CN115029271B - 一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其应用，属于功能微生物技术领域。本发明所述唾液乳杆菌CCFM1266已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62418，该菌株具有降低饮酒后个体血清谷氨酰转肽酶活性和血清甘油三酯含量的功效；且该菌株可降低饮酒后个体肝组织白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达、改善饮酒导致的肝组织炎症浸润情况及肝脏髓过氧化物酶的异常表达；可调节饮酒后小鼠粪便内与谷氨酰转肽酶活性呈负相关的Parasutterella属的肠道微生物的丰度回到正常水平；增加结肠屏障蛋白MUC2的表达，降低结肠白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。

Description

一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其 应用
技术领域
本发明涉及一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其应用，属于功能微生物技术领域。
背景技术
酒精摄入会诱导细胞色素P450单加氧酶CYP2E1的表达，CYP2E1氧化酒精产生大量活性氧(ROS)，活性氧(ROS)可引起肝脏细胞氧化应激，导致肝细胞损伤，并进一步导致机体脂质代谢紊乱，引起宿主血清谷氨酰转肽酶活性的升高。近年来，大量的研究表明肠道菌群参与到了对血清谷氨酰转肽酶活性的调控中，肠道炎症和肠道屏障的损伤都会进一步加剧肠道菌群的失调。其中，粪便Parasutterella属的相对丰度被证明与血清谷氨酰转肽酶活性呈现负相关。而血清谷氨酰转肽酶活性的升高可加速脂肪肝的产生，因此，针对血清谷氨酰转肽酶活性的调控可以有效的防治酒精性肝病。
目前，主要通过药物手段对血清谷氨酰转肽酶活性进行调节。如公开号分别为CN113876789A、CN113855691A和CN107569481A三项专利所公开的可有效抑制血清谷氨酰转肽酶活性的合成药物Licraside、Apiosylskimmin及中药提纯物五味子单体化合物，但上述药物主要应用于治疗胆汁淤积性肝病，未见其应用于酒精摄入后的谷氨酰转肽酶活性的干预中。在另一项公开的专利中(公开号为CN1853508B)，发明人通过将多种益生菌、植物提取物及维生素进行复配后应用，改善了酒精摄入后的肝功能、降低血液酒精浓度并加强了抗氧化能力、降低了血清谷氨酰转肽酶活性的活性。
上述的专利及此前研究的表明，植物乳杆菌种、发酵乳杆菌种、嗜酸乳杆菌种、短乳杆菌种、约氏乳杆菌种、唾液乳杆菌种及两歧双歧杆菌种和长双歧杆菌种或其代谢物对酒精摄入所引起的血清谷氨酰转肽酶活性的升高具有调节作用。而唾液乳杆菌作为一类具有广泛益生功能的菌种，因此，可考虑从唾液乳杆菌种中筛选具有调节饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的益生菌菌株。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266，已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62418，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266来自于来自新疆昌吉回族自治州健康人的新鲜粪便，对菌株的16S rDNA序列进行扩增和测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为唾液乳杆菌，命名为唾液乳杆菌CCFM1266。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266具有下述生物学特征：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，短杆状，两端呈圆形，无鞭毛，无芽孢；
(2)菌落特征：培养48h形成明显凸起菌落，边缘光滑，乳白色，半透明，表面湿润光滑，不产生色素；
(3)生长特性：在37℃恒温恒湿的条件下，在MRS培养基中培养约16h达到稳定期；
(4)对C57BL/6N小鼠无毒副作用。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性、降低血清甘油三酯含量、缓解肝组织的炎症与氧化应激水平、缓解结肠组织的炎症水平、修复结肠屏障损伤、调节肠道菌群，具体体现在：
(1)降低饮酒后个体血清谷氨酰转肽酶(GGT)的活性；
(2)降低饮酒后个体血清甘油三酯(TG)的含量；
(3)降低饮酒后个体肝组织白细胞介素6(IL-6)的表达；
(4)降低饮酒后个体肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达；
(5)显著改善饮酒导致的肝组织炎症浸润情况；
(6)显著改善饮酒导致的肝脏髓过氧化物酶(MPO)的异常表达；
(7)降低饮酒后个体结肠组织白细胞介素6(IL-6)的表达；
(8)降低饮酒后个体结肠组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达；
(9)显著改善饮酒后个体结肠组织屏障蛋白MUC2的表达；
(10)调节饮酒后小鼠粪便内与血清谷氨酰转肽酶(GGT)活性呈负相关的肠道微生物Parasutterella属的相对丰度回到正常水平。
