CN104611269A - 一株苹果醋杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4，其保藏编号为CGMCC NO ：8692。该菌株产酸速度快，产酯量高，具有较好的耐温性能和耐酒精能力，且传代5次后性能稳定，醋酸分解速度小；此外，该菌株可产生柠檬苦素降解酶，使柑桔果汁中存在的柠檬苦素分解，从而实现柑桔果醋脱除苦味。利用改菌株酿制的柑桔果醋酸味柔和、果香浓郁、营养丰富、口感佳。

Description

一株苹果醋杆菌及其应用

技术领域

本发明属于果醋酿造技术领域，具体涉及一株苹果醋杆菌及其应用。

背景技术

 柑桔果醋是以新鲜、成熟的柑桔类水果为原料，经酒精发酵和醋酸发酵工艺生产而成的一种营养丰富、风味优良的酸味饮料。其含有丰富的有机酸和维生素，具有消暑解渴、消除疲劳、美容养颜、增进食欲、解酒保肝、防腐杀菌等保健功效，适用于多种疾病的食疗，尤其对高血压、冠心病、动脉硬化等心血管疾病具有良好的治疗和预防作用，是新一代发酵食品。优良的醋酸菌菌种是影响柑桔果醋品质的重要因素之一，其性能的优劣会对发酵效率、产品中活性因子的含量起着决定性的作用。然而当前，我国果醋生产中，纯种培养的醋酸发酵菌种不多，常用的仅有两株：食醋菌种AS1.41恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿1.01醋酸杆菌。据研究表明，醋酸菌AS1.41并不适合液体深层培养，若将其应用于果醋生产方面，不仅产酸能力不理想，耐酒精能力也都有待提高。至于沪酿1.01醋酸杆菌，虽然其产酸速度快，酒精转酸率平均可达93.84%，但它的特异性不强，而且发酵果醋形成的风味也不佳。因此，寻找有利于果醋生产的专用醋酸菌菌株成为当前研究的热点。

同时，柑桔中含有柠碱、柚皮苷和柠檬苦素类似物等致苦物质，在利用柑桔加工成果醋的过程中，这些苦味物质会从果实中溶出，使其酿制的果醋因其苦味问题难以被广泛接受。目前采取的措施主要是吸附脱苦、添加苦味抑制剂和超临界流体萃取脱苦等，虽取得了一些效果，但工业化生产存在较大负面影响。

发明内容

为了解决背景技术中提到的技术问题，本发明的目的在于提供一种苹果醋杆菌及其应用的技术方案。

本发明中的菌株苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日：2014年01月07日，保藏号：CGMCC NO ：8692。

本菌株从自然发酵的桔子果醋醋液中分离获得，根据该菌的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、Hsp60基因序列和tuf基因序列等结果，经由中国科学院微生物研究所鉴定为苹果醋杆菌（Acetobacter malorum）。

该菌株生长于平板培养基上的菌落单个或成对排列，白色不透明，呈圆形，表面光滑，边缘整齐，为凸起状，周围有明显的碳酸钙透明圈；菌体呈杆状或短杆状，革兰氏阳性，无鞭毛，极端严格好氧，可将乙醇氧化成乙酸，不产生肠毒素，安全无毒。

苹果醋杆菌ZY.C4在发酵生产果醋上的应用。

苹果醋杆菌ZY.C4在生产柑桔果醋上的应用。

所述的苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于包括以下工艺步骤 ：

1）制备柑桔果酒；

2）制备苹果醋杆菌ZY.C4的种子液；

3）将步骤2）的种子液接种到柑桔果酒中发酵，陈酿，得到柑桔果醋。

 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤 1）中柑桔果酒的制备步骤如下：

A：制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，沥干备用；按水：糯米=2：1 的比例磨浆，用醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%（重量）的液化酶，加热至90-95℃液化30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%（重量）的糖化酶，60℃糖化6-8h，得到糯米糖化液；

B：制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与0.01%（重量）的NaHSO₃溶液按1：1的体积比加入打浆机，打浆后加入0.04%（重量）的果胶酶于60℃酶解60min，酶解后过滤，收集滤液，得到柑桔汁；

C：将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2：1的比例将两者混合，调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液；

D：酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达10⁸个/mL的酿酒酵母按接种量为10%（体积）接种于柑桔糯米混合液中，28℃搅拌培养16h后，28℃密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，灭菌，得到柑桔果酒。

