CN109468247A - 耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种耐乙醇、耐高温及高产酸的耐酸乳杆菌及其用途。针对浓香型白酒发酵后期乙醇含量高，需要分离耐受乙醇浓度更高的菌株来适应的问题，本发明提供了一种耐乙醇、耐高温及高产酸的耐酸乳杆菌。该菌株已在CGMCC中心保藏，保藏号为CGMCC NO.16507。本发明的耐酸乳杆菌菌株同时具有耐高浓度乙醇、耐高温及高产酸的能力，耐受最高乙醇浓度为15％、耐受最高温度为45℃、产乳酸能力达到17.5g/L，为提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

Description

耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途

技术领域

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途。

背景技术

浓香型白酒是我国传统白酒中的典型代表之一，在世界范围内产生了广泛的影响，占有举足轻重的地位。现有的高通量测序研究表明，在浓香型白酒酒醅发酵中后期，细菌菌群中有90％以上为耐酸乳杆菌，这主要是因为耐酸乳杆菌能够耐受高乙醇浓度、高酸度、低含氧量等条件。而浓香型白酒发酵中后期是乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等风味物质形成的重要阶段，所以，作为优势菌的耐酸乳杆菌是形成这些风味物质的重要菌株，耐酸乳杆菌对白酒的风味具有重大贡献。因此，对耐酸乳杆菌的分离鉴定以了解其特性就显得非常重要。但在浓香型白酒中，关于耐酸乳杆菌的报道主要是DNA序列信息方面，还没有关于分离鉴定获得耐酸乳杆菌菌株的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：浓香型白酒发酵后期乙醇含量高，需要分离耐受乙醇浓度更高的菌株来适应的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。其保藏编号为CGMCC NO.16507。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述耐酸乳杆菌的16S rDNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1耐酸乳杆菌的16S rDNA核苷酸序列

ttcgggtatgaagttagggaagcgagcggcggatgggtgagtaacacgtgggtaacctaccctatagtctgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataaaaggagagatcacatgatttctttttgaaaggcggcgtaagctgtcgctaaaggatggacccgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaagatagtgagagtaactgctcattatttgccggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaaagataagtcagatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaatagcatcggaaactgtctttcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagatacctggtagtccatgctgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctcagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctagtgccaacctaagagattaggcgttcccttcggggacactaagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattattagttgccagcattaagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgaggagcgaacttgtgaaggcaagcgaatctctgaaagctgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaatg。

其中，上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15％，温度耐受为≤45℃，产乳酸能力为≤17.5g/L。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的细胞学特征为：菌体为杆状，菌落呈乳白色，圆形，表明光滑湿润、凸起、边缘整齐。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的生物学特征为：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、N-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-D-吡喃木糖苷、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。

本发明还提供了一种上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌在酿酒中的用途。

本发明的有益效果为：本发明首次分离鉴定了一株耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌，该耐酸乳杆菌能耐受15％的乙醇，耐受45℃高温，产乳酸能力达到17.5g/L，是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

本发明提供的耐酸乳杆菌于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC NO.16507，生物学分类命名为耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans。

附图说明

图1所示为本发明耐酸乳杆菌菌株形态图；

图2所示为耐酸乳杆菌的16S rDNA系统发育树图；

图3所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐乙醇能力图；

图4所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受温度图；

图5所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受盐度图；

图6所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受pH图。

具体实施方式

本发明提供了一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌，其保藏编号为CGMCCNO.16507。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15％，温度耐受为≤45℃，产乳酸能力为≤17.5g/L。

本发明的菌株是从宜宾五粮液股份有限公司酒醅中分离获得。

本发明的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌能耐受15％的乙醇，耐受45℃高温，产乳酸能力达到17.5g/L，是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明使用的培养基MRS组成包括：酪蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L，吐温80 1g/L，pH自然。