本发明的第二个目的是提供一种产品，所述产品中含有上述唾液乳杆菌CCFM1266或其发酵液，或唾液乳杆菌CCFM1266的裂解物，或唾液乳杆菌CCFM1266的提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括固态食品、半固态食品、液态食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述唾液乳杆菌CCFM1266的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有所述唾液乳杆菌CCFM1266的饮料或零食。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，唾液乳杆菌CCFM1266的含量至少为1×106CFU/g或1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述保健品含有上述唾液乳杆菌CCFM1266、载体和/或辅料。
本发明的第三个目的是提供一种用于治疗酒精性肝病的药品，所述药品中含有上述唾液乳杆菌CCFM1266。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述唾液乳杆菌CCFM1266、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的第四个目的是提供了一种含有所述唾液乳杆菌CCFM1266的微生物制剂，所述微生物菌剂中，含有上述唾液乳杆菌CCFM1266，或含有唾液乳杆菌CCFM1266的发酵液，或含有唾液乳杆菌CCFM1266的冻干粉，或含有唾液乳杆菌CCFM1266灭活的菌体，或含有唾液乳杆菌CCFM1266的裂解物，或含有所述唾液乳杆菌CCFM1266提取物。
本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，唾液乳杆菌CCFM1266的含量至少为：1×109CFU/g或1×109CFU/mL。
在发明的一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法为：将唾液乳杆菌CCFM1266接种到MRS培养基中，37℃恒温恒湿条件下培养16～18h，收集菌体，用保护剂重悬菌体细胞，使菌浓度达到1010CFU/ml，然后悬浮液在37℃恒温恒湿条件下培养50～70min，干燥。
在发明的一种实施方式中，每升所述MRS培养基含有：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、吐温801mL、一水合硫酸锰0.25g。
在发明的一种实施方式中，所述保护剂含有脱脂奶粉、麦芽糊精、海藻糖。
在发明的一种实施方式中，所述保护剂含有：100g/L～150g/L脱脂奶粉、100g/L～150g/L麦芽糊精、140g/L～160g/L海藻糖。
在发明的一种实施方式中，MRS培养基培养后收集的菌体采用生理盐水清洗2～4次，所述生理盐水pH为6.8～7.2。
在发明的一种实施方式中，所述干燥可以采用任意一种菌液干燥工艺进行干燥，包括但不限于真空冷冻干燥。
在发明的一种实施方式中，所述真空冷冻干燥是在-15～-20℃预冻8～14h后进行真空冷冻干燥。
本发明的第五个目的是提供了上述唾液乳杆菌CCFM1266或上述产品或上述微生物菌剂在制备降低饮酒后血清谷氨酰转肽酶或缓解酒精性肝病的药物中的应用。
在发明的一种实施方式中，所述药物具有如下至少一种功能：
(1)降低饮酒后个体血清谷氨酰转肽酶(GGT)的活性；
(2)调节饮酒后肠道菌群失调，恢复粪便Parasutterella属的肠道微生物的含量；
(3)缓解肝组织炎症和氧化应激水平。
在发明的一种实施方式中，所述唾液乳杆菌CCFM1266在药物中的含量≥1×108CFU/g或1×108CFU/mL。
在发明的一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
在发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的第六个目的是提供了上述唾液乳杆菌CCFM1266在制备食品或保健品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为发酵食品，所述发酵食品为使用唾液乳杆菌CCFM1266发酵生产制得的，包括固态食品、液态食品、半固态食品。
在发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品；所述乳制品包括牛奶、酸奶油或奶酪；所述果蔬制品的原料包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。
本发明的第七个目的是提供了上述唾液乳杆菌CCFM1266在制备干预或改善机体脂代谢紊乱、肝细胞损伤、结肠炎症水平、结肠屏障稳态和调节肠道菌群的功能性食品或保健品中的应用。
有益效果
(1)本发明所述唾液乳杆菌CCFM1266具有降低饮酒后个体血清谷氨酰转肽酶活性和血清甘油三酯含量的功效；伴随地，可降低饮酒后个体肝组织白细胞介素6的表达、降低饮酒后个体肝组织肿瘤坏死因子α的表达、显著改善饮酒导致的肝组织炎症浸润情况，显著改善饮酒导致的肝脏髓过氧化物酶的异常表达；可调节饮酒后小鼠粪便内与谷氨酰转肽酶活性呈负相关的Parasutterella属的肠道微生物的丰度回到正常水平；并且可以增加结肠屏障蛋白MUC2的表达，降低结肠白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。由于针对血清谷氨酰转肽酶活性的调控可以有效的防治酒精性肝病，因此，本发明的唾液乳杆菌CCFM1266可以有效的防治酒精性肝病。
(2)本发明所述的唾液乳杆菌CCFM1266可用于降低饮酒后谷氨酰转肽酶活性，维持血清脂代谢稳态，调节肠道菌属相对丰度，缓解肝脏及结肠炎症与氧化应激水平，增强结肠屏障的保健食品或药物，具有非常广泛的应用前景。
