CN112852780A - 黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于单宁降解技术领域，具体涉及一种黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用。针对目前单宁酶产量低、降解单宁产鞣花酸无法工业化生产的问题，本发明提供了一种黄柄曲霉或其菌剂在制备单宁酶和降解单宁中的应用。本发明还同时给出了上述黄柄曲霉或其菌剂降解单宁的方法，步骤为：将上述黄柄曲霉和/或上述菌剂与含有单宁的样品进行发酵。另外，本发明还通过了一种黄柄曲霉，保藏编号为GDMCC No.61426。本发明提供的黄柄曲霉能够高效生产单宁酶，且酶解反应的条件具有广泛的pH适应性，从而能够在短时间内高效催化单宁的降解，能够有效提高经济效益。

Description

黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用
技术领域
本发明属于单宁降解技术领域，具体地，涉及一种黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用。
背景技术
单宁酶广泛存在于微生物、植物、动物体内，用以水解大分子单宁等。单宁酶的应用广泛，在食品工业中最为突出，其可用于除去天然食品中因单宁而引起的苦涩味，啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚类引起的变质、咖啡风味的软饮料生产、麦芽多酚的稳定处理、葡萄酒风味的改进以及作为测定天然没食子酸酯类结构的一种灵敏的分析探针。
鞣花单宁在单宁酶作用下酶解生成的产物鞣花酸，属多酚二内酯，具备抗氧化、抗病毒、抗癌等作用，目前已广泛应用于食品、医疗及制药行业。鞣花酸广泛存在于植物各组织中，但游离形式存在的鞣花酸含量极低，需要将植物进行生物酶解后才能够获得利用价值高的鞣花酸。讲解单宁产鞣花酸成为目前获取鞣花酸的主要途径。但是，单宁酶的来源较为匮乏，受到野生菌株本身单宁酶产量低、酶活低、酶解机制复杂的限制，目前生物降解单宁生产鞣花酸还无法有效的实现工业化生产。因此，开发能够产生单宁酶进而降解单宁产鞣花酸的微生物菌种是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：单宁酶产量低、降解单宁产鞣花酸无法工业化生产，需要开发产单宁酶的微生物的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种黄柄曲霉或其菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。
其中，上述应用中，所述黄柄曲霉的保藏编号为GDMCC No.61426。保藏时间为2021年1月11日，保藏地为广东省微生物菌种保藏中心，地址为：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮政编码：510070。
其中，上述黄柄曲霉的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1黄柄曲霉的ITS核苷酸序列
TTTTACATACAGCATCTAGTTAACCCTTTATCCGTGAACTGCGAAGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTCCCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCCCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGGTGTTCAATTGATGACCCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTCTGGGGAGTTT。
进一步的，上述应用中，所述菌剂为含有黄柄曲霉的菌剂。更进一步的，所述菌剂为含有保藏编号为GDMCC No.61426的黄柄曲霉的菌剂。
进一步的，上述应用中，所述菌剂含有黄柄曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。
其中，所述发酵清液的制备方法为：将黄柄曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液；所述固液分离采用离心分离的方式，离心转速为7000～12000rpm，时间为10～20min，温度为0～10℃；所述发酵培养接种量为1×103～1×106CFU/mL，转速为150～200rpm，温度为30～40℃，时间为70～100h。
本发明第二方面还提供了一种上述黄柄曲霉或其菌剂降解单宁的方法，包括以下步骤：将黄柄曲霉或其菌剂与含有单宁的样品进行发酵。
其中，所述发酵时的条件为：pH为3～6、温度为25～40℃、转速为150～200rpm、时间为40～60h；所述发酵清液与样品的体积比为1～3︰1。
进一步的，所述含有单宁的样品中单宁含量为5～10g/L。
本发明第三方面还提供了一种黄柄曲霉。所述的黄柄曲霉，保藏编号为GDMCCNo.61426。
进一步的，所述的黄柄曲霉的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第四方面还提供了一种菌剂，该菌剂含有上述的黄柄曲霉。
优选的，所述菌剂含有所述黄柄曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。
其中，上述发酵清液的制备方法为：将黄柄曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液。
进一步的，所述的固液分离采用离心分离的方式，离心转速为7000～12000rpm，时间为10～20min，温度为0～10℃。
更进一步的，发酵培养接种量为1×103～1×106CFU/mL，转速为150～200rpm，温度为30～40℃，时间为70～100h。
本发明的有益效果为：
