CN110741073A - 新乳酸菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明的新乳酸菌以胞外多糖的形式产生具有N‑乙酰葡糖胺通过α‑1，6键连接的结构的中性多糖，该乳酸菌能够从无花果中得到，具有抑制透明质酸酶的活性、抗酒精伤害活性等，在发挥抗过敏效果、抗酒精伤害效果等的饮食品、药品、饲料、化妆品等中是有用的。

Description

新乳酸菌及其用途

技术领域

本发明涉及新乳酸菌及其用途。进一步详细而言，本发明涉及一种以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的新乳酸菌，本发明还涉及含有该新乳酸菌的发挥抗过敏效果等的饮食品组合物、药品组合物等组合物。

背景技术

乳酸菌是将葡萄糖等碳水化合物发酵而获得能量并生成大量乳酸的一类细菌，是非致病性且非孢子形成性的革兰阳性菌。乳酸菌自古就被用于酸奶、奶酪等发酵食品的制备，并且，当给予适当的量时会对宿主的医疗保健发挥有益的效果，因此也被广泛地用作益生菌。

作为有益生菌效果的乳酸菌，已知有例如：具有对血清脂质的效果的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MA2株(非专利文献1)、具有降低胆固醇作用的Lactobacillusplantarum PH04株(非专利文献2)等。此外，作为来自植物的乳酸菌，还已知有具有改善脂肪肝和抑制体内脂肪蓄积的效果的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)LP28株(非专利文献3)等。

对于属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌株，已知具有抗过敏作用的Lactobacillus paracasei K71株(专利文献1)、具有抗流感病毒活性的Lactobacillus paracasei MCC1375株(专利文献2)、活化白细胞介素-12产生的Lactobacillus paracasei KW3110株(非专利文献4)等。

已知一些乳酸菌株产生胞外多糖(exopolysaccharide)作为有助于维持、改善人的健康的生理活性物质。由乳酸菌产生的胞外多糖显示发挥免疫调节功能、抗胃炎作用(非专利文献5及6)。此外，对于由属于Lactobacillus paracasei的乳酸菌产生的胞外多糖也是已知的，据报道，Lactobacillus paracasei DG株产生富含鼠李糖的胞外多糖(非专利文献7)，Lactobacillus paracasei KB28株产生富含葡萄糖的胞外多糖(非专利文献8)。另据报道，Lactobacillus paracasei 34-1株产生由D-半乳糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖和sn-甘油3-磷酸盐形成的胞外多糖(非专利文献9)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第WO2009/131208号；

专利文献2：国际公开第WO2012/133827号。

非专利文献

非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.,84,341-347(2009)；

非专利文献2：Int.J.Food Microbiol.,113,358-361(2007)；

非专利文献3：PLoS One e30696(2012)；

非专利文献4：Biosci.Biotechnol.Biochem.,73,1561-1565；

非专利文献5：Carbohydr.Polym.,124,292-301(2015)；

非专利文献6：Biol.Pharm.Bull.,17,1012-1017(1994)；

非专利文献7：Appl.Environ.Microbiol.,83,e02702-16(2107)；

非专利文献8：J.Microbiol.Biotechnol.,21,1174-1178(2011)；

非专利文献9：Carbohdr.Res.,285,129-139(1996)。

发明内容

发明要解决的问题

在这样的背景技术下，期望进一步开发作为新的益生菌有用的新乳酸菌。因此，本发明的课题在于，提供一种作为新的益生菌而被期待的、作为饮食品组合物、药品组合物等组合物的有效成分是有效的新乳酸菌及其用途。

用于解决问题的方案

本发明人等以开发作为新的益生菌有用的新乳酸菌为目的而进行了深入地研究，结果发现，从无花果中得到一种乳酸菌，该乳酸菌会产生在现有的乳酸菌中完全没有被发现的、具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的新的中性多糖，基于这些发现，进一步深入研究从而完成了本发明。

在本发明的一个方式中，本发明涉及一种以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的乳酸菌。

乳酸菌优选属于乳酸杆菌(Lactobacillus)的乳酸菌，特别优选属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌。此外，本发明的乳酸菌优选来自无花果的乳酸菌，在这之中优选Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株(保藏号NITE BP-02242)或与其同等的乳酸菌。

此外，该乳酸菌产生的中性多糖特别具有透明质酸酶抑制活性。

在本发明的另一个方式中，本发明涉及含有这些乳酸菌的组合物。

组合物优选饮食品组合物，作为饮食品，优选饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。此外，该组合物优选药品组合物、饲料组合物和化妆品组合物。

这些组合物优选用于透明质酸酶抑制、抗过敏或抗酒精伤害等。

发明效果

本发明的乳酸菌以胞外多糖的形式产生的中性多糖等多糖显示出抑制作为将透明质酸水解的酶的透明质酸酶的活性，因此，本发明的乳酸菌作为发挥抗过敏效果等的饮食品、补充剂、药品和饲料是有效的。此外，对于酒精性肝炎诱导模型小鼠，本发明的乳酸菌具有使作为酒精伤害的检查指标的血清中的AST(天冬氨酸氨基转移酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、ALP(碱性磷酸酶)等减少的效果，因此，作为用于抗酒精伤害的饮食品、药品是有效的。

进而，本发明的乳酸菌对胃酸、胆汁酸具有高耐性，因此，特别是作为在人消化道中发挥功能的饮食品、补充剂和药品、以及作为哺乳动物、家畜类、宠物等的饲料是有效的。

并且，本发明的乳酸菌在使用蛋清的培养基中也能发挥强大的增殖能力，因此该乳酸菌对于存在于蛋清中的作为分解细菌细胞壁的酶的溶菌酶、带有通过螯合作用而妨碍细菌的铁利用的功能的运铁蛋白等的防御机制强，从这一方面出发，本发明的乳酸菌作为饮食品、药品也能够有效地利用。

此外，本发明的乳酸菌带有具有下述特征的同化能力：不能同化在分解时可能会产生氢氰酸的苦杏仁甙、不能同化抑制黑色素产生而被誉为有美白效果的熊果苷。进而，如上所述，本发明的乳酸菌在使用蛋清的培养基中也能发挥强大的增殖能力，因此，例如能够与蛋清等一起作为化妆品而有效地使用。

附图说明

图1为通过本发明分离鉴定的Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的显微镜照片。图1(A)为革兰氏染色显微镜照片，(B)为扫描型电子显微镜(SEM)照片。

图2为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的胞外多糖体的基于阴离子交换色谱(TOYOPEARL DEAE-650M树脂(东曹株式会社))的分离曲线。以0mM～500mM的梯度浓度的NaCl(虚线)使胞外多糖体溶出，将各组分中的胞外多糖通过苯酚硫酸法在490nm进行监控(实线)。

图3示出将胞外中性多糖进行H-NMR和C-NMR而得到的各自的NMR曲线，其中，该胞外中性多糖是将Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的胞外多糖体通过阴离子交换柱色谱提纯而得到的。图3的(A)为H-NMR的NMR曲线，(B)为C-NMR的NMR曲线。

图4示出根据NMR曲线的胞外中性多糖的结构解析结果。根据该结构解析结果，明确了Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的胞外中性多糖具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构。

图5为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的基因组DNA的命名为pce1簇以及pce2簇的胞外多糖生物合成遗传基因簇的组织结构图。

图6中，(A)示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株、ATCC 334株和JCM8130T株这三种乳酸菌间的基因组重排图谱，(B)为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的pce1遗传基因簇与JCM 8130T株中的遗传基因簇的对应。

