不同组别小鼠粪便中丁酸含量；F为不同组别小鼠粪便中戊酸含量。
图9：不同组别小鼠肠道菌群多样性，其中：A为不同组别小鼠肠道菌群α多样性；B为不同组别小鼠肠道菌群β多样性。
图10：不同组别小鼠肠道菌群门水平堆积图。
图11：不同组别小鼠肠道菌群差异属相对丰度图，其中：A为不同组别小鼠肠道菌群Lactobacillus相对丰度；B为不同组别小鼠肠道菌群Oscillibacter相对丰度。
具体实施方式
本发明现提供以下术语和方法的解释，以更好地阐述本发明并引导所属领域技术人员实践本发明。
本文中所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的含义为“包含但不限于”、“包括但不限于”、“具有但不限于”、“含有但不限于”，并且可与相应的短语进行互换使用。
除非上下文另有明确说明，否则本文中所用术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。
除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。
技术术语的定义：
本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。
本文所用术语“平板”是指平板培养基，是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为培养平板，或平板。
本文所用术语“培养基”是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源。
本文所用术语“培养”是指对所述微生物持续一段时期的培养直到达到一种希望的目标为止。
本文所用术语“缓解结肠炎”是指预防以及降低结肠炎的频率和/或发生率和/或严重程度和/或缩短其持续时间；发生率是指任何肠炎的数量；频率是指相同肠炎的数量；
此预防涵盖降低该肠炎在以后生活中的频率和/或严重程度。
本文所用术语“发酵液”是指液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后，微生物利用培养基中的营养成分，合成菌体及分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液。
本文所用术语“菌株提取物”是指通过假长双歧杆菌乳杆菌菌株的发酵获得提取物，将其接种至合适的培养基中，在常规发酵条件下进行发酵，以合成和向培养基中分泌所述产物，并之后纯化。
本文所用术语“菌株的裂解物”是指将培养后的假长双歧杆菌乳杆菌接种至菌体裂解液中，在常规的条件下裂解后，离心、纯化后得到菌株的裂解物。
下述实施例中涉及的胰蛋白胨、酵母粉等化学品购自国药集团；下述实施例中涉及的小鼠为6-8周龄的雄性SPF(Specific pathogen free，无特定病原体)级C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；下述实施例中涉及的ELISA试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；下述实施例中涉及的葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MP Biomedicals公司；下述实施例中涉及的Fast DNA Spin Kit for Feces试剂盒购自MP Biomedicals公司；下述实施例中涉及的检测细胞因子的ELISA试剂盒购自Sigma-Aldrich公司；下述实施例中涉及的多聚甲醛购自武汉塞维尔生物科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LBS固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、K2PO4·3H2O 6g/L、柠檬酸铵2g/L、无水乙酸钠17g/L、MgSO4·7H2O 1.18g/L、MnSO4·H2O 0.134g/L、FeSO4·H2O 0.036g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L。
LBS液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、K2PO4·3H2O 6g/L、柠檬酸铵2g/L、无水乙酸钠17g/L、MgSO4·7H2O 1.18g/L、MnSO4·H2O 0.134g/L、FeSO4·H2O 0.036g/L、吐温80 1mL/L。
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L。
下述实施例中涉及的清酒乳杆菌菌悬液的制备方法如下：
将清酒乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到清酒乳杆菌菌体；将清酒乳杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于浓度为200g/L的甘油溶液中至菌浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)的检测方法：
DAI评分参照Murthy的评分系统，包括体重变化，便血情况和大便性状三个方面(具体评分标准如表1所示)。造模期间，每天测量小鼠体重，检测小鼠便血情况和大便性状，根据表1进行评分。
表1：疾病活动指数评分标准
体重下降(％) 大便稠度 便血 分数
0 正常 无血便 0
1～5 大便稀溏 无血便 1
6～10 水样腹泻 有出血但是不多 2
11～15 黏糊糊的腹泻，少量血 有出血但是不多 3
＞15 带血的严重水样泻 大出血 4