所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤2）中种子液的制备方法为：先将冷冻保藏的苹果醋杆菌ZY.C4菌株接种于斜面活化培养基上，30-32℃静止培养48h,然后挑取2-3环菌苔移入液体培养基，置于摇床，30-32℃，120r/min 培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达10⁷个/mL，按5%（体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述斜面活化斜面培养基的重量百分配比为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，分装试管，加入95%无水乙醇4% (体积百分比) ；所述液体培养基的重量百分配比为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。

所述的苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤3）中发酵条件为：取苹果醋杆菌ZY.C4种子液，按10%（体积）的接入量接种到权利要求5所述的柑桔果酒中，在31-32℃、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。

8. 如权利要求 5所述的一种利用如权利要求 1 所述的苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤D中，在搅拌培养前还加入柚苷酶，柚苷酶的加入量为每100ml柑桔糯米混合液中加入0.04g。

 一种柑桔果醋，其特征在于其制备方法为：

1）制备柑桔果酒；包括如下步骤：A：制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，沥干备用；按水：糯米=2：1 的比例磨浆，用冰醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%（重量）的液化酶，加热至90-95℃液化30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%（重量）的糖化酶，60℃糖化6-8h，得到糯米糖化液；

B：制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与含0.01%（重量）NaHSO₃的水溶液按1：1的比例加入打浆机，打浆后加入0.04%（重量）的果胶酶于60℃酶解60min，酶解后过滤，收集滤液，得到柑桔汁；

C：将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2：1的比例将两者混合，调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液；

D：酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达10⁸个/mL的酿酒酵母按接种量为10%（体积）接种于柑桔糯米混合液中，加入柚苷酶，28℃振荡培养16h后，28℃密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，灭菌，得到柑桔果酒；所述柚苷酶的加入量为每100ml柑桔糯米混合液中加入柚苷酶0.04g;

2）制备苹果醋杆菌ZY.C4的种子液；挑取苹果醋杆菌ZY.C4菌苔，活化后置于液体培养基， 在30-32℃，120r/min条件下摇床培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达10⁷个/mL，按5%（体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述液体培养基的配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5;

3）取苹果醋杆菌ZY.C4种子液，按10%（体积）的接入量接种到柑桔果酒中，在31~32℃、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。

 所述的苹果醋杆菌ZY.C4，其特征在于其分离纯化步骤如下：

1）菌源制备：选择无烂果的柑桔，洗净，打浆，先进行自然酒精发酵；并每天用糖度计测定其糖度，当糖度降至5°BX，并连续一个星期不再变化，开始过滤；收集滤液，32℃下进行自然醋酸发酵，5d后从醋液中取菌源；

2）增殖培养：取自然醋酸的发酵醋液10mL，放入90mL的增殖培养基中，并于恒温摇床32℃，120r/min条件下培养2d；所述增殖培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，0.02%的结晶紫0.5%，制霉素2.5×l0⁶单位/L，pH5.5，灭菌冷却至50-60℃后加入3% (体积) 的95%无水乙醇。

3）钙平板分离：梯度稀释增殖培养液，用于涂布分离，涂布到分离培养基上，于32℃的恒温箱中培养2d，挑选钙溶解圈大的，将不同菌落形态的单个菌落移入斜面培养基中，重复3-4次，得到纯化菌株；所述分离培养基配方为：酵母粉l%，葡萄糖l%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，灭菌冷却至50-60℃后加入4% (体积) 的95%无水乙醇和已干热灭菌的CaCO₃；所述斜面培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，灭菌后分装试管，冷却至50-60℃后加入4% (体积)的95%无水乙醇。

4）复筛：将钙平板分离的菌株挑取两环，移入20mL加有6%的无水乙醇的液体基础培养基中，于恒温摇床32℃，120r/min 培养7d，进行醋酸定量测定，根据酸度测定结果筛选出产酸量高的菌株，经鉴定为苹果醋杆菌ZY.C4；所述液体基础培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。

与常用果醋菌种沪酿1.01相比，苹果醋杆菌ZY.C4产酸速度快，产酯量高，其产酸量和产酯量分别为65.3g/L和0.951g/L，均极显著的高于对照菌株沪酿1.01的44.65g/L和0.546g/L；而且该菌株具有较好的耐温性能和耐酒精能力，且传代5次后性能稳定，醋酸分解速度小；此外，该菌株可产生柠檬苦素降解酶，使柑桔果汁中存在的柠檬苦素分解，从而实现柑桔果醋脱除苦味。利用该菌株酿制的柑桔果醋酸味柔和、果香浓郁、无苦味，营养丰富、口感佳。