图7为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的AST(天冬氨酸氨基转移酶)的影响的图表。

图8为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的ALT(丙氨酸氨基转移酶)的影响的图表。

图9为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的ALP(碱性磷酸酶)的影响的图表。

图10为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的LDH(乳酸脱氢酶)的影响的图表。

图11为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的LAP(亮氨酸氨基肽酶)的影响的图表。

图12为示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的血清中的LIP(脂肪酶)的影响的图表。

图13示出将Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株以使用蛋清的培养基进行培养的结果。

图14示出将Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株以在蛋清中加入了葡萄糖和纯盐卤(本にがり)的培养基进行培养的结果。

具体实施方式

以下，对本发明的乳酸菌及其用途进行详细说明。

1.本发明的乳酸菌

本发明的乳酸菌为以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的乳酸菌。以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的乳酸菌是现有技术中未知的，通过本发明而首次被发现。本发明的乳酸菌如果是产生具有这样特定结构的中性多糖的乳酸菌，则可以是任一种乳酸菌，并不限定于特定的乳酸菌。

作为本发明的乳酸菌，可举出例如属于乳杆菌(Lactobacillus)属、明串珠菌(Leuconostoc)属、链球菌(Streptococcus)属、片球菌(Pediococcus)属、蜜蜂球菌(Melissococcus)属、肠球菌(Enterococcus)属、明串珠菌(Trichococcus)属、乳球菌(Lactococcus)属、肉杆菌(Carnobacterium)属、漫游球菌属(Vagococcus)属、四联球菌(Tetragenococcus)属、奇异菌(Atopobium)属、魏斯氏菌(Weissella)属、酒球菌(Oenococcus)属、营养缺陷菌(Abiotrophia)属、德库菌属(Desemzia)属、副乳杆菌(Paralactobacillus)属、颗粒链菌(Granulicatella)属、嗜盐嗜碱菌(Alkalibacterium)属、奥尔森菌(Olsenella)属、棍状菌(Isobaculum)属、海洋芽胞杆菌(Marinilactibacillus)属、肉杆菌(Atopostipes)属、乳卵形菌(Lactovum)属、矛形菌(Pilibacter)属、嗜果糖乳酸菌(Fructobacillus)属、ラクチシゲミウム(Lacticigemium)属、ババリコッカス(Bavariicoccus)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属等的乳酸菌。在它们之中，优选属于乳杆菌属的乳酸菌。

作为属于乳杆菌属的乳酸菌，可举出例如副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、乙酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、酸面乳杆菌(Lactobacillusacidifarinae)、酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、低温乳杆菌(Lactobacillusalgidus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、发酵淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylotrophicus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、胃窦乳杆菌(Lactobacillus antri)、田鼠乳杆菌(Lactobacillus apodemi)、水生乳杆菌(Lactobacillus aquaticus)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、巴博乳杆菌(Lactobacillus bobalius)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、cacaonum乳杆菌(Lactobacillus cacaonum)、茶叶乳杆菌(Lactobacillus camelliae)、多毛乳杆菌(Lactobacillus capilatus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、鲸乳杆菌(Lactobacillus ceti)、人阴道乳杆菌(Lactobacillus coleohominis)、丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、堆肥乳杆菌(Lactobacillus composti)、曲面乳杆菌(Lactobacillus concavus)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌印度亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.indicus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、糊精乳杆菌(Lactobacillus dextrinicus)、食二酸乳杆菌(Lactobacillus diolivorans)、马乳杆菌(Lactobacillus equi)、驯马乳杆菌(Lactobacillus equigenerosi)、fabifermentans乳杆菌(Lactobacillus fabifermentans)、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)、谷糠乳杆菌(Lactobacillus farraginis)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、近茎轴乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillusfructivorans)、谷物乳杆菌(Lactobacillus frumenti)、府中乳杆菌(Lactobacillusfuchuensis)、母鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、胃乳杆菌(Lactobacillus gastricus)、加纳乳杆菌(Lactobacillusghanensis)、草乳杆菌(Lactobacillus graminis)、黑氏乳杆菌(Lactobacillushammesii)、仓鼠乳杆菌(Lactobacillus hamsteri)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)、早来乳杆菌(Lactobacillus hayakitensis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、稀氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillushomohiochii)、大麦乳杆菌(Lactobacillus hordei)、懒惰乳杆菌(Lactobacillusiners)、果囊乳杆菌(Lactobacillus ingluviei)、肠乳杆菌(Lactobacillusintestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、卡利克斯镇乳杆菌(Lactobacillus kalixensis)、产马乳酒乳杆菌乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、韩泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)、kisonensis乳杆菌(Lactobacillus kisonensis)、北里氏乳杆菌(Lactobacillus kitasatonis)、昆仑乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、leichmannii乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacilluslindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、苹果乳杆菌(Lactobacillusmali)、食木薯乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、明登乳杆菌(Lactobacillusmindensis)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、内氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、那慕尔乳杆菌(Lactobacillus namurensis)、南特港乳杆菌(Lactobacillus nantensis)、nodensis乳杆菌(Lactobacillus nodensis)、寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、otakiensis乳杆菌(Lactobacillus otakiensis)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、美洲虎乳杆菌(Lactobacillus pantheris)、类短乳杆菌(Lactobacillus parabrevis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、类丘状菌落乳杆菌(Lactobacillusparacollinoides)、类谷糠乳杆菌(Lactobacillus parafarraginis)、类高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、恶味乳杆菌(Lactobacillus perolens)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、鹦鹉乳杆菌(Lactobacillus psittaci)、rapi乳杆菌(Lactobacillus rapi)、蛋白原酶乳杆菌(Lactobacillus rennini)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、裂乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗西氏乳杆菌(Lactobacillus rossiae)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、神话猪乳杆菌(Lactobacillus saerimneri)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus、salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、红条乳杆菌(Lactobacillus satsumensis)、嗜黑麦乳杆菌(Lactobacillus secaliphilus)、泡菜乳杆菌(Lactobacillus senmaizukei)、沙氏乳杆菌(Lactobacillussharpeae)、白面粉乳杆菌(Lactobacillus siliginis)、斯比氏乳杆菌(Lactobacillusspicheri)、斯瓦比乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、sunkii乳杆菌(Lactobacillus sunkii)、susicola乳杆菌(Lactobacillus susicola)、台湾乳杆菌(Lactobacillus taiwanensis)、泰国乳杆菌(Lactobacillus thailandensis)、tucceti乳杆菌(Lactobacillustucceti)、厄尔纳拉乳杆菌(Lactobacillus ultunensis)、uvarum乳杆菌(Lactobacillus uvarum)、牛粪乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、费尔斯莫尔德镇乳杆菌(Lactobacillusversmoldensis)、酒乳杆菌(Lactobacillus vini)、犊乳杆菌(Lactobacillusvitulinus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、老面乳杆菌(Lactobacillus zymae)等。在它们之中，优选副干酪乳杆菌。

在这些乳酸菌之中，本发明的乳酸菌优选来自无花果的乳酸菌。具体而言，根据本发明，作为以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的乳酸菌，从无花果的叶中分离鉴定出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株。该菌株于2016年4月19日作为保藏号NITE P-02242国内保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物中心(National Institute of Technology and Evaluation，〒292-0818千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8 122号室)，之后基于布达佩斯条约转移到国际保藏，于2017年5月19日被赋予国际保藏的保藏号NITE BP-02242。

从无花果的叶中分离鉴定出的Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株如图1的照片示出那样具有下述菌学的性质：其为过氧化氢酶阴性的革兰阳性杆菌，并且具有白色菌落形成性，带有条件性异乳酸发酵的特性。进而，具有产生多糖体、特别是产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖的能力。

该中性多糖如后述的实施例4记载的那样，能够通过将从Lactobacillusparacasei IJH-SONE68株的培养物中得到的多糖体利用阴离子交换色谱而分离提纯，从而得到。根据图3示出的H-NMR和C-NMR的NMR曲线明确了该中性多糖具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构。