结肠长度的检测方法：
小鼠处死后，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量长度，并对结肠外观进行观察。
体重变化测定方法：
在实验过程中每天记录小鼠体重，并以造模前一天小鼠体重为基线，观察小鼠体重变化情况。
结肠组织病理学特征的检测方法：
取1cm远端结肠(距肛门1cm)于4％多聚甲醛溶液中4℃下浸泡24h后，送至武汉塞维尔生物科技有限公司完成结肠组织H&E染色并制备切片，用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描制作好的H&E结肠切片，进行拍照，观察结肠炎小鼠结肠病理损伤情况。
实施例1：清酒乳杆菌CCFM1267的筛选、菌种鉴定及培养
1、筛选
以来源于四川省的发酵泡菜水为样本，将样本经预处理后，在30％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.2mL样本加到5mL LBS培养基中富集8h，将富集液用0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在LBS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1267。
2、鉴定
提取所筛选清酒乳杆菌CCFM1267的基因组，将其16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，与乳杆菌属的同源度为：98.17％；结果显示菌株均为清酒乳杆菌，命名为清酒乳杆菌CCFM1267。
按照上述方法，同时筛选得到一株清酒乳杆菌，命名为清酒乳杆菌QJSNT1L10。
3、培养
将清酒乳杆菌CCFM1267接入MRS固体培养基上于37℃培养48h后，观察其菌落。图1为清酒乳杆菌CCFM1267在MRS平板固体培养基上培养48小时后的菌落形态，发现其菌落呈乳白色，半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
实施例2：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠疾病活动指数、结肠长度、体重变化及结肠组织的影响
具体步骤如下：
取6～8周龄健康雌性C57小鼠32只，随机分为4组，每组8只，4组分别为：空白对照组、造模组和灌胃清酒乳杆菌CCFM1267菌悬液的CCFM1267干预组、灌胃清酒乳杆菌QJSNT1L10菌悬液的QJSNT1L10干预组。
其中，空白组和造模组每只老鼠按照0.2mL的剂量每天灌胃一次生理盐水，其余各组每只老鼠按0.2mL的剂量灌胃1×109CFU/mL的菌悬液。
实验过程中，空白组给予正常饮水，其余各组给予2.5％的DSS饮水。
实验结束后，对每只小鼠进行异氟烷麻醉并处死。具体实验流程如表2。
表2：实验流程
分别检测每组小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)、结肠长度、体重变化、结肠组织病理学特征，结果如图2～5所示。
结果显示：由图2可知，空白组小鼠结肠长度为5.87cm，DSS造模后小鼠结肠长度缩短至4.56cm。清酒乳杆菌CCFM1267干预后，小鼠结肠长度恢复至5.40cm；而清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后对小鼠结肠长度无明显影响，结肠长度为4.48cm。
由图3可知，与空白组相比，造模组小鼠体重明显下降，造模期间体重降低14％。清酒乳杆菌CCFM1267干预后减轻了小鼠体重的下降程度，体重降低10.4％左右。而清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后对小鼠体重降低无明显影响。
由图4可知，从造模第四天开始，造模组小鼠的疾病活动指数开始增加，到第七天达到最大值，为3.05。清酒乳杆菌CCFM1267和清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后均能够有效降低结肠炎小鼠的疾病活动指数。
由图5结肠病理切片图显示，DSS造模后，结肠组织大面积粘膜层坏死，固有层中肠腺坏死消失，并伴有中性粒细胞浸润；黏膜下层小面积水肿，结缔组织排列疏松并伴有炎性细胞浸润。而清酒乳杆菌CCFM1267干预组的结肠组织结构与空白组相似，结肠各层组织结构清晰，粘膜层表面光滑；固有层中肠腺丰富，排列紧密；粘膜下层结缔组织紧密。且相较于清酒乳杆菌QJSNT1L10干预组，清酒乳杆菌CCFM1267最大程度的保护了DSS造成的结肠损伤。
上述结果表明，清酒乳杆菌CCFM1267能够有效缓解DSS造成的结肠损伤，减少体重变化，恢复结肠长度。
实施例3：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠结肠紧密连接蛋白表达的影响
各组小鼠的处理方式同实施例2。
实验结束后，将各组小鼠处死后，取出结肠组织，利用高通量破碎仪破碎结肠组织得到匀浆，然后12000g、4℃离心15min，收集上清，得到结肠组织上清液。使用BCA试剂盒测定上清液的总蛋白含量后，利用森贝伽的ELISA试剂盒，测定结肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1和Claudin-3的含量，结果如图6所示。
(1)由图6A和6B可知，空白组小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1的含量分别为：3.85pg/mg和5.07pg/mg；清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后，小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1的含量分别为：3.19pg/mg和3.95pg/mg；
