CN110684673B - L-苹果酸高产菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及L‑苹果酸高产菌株及其应用，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）L01，保藏编号为CCTCC NO：M 2019458。本发明以购买自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）的黑曲霉Aspergillus niger CICC NO：40567为出发菌株，采用ARTP物理诱变结合自然筛选得到高产L‑苹果酸的突变株Aspergillus nigerL01，该突变株L‑苹果酸的产量高，不仅能解决黄曲霉菌株发酵过程中产生黄曲霉毒素的问题，而且黑曲霉产柠檬酸的工艺目前在工业上已经成熟，可直接利用现有过剩的柠檬酸生产装置，助推企业的转型升级。

Description

L-苹果酸高产菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及L-苹果酸高产菌株及其应用。
背景技术
苹果酸（Malic Acid）是一种重要的有机酸。由于苹果酸分子中有一个手性碳原子，因而有L、D和DL-苹果酸三种异构体。天然存在的苹果酸都是左旋体即L一苹果酸（L-Malic Acid），存在于不成熟的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中，是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为一种重要的化工原料和精细化学品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。
目前L-苹果酸的生产方法主要有直接提取法、化学合成法、固定化酶或细胞法以及微生物发酵法。L-苹果酸早期的生产方法是直接提取法，是直接从含有L-苹果酸的水果和蔬菜中提取，但由于原料中L-苹果酸含量少，导致生产成本高，所以一般不适用于工业化生产L-苹果酸；化学合成法主要包括高温高压水合法、糠醛氧化法和水解法等；其中高温高压水合法被广泛用于工业化生产L-苹果酸。化学合成法优势在于能获得高浓度的产物、后处理便利、生产成本低，所以是市场上批量生产L-苹果酸的主力军，但此法存在一些弊端，比如反应条件较高、设备易腐蚀损坏、设备成本较高且没有立体选择性，产物含有D-苹果酸，不能被利用到食品和医药中，需要进行额外的光学拆分才能获得L-苹果酸，增加了生产成本；固定化酶或细胞法具有易于分离，较稳定，可反复使用等优点，但此法工艺操作较多、生产成本高以及L-苹果酸中有富马酸残留等问题，限制了 L-苹果酸的批量生产。同时随着日益枯竭的石油资源和日益加强的环保意识，人们转向微生物发酵法来获得L-苹果酸，因为此法具有成本较低、原料广泛、工艺条件温和、理论产物得率高且质量稳定、绿色环保等优点，被认为是最有前景的生产方式。微生物发酵法包括一步发酵法和两步发酵法。其中主要以一步发酵法为主。一步发酵法是指以糖质原料为底物利用霉菌直接发酵生产 L-苹果酸。目前最常用的L-苹果酸生产菌为黄曲霉菌株。
然而利用黄曲霉菌株一步发酵生产L-苹果酸过程中存在一个弊端，即黄曲霉在发酵过程中会产生黄曲霉毒素，严重影响了L-苹果酸的工业化生产。采用一步发酵法以淀粉质为原料生产 L-苹果酸的微生物多为曲霉（Aspergillus. sp.），这些菌株大多可以直接利用淀粉质原料，所以考虑到黄曲霉发酵过程中毒素的产生问题，选择能生产L-苹果酸的安全性曲霉类菌株可以作为一种有效的解决方法，而曲霉中的黑曲霉（Aspergillus niger）是是FDA认证的安全（GRAS）微生物，被广泛应用于食品工业，例如黑曲霉是制酱、酿酒、制醋的主要菌种，被用来生产酶制剂以及生产有机酸等。但目前黑曲霉是柠檬酸的主要生产菌，一般不过多积累L-苹果酸，因此若能通过诱变的方法获得一株能够高产L-苹果酸的黑曲霉菌株，不仅实现一步发酵法制备L-苹果酸解决黄曲霉安全性问题且有助于现有柠檬酸生产企业的转型升级，解决柠檬酸产能过程中低价竞争等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一株L-苹果酸高产菌株。
本发明目的是通过下列技术方案实现的：
一株L-苹果酸高产菌株，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）L01，保藏编号为CCTCC NO：M 2019458。
本发明的另一目的在于提供上述菌株在产L-苹果酸中的应用。
本发明提供了一种具体的应用方法，其技术方案如下：
取经斜面培养6～7天的菌株孢子或菌丝接入产酸培养基摇瓶发酵，产L-苹果酸。
进一步的，所述发酵培养基的制备方式为：
将玉米粉与水按质量体积比1: 4混合，加热到70℃，获取干淀粉质原料；
按800U/g干淀粉质原料的添加量加入耐高温a-淀粉酶，升温至90℃后保温至液化完全，得到玉米粉液化液，将液化液趁热用滤布过滤后得液化清液；
将所述的液化液和液化清液混合，并用水调整至总糖浓度为9-10%，加入0.1-0.2g/L尿素，补充适量碳酸钙调节pH至6~7。
进一步的，发酵温度为32～37℃，优选35℃。
进一步的，摇瓶转速为200～300r/min。