(3)唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的有效成分唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266的产品在治疗过程中不会导致患者产生不良反应。
生物材料保藏
一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM1266，分类命名为：Lactobacillus salivarius，已于2022年05月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62418，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1：唾液乳杆菌CCFM1266菌落形态图。
图2：唾液乳杆菌CCFM1266对饮酒后小鼠肝组织炎症浸润水平的影响。
具体实施方式
本发明现提供以下术语和方法的解释，以更好地阐述本发明并引导所属领域技术人员实践本发明。
本文中所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的含义为“包含但不限于”、“包括但不限于”、“具有但不限于”、“含有但不限于”，并且可与相应的短语进行互换使用。
除非上下文另有明确说明，否则本文中所用术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。
除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。
技术术语的定义：
本文所用术语“菌株”是指具有共同特征的一种特定物种的微生物。除非指示相反含义，否则术语“菌株”与“细胞”在本文中可互换使用。
本文所用术语“平板”是指平板培养基，是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为培养平板，或平板。
本文所用术语“培养基”是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源。
本文所用术语“培养”是指对所述微生物持续一段时期的培养直到达到一种希望的目标为止。
本文所用术语“下调饮酒后”是指改善慢性饮酒造成的伤害；
本文所用术语“发酵液”是指液体培养基接入微生物菌种，经过一段时间培养后，微生物利用培养基中的营养成分，合成菌体及分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液。
本文所用术语“菌株提取物”是指通过唾液乳杆菌菌株的发酵获得提取物，将其接种至合适的培养基中，在常规发酵条件下进行发酵，以合成和向培养基中分泌所述产物，并之后纯化。
本文所用术语“菌株的裂解物”是指将培养后的唾液乳杆菌接种至菌体裂解液中，在常规的条件下裂解后，离心、纯化后得到菌株的裂解物。
下述实施例中涉及C57BL/6N小鼠采购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
下述实施例中所涉及的罗伊氏乳杆菌FCQHC8L6记载于郑雨星毕业论文《鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌对DSS诱导的小鼠结肠炎的缓解作用及机制分析》，2020年。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、吐温80 1mL、一水合硫酸锰0.25g。
MRS固体培养基(g/L)：在1L的MRS液体培养基添加20g琼脂。
下述实施例中涉及的乳杆菌菌悬液的制备方法如下：
将乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液。将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液。菌液经过离心(6000×g，4℃，3min)除去培养液，采用生理盐水清洗3～5次，重悬于无菌生理盐水中，控制最终菌悬液浓度为1×109CFU/mL。
下述实施例中涉及的引物信息及退火温度如表1所示：
表1：实验所用引物及其退火温度
实施例1：唾液乳杆菌CCFM1266的筛选和鉴定
1、乳酸菌的分离筛选
(1)取1g来自新疆昌吉回族自治州健康人的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于唾液乳杆菌高度选择固体培养基(每1L MRS培养基中含有0.02g万古霉素、0.256g链霉素、20g琼脂，pH值为5.0±0.1)平板，置于37℃培养48～72h；
(2)观察记录菌落形态，如图1所示，挑取菌落划线纯化；
(3)在MRS液体培养基中，37℃培养24h，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态；
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌；
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
2、唾液乳杆菌的分子生物学鉴定
(1)单菌基因组提取(按照TIANamp Bacteria DNA kit操作步骤进行)
A.将步骤1所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取菌悬液1mL于1.5mL离心管，11500×g离心1min，尽量吸净上清；
B.向菌体沉淀中加入180μL缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton；终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性)，37℃处理30min以上；