本发明通过大量试验，创造性的发现了黄柄曲霉能够产生单宁酶并能够发酵单宁，因此提供了一种黄柄曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的新应用。基于此，本发明还筛选得到了一株新的黄柄曲霉菌株，保藏编号为GDMCC No.61426，本发明的菌株在制备单宁酶和降解单宁中具有很好的效果，经发酵培养得到的发酵清液中单宁酶的酶活性较高，对鞣花单宁的特异性转化能力强，本发明的菌株产鞣花酸的转化率最高为73.63％，鞣花酸产率最高为65.8％，具有很好的应用价值。本发明的黄柄曲霉中的单宁酶对鞣花单宁进行酶解的步骤简便，具有广泛的pH和温度的耐受性，酶解效率高。
本发明提供的菌株为黄柄曲霉Aspergillus flavipes，已于2021年1月11日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称为GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.61426，该保藏中心的地址为：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮政编码：510070。
附图说明
图1是本发明中的筛选过程中黄柄曲霉在初筛培养基上形成的透明圈。
具体实施方式
本发明提供了一种黄柄曲霉，所述黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)于2021年1月11日送交广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼)进行保藏，保藏编号为GDMCC No.61426。
本发明提供的黄柄曲霉分离自河南金银花树下的土样，所述黄柄曲霉的筛选方法的分离筛选可以采用本领域常规的用于新菌株分离筛选的方法，可根据实际需要进行选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述筛选方法包括：
S1、采集河南金银花树下的土样(北纬35°13‘，东经113°54‘)；
S2、选用孟加拉红培养基作为菌株富集培养基，将土样进行梯度稀释后涂布于富集培养基(孟加拉红培养基)中进行富集培养，对富集培养基中的菌株进行分离得到富集菌株；
S3、将富集菌株涂布于初筛培养基中进行初筛，由于初筛培养基颜色较深且不透明，菌株降解单宁后会在培养基上生成透明圈，通过筛选在初筛培养基中形成透明圈的菌株，得到初筛菌株；
S4、将初筛菌株培养至产孢，用无菌水对孢子进行洗脱制成孢子液，将孢子液接种于复筛种子培养基中，进行复筛种子培养后，再接种至复筛发酵培养基中进行复筛发酵培养，复筛发酵培养后采用BCA法测定胞外蛋白及胞内蛋白浓度，并利用甲醇绕丹宁法测定单宁酶的活性，选定目标菌株，得到所述黄柄曲霉。
优选情况下，初筛培养基具体可以包括20～40g/L的乳糖、15～25g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO3、0.5～1.5g/L的K2HPO4、0.2～0.8g/L的MgSO4、0.2～0.8g/L的KCl、0.01～0.03g/L的FeSO4和1～3％琼脂；复筛种子培养基具体可以包括20～40g/L的葡萄糖、15～25g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO3、0.5～1.5g/L的K2HPO4、0.2～0.8g/L的MgSO4、0.2～0.8g/L的KCl和0.01～0.03g/L的FeSO4；复筛发酵培养基具体可以包括20～40g/L的糖(可以为葡萄糖、乳糖、果糖和木糖中的至少一种)、15～25g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO3、0.5～1.5g/L的K2HPO4、0.2～0.8g/L的MgSO4、0.2～0.8g/L的KCl和0.01～0.03g/L的FeSO4，初始pH用40％浓度的NaOH溶液调整为4～6。示例性地，复筛种子培养的条件至少满足：温度为30～35℃、转速为150～200rpm、时间为1～3d；复筛发酵培养的条件至少满足：接种量为1～3体积％、温度为25～35℃、转速为150～200rpm、时间为2～5d。
本发明提供的黄柄曲霉经过培育能够产生大量的黄柄曲霉活菌体，本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述黄柄曲霉大量增殖即可，例如，可以将黄柄曲霉在平板培养基中培养至产孢，利用生理盐水洗脱孢子并充分振荡、稀释后获得孢子悬浮液，孢子液可以于4℃冰箱下保存备用，或者直接接种至发酵培养基中进行发酵培养；其中，平板培养基优选为包括20～40g/L的乳糖、15～25g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO3、0.5～1.5g/L的K2HPO4、0.2～0.8g/L的MgSO4、0.2～0.8g/L的KCl、0.01～0.03g/L的FeSO4和1～3％琼脂。优选情况下，在对黄柄曲霉进行发酵培养时，将孢子悬浮液接种至发酵培养基中，接种量为1×103～1×106CFU/mL，接种后于温度为30～40℃、转速150～200rpm的条件下培养70～100h，得到发酵液。其中，所述发酵培养基可以包括20～40g/L的糖(具体可以为葡萄糖、乳糖、果糖和木糖中的至少一种)、15～40g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO3、0.5～1.5g/L的K2HPO4、0.2～0.8g/L的MgSO4、0.2～0.8g/L的KCl、0.2～0.8g/L的NaCl、0.01～0.03g/L的FeSO4。