附图说明

图1为苹果醋杆菌ZY.C4和沪酿1.01的产酸曲线图；

图2为苹果醋杆菌ZY.C4和沪酿1.01耐酒精能力比较图；

图3为苹果醋杆菌ZY.C4和沪酿1.01的耐温能力比较图；

图4为苹果醋杆菌ZY.C4和沪酿1.01的产酯曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更详尽的说明。

下述实施例中，沪酿1.01购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，酿酒酵母1306购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1：醋酸菌的分离和鉴定

（1）菌源制备市购无烂果的柑桔，洗净，打浆，先进行自然酒精发酵，每天用糖度计测定其糖度，当糖度降至5°BX，并连续一个星期不再变化，开始过滤。用煮沸过的80目纱布双层过滤，过滤后把滤液保存在不锈钢锅中，即柑桔酒。用纱布遮盖锅面，32℃下进行自然醋酸发酵，即得自然发酵的醋液。5d后从醋液中取菌源，进行筛选分离。

（2）菌种分离筛选流程

菌源——增殖培养——稀释平板分离——初筛——斜面培养——液体三角瓶培养——确定初筛菌株——斜面保藏菌株——复筛——确定优良产酸菌株——斜面保藏菌株

（3）初筛方法

增殖培养：取自然醋酸的发酵醋液10mL，分别放入90mL的增殖培养基中，并于恒温摇床（32℃，120r/min）培养2d。

钙平板分离实验：梯度稀释增殖培养液，用于涂布分离，于32℃的恒温箱中培养2d，观察结果，挑选钙溶解圈大的，将不同菌落形态的单个菌落移入斜面培养基中，重复3-4次，得到纯化菌株。

（4） 复筛

将钙平板分离的菌株挑取两环，移入20mL液体基础培养基 (加6%无水乙醇) 中，于恒温摇床(32℃，120r/min) 培养7d，进行醋酸定量测定。根据酸度测定结果筛选出产酸量高的优良菌株。

产酸量高的优良菌株经鉴定为苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4。

上述分离培养所用的培养基配方如下：

增殖培养基：酵母粉1%，葡萄糖1%，0.02%的结晶紫0.5%，制霉素2.5×l0⁶单位/L，pH5.5，加入3% (v/v) 的95%无水乙醇。

分离培养基：酵母粉l%，葡萄糖l%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，加入4% (v/v) 的95%无水乙醇和已干热灭菌的CaCO₃。

斜面培养基：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，分装试管，加入95%无水乙醇4% (v/v) 。

液体基础培养基：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。

上述培养基中%未做说明的均为重量体积百分比，培养基余量为水。培养基配好后高温灭菌（现有技术），在含无水乙醇的配方中无水乙醇在培养基冷却至50-60℃后加入。

实施例2 菌株的性能测定

1.生理生化试验：

苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4的生理生化试验结果见表1

表1 生理生化试验结果

                                                 

选择产酸量高的菌株ZY.C4送往中科院微生物研究所鉴定，鉴定结果如表2所示，ZY.C4菌株不仅能氧化乙醇，还对乙酸、α-D-葡萄糖、肌醇均有氧化能力，且对于醋竹桃霉素、乳酸钠、四唑蓝等较敏感。

表2 ZY.C4菌株细胞形态和理化实验结果

 

2.毒力试验

参照GB/4789.28-2003，对筛选出的苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4进行毒力试验。将它们接种在肠毒素培养基中，它们的菌落周围有透明圈，证明它们不产肠毒素，说明ZY.C4菌株是安全无毒的。

3.优良菌株与对照菌株的性能比较

（1）原料处理

    糯米糖化液的制备流程：糯米浸泡2-4h备用。以2：1 (水：米) 比例磨浆，用冰醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%的液化酶，加热至90-95℃液化约30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%的糖化酶，60℃糖化6-8h (至碘显色反应不再为蓝)，糖度调至所需值。

制备柑桔汁：柑桔人工去皮，柑桔果肉与含0.01%NaHSO₃的水溶液按1：1的比例加入打浆机。打浆后加入0.04%的果胶酶酶解 (酶解温度60℃，酶解时间60min) ，酶解后分离得柑桔汁。