进一步的，发酵培养时间为36~48h。
本发明以购买自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）的黑曲霉Aspergillus niger CICC NO：40567 为出发菌株，采用ARTP物理诱变结合自然筛选得到高产L-苹果酸的突变株Aspergillus nigerL01，该菌株不仅能解决黄曲霉菌株发酵过程中产生黄曲霉毒素的问题，而且黑曲霉产柠檬酸的工艺目前在工业上已经成熟，可直接利用现有过剩的柠檬酸生产装置，助推企业的转型升级。
附图说明
图1为筛选菌株L-苹果酸产量对比图。
图2为Aspergillus nigerL01和出发菌株（Control）的糖耗以及L-苹果酸产量。
本发明所述的生物材料，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）L01，保藏编号为CCTCC M 2019458，保藏日期为2019年6月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国. 武汉. 武汉大学。
具体实施方式
PDA 培养基：新鲜去皮马铃薯 200 g，加热煮沸 30 min，用纱布过滤并补足失水至 1000 mL，得 20%（W/V）马铃薯浸液。再加入蔗糖 20 g，琼脂 20 g。121℃灭菌 15 min。
察氏液态培养基（g/L）：NaNO3 3，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4·7H2O
0.01，蔗糖 30，pH自然。
产酸指示平板（g/L）:葡萄糖80，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 0.1，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O0.1，FeSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.1，CaCO3 10，琼脂 20，溴甲酚绿0.02，自然pH。121℃灭菌 30 min，冷却至 50~60℃ 时，添加 0.05 g/L 制霉菌素。制霉菌素溶液用孔径 0.22μm的膜过滤后加入。其中CaCO3分开灭菌。
发酵培养基的制备方式为：
将玉米粉与水按质量体积比1: 4（g/mL）混合，加热到70℃，获取干淀粉质原料；
按800U/g干淀粉质原料的添加量加入耐高温a-淀粉酶，升温至90℃后保温至液化完全，得到玉米粉液化液，将液化液趁热用滤布过滤后得液化清液；
将所述的液化液和液化清液混合，并用水调整至总糖浓度为9-10%，加入0.1-0.2g/L尿素，补充适量碳酸钙调节pH至6~7。
L-苹果酸的HPLC的测定方法：用HPLC法对发酵组分进行定量检测，采用DIONEXHPLC P680 工作站，Alltech有机酸色谱柱 No.88645 column 250 mm×4.6 mm，紫外检测波长210 nm，流速 1 mL/min，进样量 20 μL，流动相 25 mmol/L KH2PO4，pH 2.5，柱温35℃。
实施例1：ARTP诱变处理黑曲霉
取培养5 ～ 6天孢子多且呈黑色的出发菌株（Control）斜面（斜面培养基即为PDA固体培养基）一支，用5mL无菌水冲洗培养好的新鲜斜面孢子，经过无菌纱布过滤后，置于盛有玻璃珠和察氏液态培养基的 250 mL三角瓶中（玻璃珠以大致铺满瓶底为宜），30℃、 200rpm充分摇动 30 min，使孢子均匀分散，制得单孢子悬浮液，取0.5mL用无菌生理盐水适当稀释后用血球板计数法测菌悬液浓度，调整孢子液浓度为107个/mL，作为诱变原液。利用常温常压(ARTP)等离子诱变仪对黑曲霉进行诱变。诱变时的工作气体为氦气。按照处理功率100 W，氦气流量12 SLM，样品与等离子体发生器出口距离2 mm，处理样品为10μL，分别按0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s不同的诱变照射时间来处理孢子悬浮液考察致死率。对处理后的孢子悬液进行稀释，取100μL稀释液在产酸指示平板中涂布，每个照射时间做3个稀释度，每个稀释度做4个平行实验，置于30 ℃培养箱中培养。据计数结果，以0min为空白对照，采用活菌计数法，绘制致死曲线和正突变率曲线后确定下次诱变处理时间为180 s。
实施例2：菌种筛选
初筛：取100 μL经过ARTP诱变180 s后所得孢子悬浮液涂布于产酸指示平板在30～35℃下培养48～120小时，观察能否产生变色圈来初步判断菌种是否产酸。由于产酸指示平板中添加了制霉菌素，在一定程度上抑制了霉菌生长速度，易获得单菌落。加入CaCO3能使固体培养基浑浊，而产酸后能形成钙盐，提高了菌落周围培养基的透明度，使溴甲酚绿变色圈边缘变得清晰。通过在平板上涂布诱变后的菌株，挑选变色透明圈与菌落直径比值较大的单菌落，初步判断其为产酸量较高的菌株，将其转接到PDA固体培养基，连续培养5代，直至都能生长且产孢子，转接至PDA斜面上保藏，进行复筛。