本发明可以进一步分离上述发酵液中的黄柄曲霉的发酵清液，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够将发酵液进行固液分离得到发酵清液即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件。优选情况下，采用离心分离的方法对上述发酵液进行固液分离，得到发酵清液，具体地，所述离心分离至少满足以下条件：转速为7000～12000rpm、时间为10～20min、温度为0～10℃。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，该菌剂含有上述的黄柄曲霉。在本发明中，对所述菌剂中黄柄曲霉的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
根据本发明，所述菌剂含有所述黄柄曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。在本发明中，术语“发酵清液”指的是黄柄曲霉在发酵或培养过程中产生的代谢产物(包括胞内代谢产物和/或胞外代谢产物)。
根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为发酵液离心后得到的发酵清液)和/或固态菌剂(例如可以为冻干后的菌体)。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂可采用本领域技术人员所熟知的常规技术。
第三方面，本发明提供了上述黄柄曲霉、上述菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。根据本发明，所述黄柄曲霉经发酵培养能够高效生产单宁酶，即单宁酶属于所述黄柄曲霉的发酵清液，制备单宁酶的过程可以采用常规的固液分离的方法得到含有单宁酶的发酵清液。
第四方面，本发明提供了一种降解单宁的方法，该方法包括：将上述的黄柄曲霉和/或上述的菌剂与含有单宁的样品进行发酵。
根据本发明，所述发酵后可以采用加入甲醇的方式终止降解，所述发酵后还可以进一步对单宁经降解获得的产物(例如鞣花酸、没食子酸、儿茶素)进行纯化处理，例如，采用萃取、结晶、过滤等方式；所述含有单宁的样品可以为含有单宁的溶液，单宁具体可以为鞣花单宁、没食子单宁；所述含有单宁的样品也可以通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到。
在本发明中，所述发酵可以是将黄柄曲霉的发酵菌体(活菌体或者死菌体)与所述含有单宁的样品混合，使得黄柄曲霉中的单宁酶对单宁进行降解，也可以是将黄柄曲霉的发酵产物(含有单宁酶的发酵清液，或者从黄柄曲霉的发酵液中提取、纯化得到的单宁酶)与所述含有单宁的样品混合，以对单宁进行降解。
根据本发明，降解单宁的方法优选为包括：将所述菌剂与所述含有单宁的样品进行发酵，所述菌剂为所述黄柄曲霉的发酵产物；其中，所述黄柄曲霉的发酵产物的制备方法包括以下步骤：将所述黄柄曲霉进行发酵培养得到发酵液，将所述发酵液进行固液分离得到发酵清液。此时，所述黄柄曲霉的发酵产物即为黄柄曲霉的发酵清液(含有单宁酶)。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，对黄柄曲霉的发酵产物中的单宁酶的分离步骤简单、效率高，且制得的菌剂对单宁降解的效率高。
根据本发明，所述酵清液与含有单宁的样品的体积比，可以根据黄柄曲霉进行发酵培养的接种量、含有单宁的样品中单宁的浓度进行设定。优选情况下，在发酵培养的接种量为1×103～1×106CFU/mL时，所述含有单宁的样品中单宁的浓度为5～10g/L，所述发酵清液与所述含有单宁的样品的体积比为1～3:1。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高黄柄曲霉的发酵清液中的单宁酶对单宁的降解效率。
根据本发明，所述发酵至少满足以下条件：pH为3～6，具体可以为3、4、5、6，或者上述两个数值之间的任意值；温度为25～40℃，具体可以为25℃、30℃、35℃、40℃，或者上述两个数值之间的任意值；转速为150～200rpm，具体可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或者上述两个数值之间的任意值；时间为40～60h，具体可以为40h、45h、50h、55h、60h，或者上述两个数值之间的任意值。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
以下实施例中，黄柄曲霉的初筛培养基和平板培养基的组分为：30g/L的乳糖、20g/L单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO4、2％琼脂；
复筛种子培养基的组分为：30g/L的葡萄糖、20g/L单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO4；
复筛发酵培养基和发酵培养中的培养基组分为：30g/L的葡萄糖、20g/L单宁酸、3g/L的NaNO3、1g/L的K2HPO4、0.5g/L的MgSO4、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO4，发酵初始pH用40％浓度的NaOH溶液调整为5。
以下实施例中，鞣花酸的含量通过高效液相色谱法测得，鞣花酸的转化率和鞣花酸的产率通过下列公式得出：
鞣花酸的转化率＝(鞣花酸的实际摩尔量/鞣花酸的理论摩尔量)×100％，
鞣花酸的转化率以摩尔转化率表示，1mol的鞣花单宁在理想状态下水解后可生成3mol鞣花酸；
鞣花酸的产率＝(酶解后鞣花酸的含量/酶解前鞣花单宁的含量)×100％；
黑曲霉(Aspergillus niger Van Tieghem)来源自四川大学，其他原料和试剂均为市售品。
实施例1本发明黄柄曲霉的筛选
S1、采样：样品采自采集河南金银花树下的土样(北纬35°13‘，东经113°54‘)；
S2、富集：取1g土样于9mL的无菌水中，加玻璃珠将土样打散摇匀，采用梯度稀释的方法将土壤菌悬液稀释至10～1～10～5，富集培养基选用孟加拉红液体培养基(主要成分为孟加拉红、氯霉素、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、蛋白胨)，将梯度稀释后的菌液以2体积％的接种量接种于孟加拉红液体培养基中，进行富集培养得到富集菌株；