C.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；
D.加入220μL缓冲液GB，振荡15min，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
E.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15min，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
F.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，13400×g离心30min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
G.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13400×g离心30min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
H.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13400×g离心30min，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；重复操作一次；
I.将吸附柱CB3放回收集管中，13400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
J.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，13400×g离心2min，将溶液收集到离心管中。
对菌株的16S rDNA序列进行扩增和测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为唾液乳杆菌，命名为唾液乳杆菌CCFM1266。
实施例2：唾液乳杆菌CCFM1266对模拟胃肠液及乙醇的耐受性测定
(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌CCFM1266划线接种于MRS固体培养基中，在温度37℃恒温恒湿培养箱静置培养48h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液在37℃恒温恒湿条件下，进行传代培养2～3次后，制备得到培养液。
(2)取1mL唾液乳杆菌CCFM1266的培养液，与9.0mL pH 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH 2.5的MRS培养基)混合，并在37℃恒温恒湿条件下培养，分别在0h和12h时取样，测定体系在600nm处的吸光度，并计算其生长率。生长率是在该培养液中取样时的吸光度与在第0h时吸光度之比，以％表示。结果如表2所示，结果显示，唾液乳杆菌CCFM1266在模拟胃液中的平均生长率为：62.79％。
(3)取1mL唾液乳杆菌CCFM1266的培养液加入9.0mL pH 8.0人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH 8.0的MRS培养基)中，37℃恒温恒湿条件下培养，分别在0h和12h时取样，测定体系在600nm处的吸光度，并计算其生长率。生长率是在该培养液中取样时的吸光度与在第0h时吸光度之比，以％表示。结果如表2所示，结果显示，唾液乳杆菌CCFM1266在模拟肠液中的平均生长率为：8.22％。
(4)将活化三代后的菌株分别接种于乙醇浓度为0mM、1mM和5mM的MRS液体培养基中，在37℃恒温恒湿培养箱，于96孔板中进行静置培养，测定培养12h后体系600nm处的吸光度，并计算其在不同浓度乙醇体系中的生长率。生长率是在乙醇浓度为1mM和5mM的培养基中培养12h时体系的吸光度，与乙醇浓度为0mM的培养基中培养12h时体系的吸光度的比值，以％表示，结果如表2所示。
表2：唾液乳杆菌CCFM1266对模拟胃肠液及乙醇的耐受性
模拟胃液 模拟肠液 乙醇(1mM) 乙醇(5mM)
生长率(％) 62.79±7.00 8.22±2.26 99.31±1.72 101.26±2.86
结果显示，其在乙醇浓度为1mM和5mM时的平均生长率分别为：99.31％和101.26％，结果表明，唾液乳杆菌CCFM1266对乙醇具有较好的耐受性。
实施例3：唾液乳杆菌CCFM1266对C57BL/6N小鼠的毒副作用测定
按照前述乳杆菌菌悬液方法，将唾液乳杆菌CCFM1266菌体细胞重悬于无菌生理盐水中，制成浓度为1×109CFU/mL的菌悬液。
取体重20g左右的7周龄健康雄性C57BL/6N小鼠8只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次0.2mL，观察一周，记录小鼠死亡和体重变化情况，结果列于表3中。
表3：小鼠体重的变化及死亡情况
时间(天) 1 2 3 4 5 6 7
体重(g) 20.12±0.4 20.15±0.2 20.97±0.8 21.01±0.5 21.10±0.3 21.15±0.3 21.23±0.4
死亡情况 - - - - - - -
注：-表示小鼠无死亡。
结果显示，喂食浓度1×109CFU/mL的唾液乳杆菌CCFM1266菌悬液未对小鼠造成明显影响，小鼠体重无显著变化，小鼠外观无明显病理症状，无死亡现象产生。
实施例4：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠血清谷氨酰转肽酶活性和血清甘油三酯含量的影响
