CN111662850A - 一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一种可预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的药品，此药品的有效成分为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1120，此副干酪乳杆菌CCFM1120能够有效缓解酒精性肠道损伤以及酒精性肝损伤，具体体现在：显著提高酒精造模小鼠肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量；显著降低酒精造模小鼠血清中内毒素的含量；显著降低酒精造模小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性；显著降低酒精造模小鼠肝脏中氧化应激水平；显著改善酒精造模小鼠肝脏组织的病理损伤。

Description

一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的不断提高，我国酒精的人均消耗量有大幅度增长，酒精相关器官损伤疾病的发病率也逐年增加。

肠道是酒精损伤的重要靶器官之一，酒精性肠道损伤会使得人体肠粘膜上皮细胞功能失调，进而改变人体小肠通透性，最终导致人体小肠对内毒素和细菌等致病因子具有高通透性。小肠对内毒素和细菌等致病因子的高通透性会导致机体发热、白细胞增多、微循环障碍、休克、多器官功能衰竭等，并且，酒精性肠道损伤引起的内毒素肠渗漏是导致酒精性肝损伤的重要病理环节。已有大量研究阐明了酒精-内毒素-枯否细胞-TNF-α等细胞因子-肝脏炎症这一损伤途径和机制。还有研究发现，肝巨噬细胞(库普弗细胞)是内毒素解毒的主要细胞，也是内毒素攻击的靶细胞，内毒素除了干扰细胞能量代谢和细胞内信号传导而对肝细胞产生直接毒性作用外，还能激活库普弗细胞释放促炎介质，介导肝损害。可见，酒精性肠道损伤对人体，尤其是人体肠道和肝脏的伤害巨大。

目前，已有一些研究找到了部分可用于预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的药物，例如，公开号为CN1733286A的专利申请文本提供了一种中药复方制剂，此中药复方制剂可以改善酒精引起的小肠结构变化、小肠通透性增加以及肝损伤；公开号为CN102961522A的专利申请文本提供了一种中药复方制剂，此中药复方制剂可以改善酒精性肠道损伤、减轻肠道渗漏和内毒素血症；公开号为CN101224232A的专利申请文本提供了从中药葛根的根中提取得到的葛根总黄酮，此葛根总黄酮能抑制酒精引起的小肠通透性的增加，降低血液中酒精浓度，减轻酒精引起的肝脏损害。但是，这些药品均存在见效慢、安全性不高等缺陷，在临床疗效上具有一定的局限性。

因此，仍需找到一种药品，此药品可有效预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤，并且，安全性高。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株能够缓解酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一株副干酪乳杆菌CCFM1120，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CCFM1120保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61014，保藏日期为2020年05月06日。

所述副干酪乳杆菌CCFM1120来源于四川眉山仁寿县的泡菜样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌CCFM1120。

本发明还提供了副干酪乳杆菌CCFM1120在制备预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的药品中的应用。

本发明的一种实施方式中，所述药品中，上述副干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述副干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述副干酪乳杆菌。

本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述副干酪乳杆菌CCFM1120的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或药品。

本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述副干酪乳杆菌CCFM1120、药物载体和/或药用辅料。

本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述副干酪乳杆菌CCFM1120的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述副干酪乳杆菌CCFM1120的饮料或零食。

本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述副干酪乳杆菌CCFM1120接种到培养基中进行培养，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水或缓冲液清洗后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。

有益效果：

1、本发明提供了一种可预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的药品，此药品的有效成分为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CCFM1120，此副干酪乳杆菌CCFM1120能够有效缓解酒精性肠道损伤以及酒精性肝损伤，具体体现在：

(1)显著提高酒精造模小鼠肠道紧密连接蛋白的mRNA表达量；

(2)显著降低酒精造模小鼠血清中内毒素(LPS)的含量；

(3)显著降低酒精造模小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性；

(4)显著降低酒精造模小鼠肝脏中氧化应激水平；

(5)显著改善酒精造模小鼠肝脏组织的病理损伤。

2、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，本发明的副干酪乳杆菌CCFM1120以及有效成分为副干酪乳杆菌CCFM1120的产品安全性较高，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用。