S3、初筛：将S2得到的富集菌株取200μL接种于初筛培养基中进行涂布，30℃下培养3d，通过初筛培养基中是否形成透明圈及透明圈直径与菌体直径比值大小(D/d)，筛选出初筛菌株，具体可参见图1所示；
S4、复筛：将S3得到的初筛菌株培养至产孢，用无菌水对孢子进行洗脱制成孢子液，将孢子液以接种量为107CFU/mL接种于复筛种子培养基中，在温度为32℃、转速为180rpm的条件下进行复筛种子培养2d，得到复筛种子液；再将复筛种子液以接种量为2体积％接种至复筛发酵培养基中，在温度为30℃、转速为180rpm的条件下进行复筛种子培养3d，得到复筛发酵液；取复筛发酵液在温度为4℃、转速为10000rpm的条件下离心15min得到的上清液为复筛发酵清液，采样BCA法测定复筛发酵清液中的蛋白含量，并用甲醇绕单宁法，以没食子酸丙酯作为底物测定单宁酶酶活，将复筛发酵清液与浓度为5g/L的鞣花单宁水溶液以体积比1：1混合，于30℃、180rpm条件下液态发酵48h，测定鞣花酸的生成率；根据鞣花酸的产率及单宁酶的酶活选定目标菌株，即为复筛菌株；
S5、将S4得到的复筛菌株接种于PDA培养基，送至擎科生物公司进行18s测序，序列如SEQ ID NO:1所示，将菌株的全基因组与NCBI数据库中进行比对，最终确定菌株为黄柄曲霉，并于2021年1月11日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61426。
实施例2
(1)将实施例1得到的黄柄曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
(2)将步骤(1)得到的孢子悬浮液以接种量为105CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为35℃、转速为180rpm的摇床中进行发酵培养84h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
(3)将步骤(2)得到的发酵液在温度为4℃、转速为10000rpm的条件下离心15min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为5g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为1：1进行混合，在温度为30℃、pH为4.0、转速为180rpm的条件下转化制备鞣花酸48h，得到降解产物。
将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸的转化率可达63.3％、鞣花酸产率为57.8％。
实施例3
(1)将实施例1得到的黄柄曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为108CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
(2)将步骤(1)得到的孢子悬浮液以接种量为106CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为40℃、转速为150rpm的摇床中进行发酵培养100h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
(3)将步骤(2)得到的发酵液在温度为0℃、转速为12000rpm的条件下离心10min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为10g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为3：1进行混合，在温度为25℃、pH为3.0、转速为150rpm的条件下转化制备鞣花酸60h，得到降解产物。
将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸的转化率可达73.63％、鞣花酸产率为65.8％。
实施例4
(1)将实施例1得到的黄柄曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为105CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；
(2)将步骤(1)得到的孢子悬浮液以接种量为103CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为30℃、转速为200rpm的摇床中进行发酵培养70h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；
(3)将步骤(2)得到的发酵液在温度为10℃、转速为7000rpm的条件下离心20min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为8g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为2：1进行混合，在温度为40℃、pH为6.0、转速为200rpm的条件下转化制备鞣花酸40h，得到降解产物。
将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸的转化率可达60.52％、鞣花酸产率为57.8％。
对比例1
(1)发酵培养基的组分和含量为：NaNO3 2g/L、K2HPO4 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO40.5g/L、FeSO4 0.01g/L、蔗糖30g/L，其余为水；灭菌后立即加入黑曲霉(Aspergillusniger Van Tieghem)，在温度为30℃、转速为165rpm的条件下摇床培养72h得到发酵液；
