CN108587923B - 一种改善苹果酸发酵性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善苹果酸发酵性能的方法，属于微生物领域。米曲霉菌株(Aspergillusoryzae FMME 338)，保藏编号CCTCC NO:M 2016401。本发明同时公开一种发酵生产L‑苹果酸方法，温度30℃，摇床转速200r/min，发酵周期120h，最终发酵L‑苹果酸产量可达129.2g/L，是一株高产L‑苹果酸的优良野生菌株。本发明发酵生产L‑苹果酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，且发酵液中L‑苹果酸纯度高，杂酸较少，发酵周期短，适用于工业化生产。

Description

一种改善苹果酸发酵性能的方法

技术领域

本发明涉及一种改善苹果酸发酵性能的方法，属于微生物领域。

背景技术

苹果酸(Malic acid)又名二羟基丁二酸，分子式为HOOCH₂-CH(OH)COOH,相对分子质量为134.09。苹果酸是非常重要的有机酸之一，广泛的应用于化工、食品及医药工业等领域。因其分子结构中含一个不对称碳原子，所以具有旋光性，存在L-苹果酸和D-苹果酸两个手性对映体。其中L-苹果酸广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢。

苹果酸是天然果酸的重要组成部分。苹果酸的呈味作用明显，酸味持久柔和、性质稳定，是优良的酸味剂和调酸剂。L-苹果酸能增进药物的稳定性，促进人体对药物的吸收，可以作为药物稳定剂。苹果酸还能应用于日用化工方面。

目前，微生物发酵法生产苹果酸主要有三种方法，直接发酵法、两步发酵法和酶转化法。直接发酵法又称一步发酵法，该工艺采用糖质原料，用霉菌直接发酵生产苹果酸；两步发酵法制备L-苹果酸是采用两种不同功能的微生物，采用糖质原料，先由根霉发酵生成富马酸或富马酸与苹果酸的混合物，再由酵母或细菌等转化成单一的L-苹果酸；转化发酵是将两步发酵中第一步发酵产物富马酸转化为苹果酸，而酶转化法是利用微生物的延胡索酸酶将富马酸盐转化为苹果酸盐，成本高，不适合工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株产L-苹果酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2016401，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的第二个目的是本发明的目的在于提供一种提高苹果酸产量的方法，所述方法是在米曲霉的培养过程中加入氧化铝。

在本发明的一种实施方式终，所述方法将培养成熟的米曲霉孢子制成孢子悬液，接种至种子培养基进行种子培养和发酵培养；在发酵培养过程中添加0.3-0.6/L氧化铝控制孢子萌发和菌丝缠绕获得最佳产酸形态的菌球。

在本发明的一种实施方式中，接种量为10⁶-10⁷CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，发酵温度为28～32℃。

在本发明的一种实施方式中，氧化铝添加量为0.3-0.6/L。

在本发明的一种实施方式中，发酵周期为96h～168h。

在本发明的一种实施方式中，接种前进行种子培养，所述种子培养在种子培养基中进行，使孢子终浓度为10⁶个/mL；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，K₂HPO₄0.56g/L，KH₂PO₄ 0.56g/L，NaH₂PO₄·H₂0 0.925g/L，Na₂HPO₄ 0.82g/L，MgSO₄·7H₂O 0.075g/L，CaCl₂·H₂O 0.075g/L。

在本发明的一种实施方式中，种子培养前进行斜面培养，所述斜面培养是指接种一环菌株于PDA斜面培养基，于28℃培养5天。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为葡萄糖120g/L，蛋白胨6g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，KH₂PO₄ 0.15g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，CaCO₃100 g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述斜面培养基为称取洗净去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮烂(约20～30分钟)，双层纱布滤去马铃薯块，加入葡萄糖20g，琼脂15g，定容至1L，115℃灭菌20分钟。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以10％的接种量接种，在30℃，200r/min发酵120h。

本发明的第三个目的是提供所述米曲霉在食品、化工领域的应用，尤其是在制备酸味剂、调味剂方面的应用。

本发明的有益效果：本发明基于萌发过程孢子聚集与菌丝球缠绕对外加剪切力的敏感性不同,通过在种子培养至特定阶段、启动机械扰动的方式,扰动孢子萌发和菌丝缠绕过程,增大萌发菌丝之间的碰撞几率，形成直径更小、内部结构更加疏松的菌丝球体，同时断裂的菌丝体会重新缠绕形成新的菌球体，有利于溶氧与传质，发酵性能得以显著提升发酵周期缩短，发酵产酸量、发酵转化率及发酵指数提高此外，扰动作用增加了菌丝球数量，相同条件下可降低孢子使用量，降低了生产成本，具有重要的经济效益。本发明操作简单，具有广阔的应用前景。应用此方法FMME 338在摇瓶水平上发酵生产L-苹果酸产量达129g/L，发酵液中L-苹果酸纯度高，杂酸占总酸6％以下。本发明发酵生产L-苹果酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，且发酵周期短，适用于工业化生产。

生物材料保藏

米曲霉((Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2016401，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

附图说明

图1为HPLC测定L-苹果酸的标准曲线；

图2为米曲霉菌球形态的控制与产酸的关系；

图3为米曲霉发酵过程L-苹果酸产量变化曲线；

图4为发酵液HPLC检测结果；A，1g/L L-苹果酸标样色谱图B，120h发酵液的色谱图；

图5为米曲霉在30L发酵罐中进行放大实验的苹果酸发酵曲线。

具体实施方式

PDA培养基：称取洗净去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮烂(20～30分钟)，双层纱布滤去马铃薯块，加入葡萄糖20g，琼脂15g，定容至1L，115℃灭菌20分钟。