取体重19～20g的7周龄健康雄性C57BL/6N小鼠50只，适应环境1周，随机分为5组：空白对照组(空白组)、酒精实验组(酒精组)、麦芽糊精对照组(麦芽糊精组)(与酒精等热量)、唾液乳杆菌CCFM1266干预组(CCFM1266组)、罗伊氏乳杆菌FCQHC8L6干预对照组(FCQHC8L6组)，每组含小鼠10只。
为模拟人在非疾病状态下的慢性、社交性饮酒模式，于每日上午7:00～9:00之间，分别对空白组、麦芽糊精组、酒精组和两个干预组小鼠，进行0.2mL的无菌水、麦芽糊精和酒精灌胃造模。造模同时，于每日17:00～19:00之间(即酒精灌胃后10h，减小酒精残留对菌株的胁迫)，分别对空白组、麦芽糊精组、酒精组和两个干预组小鼠，进行0.2mL的无菌生理盐水和菌悬液灌胃干预。具体处理方式见表4所示。
将干预所用的唾液乳杆菌CCFM1266和罗伊氏乳杆菌FCQHC8L6按照实施例2中所述进行三代活化培养，将第三代培养后12h将菌液在8000×g，4℃条件下离心10min，弃去上清；利用无菌生理盐水洗涤菌泥2～4次，将所得的洗涤后的菌泥重悬于无菌生理盐水中，用于小鼠灌胃；灌胃菌悬液的浓度为1×109CFU/mL；实验动物分组及处理方法见表4。
表4：实验动物分组
组别 动物数(只) 处理方式(每天灌胃) 处理时长
空白组 10 0.2mL无菌水+0.2mL无菌生理盐水 14天
麦芽糊精组 10 0.2mL45％(w/v)麦芽糊精+0.2mL无菌生理盐水 14天
酒精组 10 0.2mL35％(v/v)乙醇+0.2mL无菌生理盐水 14天
FCQHC8L6组 10 0.2mL35％(v/v)乙醇+0.2mL FCQHC8L6菌悬液 14天
CCFM1266组 10 0.2mL35％(v/v)乙醇+0.2mL CCFM1266菌悬液 14天
试验期间定期监测小鼠体重。
于实验末期收集小鼠新鲜粪便，在液氮中淬灭酶促反应后，将其冻存于-80℃冰箱，用于后续粪便菌群分析。对小鼠采用异氟烷进行麻醉(异氟烷气体浓度2％，维持2min)，随即摘眼球取血，后脱颈处死。将血液样品收集于1.5mL的离心管中，室温下静置2h后，于4℃，3000×g离心15min，吸取上清分装于PCR管中，存放于-80℃冰箱待测定血清生化指标用；肝脏组织剔除脂肪与胆囊后，剪取肝左叶组织置于4％多聚甲醛中固定，常温避光保存，用于后续组织病理学切片制备，其余肝脏组织置于液氮速冻，后存放于-80℃冰箱用于测定组织基因表达情况。结肠组织剔除脂肪，用镊子刮取内容物后，将无内容物的结肠组织置于液氮中速冻，而后存放于-80℃冰箱用于测定组织基因表达情况。
于测定当日将血清样本置于4℃冰箱化冻，随后取70μL血清，按照1:3(v/v)用生理盐水进行稀释。稀释后样品用全自动生化分析仪测定血清谷氨酰转肽酶(GGT)的活性和血清甘油三酯(TG)的含量，最终结果由下机数据乘以稀释体积得到，小鼠血清GGT活性、甘油三酯(TG)含量的测定结果见表5所示。
表5：小鼠血清GGT活性和TG含量
注：ab字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
结果显示，酒精摄入后，小鼠血清中GGT活性显著提高，达到2.78U/L，而唾液乳杆菌CCFM1266的干预可以将血清GGT活性下调至1.74U/L，下调约37.4％；且干预效果显著优于对照组罗伊氏乳杆菌FCQHC8L6。
酒精摄入后，小鼠血清中TG含量显著提高，达到2.05U/L，而唾液乳杆菌CCFM1266的干预可以将血清GGT活性下调至0.91U/L，下调约55.6％；且干预效果显著优于对照组罗伊氏乳杆菌FCQHC8L6。
实施例5：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠肝组织白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达的影响
C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。称取实施例4中收集的小鼠肝脏组织0.5g于无酶1.5mL离心管中，按照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试剂说明书进行组织总RNA提取；所得RNA经过琼脂糖凝胶电泳验证完整性合格后，在超微量分光光度计ss RNA模式下测定其浓度，用DEPC水将产物RNA统一稀释至800ng/μL；以稀释后的RNA为模板，按照HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒说明书进行反转录；以反转录后的cDNA为模板，β-actin基因为内参，按照SYBR Green PCR染料说明书配制qPCR体系并设定反应程序，其中，目的基因退火温度按表1进行修改。实验所用引物序列见表1，引物委托上海生工实验室进行PAGE法合成。将下机数据按2-ΔΔCT法计算得到，其中ΔΔCT的计算方法如下：
ΔΔCT＝(CT(目的基因，实验组)-·CT(内参基因，实验组))-(CT(目的基因，空白组)-·CT(内参基因，空白组))
实验结果见表6所示。
表6：小鼠肝组织IL-6和TNF-α的相对表达量
空白组 麦芽糊精组 酒精组 CCFM1266组 FCQHC8L6组
IL-6 1.00±0.00ab 0.95±0.25b 1.47±0.40a 0.83±0.42b 1.18±0.43ab
TNF-α 1.00±0.00b 0.90±0.34b 2.06±0.55a 0.85±0.11b 1.26±0.52b
注：ab字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
结果显示，酒精摄入后，小鼠肝组织IL-6和TNF-α的相对表达水平显著提高，而唾液乳杆菌CCFM1266可显著下调两个炎症因子基因的相对表达水平，且唾液乳杆菌CCFM1266对肝组织IL-6相对表达水平的抑制作用优于干预对照组菌株FCQHC8L6。