(2)酶解培养基的组分和含量为：鞣花单宁5g/L、K2HPO4 l.0g/L、KCI 0.5g/L、MgSO4 0.25g/L、FeSO4 0.01g/L、NaNO3 2g/L，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值为4.5；将步骤(1)得到的发酵液以2体积％的接种量移至酶解培养基中，在温度为28℃、转速为120rpm的条件下摇床培养4天得到酶解液；
(3)将步骤(2)得到的酶解液离心后利用高效液相色谱测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸的产率为23％。
由实施例和对比例可知，黄柄曲霉在降解单宁产鞣花酸上具有很好的应用效果，鞣花酸转化率达到60％以上，产率在57％以上，在制备单宁酶和降解单宁上具有很好的应用前景。
序列表
<110> 泸州品创科技有限公司
南京师范大学
<120> 黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用
<130> A210079K（序）
<141> 2021-02-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttacatac agcatctagt taacccttta tccgtgaact gcgaaggctc attaaatcag 60
ttatcgttta tttgatagtc ccttactaca tggatacctg tggtaattct agagctaata 120
catgctaaaa accccgactt cggaaggggt gtatttatta gataaaaaac caatgccctt 180
cggggctcct tggtgattca taataactta acgaatcgca tggccttgcg ccggcgatgg 240
ttcattcaaa tttctgccct atcaactttc gatggtagga tagtggccta ccatggtggc 300
aacgggtaac ggggaattag ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac 360
atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag gtagtgacaa 420
taaatactga tacggggctc ttttgggtct cgtaattgga atgagtacaa tttaaatccc 480
ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca 540
atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaaccttg ggtctggctg 600
gccggtccgc ctcaccgcga gtactggtcc ggctggacct ttccttctgg ggaatcccat 660
ggccttcact ggctgtgggg ggaaccagga cttttactgt gaaaaaatta gagtgttcaa 720
agcaggcctt tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg cggttctatt 780
ttgttggttt ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggcg tcagtattca 840
gctgtcagag gtgaaattct tggatttgct gaagactaac tactgcgaaa gcattcgcca 900
aggatgtttt cattaatcag ggaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc 960
gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg gtgttcaatt gatgacccgc 1020
tcggcacctt acgagaaatc aaagtttttg ggtctgggga gttt 1064

Claims (10)

1.黄柄曲霉或其菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄柄曲霉的保藏编号为GDMCCNo.61426。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄柄曲霉的ITS核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述菌剂为含有黄柄曲霉的菌剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述菌剂含有黄柄曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵清液的制备方法为：将黄柄曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液；所述固液分离采用离心分离的方式，离心转速为7000～12000rpm，时间为10～20min，温度为0～10℃；所述发酵培养接种量为1×103～1×106CFU/mL，转速为150～200rpm，温度为30～40℃，时间为70～100h。
7.黄柄曲霉或其菌剂降解单宁的方法，其特征在于，包括以下步骤：将黄柄曲霉或其菌剂与含有单宁的样品进行发酵。
8.根据权利要求7所述的黄柄曲霉或其菌剂降解单宁的方法，其特征在于：所述发酵时的条件为：pH为3～6、温度为25～40℃、转速为150～200rpm、时间为40～60h；所述发酵清液与样品的体积比为1～3︰1。
9.一种黄柄曲霉，其特征在于：保藏编号为GDMCC No.61426。
10.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求9所述的黄柄曲霉。
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