此外，如后述的实施例3的表1示出的那样，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株具有对糖类的同化能力。特别地，与其它的Lactobacillus paracasei相比，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株带有具有下述特征的糖类同化能力：不会同化在分解时可能会产生氢氰酸的苦杏仁甙、不会同化抑制黑色素产生而被誉为有美白效果的熊果苷。

根据Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的全基因组序列的解析，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的基因组DNA由GC含量46.37％的3084917bp形成，结构遗传基因的数量预测为2963个。进而，还示出Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株带有2个质粒，其中1个至少为51kb，另1个为45267bp的大小。与其它乳酸菌相比，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株具有更大的基因组大小和结构遗传基因数。

此外，在Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的基因组DNA序列中，发现了2个胞外多糖生物合成遗传基因簇，将其中一个23kb的簇命名为pce1簇，将另一个28kb的簇命名为pce2簇。而且，在pce2簇中，发现了从1个命名为pce2J的糖基转移酶遗传基因中推定的蛋白质带有与已知的在β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶中发现的pfam02485基序或结构域(Genes Dev.1993 Mar；7(3):468-478和J.Biol.Chem.1999 Jan 29；274(5):3215-3221)同样的基序或结构域，由此，启示了在pce2簇中编码该蛋白质的结构遗传基因参与中性多糖的生物合成。

在本发明中，与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株同等的乳酸菌也包含在本发明的乳酸菌中。在此，同等的乳酸菌是指：属于Lactobacillus paracasei的乳酸菌中具有产生如下中性多糖的能力的乳酸菌，该中性多糖具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构。此外，同等的乳酸菌是指如下的菌株：属于副干酪乳杆菌的菌株中，其16S rDNA基因的碱基序列与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的16S rDNA基因的序列号1的碱基序列有98％以上、优选99％以上、更优选100％的同一性，并且优选具有与Lactobacillusparacasei IJH-SONE68株相同的菌学性质和/或相同的糖类同化能力的菌株。此外，同等的乳酸菌是指：属于副干酪乳杆菌的菌株中，且、具有与Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株具有的抗过敏作用、抗酒精伤害作用、耐酸性等生物活性相同的生物活性的菌株。

这些同等的乳酸菌能够通过例如对Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株进行突变、遗传基因重组等通常的变异处理技术而得到，此外，也可以是通过选择Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的天然变异株等而培育的菌株。

2.本发明的乳酸菌的获得和增殖

本发明的乳酸菌能够与在后述实施例4中记载的Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株产生的多糖体的分离提纯同样地进行，将乳酸菌产生的胞外多糖分离，研究该多糖是否为具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖，从而获得。

本发明的乳酸菌能够通过培养它们而容易地使之增殖。培养的方法只要是乳酸菌能够增殖的培养方法即可，并不限定于特定的培养方法，能够直接使用通常用于培养乳酸菌的方法，或者也可以根据需要适当修正通常用于培养乳酸菌的方法来使用。例如培养温度通常可以为25～50℃，优选为35～42℃。培养可以在有氧条件或厌氧条件下进行，特别优选在厌氧条件下进行，例如，能够一边将适当浓度的二氧化碳气体、氮气等厌氧性气体进行通气一边进行培养。此外，也可以在液体静置培养等微氧条件下培养。

作为培养乳酸菌的培养基没有特别限定，能够将通常用于培养乳酸菌的培养基根据需要适当修正来使用。即，作为碳源，能够根据同化性使用例如半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类。作为氮源，能够使用例如氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等铵盐类、硝酸盐类。此外，作为无机盐类，能够使用例如氯化钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化钙、硝酸钙、氯化锰、硫酸亚铁等。此外，也可以使用蛋白胨、酒糟、乳清(Whey)、大豆粉、脱脂豆粕、肉提取物、酵母提取物等有机成分。此外，作为制备完成的培养基，能够优选使用例如MRS培养基或其修正培养基。

乳酸菌可以直接使用培养后得到的培养物，可以将得到的培养物稀释或浓缩来使用，也可以使用从培养物回收的菌体。此外，只要不损害本发明的效果，也能够在培养后进行加热及冻干等各种追加操作。追加的操作优选为活菌生存率高的操作。此外，本发明的乳酸菌可以是活菌，也可以是死菌，也可以是活菌和死菌两者。死菌也可以是匀浆。

3.本发明的乳酸菌的用途

本发明的乳酸菌以胞外多糖的形式产生的中性多糖、酸性多糖等多糖显示出抑制作为将透明质酸水解的酶的透明质酸酶的活性。对于酒精性肝炎诱导模型小鼠，本发明的乳酸菌具有使作为酒精伤害的检查指标的血清中的AST(天冬氨酸氨基转移酶)等减少的效果。本发明的乳酸菌对胃酸、胆汁酸具有高耐性。并且，本发明的乳酸菌在使用蛋清的培养基中也能发挥强大的增殖能力，因此，该乳酸菌对于作为存在于蛋清中的分解细菌细胞壁的酶的溶菌酶、通过螯合作用而带有妨碍细菌铁利用功能的运铁蛋白等的生物防御机制强。

像这样，本发明的乳酸菌发挥各种生物活性、具有生理学特征，因此能够广泛地用作饮食品组合物、药品组合物、饲料组合物、化妆品组合物等各种组合物的有效成分。例如，能够用作透明质酸酶抑制用、抗过敏用或抗酒精伤害用饮食品组合物、药品组合物或饲料组合物的有效成分。此外，本发明的乳酸菌也能够与蛋清等一起用作化妆品组合物的有效成分。

本发明的药品组合物只要含有本发明的乳酸菌则没有特别限定。本发明的药品组合物通常可以将本发明的乳酸菌配合生理上可接受的液体或固体制剂载体，进行制剂化而使用。

本发明的药品组合物的剂型没有特别限定，具体而言，能够例示片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、软膏剂、贴剂、滴眼剂和滴鼻剂等。在制剂化时，能够使用作为制剂载体而通常使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂、滑润剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂，表面活性剂或注射用溶剂等添加剂。

本发明的药品组合物的制剂中的乳酸菌的含量可以根据剂型、用法、对象的年龄、性别、疾病的种类、疾病的程度及其他条件等适当设定，通常优选为1×10⁶～1×10¹²cfu/g或1×10⁶～1×10¹²cfu/ml的范围内，更优选为1×10⁷～1×10¹¹cfu/g或1×10⁷～1×10¹¹cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。

只要不损害本发明的效果，也可以根据用途将本发明的乳酸菌与其它的有效成分例如免疫调节剂等适当并用。

本发明的药品组合物的给与时间没有特别限定，能够根据适用对象选择适当给与时间。此外，可以预防性给与，也可以用于维持治疗。给与形态优选根据制剂形态、给与对象的年龄、性别、其他条件、给与对象的症状的程度等适当决定。本发明的药品组合物在任何情况下，都能够1日1次或分为多次给与，此外也可以设为数日或数周间给与1次。

本发明的药品组合物例如能够用于使给与对象的过敏减轻。此外，本发明的药品组合物能够用于例如酒精性肝伤害、酒精依赖症、酒精性肝炎、脂肪肝等的治疗、缓和或预防用。

本发明的包含乳酸菌的饮食品组合物的饮食品只要含有乳酸菌则没有特别限定，作为饮食品可例示软饮料、碳酸饮料、营养饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料等饮料；这些饮料的浓缩原液、制备用粉末等；冰淇淋、果子露、刨冰等冰品；糖、软糖、麦片、泡泡糖、糖果、口香糖、巧克力、片状糖果、零食、饼干、果冻、果酱、奶油和烘焙食品等点心类；加工乳、乳饮料、发酵乳、酸奶饮料、黄油等乳制品；面包；肠内营养剂、流食、儿童牛奶、运动饮料；菜泥等食品；其它功能性食品等。此外，饮食品也可以是补充剂，例如可以是颗粒状、粉状、片状的补充剂。在饮食品是补充剂的情况下，对于每一日的食物量和摄取热量，能够不受其它食品的影响地摄取乳酸菌。