生物材料保藏

一株副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CCFM1120，分类学命名为Lactobacillus paracasei，已于2020年05月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61014，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：不同组别小鼠肠道紧密连接蛋白ZO-1的mRNA表达量。

图2：不同组别小鼠肠道紧密连接蛋白Occludin的mRNA表达量。

图3：不同组别小鼠肠道紧密连接蛋白Claudin-1的mRNA表达量。

图4：不同组别小鼠血清中内毒素(LPS)的含量。

图5：不同组别小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的活性。

图6：不同组别小鼠血清中谷草转氨酶(AST)的活性。

图7：不同组别小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

图8：不同组别小鼠肝脏中谷胱甘肽(GSH)的含量。

图9：不同组别小鼠肝脏中丙二醛(MDA)的含量。

图10：空白对照组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。

图11：酒精造模组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。

图12：副干酪乳杆菌CCFM1120干预组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。

图13：干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。

图14：瑞士乳杆菌8M-10干预组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。

图1-9中，*表示与模型组相比，具有显著性差异(p<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中涉及SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠购自维通利华实验动物有限公司；下述实施例中涉及的Lieber DeCarli对照液体饲料(不含酒精)和Lieber DeCarli酒精液体饲料(含酒精)购自南通特洛菲饲料科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购自上海恒天然商贸有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄0.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄0.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

下述实施例中涉及的乳杆菌菌悬液的制备方法如下：

将乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液于4℃、6000g的条件下离心10min，得到乳杆菌菌体；将乳杆菌菌体经生理盐水洗涤3次后重悬于浓度为120g/L的脱脂乳粉溶液中至菌浓度为1×10⁹CFU/mL，得到菌悬液，将菌悬液于-80℃下保存待用。

实施例1：副干酪乳杆菌CCFM1120的筛选及鉴定

1、筛选

以来源于江苏省昆山市的健康人群新鲜粪便为样本，将样本经预处理后，在30％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL 0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1120(菌株原始编号为RS85)。

2、鉴定

提取CCFM1120的基因组，将CCFM1120的16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CCFM1120。

实施例2：副干酪乳杆菌CCFM1120的培养

将副干酪乳杆菌CCFM1120接入MRS固体培养基中于37℃培养48h后，观察其菌落并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落呈乳白色半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。

将副干酪乳杆菌CCFM1120接入MRS液体培养基中于37℃培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过pH计测量培养液的pH，发现副干酪乳杆菌CCFM1120在培养过程中产酸。

将副干酪乳杆菌CCFM1120接入MRS液体培养基中分别于10～50℃下培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD₆₀₀，发现副干酪乳杆菌CCFM1120在30～37℃生长最佳，培养18～24h达到生长稳定期。

实施例3：副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠的影响

具体步骤如下：

1、实验方法

取SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，5组分别为：空白对照组(pair-fed，PF)、酒精造模组(alcohol-fed，AF)、灌胃干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2菌悬液的干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组(AF+V-CQRC7-161-M2)、灌胃副干酪乳杆菌CCFM1120菌悬液的副干酪乳杆菌CCFM1120干预组(AF+CCFM1120)、灌胃瑞士乳杆菌8M-10菌悬液的瑞士乳杆菌8M-10干预组(AF+8M-10)；其中，干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2和瑞士乳杆菌8M-10是和副干酪乳杆菌CCFM1120同批筛选出来的其他乳杆菌。