而清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够显著上调结肠炎小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1的含量，将结肠组织中Occludin的含量从3.39pg/mg(造模组)上调至5.55pg/mg，Claudin-1的含量从4.48pg/mg(造模组)上调至7.79pg/mg。
(2)由图6C和6D可知，空白组小鼠结肠组织中ZO-1和Claudin-3的含量分别为：3.41pg/mg和3.18pg/mg；清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后，小鼠结肠组织中ZO-1和Claudin-3的含量分别为：2.98pg/mg和2.28pg/mg；可见，清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后对上述四类紧密连接蛋白的含量未显示出上调趋势。
而清酒乳杆菌CCFM1267干预后对结肠炎小鼠结肠组织中ZO-1和Claudin-3的含量显示出上调趋势，将结肠组织中ZO-1的含量从3.16pg/mg(造模组)上调至4.13pg/mg，Claudin-3的含量从2.88pg/mg(造模组)上调至3.96pg/mg，但是与造模组相比，在统计学上无显著性差异。
实施例4：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠结肠细胞因子表达水平的影响
各组小鼠的处理方式同实施例2。
实验结束后，将各组小鼠处死后，取出结肠组织，利用高通量破碎仪破碎结肠组织得到匀浆，然后12000g、4℃离心15min，收集上清，得到结肠组织上清液。使用BCA试剂盒测定上清液的总蛋白含量后，按照结肠组织生化指标测定方法检测结肠组织上清液中细胞因子TNF-ɑ、IL-6、IL-17、IL-1β的含量；结果如图7A～7D所示。
DSS造模后，小鼠结肠组织中TNF-ɑ、IL-17、IL-6、IL-1β四类促炎细胞因子的含量较空白组小鼠均显著上调，分别为67.22pg/mg、195.63pg/mg、267.64pg/mg和284.64pg/mg。
清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够显著下调上述四类促炎细胞因子的含量，将结肠炎小鼠结肠组织中的TNF-ɑ含量降低至23.62pg/mg；IL-17含量降低至45.504pg/mg；IL-6含量降低至115.75pg/mg；IL-1β含量降低至205.728pg/mg。
而清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后仅能够显著下调结肠炎小鼠结肠组织中IL-17的含量，对其余三类促炎细胞因子，虽然有下调趋势，但与造模组相比，在统计学上无显著性差异。
实施例5：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠短链脂肪酸含量的影响
具体步骤如下：
各组小鼠的处理方式同实施例2。区别在于，在第14天收集各组小鼠的盲肠内容物。
实验结束后，对每只小鼠进行异氟烷麻醉并处死。
将收集得到的小鼠粪便置于液氮中，后转移至80℃箱，在进行短链脂肪酸含量的检测前取出，进行真空冷冻干燥，准确称取0.05g冻干后的粪便样品溶解于0.5mL饱和氯化钠溶液中，浸泡30min，组织匀浆机匀浆，加入0.02mL浓度为10％的硫酸，震荡30s，在通风橱内向粪便溶液中准确加入0.8mL乙醚溶液，震荡30s后离心15min(8000g、4℃)，移取上清液至含有0.3g无水硫酸钠的离心管中，震荡均匀，离心15min(8000g、4℃)，取上清至气质容量瓶中，通过GC MS检测短链脂肪酸含量，检测结果见图8A～8F及表3所示。
表3：不同组别的短链脂肪酸的含量(μmol/g)
空白组 造模组 CCFM1267 QJSNT1L10
总短链脂肪酸含量 502.28 308.61 605.56 515.94
乙酸含量 198.13 175.52 357.87 323.65
丙酸含量 102.08 63.37 140.57 99.48
异丁酸含量 10.94 10.29 13.37 12.53
丁酸含量 166.12 43.10 73.09 61.88
戊酸含量 18.71 8.10 11.07 9.20
结果显示，与空白组相比，DSS造模后结肠炎小鼠粪便内乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸及总短链脂肪酸含量降低。
而清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够显著上调乙酸、丙酸和总短链脂肪酸的含量，将粪便内乙酸含量从175.52μmol/g(造模组)上调至357.85μmol/g；丙酸含量从63.37μmol/g(造模组)上调至140.57μmol/g；总短链脂肪酸含量从308.60μmol/g(造模组)上调至605.55μmol/g。此外，清酒乳杆菌CCFM1267干预后还能够上调粪便内异丁酸、丁酸和戊酸的含量，但与造模组相比，在统计学上无显著性差异。而清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后仅能够显著上调粪便中乙酸的含量，对丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸及总短链脂肪酸含量无显著影响。