上述这样的饮食品能够通过在饮食品的原料中添加乳酸菌而制造，或者能够与通常的饮食品同样地进行制造。乳酸菌的添加可以在饮食品的制造工序中的任一阶段进行。可以经过添加乳酸菌的发酵工序而制造饮食品。作为这样的饮食品，可举出乳酸菌饮料、发酵乳等发酵食品等。

作为食品或饮料的原料，能够使用可用于通常的饮料、食品的原料。制造的饮食品能够口服摄入。

本发明的饮食品中也包含在饮食品的制造工序或在制造后添加到饮食品中的用于制造饮食品的原料、及食品添加剂等。例如，本发明的乳酸菌能够用作发酵乳制造用起始细菌。此外，也能够将本发明的乳酸菌在之后添加到制造的发酵乳中。

饮食品组合物中乳酸菌的含量可根据饮食品的方式而适当设定，通常，在饮食品中优选为1×10⁶～1×10¹²cfu/g或1×10⁶～1×10¹²cfu/ml的范围内，更优选为1×10⁷～1×10¹¹cfu/g或1×10⁷～1×10¹¹cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。

本发明的包含乳酸菌的饮食品组合物能够用于利用抗过敏效果、抗酒精伤害效果的各种用途。

本发明的包含乳酸菌的饮食品能够作为表示其用途的饮食品而制造、出售。在这样的饮食品中，能够使用“过敏改善用”、“酒精伤害改善用”等的表示。毋庸置疑，除此之外，只要是表达通过这样的改善效果而再次产生的效果的表示，就能够使用。在此，“表示”是指对于消费者而言、为使其知晓上述用途的全部的行为，只要是可使其想起、类推上述用途的表示，则不限于表示的目的、表示的内容、表示的对象物和介质等，全部符合“表示”。但是，优选通过消费者能够直接地认识上述用途的表现来表示。

具体而言，能够例示在本发明的饮食品涉及的商品或商品的包装上表示上述用途，特别优选在包装、容器、目录、宣传册、POP等销售现场的宣传材料、其它文件等的表示。此外，作为表示，能够例示例如健康食品、功能性食品、肠内营养食品、特殊用途食品、营养功能食品、准药品(Quasi-Drugs)、特定保健用食品等。

作为本发明的包含乳酸菌的饲料组合物的饲料，可举出宠物食品、家畜饲料、养鱼饲料等。这样的饲料能够通过在一般的饲料例如谷类、粕类、糠类、鱼粉、骨粉、油脂类、脱脂奶粉、乳清(Whey)、卤水、矿物质饲料、酵母类等中混合乳酸菌而制造。此外，例如也可以像青贮饲料的情况那样，经过添加乳酸菌的发酵工序而制造饲料。制造的饲料能够口服给与通常的哺乳动物、家畜类、饲养鱼类、宠物等。此外，在饲养鱼类的情况下，也能够采用将添加了本发明的乳酸菌的发酵物撒在养鱼场的方法。

饲料组合物中乳酸菌的含量可以根据饲料的方式、给与对象而适当设定，优选为1×10⁶～1×10¹²cfu/g或1×10⁶～1×10¹²cfu/ml的范围内，更优选为1×10⁷～1×10¹¹cfu/g或1×10⁷～1×10¹¹cfu/ml的范围内。在乳酸菌为死菌的情况下，cfu/g或cfu/ml能够替换为个细胞/g或个细胞/ml。

本发明的包含乳酸菌的饲料组合物能够用于例如利用抗过敏效果的各种用途。

作为本发明的包含乳酸菌的化妆品组合物的化妆品，可举出例如肥皂、沐浴露、洁面霜、洗面奶等清洁剂；化妆水(lotion)、雪花膏、冷霜、润肤霜、按摩霜等乳霜；乳液、美容液等。

在本发明的包含乳酸菌的化妆品组合物中，优选使用例如下述的乳酸发酵蛋清，该乳酸发酵蛋清是将鸡等鸟类的蛋打破，在分离出蛋黄的液体状的蛋清中添加本发明的乳酸菌，使其发酵而得到的。这样的乳酸发酵通常可以使用葡萄糖等作为营养源，根据需要添加酵母提取物等发酵促进物质，使其发酵。乳酸发酵蛋清的形态根据配合的化妆品可举出例如液体状、粉末状、霜状、膏状、果冻状等。

用于本发明的化妆品组合物的乳酸菌的含量例如以乳酸发酵蛋清的干燥物换算计通常设为0.001重量％以上、进一步优选设为0.01重量％以上。

本发明的包含乳酸菌的化妆品组合物能够用于例如利用抗过敏效果的各种用途。此外，也能够用作显示美白效果、保湿效果的化妆品。

实施例

以下，根据实施例对本发明进行进一步详细地说明，但是本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

乳酸菌的分离及鉴定

1.乳酸菌样品的分离

选择无花果(品种为“とよみつ姫”)的叶、茎和果实，使用杀菌过的镊子和剪刀制成2～3mm的小碎片后，在放有灭菌过的MRS液体培养基的试管中各放入5～6个碎片，在28℃和37℃静置培养，直到作为乳酸菌的标准培养基的MRS培养基浑浊(增殖)。此外，直到乳酸菌候选株的增殖能够目视为止需要2～4日。

将上述乳酸菌候选株的各培养液的一部分在MRS寒天培养基上使用一次性圈划线接种后，进行静置培养。在寒天培养基上形成的菌落中，将“颜色、光泽、形状不同的菌落”全部取出，在新鲜的MRS寒天培养基上进行划线接种，将菌落纯化。

对于纯化的各菌落，为了验证有无过氧化氢酶的产生，进行H₂O₂测试。这是观察在将菌体暴露于10％的H₂O₂溶液中时是否发生氧的产生的试验法，如果存在过氧化氢酶就会产生氧。此外，乳酸菌不产生过氧化氢酶。

作为尝试从无花果的探索分离的结果，从将无花果的叶作为分离源的菌株中能够得到1株显示过氧化氢酶阴性的乳酸菌候选株。

2.分离株的鉴定

将上述乳酸菌候选株用MRS液体培养基重新培养，通过离心分离获得菌体。用细胞壁溶解酶处理后使用DNAzol试剂，提取基因组DNA。

按照Lane,D.J.(1991).16S/23S rRNA sequencing.In Nucleic AcidTechniques in Bacterial Systematics、pp.115-175.Edited by E.Stackebrandt&M.Goodfellow.Chichester:Wiley记载的方法，将基因组DNA作为模板，通过使用27f引物(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(序列表的序列号1)和1525r引物(5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3')(序列表的序列号2)的PCR反应而使16S rDNA部分扩增，利用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG制)，从琼脂糖凝胶中回收目标片段。用于确定碱基序列的基于Dye terminator法的测序反应用Big DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1(ThermoFisherScientific公司制)进行，用ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(ThermoFisherScientific公司制)解析。解析了的16S rDNA的碱基序列具有序列表的序列号1的碱基序列。对该碱基序列利用BLAST program进行相同性检索，与DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)的数据库比较，由此进行分离株的分类学鉴定。

将从无花果的叶中分离的乳酸菌候选株命名为IJH-SONE68株，它与已经登录在DNA data bank(DDBJ/EMBL/GenBank)的“Lactobacillus paracasei R094”的菌株中碱基序列的accession号为“NR_025880”的碱基序列100％一致，因此鉴定为Lactobacillusparacasei。