实验共10周：第一周为小鼠适应期，适应期小鼠饲养于25±2℃、相对湿50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验，所用饲料为LieberDeCarli对照液体饲料。第一周结束后，给空白对照组小鼠继续饲喂Lieber DeCarli对照液体饲料，连续喂养9周；给酒精造模组小鼠、干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组小鼠、副干酪乳杆菌CCFM1120干预组小鼠和瑞士乳杆菌8M-10干预组小鼠饲喂酒精浓度逐步增加的Lieber DeCarli酒精液体饲料进行酒精适应性喂养，酒精浓度增加幅度为1％-2％-3％-4％-5％(v/v)，酒精适应性喂养5天后，给酒精造模组小鼠、干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组小鼠、副干酪乳杆菌CCFM1120干预组小鼠和瑞士乳杆菌8M-10干预组小鼠饲喂酒精浓度为28％(v/v)的Lieber DeCarli液体饲料，连续喂养2天+8周，其中，酒精造模组小鼠在喂养的最后4周按1mL/天的剂量灌胃浓度为120g/L的脱脂乳粉溶液，干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组小鼠、副干酪乳杆菌CCFM1120干预组小鼠和瑞士乳杆菌8M-10干预组小鼠在喂养的最后4周按照按1mL/天的剂量灌胃菌悬液。

灌胃结束后，收集小鼠新鲜粪便样品。对灌胃结束的小鼠禁食12小时后，麻醉小鼠并迅速摘眼球取血，辅以颈椎脱臼法处死。收集处死后小鼠的血液样本，将血液样本于4℃静置1h，3000rpm离心15min，小心收集上层血清。对处死后小鼠进行解剖，将解剖得到的小鼠肝脏在冰冷的生理盐水中漂洗拭干，拍照观察后称重，并取左叶完整切片用；另取0.1g肝组织匀浆用，加入9倍组织块重量的预冷的生理盐水充分研磨，使肝组织匀浆化，4℃下6000rpm离心15分钟，弃脂肪和沉淀，小心收集上清即为肝匀浆液。将解剖得到的小鼠回肠组织在冰冷的生理盐水中漂洗拭干，称重，取0.1g肠段提取RNA用。所有样品均于-80℃冰箱超低温保存。

2、实验结果

2.1、副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠肠道紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

紧密连接是肠粘膜上皮细胞之间最重要的连接，在维持肠粘膜上皮细胞极性和调节肠屏障通透性方面起着至关重要的作用。紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1是肠道紧密连接的重要组成，因此，可通过分析小鼠肠道中紧密连接蛋白的mRNA表达量来评价药物对酒精造模小鼠的影响。

以小鼠回肠组织提取得到的RNA为模板，采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表达量(ZO-1、Occludin和Claudin-1和内参基因β-actin的扩增引物如表1所示)，检测结果见图1-3。

由图1-3可知，与空白对照组小鼠相比，酒精造模组小鼠肠道中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA相对表达水平显著降低(分别较空白对照组降低了50.22％、58.96％和58.76％)，说明酒精会造成小鼠肠道屏障的破坏；与酒精造模组小鼠相比，副干酪乳杆菌CCFM1120组小鼠肠道中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA相对表达水平显著升高(分别提高至空白对照组的1.12倍、1.11倍和1.14倍)，且效果远优于瑞士乳杆菌8M-10(分别较空白对照组下降了72.04％、77.82％和73.92％)和干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2(分别较空白对照组下降了65.93％、67.15％和67.35％)，说明副干酪乳杆菌CCFM1120可有效提高慢性酒精性暴露小鼠肠道紧密连接蛋白的水平，从而缓解酒精性肠道损伤，保护肠粘膜屏障。

表1 RT-PCR引物基因序列

2.2、副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠血清中内毒素(LPS)含量的影响

内毒素(LPS)是指来自肠道中的革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖成分，具有广泛的生物活性，过量时会引起严重的炎症反应。酒精及其代谢物乙醛和一氧化氮可破坏肠上皮屏障功能，增加肠道对内毒素的通透性，导致内毒素从肠道转移到门静脉，然后进入肝脏和血液循环，进一步促进肝脏炎症和内毒素血症，因此，可通过分析小鼠血清中内毒素(LPS)的含量来评价药物对酒精造模小鼠的影响。