实施例6：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠肠道菌群多样性的影响
具体步骤如下：
各组小鼠的处理方式同实施例2，实验结束后，对每只小鼠进行异氟烷麻醉并处死。
采用Fast DNA Spin Kit for Feces试剂盒提取每组小鼠粪便细菌宏基因组后，对16s V3 V4区序列进行PCR扩增后，通过二代测序仪粪便样品中肠道菌群多样性。结果如图9所示。
由图9A可知，清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后显著降低了结肠炎小鼠肠道菌群α多样性，而清酒乳杆菌CCFM1267干预后对结肠炎小鼠肠道菌群α多样性无明显影响。
由图9B可知，清酒乳杆菌CCFM1267干预组与造模组存在离散，这表明清酒乳杆菌CCFM1267干预组与造模组肠道菌群结构存在差异。
实施例7：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠肠道菌群组成的影响
具体步骤如下：
各组小鼠的处理方式同实施例2，区别在于，在第14天收集各组小鼠的粪便。实验结束后，对每只小鼠进行异氟烷麻醉并处死。
采用Fast DNA Spin Kit for Feces试剂盒提取每组小鼠粪便细菌宏基因组后，对16s V3 V4区序列进行PCR扩增后，所涉及的引物如表4所示：
表4：引物序列
引物 序列
341F CCTAYGGGRBGCASCAG
806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
通过二代测序仪粪便样品中肠道菌群组成，结果如图10和图11所示。
结果显示，由图10可知，清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够增加结肠炎小鼠肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度，降低拟杆菌门和变形菌门的相对丰度。而与造模组相比，清酒乳杆菌QJSNT1L10上调了变形菌门的相对丰度。
由图11A～B可知，清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够显著上调小鼠肠道菌群中有益菌属乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度，下调结肠炎相关菌属颤杆菌克属(Oscillibacter)的相对丰度。这表明，清酒乳杆菌CCFM1267干预后能够有效改善结肠炎小鼠肠道菌群结构。
实施例8：清酒乳杆菌CCFM1267对结肠炎小鼠血液中吲哚-3-乙酸含量的影响
具体步骤如下：
各组小鼠的处理方式同实施例2，区别在于，于第14天采血。实验结束后，对每只小鼠进行异氟烷麻醉并处死，检测吲哚-3-乙酸含量，方法如下：
移取100μL血清样本于1.5mL离心管中，加入提前-20℃预冷的400μL甲醇(或甲醇：乙腈＝1:1)沉淀蛋白，涡旋30s后将样本放置于-20℃冰箱中孵育1h。孵育结束后在4℃下，15000rpm高速离心15min；取上清液用旋转蒸发仪蒸发至干。使用200μL甲醇：水(4:1,v/v)复溶后涡旋30s，4℃下，15000rpm高速离心15min，取上清过0.22μm滤膜，移取上清液适当体积装入进样小瓶，进行HPLC分析。使用Compound Discoverer初步筛选并导出样品代谢物结果。整合阳离子及阴离子模式下代谢物的峰面积，归一化后通过SIMCA 14.1计算代谢物的VIP值。
表5：结肠炎小鼠血清中吲哚-3-乙酸含量
组别 吲哚-3-乙酸峰面积
空白组 3103759.492
造模组 1908994.002
CCFM1267 2056107.876
QJSNT1L10 1779784.688
由表5可知，造模组小鼠血清中吲哚-3-乙酸的峰面积从3103759.492(空白组)降至1908994.002；
清酒乳杆菌QJSNT1L10干预后结肠炎小鼠血清中吲哚-3-乙酸峰面积降至1779784.688，低于造模组水平。
而清酒乳杆菌CCFM1267干预后，能够将小鼠血清中吲哚-3-乙酸峰面积上调至2056107.876，高于造模组水平。
由此可以发现，相较于清酒乳杆菌QJSNT1L10，清酒乳杆菌CCFM1267能够更好的上调小鼠血清中吲哚-3-乙酸含量。
实施例9：清酒乳杆菌CCFM1267代谢产物分析
具体步骤如下：
(1)将清酒乳杆菌CCFM1267在MRS液体培养基中培养18h后，制备得到培养液，将制备得到的培养液在4℃下10000g离心5min，收集上清液。
(2)取100μL上清液于1.5mL离心管中，加入400μL提前-20℃预冷的沉淀液(甲醇：乙腈＝(1:1，v/v))进行沉淀蛋白。将上述离心管置于涡旋30s后冰浴超声10min后，并将装有上清液样本的离心管于-20℃冰箱孵育1h，二次沉淀蛋白。孵育结束后后4℃下，15000rpm高速离心15min，取上清液用旋转蒸发仪蒸发至干。
(3)向步骤(2)得到的蛋白样品中加入200μL甲醇：水(4:1)对样本进行复溶。并在4℃下，15000rpm高速离心15min，取上清过0.22μm滤膜，将提取得到的样品转入进样瓶，进行HPLC分析。使用Compound Discoverer初步筛选并导出样品代谢物结果。整合阳离子及阴离子模式下代谢物的峰面积，归一化后通过SIMCA 14.1计算代谢物的VIP值。以VIP>1，FC>2或<0.5，P<0.05为筛选条件筛选清酒乳杆菌CCFM1267和清酒乳杆菌QJSNT1L10之间的显著差异代谢物。结果如表6所示。
