CN114958630B - 一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母及应用，所述季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62236；所述季也蒙毕赤酵母在以绿茶、蔗糖为底物发酵制备的康普茶中，测定发酵过程中葡萄糖醛酸含量，发现葡萄糖醛酸含量最高可达2.75g/L，采用纯菌发酵生产康普茶时，不仅能获得典型风味的康普茶，还能显著提高其功能性成分含量。

Description

一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母及应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体是一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母及应用。
背景技术
康普茶（Kombucha），又名红茶菌，海宝，是以糖茶水为主要发酵原料，经微生物发酵而成的功能性饮料。源自我国渤海地区，公元414年传入日本，随着贸易路线的扩大，随后传入苏联、东欧和德国等地，在世界范围内广泛传播。康普茶内含有多种代谢产物、茶叶浸出物以及活的微生物，使得康普茶具有多种保健功能，如调节胃肠道健康、促进消化、提神、抗癌、降血糖、降血脂及保肝、预防心血管疾病、提高免疫、缓解风湿、痛风和痔疮等功能。现已确定康普茶中的主要功能性成分为葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)，又称葡糖醛酸。它是康普茶中最关键、最有健康价值的成分，是康普茶的解毒抗癌功能因子，也是人体肝脏内最主要的解毒物质之一，可降低肝淀粉酶活性，增加肝糖原含量，减少贮存的脂肪，起保护肝脏和解毒的作用。
当前康普茶多以自然的多菌株共同发酵生产为主，不仅生产周期长，且功能性成分葡萄糖醛酸含量较低，大概在0.003-0.01 g/L。而且自然发酵的康普茶中，大部分微生物会形成菌膜，如果将生产进行规模化工业生产，菌膜的产生将会导致设备、管道的清洗困难，也不便于管道的输送，影响了产品的规模化生产。同时多菌株的自然发酵，对菌种的组成不可控，这将导致产品存在一定的生物安全隐患，不利于产品品质的稳定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母及应用，在获得具有典型风味的康普茶的同时，还能提高康普茶中功能性成分葡萄糖醛酸含量。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii）于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No : 62236。
进一步的，所述季也蒙毕赤酵母从康普茶中筛选得到。
进一步的，从康普茶中筛选所述季也蒙毕赤酵母的方法包括以下步骤：
S1、菌株筛选
采用YPD及HS固体培养基对微生物进行筛选；取自然发酵康普茶发酵液，加入无菌水中按照浓度梯度依次稀释，在无菌环境下采用涂布法进行试验，每个浓度梯度培养三个平板，进行涂布培养，置于恒温箱中培养，挑选长势良好的单菌进行划线培养2-3次。
 S2、菌株发酵性能分析
将S1中筛选出的30株菌株传代稳定后，接种到茶糖水培养基中发酵10 d，测定发酵过程中的葡萄糖醛酸含量。根据发酵性能结果，将高产葡萄糖醛酸的菌株进行鉴定。
S3、菌株鉴定
结合菌株发酵性能结果，提取菌株DNA，并将PCR扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，得到一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii）。
S4、活化培养
挑选保存的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii），并划线于YPD固体培养基上进行培养，直至长出单菌落；
S5、种子液的制备
从步骤S4中的所述YPD固体培养基中挑选单菌落，并接种于YPD液体培养基中进行培养；
S6、康普茶的制备
将绿茶与蔗糖溶解在水中，并进行高温高压灭菌，冷却至常温后过滤，向滤液中接种所述种子液，静置培养；
S7、生长曲线的测定
将步骤S4活化的菌株采用接种在YPD液体培养基及步骤S6中的茶糖水培养基上，进行摇床培养，每隔一段时间进行取样，菌落总数采用血球计数板计数，绘制生长曲线。
本发明通过可培养方法筛选了自然发酵康普茶中的30株菌株，研究了各菌株的产葡萄糖醛酸的能力，最后筛选获得了一株高产葡萄糖醛酸且不产生菌膜的菌株，通过培养条件优化，至最后通过对糖茶水发酵获得的发酵成熟液，在拥有康普茶典型风味的同时，也大幅度提高了功能性成分的含量，这为纯种发酵康普茶的工业化生产奠定了基础。