柑桔汁和糯米糖化液以2：1的比例混合调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液。

（2）酒精发酵

将经扩大培养的酿酒酵母1306 (菌体数量达10⁸个/mL）按接种量为10%（v/v）接种于已处理的柑桔糯米混合液中，并加入0.04%的柚苷酶（即每100ml柑桔糯米混合液中加入0.04g柚苷酶），置于28℃的恒温培养箱培养4天后，保存备用，即柑桔果酒。

（3）果酒酒液灭菌处理

将上述备用的柑桔果酒于无菌操作室内用纱布过滤两遍，并量取50mL酒样装入事先已灭过菌的锥形瓶中。分装完毕后，再放入80℃的恒温水浴锅中水浴灭菌30分钟。

（4） 醋酸菌种子液的制备

标准曲线的制备：将所筛选的性能优良菌株挑取两环，移入50mL液体培养基中，置于摇床 (32℃，120r/min) 培养48个小时，设置空白对照。培养两天后，先取发酵液稀释10倍，再分别加入稀释过的发酵液10mL、9mL、8mL、7mL、6mL于试管中，用空白液体培养基补足至10mL，振荡混匀后，于420nm下测其OD值，以发酵液醋酸菌浓度为横坐标，菌悬液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y=3×10⁹x-0.0138，R²=0.9944。

种子液的制备：将对照菌株和两个优良菌株移入斜面培养两天后，在斜面上挑取两环，移入50mL的液体培养基，置于摇床 (32℃，120r/min) 培养2天，取其发酵液测定其吸光值，查标准曲线确定发酵液中含有醋酸菌的浓度，并将菌体浓度调整为10⁷个/mL，按5%接入100mL的柑桔果酒中振荡培养24h备用。

（5）最佳发酵时间的测定

取优良菌株苹果醋杆菌ZY.C4及对照菌株得的种子液接种于处理后的100mL发酵酒液中，每隔24小时测定发酵液的产酸量和产酯量，连续测定7天。

发酵时间是影响醋酸产量和醋酸转化率的重要因素之一，通过对发酵时间曲线的制作，可以了解发酵过程进行情况，并能确定发酵终止时间，从而节约果醋酿造生产成本。ZY.C4菌株以及对照菌株的产酸量随培养时间的变化如图1所示。从图中可知，随着时间延长，两个菌株的产酸量变化趋势大致相同，都是先上升后下降，第一天为醋酸菌的增殖过程，酒精消耗较缓，醋酸产量较慢，第二天到第五天是醋酸菌的旺盛发酵期，醋酸含量迅速上升，到达第五天，ZY.C4菌株和沪酿1.01的产酸量均达到最大值，分别为54.35g/L、39.7g/L。

实验发现，随着发酵时间延长，果醋的香气也越浓郁，结合醋酸含量这项指标，确定筛选出的优良醋酸菌的最佳发酵时间为5天。

（6）耐酒精能力

取制备的种子液，接种于处理后酒精终浓度分别为5%、7%、9%、11%、13% (均为v/v) 的100mL发酵酒液中，培养5d后，测定发酵液的产酸量。

ZY.C4菌株与对照菌株沪酿1.01耐酒精能力的结果如图2所示。初始酒度不同，醋酸菌的产酸速率和酒精消耗率也不同。醋酸菌对发酵酒精含量有较高的要求，一般来说，酒精度的升高会促进发酵过程中产酸含量的增加，但是过高的酒精浓度则会抑制醋酸菌的生长和繁殖，使产酸量下降。由图可知，菌株ZY.C4、和沪酿1.01随酒精浓度的增加其产酸能力的趋势大致相同，都是先增加后降低。无论初始酒度为多少，ZY.C4菌株产酸量始终最高，沪酿1.01次之。在酒精度为7%时，菌株ZY.C4的产酸量达到最大值，为63g/L。

（7） 耐温能力

将菌株的种子液接种于处理后的100mL发酵酒液中，分别置于25℃、28℃、31℃、34℃、37℃下，观察其发酵情况，5d后测产酸量。

温度是影响菌株生长的一个重要因素，发酵温度对醋酸发酵的影响如图3所示。在一定范围，两个菌株的生长繁殖速度随着温度的升高均增长，当上升到一定温度时，其代谢开始受阻，产酸量均明显下降。当发酵温度为31℃时， ZY.C4菌株以及沪酿1.01的产酸量均达到最大值，产酸量分别为69.3g/L、51.65g/L；当发酵温度继续增加，醋酸含量逐渐降低，当温度高于31℃时，它们的产酸量均大幅度降低。