该菌株于2016年4月19日作为保藏号NITE P-02242国际保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物中心(National Institute of Technology andEvaluation，〒292-0818千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8 122号室)，之后基于布达佩斯条约转移到国际保藏，于2017年5月19日被赋予国际保藏的保藏号NITE BP-02242。

3.基因组DNA的序列分析

对于IJH-SONE68株的基因组DNA，利用使用了P6聚合酶和C4化学染料(P6C4)的单分子实时(SMRT)细胞，通过PacBio RS II(Pacific Biosciences、Menlo Park、CA、U.S.A.)进行基因组DNA测序。将提纯的基因组DNA试样使用g-TUBE试剂盒(Covaris、Woburn、MA、U.S.A.)剪断为碎片。接下来，将剪断的碎片用AMPure PB试剂盒(Pacific Biosciences)提纯。使用PacBio DNA模板制备试剂盒1.0(Pacific Biosciences)和PacBio DNA/Polymerase Binding Kit P6(Pacific Biosciences)构筑DNA文库。通过Blue Pippin(Sage Science、Beverly、MA、U.S.A.)将短碎片除去，接下来将提纯DNA文库在PacBio SMRT平台上进行测序。使用分层基因组装配过程(HGAP)协议(Nat.Methods,10,563-56933)进行从头组装(de novo assembly)，将得到的全部基因组重叠群通过微生物基因组注释管道(MiGAP)进行注释(The 20th International Conference on Genome Informatics(GIW2009)Poster and Software Demonstrations(Yokohama),S001-1-2)。

4.基因组DNA的序列分析结果

测定IJH-SONE68株的全基因组序列，其结果是基因组DNA由GC含量46.37％的3084917bp形成，结构遗传基因的数量通过MiGAP预测为2963个。进而，根据序列的结果，示出IJH-SONE68株包含2个质粒，其中1个至少为51kbp，另1个为45267bp的大小。与其它乳酸菌相比，IJH-SONE68株具有更大的基因组大小和结构遗传基因数。

实施例2

经分离鉴定的乳酸菌的菌学性质

经分离鉴定的上述乳酸菌IJH-SONE68株如图1的照片示出那样具有下述菌学的性质：其为过氧化氢酶阴性的革兰阳性杆菌，并且具有白色菌落形成性，具有条件性异乳酸发酵的特性且具有产生多糖体的能力。

实施例3

经分离鉴定的乳酸菌的糖类同化能力

1.同化能力的试验方法

对于IJH-SONE68株对49种糖类的同化能力，通过以下的试验方法进行研究。

将IJH-SONE68株用MRS液体培养基静置培养至增殖的静止期。将离心得到的菌体用适量的suspension medium(bioMérieux,Inc制)清洗后，最终悬浮在2mL的suspensionmedium中。将其一部分加入5mL的suspension medium中，求出麦克法兰浊度成为2的量(n)。接下来，在API 50 CHL培养基(bioMérieux,Inc制)中添加2n的菌液，将其分注到API 50CHL试剂盒(bioMérieux,Inc制，在各孔的底部分别涂有49种的糖)的各个孔中。最后，层叠矿物油，放置于放有灭菌水的托盘中。在37℃培养48小时后，观察各孔的色调的变化，由此进行有无同化能力的判定。

2.同化能力的试验结果

对于IJH-SONE68株对49种糖类的同化能力进行研究的结果如表1所示。在表1中，也一并示出了对专利公开公报记载的其它Lactobacillus paracasei使用同样的试剂盒而研究的同化能力。

[表1]

IJH-SONE68株对糖类的同化能力

表中，+表示能够同化，-表示不能够同化。

对于糖同化试剂盒：在JP2016-123382、JP2011-142907中使用API50CHL(bioMerieux.Inc.制)试剂盒。在JP2016-113378中使用AIP50CH(SIMEx BioMerieux.Inc.制)。

在JP2007-189973和JP2016-37451中没有特别说明使用的试剂盒。，

NITE P-01960、NITE PB-01633、NRRL-B50327为Lactobacillus paracasei，NITEP-159、NITE P-160、NITE P-01810为Lactobacillus paracasei ssp.paracasei。

根据表1的结果可知，与其它的Lactobacillus paracasei相比，IJH-SONE68株不会同化在分解时可能会产生氢氰酸的苦杏仁甙，不会同化抑制黑色素产生而被誉为有美白效果的熊果苷，也不会将它们分解，因此可以说安全性优异，在作为化妆品的添加剂使用的情况下美白效果优异。此外，相对于其它Lacto bacillus paracasei不能同化D-核糖、能够同化D-松二糖的情况，IJH-SONE68株具有能够同化D-核糖、不能够同化D-松二糖的特征。

实施例4

1.IJH-SONE68株产生的多糖体的分离提纯

用以下的方法将IJH-SONE68株产生的胞外多糖进行分离提纯。

将IJH-SONE68株用MRS液体培养基静置培养至增殖的静止期。将5mL的该培养液作为种子培养液，接种在5L的多糖体产生用半合成培养基(其组成后述)后，在37℃静置培养120小时。将培养液冷却至4℃后，为了使培养液上清液中包含的蛋白质变性而在之后的步骤中作为沉淀除去，加入202.5mL的100％三氯乙酸水溶液，混合后静置30分钟。通过离心取除沉淀，在回收的上清液中加入等量的丙酮混合后，在4℃静置一晚，由此使IJH-SONE68株产生的多糖体沉淀。将沉淀物通过离心回收后，用250mL的70％乙醇进行沉淀物的清洗。使沉淀物风干后，通过加入75mL的50mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)混合1小时，由此使沉淀物溶解。通过离心将不溶性的杂质取除后，对回收的上清液分别加入750μL的1mg/mL DNase溶液(Worthington Biochemical Corporation)和1mg/mL RNase溶液(nacalai.co.jp)，在37℃反应8小时。接下来加入750μL的2mg/mL proteinase K溶液(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation.制)，在37℃反应16小时。将反应后的溶液冷却至4℃后，为了使添加的各个酶变性而在之后的离心中作为沉淀除去，加入8.75mL的100％三氯乙酸水溶液进行混合，在4℃静置1小时。通过离心取除沉淀，对得到的上清液加入262.5mL的100％乙醇，充分地混合后，通过离心从而将IJH-SONE68株产生的多糖体作为沉淀物回收。用50mL的70％乙醇清洗沉淀物后风干，加入适量(约25mL)的纯净水，在4℃静置一晚，由此使多糖体溶解。对于溶解后的多糖体样品，使用10000MWCO的超滤单元(默克公司)将溶剂置换为纯净水，并且取除回收的样品中的单糖类等小分子，得到经提纯的多糖体样品。

将提纯了的多糖体样品上样于填充了TOYOPEARL DEAE-650M树脂(东曹株式会社)的开放柱(2.5×22cm)，进行为了分离提纯中性多糖组分和酸性多糖组分的过柱，其中，该TOYOPEARL DEAE-650M树脂预先用50mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)平衡过。溶液使用相同的buffer，流速固定在1mL/min。此外，将溶出液每6mL回收于不同的试管中。首先，从开始到240分钟为止之间用相同的buffer使之溶出(试管号1-40)。接下来，从240分钟的时刻到600分钟的时刻为止，制作使用相同的buffer的0-500mM NaCl的浓度梯度，继续溶出(试管号41-100)。柱分离谱图示于图2。对于溶出于试管的全部样品，通过苯酚硫酸法(后述)确认了多糖体的存在后，将该试管内的溶液分别作为中性多糖组分、酸性多糖组分合并。对于各个组分，使用10000MWCO的超滤单元将溶剂置换为纯净水，并且取除回收的样品中的单糖类等小分子。