斜面和平板培养基为相应MRS培养基中加入2％的琼脂粉。

实施例1耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotoleransR3的分离和鉴定

1、菌株的分离

发酵糟醅取自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间。取10g出窖的酒醅于90mL无菌生理盐水中，振荡混匀后取上清液进行梯度稀释，取10^-2-10^-5稀释液涂布于含溴甲酚绿的MRS平板上，37℃厌氧下培养7天，挑选平板上的菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株，斜面保存。菌株命名为R3。

2、菌株的形态学特征

分离得到的R3菌株为革兰氏阳性菌，短杆状，在MRS培养基上菌落为乳白色、表面湿润光滑、边缘整齐、中间凸起。

3、生理生化特性

分离得到的R3菌株能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、N-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾中的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-D-吡喃木糖苷、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。

4、16S rDNA鉴定

将菌株R3接种于MRS培养基中，37℃厌氧下培养7天，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保藏备用。

利用引物27F和1492R对细菌基因组16S rDNA进行扩增，27F：agtttgatcmtggctcag(SEQ ID NO:2)，1492R：ggttaccttgttacgactt(SEQ ID NO:3)。

扩增体系(共25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1μL，DNA10ng，引物F(10μmol/L)0.5μL，引物R(10μmol/L)0.5μL，加双蒸水至25μL。扩增程序:：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃60s，共30个循环；72℃10min，4℃终止反应。

16S rDNA序列测定：利用胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成，测定结果得到菌株R3的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

系统发育树构建：将所测定的细菌16S rDNA基因序列分别与GenBank数据库进行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用Clustalw软件进行序列比对，采用MEGA 5软件进行系统发育分析，构建系统发育树，如图2所示。

综合菌体形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列，将菌株R3鉴定为耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)。该菌株R3于2018年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.16507。

实施例2耐酸乳杆菌R3的产乳酸能力试验

采用高效液相色谱法检测耐酸乳杆菌R3的产乳酸能力。

将菌株R3接种于液体MRS培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝1.8，按照体积比5％的接种量接种到100mL液体MRS培养基，37℃厌氧盒培养7天。采用HPLC测定乳酸含量。

前处理：取发酵液0.1mL，以0.1％的磷酸水溶液稀释至1mL，于2mL离心管中，振荡均匀，0.2μm滤膜过滤后作为待测样品。

HPLC条件：柱温30℃。流动相：A：甲醇；B：0.1％的磷酸水溶液。梯度洗脱：0min：100B；8min：100B；25min：10B；28.5min：10B；29min：100B；35min：100B；停止：35min；流速：1.0mL/min。乳酸标准曲线：标准曲线为：y＝0.284x-3.0446，R²＝0.9999。

实验结果为：乳酸含量为17.5g/L。

实施例3耐酸乳杆菌R3的耐乙醇能力试验

将菌株Lactobacillus acetotoleransR3和模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720均接种于液体MRS培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同浓度乙醇(2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、15％和16％)的100mL液体MRS培养基，37℃厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(EppendorfBioSpectrometer)测定吸光度OD₆₀₀。计算培养后与前的OD₆₀₀差值，结果如图3所示。

由图3可知，菌株Lactobacillus acetotoleransR3在乙醇浓度为15％的MRS培养基中培养后其OD₆₀₀差值为1.15，而当乙醇浓度为16％时，其OD₆₀₀差值几乎为0，表明基本不生长。因此Lactobacillus acetotoleransR3的乙醇耐受能力为15％。相比模式菌株Lactobacillus acetotoleransCICC10720的乙醇耐受能力为12％，菌株LactobacillusacetotoleransR3的耐乙醇能力增强。

实施例4耐酸乳杆菌R3的耐温度能力试验

将菌株Lactobacillus acetotoleransR3和模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720均接种于液体MRS培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到100mL液体MRS培养基，分别放置在不同温度(30、35、40、45、50和55℃)的培养箱中厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(EppendorfBioSpectrometer)测定吸光度OD₆₀₀。计算培养后与前的OD₆₀₀差值，结果如图4所示。