（8）产酯能力

菌株产酯量也是评定菌株性能的重要指标之一，酯类的数量和种类会直接影响果醋的风味和品质。菌株ZY.C4和沪酿1.01的产酯量如图4。从图中可以看出，菌株ZY.C4的产酯量远远高于对照菌株沪酿1.01，酯类含量的随发酵时间延长的变化情况和产酸量的趋势一致，也都是先上升后下降，同样在第五天的时候，产酯量到达峰值。其中沪酿1.01的产酯量为0.546g/L，ZY.C4为0.951g/L 。菌株ZY.C4产酯量高，性能较优。

（9）稳定性测定

性能稳定是评价醋酸菌是否优异的另一个重要指标。将菌株ZY.C4传代5次，并观察每代菌株的培养特征，结果发现，5次传代中，各代的菌落形态均一致，形状规则，有明显水解圈，且5次传代之后，菌株ZY.C4产酸性能稳定，各代之间均无极显著性差异，菌株遗传性能稳定。

表3产酸稳定性

实施例3柑桔果醋的生产工艺

1）制备柑桔果酒；包括如下步骤：

A：制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，沥干备用；按水：糯米=2：1 的比例磨浆，用冰醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%（重量）的液化酶，加热至90-95℃液化30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%（重量）的糖化酶，60℃糖化6-8h，得到糯米糖化液；

B：制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与含0.01%（重量）NaHSO₃的水溶液按1：1的比例加入打浆机，打浆后加入0.04%（重量）的果胶酶于60℃酶解60min，酶解后过滤，收集滤液，得到柑桔汁；

C：将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2：1的比例将两者混合，调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液；

D：酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达10⁸个/mL的酿酒酵母按接种量为10%（体积）接种于柑桔糯米混合液中，加入柚苷酶，28℃振荡培养16h后，28℃密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，调整酒精度为7%，灭菌，得到柑桔果酒；柚苷酶的加入量为每100ml柑桔糯米混合液中加入柚苷酶0.04g。

2）制备苹果醋杆菌ZY.C4的种子液；挑取苹果醋杆菌ZY.C4菌苔，活化后置于液体培养基， 在30-32℃，120r/min条件下摇床培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达10⁷个/mL，按5%（体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述液体培养基的配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。

3）取苹果醋杆菌ZY.C4种子液，按10%（体积）的接入量接种到柑桔果酒中，在31~32℃、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。利用该菌株酿制的柑桔果醋酸味柔和、果香浓郁、无苦味，总酸量、总酯量和氨基态氮含量分别为65.3g/L、0.951g/L和0.669 g/L，见表4。

表4各菌株酿制的柑桔果醋产品主要品质

Claims (10)

1.苹果醋杆菌 (Acetobacter malorum) ZY.C4, 保藏编号为CGMCC NO ：8692。

2.如权利要求 1 所述的苹果醋杆菌ZY.C4在发酵生产果醋上的应用。

3.如权利要求 1 所述的苹果醋杆菌ZY.C4在生产柑桔果醋上的应用。

4.一种利用如权利要求 1 所述的苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于包括以下工艺步骤 ：

1）制备柑桔果酒；

2）制备苹果醋杆菌ZY.C4的种子液；

3）将步骤2）的种子液接种到柑桔果酒中发酵，陈酿，得到柑桔果醋。

5.如权利要求 4 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤 1）中柑桔果酒的制备步骤如下：

A：制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，沥干备用；按水：糯米=2：1 的比例磨浆，用醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%（重量）的液化酶，加热至90-95℃液化30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%（重量）的糖化酶，60℃糖化6-8h，得到糯米糖化液；

B：制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与0.01%（重量）的NaHSO₃溶液按1：1的体积比加入打浆机，打浆后加入0.04%（重量）的果胶酶于60℃酶解60min，酶解后过滤，收集滤液，得到柑桔汁；

C：将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2：1的比例将两者混合，调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液；

D：酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达10⁸个/mL的酿酒酵母按接种量为10%（体积）接种于柑桔糯米混合液中，28℃搅拌培养16h后，28℃密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，灭菌，得到柑桔果酒。

6.如权利要求 4 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤2）中种子液的制备方法为：先将冷冻保藏的苹果醋杆菌ZY.C4菌株接种于斜面活化培养基上，30-32℃静止培养48h,然后挑取2-3环菌苔移入液体培养基，置于摇床，30-32℃，120r/min 培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达10⁷个/mL，按5%（体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述斜面活化斜面培养基的重量百分配比为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，分装试管，加入95%无水乙醇4% (体积百分比) ；所述液体培养基的重量百分配比为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。