表6：清酒乳杆菌CCFM1267与清酒乳杆菌QJSNT1L10的显著差异代谢物
差异代谢物 FC值 P值
D-(+)-Tryptophan 0.071866 0.010272
Cytosine 0.10657 0.00072996
4-Hydroxybutyric acid(GHB) 0.11011 0.00066448
Pantothenic acid 0.29701 0.0015686
Xanthine 0.36977 0.012159
Cytidine 0.41667 0.043338
3-Aminophenol 2.4616 0.039459
5'-S-Methyl-5'-thioadenosine 2.5757 0.010239
Crotonic acid 2.8615 0.0056499
Indole-3-acetic acid 2.8703 0.033046
6-Methylquinoline 3.2949 0.046418
Palmitoyl carnitine 5.142 0.021209
Acetylcholine 8.4266 0.00000652
NP-019722 37.401 0.0000072754
注：FC>1代表清酒乳杆菌JXJ41高于清酒乳杆菌QJSNT1L10，FC<1则反之。
由表6可以发现，清酒乳杆菌CCFM1267和清酒乳杆菌QJSNT1L10共存在14种显著差异代谢物。其中，清酒乳杆菌CCFM1267能够代谢产生更多的吲哚-3-乙酸(Indole-3-aceticacid)。
上述结果表明，清酒乳杆菌CCFM1267代谢产生的吲哚-3-乙酸可能是维持肠道健康的关键物质。
实施例10：清酒乳杆菌CCFM1267的应用
清酒乳杆菌CCFM1267可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
清酒乳杆菌CCFM1267划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到清酒乳杆菌CCFM1267菌粉；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基；
保护剂的成分包含：130g/L脱脂奶粉。
实施例11：清酒乳杆菌CCFM1267的应用
清酒乳杆菌CCFM1267可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下
清酒乳杆菌CCFM1267划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经6000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂重悬至浓度1×1010CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得清酒乳杆菌CCFM1267的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品；
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6.8，得到培养基。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株能够降低肠道促炎细胞因子的清酒乳杆菌及其应用
<130> GBAA220677B
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (992)..(992)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1002)..(1003)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1005)..(1012)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1014)..(1014)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1016)..(1018)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1024)..(1028)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1030)..(1030)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1033)..(1036)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1038)..(1049)
<223> n is a, c, g, or t
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<222> (1051)..(1051)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1053)..(1053)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1055)..(1055)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1057)..(1060)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1062)..(1063)
<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