实施例6：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠肝组织炎症浸润水平的影响
C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。将实施例4中固定后的肝脏经过石蜡包埋，再使用切片机将包埋块切成大约5μm左右厚度的切片。将切片先进行苏木精染色，再进行伊红染色。
使用数字切片扫描仪对染色后的切片进行扫片并拍照。使用CaseViewer 2.4扫描软件选取组织的目的区域进行200倍成像，成像完成后使用Image-Pro Plus分析软件对肝脏病理损伤进行统计分析。
实验结果如图2所示。酒精摄入后，小鼠肝脏出现局部炎症浸润病灶，而在唾液乳杆菌CCFM1266干预后，小鼠肝脏炎症浸润水平降低，未见明显的炎性病灶区域，恢复到与空白组一致水平。
实施例7：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠肝脏髓过氧化物酶基因表达的影响
C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。样本前处理及肝脏髓过氧化物酶(MPO)表达的测定方法同实施例5，其中，目的基因退火温度按表1进行修改。实验所用引物序列见表1，引物委托上海生工实验室进行PAGE法合成。将下机数据按2-ΔΔCT法计算得到，其中ΔΔCT的计算方法如下：
ΔΔCT＝(CT(目的基因，实验组)-·CT(内参基因，实验组))-(CT(目的基因，空白组)-·CT(内参基因，空白组))
实验结果见表7所示。
表7：小鼠肝组织MPO的相对表达量
空白组 麦芽糊精组 酒精组 CCFM1266 FCQHC8L6
MPO 1.00±0.00b 0.72±0.38b 2.07±0.58a 0.70±0.17b 0.93±0.60b
注：ab字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
结果显示，酒精摄入引起小鼠肝脏氧化应激反应，导致肝脏MPO的相对表达量显著提高，而唾液乳杆菌CCFM1266干预可有效地降低MPO的表达量，且效果优于对照组菌株的干预效果。
实施例8：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠结肠白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达的影响
C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。样本前处理及结肠白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的测定方法同实施例5，其中，目的基因退火温度按表1进行修改。实验所用引物序列见表1，引物委托上海生工实验室进行PAGE法合成。将下机数据按2-ΔΔCT法计算得到，其中ΔΔCT的计算方法如下：
ΔΔCT＝(CT(目的基因，实验组)-·CT(内参基因，实验组))-(CT(目的基因，空白组)-·CT(内参基因，空白组))
实验结果见表8所示。
表8：小鼠结肠IL-6和TNF-α的相对表达量
空白组 麦芽糊精组 酒精组 CCFM1266组 FCQHC8L6组
IL-6 1.00±0.00b 1.52±0.39ab 2.13±0.58a 0.87±0.20b 1.43±0.24ab
TNF-α 1.00±0.00b 0.86±0.14b 3.04±0.58a 1.10±0.06b 1.46±0.31b
注：ab字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
结果显示，酒精摄入后，小鼠结肠IL-6和TNF-α基因的相对表达水平显著提高，而唾液乳杆菌CCFM1266可显著下调两个炎症因子基因的相对表达水平，且唾液乳杆菌CCFM1266对结肠IL-6和TNF-α相对表达水平的抑制作用均优于干预对照组菌株FCQHC8L6。
实施例9：唾液乳杆菌CCFM1266干预对饮酒后小鼠结肠屏障蛋白MUC2表达的影响
C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。样本前处理及结肠屏障蛋白MUC2表达的测定方法同实施例5，其中，目的基因退火温度按表1进行修改。实验所用引物序列见表1，引物委托上海生工实验室进行PAGE法合成。将下机数据按2-ΔΔCT法计算得到，其中ΔΔCT的计算方法如下：
ΔΔCT＝(CT(目的基因，实验组)-·CT(内参基因，实验组))-(CT(目的基因，空白组)-·CT(内参基因，空白组))
实验结果见表9所示。
表9：小鼠结肠MUC2的相对表达量
空白组 麦芽糊精组 酒精组 CCFM1266组 FCQHC8L6组
MUC2 1.00±0.00ab 1.56±0.21a 0.68±0.22b 1.58±0.38a 0.92±0.18ab
注：ab字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
酒精摄入后，小鼠结肠屏障蛋白MUC2基因的相对表达水平显著降低，而唾液乳杆菌CCFM1266可显著上调结肠屏障蛋白MUC2基因的相对表达水平，维持小鼠肠道屏障的完整性，且唾液乳杆菌CCFM1266对结肠屏障蛋白MUC2的调节作用优于干预对照组菌株FCQHC8L6。
实施例10：唾液乳杆菌CCFM1266对饮酒后小鼠肠道Parasutterella属相对丰度的影响C57BL/6N小鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
粪便基因组提取：将实施例4中所采集到的小鼠粪便按照Fast DNA Spin Kit forFeces试剂盒说明书，进行粪便进行DNA提取。以提取所得DNA为模板，按照2×Taq PlusMasterMix说明书配制PCR反应体系，对16S V3-V4区进行PCR扩增。