7.如权利要求 4 所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤3）中发酵条件为：取苹果醋杆菌ZY.C4种子液，按10%（体积）的接入量接种到权利要求5所述的柑桔果酒中，在31-32℃、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。

8.如权利要求5所述的一种利用苹果醋杆菌ZY.C4生产柑桔果醋的方法，其特征在于所述的步骤D中，在搅拌培养前加入柚苷酶，柚苷酶的加入量为每100mL柑桔糯米混合液中加入0.04g。

9.一种柑桔果醋，其特征在于其制备方法为：

1）制备柑桔果酒；包括如下步骤：A：制备糯米糖化液：糯米浸泡2-4h，沥干备用；按水：糯米=2：1 的比例磨浆，用醋酸和碳酸钠调pH至6.2-6.4，加入1%（重量）的液化酶，加热至90-95℃液化30min，降温至60℃后，调pH至4.5-5.0，再添加1%（重量）的糖化酶，60℃糖化6-8h，得到糯米糖化液；

B：制备柑桔汁：柑桔去皮，柑桔果肉与含0.01%（重量）NaHSO₃的水溶液按1：1的比例加入打浆机，打浆后加入0.04%（重量）的果胶酶于60℃酶解60min，酶解后过滤，收集滤液，得到柑桔汁；

C：将糯米糖化液和柑桔汁混合：按柑桔汁：糯米糖化液=2：1的比例将两者混合，调整糖度至11％，并置于85℃热水中水浴杀菌15分钟，冷却备用，得到柑桔糯米混合液；

D：酒精发酵：将经扩大培养的菌体数量达10⁸个/mL的酿酒酵母按接种量为10%（体积）接种于柑桔糯米混合液中，加入柚苷酶，28℃振荡培养16h后，28℃密闭静置培养4d，过滤，收集滤液，灭菌，得到柑桔果酒；所述柚苷酶的加入量为每100mL柑桔糯米混合液中加入柚苷酶0.04g；

2）制备苹果醋杆菌ZY.C4的种子液；挑取苹果醋杆菌ZY.C4菌苔，活化后置于液体培养基， 在30-32℃，120r/min条件下摇床培养48h后，调整菌液浓度使其菌体数量达10⁷个/mL，按5%（体积）的接入量接入柑桔果酒中振荡培养24h，即为种子液；所述液体培养基的配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5；

3）取苹果醋杆菌ZY.C4种子液，按10%（体积）的接入量接种到柑桔果酒中，在31~32℃、搅拌转速为200r/min条件下发酵5-7d后静置陈酿6个月。

10.如权利要求 1 所述的苹果醋杆菌ZY.C4，其特征在于其分离纯化步骤如下：

1）菌源制备：选择无烂果的柑桔，洗净，打浆，先进行自然酒精发酵；并每天用糖度计测定其糖度，当糖度降至5°BX，并连续一个星期不再变化，开始过滤；收集滤液，32℃下进行自然醋酸发酵，5d后从醋液中取菌源；

2）增殖培养：取自然醋酸的发酵醋液10mL，放入90mL的增殖培养基中，并于恒温摇床32℃，120r/min条件下培养2d；所述增殖培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，0.02%的结晶紫0.5%，制霉素2.5×l0⁶单位/L，pH5.5，灭菌冷却至50-60℃后加入3% (体积) 的95%无水乙醇；

3）钙平板分离：梯度稀释增殖培养液，用于涂布分离，涂布到分离培养基上，于32℃的恒温箱中培养2d，挑选钙溶解圈大的，将不同菌落形态的单个菌落移入斜面培养基中，重复3-4次，得到纯化菌株；所述分离培养基配方为：酵母粉l%，葡萄糖l%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，灭菌冷却至50-60℃后加入4% (体积) 的95%无水乙醇和已干热灭菌的CaCO₃；所述斜面培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，CaCO₃1.5%，琼脂2%，pH5.5，灭菌后分装试管，冷却至50-60℃后加入4% (体积)的95%无水乙醇；

4）复筛：将钙平板分离的菌株挑取两环，移入20mL加有6%的无水乙醇的液体基础培养基中，于恒温摇床32℃，120r/min 培养7d，进行醋酸定量测定，根据酸度测定结果筛选出产酸量高的菌株，经鉴定为苹果醋杆菌ZY.C4；所述液体基础培养基配方为：酵母粉1%，葡萄糖1%，pH5.5。