<222> (1065)..(1066)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1068)..(1068)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1070)..(1083)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1085)..(1089)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
nnnnnnnnnn nnncnanacn tgcagtcgaa cgcactctcg tttagattga aggagcttgc 60
tcctgattga taaacatttg agtgagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 120
cctaaagtgg gggataacat ttggaaacag atgctaatac cgcataaaac ctaacaccgc 180
atggtgtagg gttgaaagat ggtttcggct atcactttag gatggacccg cggtgcatta 240
gttagttggt gaggtaaagg ctcaccaaga ccgtgatgca tagccgacct gagagggtaa 300
tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 360
ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat 420
cgtaaaactc tgttgttgga gaagaatgta tctgatagta actgatcagg tagtgacggt 480
atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 540
agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 600
aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag 660
gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtanata tatggaagaa caccagtggc 720
gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcaaacagg 780
attacatacc ctggtagtcc atgcngtana cgatgagtgc tangtgttgg anggtnttcc 840
gcccntcagt gccgccnctn acgcattaga cactccgcct gntgagtacn accgcaangn 900
tgannctcnn aacgaattga cgngnnncng cacaannngc ngnnnnctgt gntatnnttc 960
ncannaactg caancnnntn cccangtcnt gncaatcttt gnntnnnnnn nnanannnag 1020
cttnnnnncn gtnnnnannn nnnnnnnnng ncnangnnnn cnncnncncn nnnnnnnnnn 1080
nnntnnnnn 1089

Claims (7)

1.一株清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei)CCFM1267，其特征在于，所述清酒乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62426，保藏日期为2022年04月26日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，含有权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1267，或含有清酒乳杆菌CCFM1267的发酵液，或含有清酒乳杆菌CCFM1267的冻干粉，或含有清酒乳杆菌CCFM1267灭活的菌体，或含有清酒乳杆菌CCFM1267的裂解物，或含有清酒乳杆菌CCFM1267提取物。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，清酒乳杆菌CCFM1267的含量不低于5×109CFU/mL或5×109CFU/g。
4.一种预防和/或治疗结肠炎的药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1267或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
5.权利要求1所述的清酒乳杆菌CCFM1267，或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备预防和/或治疗结肠炎的产品中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、饲料或饲料添加剂。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述产品中，清酒乳杆菌CCFM1267的含量不低于5×109CFU/mL或5×109CFU/g。
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