通过以上，将中性多糖组分和酸性多糖组分作为IJH-SONE68株产生的胞外多糖而分离提纯。

多糖体产生用半合成培养基是将Kimmel SA、Roberts RF.Development of agrowth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillusdelbrueckii ssp.bulgaricus RR.Int.J.Food Microbiol.、40、87-92(1998)记载的培养基按以下的方式进行改变。

微量元素溶液被记载于Kets EPW,Galinski EA,de Bont JAM.Carnitine:anovel compatible solute in Lactobacillus plantarum.Arch.Microbiol.,192,243-248(1994)，其组成为如下所述。

苯酚硫酸法(DuBois M,Gilles KA,Hamilton JK,Rebers PA,SmithF.Colorimetric method for determination of sugars and relatedsubstances.Anal.Chem.,28,350-356(1956))

将30μL的对象样品与等量的5w/v％苯酚水溶液混合后，加入150μL的浓硫酸混合，使反应开始。在10分钟后立刻进行冰冷，使反应停止。通过测定反应液在490nm的吸光度，从而测定糖类的浓度。应予说明的是，在浓度的确定中，使用将葡萄糖作为标准品进行相同实验从而制作的标准曲线。

2.胞外多糖的分析

将上述通过阴离子交换柱色谱(TOYOPEARL DEAE-650M树脂(东曹株式会社))而提纯的胞外中性多糖进行H-NMR和C-NMR，将得到的各自的NMR曲线示于图3。它们的基于NMR曲线的胞外中性多糖的结构解析结果示于图4。

根据该结构解析结果，明确了IJH-SONE68株的胞外中性多糖具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构。

3.IJH-SONE68株的胞外多糖的生物合成遗传基因簇的解析

基于实施例1记载的IJH-SONE68株的基因组序列的注释，在基因组DNA上发现了2个胞外多糖生物合成遗传基因簇(图5)。将其中一个23kb的簇命名为pce1簇，该pce1簇由包含对功能不明的蛋白质进行编码的遗传基因的18个开放阅读框(ORF(pce1A～R))构成。将另一个28kb的簇命名为pce2簇，这个pce2簇包含12个完整的ORF和3个截短(truncated)ORF(pce2A～O)。进而，在pce2簇上发现了12个转座酶相关遗传基因。

关于在胞外多糖的生物合成中需要的编码蛋白质的遗传基因，在pce1簇中没有发现编码作为链长调节因子而发挥作用的蛋白质-酪氨酸磷酸酶Wzb的wzb遗传基因(YotherJ.Annu.Rev.Microbiol.,65,563-581(2011))。另一方面，在pce2簇上不存在与催化糖聚合的最初工序的引导糖基转移酶(van Kranenburg R,Vos HR,van Swam II,Kleerebezem M,de Vos WM.J Bacteriol.1999 Oct；181(20):6347-6353)显示相同性的遗传基因。

制作IJH-SONE68株、ATCC334株(Makarova,K.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(42),15611-15616(2006))和JCM8130T株(Toh,H.et.al,PLoS ONE 8,e75073(2013))这三个乳酸菌之间的基因组重排图谱(图6)。根据图谱可知pce2簇区域对IJH-SONE68株是特异的。另一方面，在ATCC334株的基因组上没有发现对pce1簇显示相同性的遗传基因簇，但在JCM8130T株上存在。

基于上述的相同性检索，在pce1簇和pce2簇上，发现了分别与wzb遗传基因和引导糖基转移酶遗传基因相同的遗传基因。由于在IJH-SONE68株的基因组DNA中没有发现其它的簇等，因而可以认为，对胞外多糖的生物合成而言必要的基因以pce1簇和pce2簇相互补充。实际上，pce1簇和pce2簇仅仅只相隔34kb。

在pce2簇中，发现了从1个命名为pce2J的糖基转移酶遗传基因中推定的蛋白质带有与已知的在β-1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶中发现的pfam02485基序或结构域(GenesDev.1993 Mar；7(3):468-478和J.Biol.Chem.1999 Jan 29；274(5):3215-3221)同样的基序或结构域，由此，启示了在pce2簇中编码该蛋白质的结构遗传基因参与中性多糖的生物合成。实际上，与ATCC 334株和JCM 8130T株相比较，pce2簇对IJH-SONE68株基因组是特异的，可以认为，可以由pce2簇生物合成新结构的中性多糖。

实施例5

IJH-SONE68株产生的胞外多糖体的透明质酸酶抑制活性

研究作为在实施例4中得到的IJH-SONE68株产生的胞外多糖的、包含中性多糖组分和酸性多糖组分的多糖样品、以及中性多糖组分和酸性多糖组分的透明质酸酶抑制活性。

1.试验方法

对于10μL的下述水溶液，添加5μL的透明质酸酶溶液(MP Biomedicals公司、4mg/mL、100mM乙酸钠buffer(pH 4.0))，在37℃孵化20分钟，该水溶液含有将实施例4中得到的包含中性多糖组分和酸性多糖组分的多糖体样品、中性多糖组分及酸性多糖组分调节至任意浓度的多糖。之后，加入10μL的酶活性化溶液(0.5mg/ml Compound 48/80(MPBiomedicals公司)、3.75mg的CaCl₂·2H₂O、100mM乙酸钠buffer(pH 4.0))，再在37℃孵化20分钟。接下来，加入25μL的透明质酸钠溶液(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation.、0.8mg/mL、100mM乙酸钠buffer(pH 4.0))，进一步在37℃反应40分钟。在反应后，通过加入10μL的0.4M的NaOH水溶液而使反应停止。接下来加入10μL的100mM硼酸钾buffer(pH 10.0)，之后在100℃加热3分钟，立刻进行冰冷。将40μL的反应液与200μL的p-DMAB溶液(后述)混合，在37℃反应20分钟，之后测定在585nm的吸光度。作为对照，对不包含透明质酸酶溶液的反应液也同样地进行制备，进行实验。

对于多糖体样品的酶活性抑制率，通过以下的式子求出。

抑制率(％)＝100-(S/C)×100

在该式中，C表示不包含样品的情况下的酶活性，S表示包含样品的情况下的酶活性。此外，对于多糖体样品的IC₅₀值，在取得多个使含有浓度变化的数据后，制图成取X轴为多糖体样品浓度、Y轴为抑制率的图表，根据以下的近似式而求出。

[数1]

Y＝α/(1+βe^-γX)

式中α、β和γ表示常数。

p-DMAB溶液(Fujitani N、Sakai S、Yamaguchi Y、Takenaka H.Inhibitoryeffects of microalgae on the activation of hyaluronidase.J.Appl.Phycol.,13,489-492(2001))

在即将使用10×储备溶液(5g的p-dimethylaminobenzaldehyde、6ml的10M的HCl、44ml的乙酸)之前以乙酸稀释来制备p-DMAB溶液。

2.试验结果

将得到的对于透明质酸酶的抑制活性的试验结果示于表2。

[表2]

IJH-SONE68株产生多糖体的透明质酸酶活性抑制

*到2000μg/ml为止，没有观察到透明质酸酶活性抑制

根据表2的结果显然可知，作为IJH-SONE68株产生的胞外多糖的多糖样品(包含中性多糖组分和酸性多糖组分)、中性多糖组分和酸性多糖组分显示高的透明质酸酶活性抑制。特别是多糖体样品和中性多糖组分显示了与具有抗炎作用的甘草酸二钾相同程度的透明质酸酶活性抑制。