固体筛选培养基(g/L)：蔗糖30，NaNO₃3，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，琼脂20。

产酸指示培养基(g/L)：葡萄糖80，(NH₄)₂SO₄ 2，K₂HPO₄ 0.5，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.03，FeSO₄·7H₂O 0.05，CaCO₃ 10,琼脂20，溴甲酚绿0.02。

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨3，K₂HPO₄ 0.56，KH₂PO₄ 0.56，NaH₂PO₄·H₂00.925，Na₂HPO₄ 0.82，MgSO₄·7H₂O 0.075，CaCl₂·H₂O 0.075

微量元素溶液：5g/LNaCl，5g/LFeSO₄·7H₂O，1g/L柠檬酸。

L-苹果酸的测定：

发酵液预处理：取发酵液加入4mol/L的HCl，8000r/min离心10min取上清。

高效液相色谱条件：色谱柱：

C₁₈(5μm 4.6×250mm)；流动相：0.1mol/LKH₂PO₄，磷酸调pH至2.8；柱温：20℃；检测波长：215nm；进样量：10μl；流速:0.6ml/min。

实施例1

(1)米曲霉初步分离纯化

从无锡周边地区果园采集土壤样品，取适量的土壤，放入装有100mL无菌水的250mL三角瓶，振荡，稀释10^-4～10^-6倍分别涂布于产酸指示平板上，在28℃下培养3天。观察平板变色情况，挑取变色圈大的单菌落孢子接种于固体筛选培养基上于28℃培养5，分离纯化至无杂菌，保藏于PDA斜面，以供使用。

(2)产L-苹果酸米曲霉的筛选

取10支长满孢子的上述分离纯化得到的菌株，每支加入5mL无菌水，在超净台中用接种环将孢子全部刮下，用玻璃珠震荡打散，通过宣纸过滤，得到单孢子悬液，将孢子悬液接种于种子培养基，30℃培养14h后转接于发酵培养基，30℃下培养5天收集发酵液，经高效液相分析，筛选L-苹果酸产量为80g/L的菌株为目的菌株。

(3)产L-苹果酸米曲霉的鉴定

提取目的菌株的基因组DNA，以出发菌株的基因组DNA为模板，使用真菌26S rDNAPCR通用引物正向引物EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'、:反向引物EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3进行扩增。用胶回收试剂盒纯化PCR产物，核酸电泳验证。18SrDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果(如SEQ ID NO.1所示)在Genbank数据库中与已有序列进行Blast比对分析，结果表明其与米曲霉的26S rDNA序列相似性最高达99％，将其命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338。

实施例2

(1)斜面培养：接种一环菌株于斜面培养基，于28℃培养5；

(2)种子培养：向装液量100mL/250mL的种子培养基中接入孢子悬液，使孢子终浓度在10⁶个/mL；温度30℃，摇床转速200r/min条件下，培养14h；

(3)发酵培养：将种子液以10％(v/v)接种至发酵培养基，温度30℃，摇床转速200r/min条件下，发酵120h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃ 100。

HPLC检测发酵液中L-苹果酸及杂酸含量，结果如表1所示。

表1发酵液中L-苹果酸及杂质含量

采用本实施例的方法应用米曲霉发酵生产L-苹果酸，发酵120h后，只有极少量其他杂酸的存在(如图4所示，L-苹果酸出峰时间为9.6min左右，琥珀酸出峰时间为11.6min左右，富马酸出峰时间为14.9min左右)，琥珀酸含量仅为3.2g/L，富马酸0.6g/L。

实施例3

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃ 90。

斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。

在发酵培养基中添加氧化铝0.3g/L。

实施例4

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃ 120。

斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。

在发酵培养基中添加氧化铝0.4g/L。

实施例5

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃ 80。

斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。

在发酵培养基中添加氧化铝0.5g/L。

实施例6

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1。

斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。

在发酵培养基中添加氧化铝0.6g/L。

不同实施方式下米曲霉的形态如图2所示，随着氧化铝添加量的不断增加，菌球形态呈现越来越小的菌球，产量也随着氧化铝的添加而呈现先增后减的趋势，氧化铝添加量在0.5g/L左右时菌球形态最佳。

不同实施方式下L-苹果酸发酵结果见表2。结果表明氧化铝对米曲霉发酵生产L-苹果酸影响很大，发酵培养基中不添加氧化铝时，产量90g/L,当氧化铝添加量在0.3-0.5g/L之间时基本产酸在90g/L以上，当氧化铝添加量达到0.6g/L时，苹果酸产量下降至98g/L。由表可知最佳氧化铝添加量在0.5g/L。

表2不同实施方式下米曲霉生产L-苹果酸发酵结果

实施例7

发酵培养基(g/L)：葡萄糖180，蛋白胨6，K₂HPO₄ 0.15，KH₂PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCl₂·2H₂O 0.1，CaCO₃ 100。

斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。

在发酵培养基中添加氧化铝0.5g/L。

在30L发酵罐中进行放大实验(如图5所示)，结果如表3所示。发酵120h苹果酸含量为129g/L，杂酸含量仅为苹果酸含量的6.4％。

表3发酵液中L-苹果酸及杂质含量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种提高米曲霉苹果酸产量的方法，其特征在于，在米曲霉培养和/或发酵过程中加入0.5g/L的氧化铝；所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2016401。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，米曲霉的接种量为10⁶-10⁷CFU/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵温度为28～32℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，米曲霉的接种量为10⁶-10⁷CFU/mL；发酵温度为28～32℃；发酵周期为96h～168h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，接种前进行种子培养；所述种子培养是使孢子终浓度达到至少1×10⁶个/mL。

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