由图4可知，菌株Lactobacillus acetotoleransR3在45℃培养后其OD₆₀₀差值为1.41，而当温度为50℃时，其OD₆₀₀差值几乎为0，表明基本不生长。因此菌株LactobacillusacetotoleransR3的温度耐受能力为45℃。相比模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720的乙醇耐受能力为40℃，耐高温能力增强。

实施例5耐酸乳杆菌R3的耐盐能力

将菌株Lactobacillus acetotoleransR3和模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720均接种于液体MRS培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同NaCl(2％、4％、6％、8％、9％和10％)的100mL液体MRS培养基，37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(EppendorfBioSpectrometer)测定吸光度OD₆₀₀。计算培养后与前的OD₆₀₀差值，结果如图5所示。

由图5可知，菌株Lactobacillus acetotoleransR3在NaCl为8％的MRS培养基中培养后其OD₆₀₀差值为1.38，而当乙醇浓度为9％时，其OD₆₀₀差值负，表明不生长。因此菌株Lactobacillus acetotoleransR3的NaCl耐受能力为8％。相比模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720的NaCl耐受能力为4％，耐盐能力增强。

实施例6耐酸乳杆菌R3的耐酸能力

将菌株Lactobacillus acetotoleransR3和模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720均接种于液体MRS培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同pH(7、6、5、4、3、2和1.8)的100mL液体MRS培养基，用盐酸调节pH，在37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(EppendorfBioSpectrometer)测定吸光度OD₆₀₀。计算培养后与前的OD₆₀₀差值，结果如图6所示。

由图6可知，菌株Lactobacillus acetotoleransR3在pH为2的MRS培养基中培养后其OD₆₀₀差值为0.50，而当乙醇浓度为1.8时，其OD₆₀₀差值负，表明不生长。因此，菌株Lactobacillus acetotoleransR3的pH耐受能力为2。模式菌株LactobacillusacetotoleransCICC10720的pH耐受能力也为2。本发明的菌株R3与现有的耐酸乳杆菌耐pH能力相当。

序列表

<110> 宜宾五粮液股份有限公司

<120> 耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途

<130> A181256K

<141> 2018-11-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcgggtatg aagttaggga agcgagcggc ggatgggtga gtaacacgtg ggtaacctac 60

cctatagtct gggataccac ttggaaacag gtgctaatac cggataaaag gagagatcac 120

atgatttctt tttgaaaggc ggcgtaagct gtcgctaaag gatggacccg cggtgcatta 180

gctagttggt aaggtaacgg cttaccaagg caacgatgca tagccgagtt gagagactga 240

tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300

ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat 360

cgtaaagctc tgttgttggt gaagaaagat agtgagagta actgctcatt atttgccggt 420

aatcaaccag aaagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 480

agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggaaagataa gtcagatgtg 540

aaagccctcg gcttaaccga ggaatagcat cggaaactgt ctttcttgag tgcagaagag 600

gagagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc 660

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attagatacc tggtagtcca tgctgtaaac gatgagtgct aagtgttggg aggtttccgc 780

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aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 900

caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tctagtgcca acctaagaga ttaggcgttc 960

ccttcgggga cactaagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020

gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attattagtt gccagcatta agttgggcac 1080

tctaatgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc 1140

cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatgggcagt acaacgagga gcgaacttgt 1200

gaaggcaagc gaatctctga aagctgttct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta 1260

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ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaatg 1369

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (4)

1.耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌，其特征在于：该耐酸乳杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16507。

2.根据权利要求1所述的耐酸乳杆菌，其特征在于：所述耐酸乳杆菌的16S rDNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的耐酸乳杆菌，其特征在于：所述耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15％，温度耐受为≤45℃，产乳酸能力为≤17.5g/L。

4.权利要求1～3任一项所述的耐酸乳杆菌在酿酒中的用途。