摇瓶复筛：经过一轮初筛后，得到10株产酸较高的突变株，然后取少量孢子直接接入装有70mL产酸培养基的250mL三角瓶中，在32～37℃，转速200～300rpm下培养120小时，采用TiCl3法半定量检测L-苹果酸的产量快速筛选L-苹果酸高产突变株，在发酵液体系中15%（W/V）TiCl3溶液能与 L-苹果酸产生特异性白色沉淀反应，对其检出限度约为0.4 g/L。利用 TiCl3溶液这一反应特性，每个菌株发酵液取5 mL，将每种发酵液稀释不同浓度，观察滴加15% TiCl3溶液是否有白色沉淀产生可以判断发酵液中L-苹果酸的大致浓度范围，并据此快速筛选5株L-苹果酸高产突变株，取5株突变株发酵液5mL，添加 45 mL 1 mol/L 的Na2SO4溶液， 35℃，150 rpm 摇床反应 10 min，10000 rpm 离心 5 min除去菌体和固体悬浮物，上清液以孔径 0.45μm的滤膜过滤，取 1 mL滤液用水进行适当稀释后，用HPLC法进行定量检测L-苹果酸的产量，其结果如图1所示，最终得到一株L-苹果酸产量最高的突变株XQ-1，将该菌株分类命名为 Aspergillus nigerL01，并保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC NO：M 2019458。
实施例3：突变株与原始菌株的L-苹果酸发酵性能比较
取经斜面培养6～7天的产酸最高的突变株少量孢子或菌丝直接接入装有70mL产酸培养基的250 mL三角瓶中，在32～37℃，转速200～300r/min下培养120小时，发酵结束后，测定其L-苹果酸的产量，实验设三次重复，其平均结果如表1所示。结果表明在相同的发酵条件下，出发菌株（Control）经诱变处理和筛选后，得到的一株突变株比原始菌株增加了84.1g/L，L-苹果酸的产量高达106.5g/L，比原始菌株提高了将近4倍。
表1
菌株 L-苹果酸的产量（g/L）
Control 22.4
突变株XQ-1 106.5
实施例4：确定突变菌株产酸稳定性
选取产酸提高最大及产酸增幅最大的突变株即Aspergillus nigerL01，按照实施例3，进一步传代培养，连续传代 5 次，对其遗传稳定性进行检验，实验结果见表2。
表2 突变株Aspergillus nigerL01的产酸稳定性实验结果
代次 1 2 3 4 5
产酸（g/L） 106.5 103.8 104.5 108.2 103.2
由表 2可知，菌株Aspergillus nigerL01产酸能力稳定，未发现有退化现象，具有较好的遗传稳定性，故选为最终的目的菌。
实施例5：突变株与原始菌株的产酸性能和耗糖性能比较
菌株的产酸能力和耗糖性能是衡量菌株性状优劣的主要指标，因此对突变菌株XQ-1与原始菌株的产酸性能和耗糖性能进行了研究，在底物葡萄糖浓度120g/L，35℃，转速300r/min的条件下培养84小时。
本实施例的L-苹果酸测定结果如图2所示。
本实施例的葡萄糖含量测定：发酵停止后添加适量 6 mol/L HCl，调节发酵液至酸性并 80 ℃水浴加热 30 min，抽滤后取上清液用于分析检测。发酵液中葡萄糖含量测定采用 SBA-40C 生物传感仪，结果如图2所示。
由图2可知，出发菌株和突变株Aspergillus niger L01在发酵前18 h，因为此时菌体处于孢子萌发阶段，所以产酸和耗糖较少。发酵24 h左右菌体快速生长，耗糖迅速增加，产酸增加较少，因为此时糖主要用于菌体生长。之后菌体进入稳定期，产酸和耗糖都大幅度增加，这一时期是L-苹果酸积累的主要时期。在72 h左右，糖的浓度已经较低，菌体生长较缓慢，L-苹果酸的积累开始变少，发酵接近终点。在结束时，突变株Aspergillus nigerL01的L-苹果酸产量、糖酸转化率和L-苹果酸生产速率分别为106.5g/L、113.5%、1.27g/L/h，均优于出发菌株，具有良好的实际生产前景。

Claims (7)

1.一株产L-苹果酸菌株，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）L01，保藏编号为CCTCC NO：M 2019458。
2.权利要求1所述菌株在产L-苹果酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，取经斜面培养6～7天的菌株孢子或菌丝接入发酵培养基摇瓶发酵，产L-苹果酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的制备方式为：
将玉米粉与水按质量体积比1: 4混合，加热到70℃，获取干淀粉质原料；
按800U/g干淀粉质原料的添加量加入耐高温a-淀粉酶，升温至90℃后保温至液化完全，得到玉米粉液化液，将液化液趁热用滤布过滤后得液化清液；
将所述的液化液和液化清液混合，并用水调整至总糖浓度为9-10%，加入0.1-0.2 g/L尿素，补充适量碳酸钙调节pH至6~7。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵温度为32～37℃。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，摇瓶转速为200～300r/min。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养时间为36~84h。
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