PCR产物纯化：将上述PCR产物在110V电压下进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下，对460bp处条带进行切胶回收，按照DNA Gel/PCR Psurification Miniprep Kit试剂盒说明书进行产物纯化。在超微量分光光度计ds DNA模式下测定纯化产物浓度。
菌群测序：将纯化后产物按等质量浓度进行混样，参照文献方法进行16S V3-V4文库构建，基于Illumina Miseq高通量测序平台进行扩增子测序。
菌群分析：基于Cutadapt软件根据引物序列对下机数据进行拆分；基于Qiime2软件对拆分后数据进行去噪、进化树构建、物种注释以及统计分析，实验结果如表10所示。
表10：小鼠粪便Parasutterella属的相对丰度
空白组 麦芽糊精组 酒精组 CCFM1266组 FCQHC8L6组
Parasutterella属相对丰度 99±44ab 84±35ab 36±21c 129±19a 63±27bc
注：abc字母表示基于邓肯检验的组间显著性差异分析结果(P<0.05)。
酒精摄入后，小鼠粪便中肠道菌Parasutterella属的相对丰度出现下降，而唾液乳杆菌CCFM1266干预可恢复小鼠肠道Parasutterella属的相对丰度，且干预效果显著优于对照组菌株FCQHC8L6。
实施例11：含唾液乳杆菌CCFM1266的发酵剂的制备
MRS培养基：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、吐温80 1mL、一水合硫酸锰0.25g，水定容至1000mL，调节pH至6.5，在119-123℃条件下灭菌15-25min。
保护剂：100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精140g/L-160g/L海藻糖。
将唾液乳杆菌CCFM1266接种到MRS培养基中，37℃恒温恒湿条件下培养18-20h，收集菌体，用保护剂重悬菌体细胞，使菌浓度达到1010CFU/mL，然后悬浮液在37℃恒温恒湿条件下培养50-70min，干燥。所述干燥是在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥。
实施例12：唾液乳杆菌CCFM1266的应用
(1)利用唾液乳杆菌CCFM1266制造乳杆菌乳饮料
将原料乳脱脂奶在95℃热杀菌20min，然后冷却至4℃，再加入实施1中筛选得到的唾液乳杆菌CCFM1266或实施例11中制备的发酵剂，使菌体浓度达到106CFU/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含唾液乳杆菌CCFM1266活菌的乳饮料。
(2)利用唾液乳杆菌CCFM1266制造豆奶
采用软水浸泡大豆，水量为原大豆量三倍体积，在温度80℃下浸泡1～2h，再去除大豆皮。接着，沥去浸泡水，另加沸水磨浆，并在温度高于80℃的条件下保温10～15min。浆体用150目滤膜过滤后离心，得到的离心液即为粗豆奶，再将它加热到温度140～150℃，然后将热的粗豆奶迅速导入真空冷却室进行抽真空，所述粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出。经过真空脱气后，将其温度降至37℃左右，再接入实施例1筛选的唾液乳杆菌CCFM1266或实施例11制备的发酵剂，使唾液乳杆菌CCFM1266浓度达到106CFU/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含唾液乳杆菌CCFM1266活菌的豆奶。
(3)利用唾液乳杆菌CCFM1266制造果蔬饮料
选用新鲜蔬菜(例如黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜中的一种或多种)洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2s后，立即降温到37℃左右，再接入本发明的唾液乳杆菌CCFM1266发酵剂，使其浓度达到106CFU/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含唾液乳杆菌CCFM1266活菌的果蔬饮料。
(4)利用唾液乳杆菌CCFM1266制造胶囊制品
本发明的唾液乳杆菌CCFM1266在MRS培养基上培养24h，在温度4℃与4000×g的条件下离心20min，用PBS冲洗两次，再加入以最后得到含唾液乳杆菌CCFM1266的粉剂重量计4％脱脂奶粉和6％乳糖混合10min，再加入无菌2％氯化钙和3％海藻酸钠，同时以150×g搅拌10min，再静止固化30min，最后清洗过滤，得到的滤液进行冷冻干燥20h，得到含唾液乳杆菌CCFM1266的粉剂，把这种粉剂装入商业化的药用微胶囊，得到所述的胶囊制品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种可下调饮酒后血清谷氨酰转肽酶活性的唾液乳杆菌及其应用
<130> GBAA220676B
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1018
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (723)..(723)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
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<222> (803)..(804)