采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定各组小鼠血清中内毒素的含量，检测结果见图4。

由图4可知，与空白对照组小鼠(164.69ng/L)相比，酒精造模组小鼠血清中内毒素(LPS)的含量显著升高(256.22ng/L)；与酒精造模组小鼠相比，副干酪乳杆菌CCFM1120组小鼠血清中内毒素(LPS)的含量显著降低(181.77ng/L)，且效果远优于瑞士乳杆菌8M-10(223.93ng/L)和干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2(235.35ng/L)，说明副干酪乳杆菌CCFM1120能够有效抑制慢性酒精引起的肠道通透性和内毒素血症。

2.3、副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性的影响

谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是评价肝功能最常用的生化指标，因此，可通过分析小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性来评价药物对酒精造模小鼠的影响。

利用全自动血清生化分析仪测定各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性，检测结果见图5-6。

由图5-6可知，与空白对照组小鼠(26.51U/L和60.31U/L)相比，酒精造模组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性显著升高(36.78U/L和119.98U/L)；与酒精造模组小鼠相比，副干酪乳杆菌CCFM1120组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性显著降低(27.50U/L和68.55U/L)，且降低程度远优大于瑞士乳杆菌8M-10(34.28U/L和97.99U/L)和干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2(36.22U/L和96.41U/L)，说明副干酪乳杆菌CCFM1120能够有效能够有效抑制慢性酒精导致的小鼠肝脏损伤。

2.4、副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠肝脏中氧化应激水平的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)是体内重要的抗氧化物质，它们含量的减少会导致机体线粒体功能受损。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物之一，其含量也反应了机体的脂质过氧化和氧化应激损伤程度。

采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定各组小鼠肝匀浆中SOD、GSH和MDA含量的测定，检测结果见图7-9。

由图7-9可知，与空白对照组小鼠(126.14U/mg蛋白、7.60μmol/g蛋白和2.46nmol/mg蛋白)相比，酒精模型组小鼠肝脏中SOD和GSH活性显著降低(75.33U/mg蛋白和4.60μmol/g蛋白)，相应的MDA浓度明显升高(5.51nmol/mg蛋白)；而与酒精造模组小鼠相比，干酪乳杆菌CCFM1120处理可以有效地恢复SOD和GSH活性(118.01U/mg蛋白和7.19μmol/g蛋白)，并显著降低MDA浓度(3.53nmol/mg蛋白)；且恢复程度远优于瑞士乳杆菌8M-10(96.23U/mg蛋白、5.37μmol/g蛋白和5.18nmol/mg蛋白)和干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2(95.61U/mg蛋白、5.34μmol/g蛋白和4.67nmol/mg蛋白)。这一结果表明干酪乳杆菌CCFM1120能够有效抑制慢性酒精引起的氧化损伤。

2.5、副干酪乳杆菌CCFM1120对酒精造模小鼠肝脏组织病理损伤的影响

取小鼠肝脏左叶同一位置的组织用10％多聚甲醛溶液固定后，经过石蜡包埋、切片，用苏木精和伊红染料进行染色，在显微镜下观察拍照，观察见图10-14。

由图10-14可知，空白对照组小鼠肝细胞结构较完整，肝细胞有明显的界线且胞浆均匀，有轻微脂肪变性，无炎性浸润；酒精造模组脂肪变性明显，有大片的脂肪空洞，肝细胞肿胀变形，出现炎性细胞浸润，可见，与空白对照组小鼠相比，酒精造模组小鼠的肝脏出现了严重的病理损伤；与酒精造模组小鼠相比，副干酪乳杆菌CCFM1120组小鼠肝脏组织的病理损伤出现了明显的减轻，主要表现为脂肪泡减少，脂肪变性减轻，可见，副干酪乳杆菌CCFM1120能够有效缓解慢性酒精导致的小鼠肝脏病理损伤；而干酪乳杆菌V-CQRC7-161-M2干预组小鼠和瑞士乳杆菌8M-10干预组小鼠的肝脏中仍可以观察到较多的脂肪空泡，肝细胞肿胀。