实施例6

IJH-SONE68株的耐酸性特性

为了研究IJH-SONE68株的耐酸性特性，进行对人工胃液和人工胆汁的耐酸性试验。

1.对人工胃液的耐酸性试验

(1)试验方法

人工胃液使用日本药局方崩解试验第一溶液(pH1.2)和日本药局方崩解试验第二溶液(pH6.8)(均为FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.制)制备。制备含有0.04w/v％胃蛋白酶(1∶10000，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corpora tion.制)、pH3.0的人工胃液，定量接种以MRS液体培养基静置培养至稳定状态的IJH-SONE68株的种子培养液后，计数1、3、5小时后的活菌数。将接种时刻的活菌数作为100％，求出生存率。另外，在计测活菌数时，将经过各小时后的溶液的一部分稀释至适当阶段，使用BCP平板计数琼脂(Nissui Pharma ceutical Co.，Ltd.)进行倾注培养(37℃，厌氧，数日)，计数产生的菌落数，由此算出该稀释液中存在的活菌数。同时也对Lactobacillus bulgaricus B-5b(http：//www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search_detail.php？maff＝401001)进行试验。

(2)试验结果

得到的耐酸性试验结果示于表3。

[表3]

对人工胃液的耐性

根据表3的结果显然可知，与Lactobacillus bulgaricus B-5b相比，IJH-SONE68株对人工胃液具有高耐酸性特性。

2.对人工胆汁的耐酸性试验

(1)试验方法

制备含有0.1、0.2、0.3w/v％胆汁粉(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation.制)的MRS液体培养基，0.1v/v％接种以MRS液体培养基静置培养至稳定状态的IJH-SONE68株的种子培养液，在37℃进行24小时的静置培养。培养结束后，将不含胆汁粉的MRS培养基的菌体的浊度(O.D.600nm)作为100％，算出包含各浓度的胆汁粉的MRS培养基的菌体浊度的比例。同时也对Lactobacillus acidophilus L-54(由日本乳业技术协会提供)和Lactobacillus bulgaricus B-5b进行试验。

(2)试验结果

得到的耐酸性试验结果示于表4。

[表4]

对人工胆汁的耐性

根据表4的结果显然可知，与Lactobacillus acidophilus L-54和Lactobacillusbulgaricus B-5b相比，IJH-SONE68株对人工胆汁具有高耐酸性。

实施例7

IJH-SONE68株对酒精伤害的效果

为了研究IJH-SONE68株对酒精伤害的效果，对于IJH-SONE68株对酒精性肝炎诱导模型小鼠的影响进行研究。

1.试验方法

对具有酒精嗜好性的C57BL/6J系雄性小鼠(日本CLEA，8周)，使其摄取6周含酒精饲料，由此制作酒精性肝炎诱导模型小鼠，观察其间乳酸菌摄取的有无造成的影响。具体而言，在饲育期间中根据饲料的不同将小鼠分为以下3组((1)～(3))，在饲育开始6周后进行采血。

1)：阳性对照组(仅使用含酒精饲料L10016)

2)：阴性对照组(仅使用不含酒精饲料L10015)

3)：IJH-SONE68株给与组(含酒精饲料L10016+乳酸菌活菌体)

含酒精饲料L10016：

在即将使用前将水和酒精混合于Pre-Mix L10016A(Research Diet公司)中而制备

不含酒精饲料L10015：

在即将使用前将水和麦芽糊精混合于Pre-Mix L10016A(Research Diet公司)中而制备

另外，就小鼠而言，购入7周龄的小鼠，每1组设为5只，为了适应1周，预先用普通饲料(OYC Oriental Yeast CO.,LTD，MF)饲育，之后供给试验。饲育在广岛大学霞校区的霞动物实验设施进行，此外，在饲育期间中维持湿度为40-60％、气温为20-26℃，在每12小时切换照明的ON/OFF的环境下进行。每个小鼠的识别通过使用动物记号笔(Muromachi KikaiCo.,Ltd.制)分别将尾部涂色而进行(以红、蓝、绿、黄、无涂色进行区别)。

试验饲料为下述饲料：在MRS培养基中培养各乳酸菌株、清洗，混合于酒精饲料中。在实验中，饲料设为每日交换放入喂食容器的饲料、且能够自由摄取的方式。应予说明的是，不给予包含水在内的一切其它饲料。此外，也对于饲料的剩余量进行计测。从开始饲育经过6周后，通过吸入异氟醚和腹腔给与戊巴比妥，从而使小鼠安乐死，进行采血。从血液回收的血清冻存于-80℃。进行血生化检查，测定被作为酒精伤害的检查指标的血清中的AST(天冬氨酸氨基转移酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、ALP(碱性磷酸酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、LAP(亮氨酸氨基肽酶)和LIP(脂肪酶)的值。各测定值的统计解析根据SPSS 17.0(SPSSJapan)而进行。

2.试验结果

将对于阳性对照组(PC)、阴性对照组(NC)和IJH-SONE68株给与组(SONE68)的AST、ALT、ALP、LDH、LAP和LIP的各测定值(IU/L)示出于图7～12的图表。根据图7～12的图表可知，IJH-SONE68株比阳性对照组(PC)减少了AST、ALT、ALP、LDH、LAP和LIP的值，具有对酒精伤害的优异的预防改善效果。

实施例8

IJH-SONE68株在原浆中的应用

以下示出将IJH-SONE68株应用于由无花果果实、酒糟等形成的原浆的例子。

将无花果果实切分为适当的大小，加入相对于重量而言1.0(w/w)％的纤维素酶“ONOZUKA”3S、0.5(w/w)％的果胶酶3S、0.5(w/w)％的抗坏血酸钠、2.0(w/w)％的酒糟(酿造副产物)粉末和100(w/w)％的纯水，使用全提取装置(Toyo Koatsu Inc.制)，在50℃、100MPa的条件下进行24小时处理。具体而言，用菜刀将无花果果实大致均等地分割成1/4大小，将必要量的分割了的无花果果实预先投入处理用小袋(杂交袋、Cosmo Bio Co.,Ltd.制)，向其中添加溶解了全部上述试剂的水溶液后，尽可能地取除气泡，利用密封机(聚合密封机、AS ONE Corporation.制)而密封。将密封后的袋子放入全提取装置(2L型号、ToyoKoatsu Inc.制)，以上述条件进行处理。另外，在培养前，在清洁工作台(SANYO公司制)内将小袋无菌开封(使用以酒精进行灭菌处理的剪刀)，将内容物无菌转移至预先通过高压灭菌机(TOMY SEIKO CO.,LTD.制)处理而进行了灭菌处理的容器(广口塑料瓶、AS ONECorporation.制)。

对于制备的原浆，以成为1(v/v)％相当量的方式添加预先使用MRS培养基在37℃种子培养了2-3日的Lactobacillus paracaseiIJH-SONE68株的菌体悬浊液，在37℃进行48小时静置培养。具体而言，首先将在每个螺纹试管中分别注入了10mL的MRS培养基(默克公司)以118℃、15min的条件进行高压灭菌，在清洁工作台内向其中接种在-80℃冻存的IJH-SONE68株的菌液备份。盖严后，将试管立于培养器，并以竖立的状态在37℃培养2-3日。培养后，颠倒混匀至培养液的浑浊度变得均匀为止，在清洁工作台内将内容物移至15mL容量的离心管(Nunc公司制)。通过离心(Eppendorf公司制)使菌体沉淀后，在清洁工作台内将培养液上清液舍去，并且加入10mL的原浆，盖严后，通过涡流机(Scientific Industries公司制)使沉淀的菌体再悬浊。之后，在清洁工作台内向原浆加入必要量的菌体悬浊原浆，盖严后，将瓶子以竖立的状态在培养器(Yamato Scientific Co.,Ltd.制)中在37℃进行2-3日的培养。