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<222> (817)..(817)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
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<222> (825)..(825)
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<400> 1
gcagtcgaac gaaactttct tacaccgaat gcttgcattc accgtaagaa gttgagtggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctaaaagaag gggataacac ttggaaacag 120
gtgctaatac cgtatatctc taaggatcgc atgatcctta gatgaaagat ggttctgcta 180
tcgcttttag atggacccgc ggcgtattaa ctagttggtg gggtaacggc ctaccaaggt 240
gatgatacgt agccgaactg agaggttgat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa 300
actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa 360
cgccgcgtga gtgaagaagg tcttcggatc gtaaaactct gttgttagag aagaacacga 420
gtgagagtaa ctgttcattc gatgacggta tctaaccagc aagtcacggc taactacgtg 480
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg 540
aacgcaggcg gtcttttaag tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gtagtgcatt 600
ggaaactgga agacttgagt gcagaagagg agagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat 660
gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct 720
gangttcgaa agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780
gatgaatgct angtgttgga ggnnttccgc ccttcantgc cgcanctaac gcaataanca 840
ttccgcctgg ggagtacgan cgcaaggttg aaactcaaan naattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtggn ncatgtggtt taattcgaaa ncaacgcgaa nanccttacc aggtcntgac 960
atcctttgac cacctaanan antagnnttc ccttnnnncn aantgacagg tnntgnna 1018

Claims (9)

1.一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius) CCFM1266，已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62418。
2.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的唾液乳杆菌CCFM1266或其发酵液，所述发酵液中含有唾液乳杆菌CCFM1266；所述产品为食品或保健品。
3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品中，唾液乳杆菌CCFM1266的含量至少为：1×106 CFU/g或1×106 CFU/mL。
4.一种用于治疗酒精性肝病的药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的唾液乳杆菌CCFM1266。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，含有权利要求1所述的唾液乳杆菌CCFM1266，或含有唾液乳杆菌CCFM1266的发酵液，或含有唾液乳杆菌CCFM1266的冻干粉；所述发酵液中含有唾液乳杆菌CCFM1266。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，唾液乳杆菌CCFM1266的含量至少为：1×109 CFU/g或1×109 CFU/mL。
7.权利要求1所述的唾液乳杆菌CCFM1266或权利要求2或3所述的产品或权利要求5或6所述的微生物菌剂在制备降低饮酒后血清谷氨酰转肽酶或治疗酒精性肝病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物含有所述唾液乳杆菌CCFM1266、药物载体和/或药用辅料。
9.权利要求1所述的唾液乳杆菌CCFM1266在制备饮酒后降低血清谷氨酰转肽酶活性和/或降低血清甘油三酯含量、干预或改善肝细胞损伤、结肠炎症水平、结肠屏障稳态和调节肠道菌群的保健品中的应用。
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