实施例4：副干酪乳杆菌CCFM1120的应用

副干酪乳杆菌CCFM1120可用于制备即食型乳酸菌粉剂，菌粉的具体制备过程如下：

副干酪乳杆菌CCFM1120划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液4000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用pH 7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉；将副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉与低聚果糖、低聚半乳糖、山楂粉、枸杞粉、桑葚粉按照质量比为5:1:1:1:1:1的比例混合，得到即食型乳酸菌粉剂；

其中，保护剂含有100g/L脱脂奶粉、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖。

实施例5：副干酪乳杆菌CCFM1120的应用

副干酪乳杆菌CCFM1120可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：

副干酪乳杆菌CCFM1120划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液4000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用pH 7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉；

其中，保护剂含有100g/L脱脂奶粉、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖。

将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉至浓度为不低于1×10⁶CFU/mL，得到乳饮品(乳饮品需在4℃下冷藏保存)。

将鲜奶与糖按照质量比为20:1的比例混合后，先在65℃、20MPa的条件下进行均质，然后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料A；待发酵原料A降温至35℃后，将发酵原料A、副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉、商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比为100:1:1:1的比例混合，得到发酵原料B；将发酵原料B在35℃下保温发酵7h至凝乳后，在4℃下冷藏24h，得到发酵乳。

实施例6：副干酪乳杆菌CCFM1120的应用

副干酪乳杆菌CCFM1120可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下

副干酪乳杆菌CCFM1120划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液4000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用pH 7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；菌悬液添加至浓度为30g/L的海藻酸钠溶液中至浓度为2×10¹⁰CFU/mL后，充分搅拌，使得副干酪乳杆菌CCFM1120的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为20g/L的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中，得到胶囊制品；

其中，保护剂含有100g/L脱脂奶粉、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖。

实施例7：副干酪乳杆菌CCFM1120的应用

副干酪乳杆菌CCFM1120可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：

副干酪乳杆菌CCFM1120划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液4000r/min离心10min，得到菌泥；将菌泥用pH 7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次后用保护剂重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉；

其中，保护剂含有100g/L脱脂奶粉、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖。

称取副干酪乳杆菌CCFM1120菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌

<400> 1

tatgagagtt tgatcctggc tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc 60

gaacgagttc tcgttgatga tcggtgcttg caccgagatt caacatggaa cgagtggcgg 120

acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat 180

gctaataccg catagatcca agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat 240

cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg 300

atgatacgta gccgaactga gaggttgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa 360

ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac 420

gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg 480

gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc 540

cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga 600

gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg 660

gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg 720

cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg 780

aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg 840

atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat 900

tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 960

agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 1020

cttttgatca cctgagagat caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg 1080

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1140

tgactagttg ccagcattta gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg 1200

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1260

atggatggta caacgagttg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa agccattctc 1320

agttcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat 1380

cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1440

gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac ccttttaggg agcgagccgt ctaaggtggg 1500

acaaatgatt agggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg agaacctgcg gctggatcac 1560

ctcctt 1566

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctaagagga ggatggtcgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcaacacct caaccccctc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttccatca tttcgctgtg t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctgaaacca tcaagtccac a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcacttttcc tgcggtgact 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggaacgtgg ccgatataat g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcaaagat gttttgccac ag 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tacaaattcc cattgcagcc c 21

Claims (10)

1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61014，保藏日期为2020年05月06日。

2.权利要求1所述副干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗酒精性肠道损伤或酒精性肝损伤的药品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药品中，权利要求1所述副干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×10⁶CFU/mL或1×10⁶CFU/g。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。

9.如权利要求2-8任一项所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

10.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌。

Images