通过以上而得到的原浆与没有加入菌体悬浊液而得到的原浆相比，酸味增加，得到了良好的口感和风味。

实施例9

使用蛋清培养基的培养

将IJH-SONE68株使用蛋清培养基培养，研究其增殖。

1.蛋清培养基的制备及培养

(1).方法

将连壳用酒精轻微消毒了的鸡蛋在清洁工作台中打破，将蛋黄与蛋清分割，只取得蛋清部分。蛋白取出分到50mL容量的锥形管中，进行利用涡流的搅拌从而制成均匀的粘度后，以成为均匀的量的方式分注到培养用的其它管内。

将种子培养的IJH-SONE68株的乳酸菌的培养液以终浓度成为1v/v％的方式无菌接种于各管，进行静置培养。同样地，使用作为其它乳酸菌的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(LP28株)进行培养。

(2).结果

培养结果示于图13。由图13可知，IJH-SONE68株的乳酸菌在使用蛋清的培养基中非常多地增殖。

2.在蛋清中加入了葡萄糖和纯盐卤的培养基的制备及培养

(1).方法

在以上述(1)的方法进行培养时，以终浓度成为1v/v％的方式在蛋清中加入葡萄糖，进而，同样地以终浓度成为1v/v％的方式在蛋清中加入纯盐卤(组成：Na⁺：92mg；Ca²⁺:3500mg；Mg²⁺:6400mg；以及K⁺:2300mg)，进行培养。具体而言，在乳酸菌的培养前，分别无菌添加进行了过滤灭菌处理的蛋清1/10容量的10w/v％的葡萄糖水溶液、以及同样地进行了过滤灭菌处理的蛋清1/100容量的纯盐卤，进行培养。

(2).结果

培养结果示于图14。由图14可知，IJH-SONE68株的乳酸菌在对蛋清加入葡萄糖和纯盐卤的培养基中显著地增殖。

由这些结果可知，IJH-SONE68株的乳酸菌在使用蛋清的培养基中也能发挥强大的增殖能力，因此，该乳酸菌对于作为存在于蛋清中的分解细菌细胞壁的酶的溶菌酶、带有通过螯合作用而妨碍细菌的铁利用的功能的运铁蛋白等的活体防御机制强。

根据以上详细的说明中显然可知，根据本发明，可以提供以下的发明。

[1]一种乳酸菌，以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1,6键连接的结构的中性多糖。

[2]根据上述[1]所述的乳酸菌，其中，上述乳酸菌为属于乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌。

[3]根据上述[1]或[2]所述的乳酸菌，其中，上述乳酸菌为属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)属的乳酸菌。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的乳酸菌，其中，上述乳酸菌为来自无花果的乳酸菌。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的乳酸菌，其中，上述乳酸菌为Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株(保藏号NITE BP-02242)或与之同等的乳酸菌。

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的乳酸菌，其中，上述中性多糖具有透明质酸酶抑制活性。

[7]一种组合物，其含有上述[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌。

[8]根据上述[7]所述的组合物，其中，组合物为饮食品组合物。

[9]根据上述[8]所述的组合物，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。

[10]根据上述[7]所述的组合物，其中，组合物为药品组合物。

[11]根据上述[7]所述的组合物，其中，组合物为饲料组合物。

[12]根据上述[7]所述的组合物，其中，组合物为化妆品组合物。

[13]根据上述[7]～[12]中任一项所述的组合物，其用于透明质酸酶抑制。

[14]根据上述[7]～[12]中任一项所述的组合物，其用于抗过敏。

[15]根据上述[7]～[12]中任一项所述的组合物，其用于抗酒精伤害。

[16]上述[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌作为组合物的有效成分的用途。

[17]根据上述[16]所述的用途，其中，组合物为饮食品组合物。

[18]根据上述[17]所述的用途，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。

[19]根据上述[16]所述的用途，其中，组合物为药品组合物。

[20]根据上述[16]所述的用途，其中，组合物为饲料组合物。

[21]根据上述[16]所述的用途，其中，组合物为化妆品组合物。

[22]根据上述[16]～[21]中任一项所述的用途，其中，组合物为用于透明质酸酶抑制的组合物。

[23]根据上述[16]～[21]中任一项所述的用途，其中，组合物为用于抗过敏的组合物。

[24]根据上述[16]～[21]中任一项所述的用途，其中，组合物为用于抗酒精伤害的组合物。

[25]一种组合物的制造方法，包含将上述[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌与其它的成分混合。

[26]根据上述[25]所述的制造方法，其中，组合物为饮食品组合物。

[27]根据上述[26]所述的制造方法，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。

[28]根据上述[25]所述的制造方法，其中，组合物为药品组合物。

[29]根据上述[25]所述的制造方法，其中，组合物为饲料组合物。

[30]根据上述[25]所述的制造方法，其中，组合物为化妆品组合物。

[31]根据上述[25]～[30]中任一项所述的制造方法，其中，组合物为用于透明质酸酶抑制的组合物。

[32]根据上述[25]～[30]中任一项所述的制造方法，其中，组合物为用于抗过敏的组合物。

[33]根据上述[25]～[30]中任一项所述的制造方法，其中，组合物为用于抗酒精伤害的组合物。

[34]一种应用方法，其为将上述[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌应用于需要其的对象的方法，包含将含有上述[1]～[6]中任一项所述的乳酸菌的组合物应用于对象的步骤。

[35]根据上述[34]所述的应用方法，其中，组合物为饮食品组合物。

[36]根据上述[35]所述的应用方法，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。

[37]根据上述[34]所述的应用方法，其中，组合物为药品组合物。

[38]根据上述[34]所述的应用方法，其中，组合物为饲料组合物。

[39]根据上述[34]所述的应用方法，其中，组合物为化妆品组合物。

[40]根据上述[34]～[39]中任一项所述的应用方法，其中，对于对象发挥透明质酸酶抑制作用。

[41]根据上述[34]～[39]中任一项所述的应用方法，其中，对于对象发挥抗过敏作用。

[42]根据上述[34]～[39]中任一项所述的应用方法，其中，对于对象发挥抗酒精伤害。

产业上的可利用性

如以上详细说明的那样，本发明的乳酸菌产生发挥透明质酸酶抑制活性且显示抗过敏效果的胞外多糖，并且显示抗酒精伤害效果。进而，本发明的乳酸菌对胃酸、胆汁酸具有高耐性，在使用蛋清的培养基中也能发挥强大的增殖能力。因此，本发明的乳酸菌能够用作饮食品、药品、饲料、化妆品等的有效成分。

Claims (15)

1.一种乳酸菌，其以胞外多糖的形式产生具有N-乙酰葡糖胺通过α-1，6键连接的结构的中性多糖。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为属于乳杆菌即Lact obacillus属的乳酸菌。

3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为属于副干酪乳杆菌即Lactobacillus paracasei属的乳酸菌。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为来自无花果的乳酸菌。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为Lactob acillusparacasei IJH-SONE68株或与之同等的乳酸菌，Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株的保藏号为NITE BP-02242。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的乳酸菌，其中，所述中性多糖具有透明质酸酶抑制活性。

7.一种组合物，其含有权利要求1～6中任一项所述的乳酸菌。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，组合物为饮食品组合物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，饮食品为饮料、功能性食品、发酵食品或补充剂。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中，组合物为药品组合物。

11.根据权利要求7所述的组合物，其中，组合物为饲料组合物。

12.根据权利要求7所述的组合物，其中，组合物为化妆品组合物。

13.根据权利要求7～12中任一项所述的组合物，其用于抑制透明质酸酶。

14.根据上述权利要求7～12中任一项所述的组合物，其用于抗过敏。

15.根据权利要求7～10中任一项所述的组合物，其用于抗酒精伤害。

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