进一步的，步骤S1中稀释浓度梯度为10-4、10-5、10-6。
进一步的，步骤S1中所述恒温箱温度设置为30℃，所述摇瓶培养在25-30℃、150-220 r/min培养30-72 h。
进一步的，步骤S5中所述单菌落在25-30℃、150-220 r/min的所述YPD液体培养基培养18-20h。
进一步的，步骤S6中所述高温高压灭菌温度为115℃，灭菌时间为15 min，。
进一步的，步骤S6中所述种子液的接种量为1-3%（v/v），静置培养温度为25-30℃，静置培养时间为10 d。
进一步的，步骤S7中所述活化的菌株按3-5 %（v/v）、菌液浓度为1×107-8 CFU/mL接种在所述YPD液体培养基及步骤S3中的茶糖水培养基上。
进一步的，将所述季也蒙毕赤酵母应用于康普茶的制备，并与传统发酵康普茶进行感官评价。
本发明的有益效果是：本发明从自然发酵康普茶中筛选到一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，该菌株酵母颜色为奶白色，形状为圆形，表面光泽，边缘整齐，容易挑取。细胞形态来看，整体呈圆形或椭圆形，细胞形态较饱满，单极芽殖，在发酵过程中使得发酵康普茶中的葡萄糖醛酸含量高达2.75 g/L，并且保持了康普茶的风味特征。
附图说明
图1为筛选过程中部分菌株发酵产生葡萄糖醛酸情况图；
图2季也蒙毕赤酵母基于ITS序列的系统发育树；
图3为季也蒙毕赤酵母菌的菌落形态及细胞形态；
图4为季也蒙毕赤酵母MCJ-1的生长曲线图；
图5为葡萄糖醛酸标准品色谱图谱；
图 6为季也蒙毕赤酵母发酵样品的葡萄糖醛酸产量图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母 （Pichia  guilliermondii）于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo : 62236。所述季也蒙毕赤酵母从康普茶中筛选得到，筛选方法包括以下步骤：
S1、菌株筛选
采用YPD及HS固体培养基对康普茶中的微生物进行筛选；取自然发酵康普茶发酵液1 mL，加入无菌水中按照浓度梯度依次稀释10-4、10-5、10-6，在无菌环境下采用涂布法进行试验，每个浓度梯度培养三个平板，各取100 μL稀释液进行涂布培养，置于30℃恒温箱中培养，挑选长势良好的单菌进行划线培养2次。
 S2、菌株发酵性能分析
将S1中筛选出的30株菌株传代稳定后，接种到茶糖水培养基中发酵10 d，测定发酵过程中的葡萄糖醛酸含量。根据发酵性能结果，将高产葡萄糖醛酸的菌株进行鉴定。
S3、菌株鉴定
结合菌株发酵性能结果，提取菌株DNA，并将PCR扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，得到一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii）。
S4、活化培养
挑选在-80℃的甘油管中保存的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii），并划线于YPD固体培养基上，在25℃下培养2 d，直至长出单菌落；
S5、种子液的制备
从步骤S1中的所述YPD固体培养基中挑选单菌落，并接种于50 mL YPD液体培养基中在25℃、150 r/min条件下培养18 h；
S6、康普茶的制备
将4 g绿茶与80 g蔗糖溶解在水中，并在115℃下高温高压灭菌15 min，其后进行紫外照射至常温，并进行过滤，向滤液中接种所述种子液，接种量为1%（v/v）, 在25℃下静置培养时间为10 d；
S7、生长曲线的测定
将步骤S4活化的菌株按3%（v/v）、菌液浓度为1×107CFU/mL接种在YPD液体培养基及步骤S6中的茶糖水培养基上，在25℃、150 r/min下摇床培养，每隔2 h进行取样，菌落总数采用血球计数板计数，绘制生长曲线；
实施例2
一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母（ Pichia  guilliermondii）于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo : 62236。所述季也蒙毕赤酵母从康普茶中筛选得到，筛选方法包括以下步骤：
S1、菌株筛选
采用YPD及HS固体培养基对康普茶中微生物进行筛选；取自然发酵康普茶发酵液1mL，分别加入无菌水中按照梯度依次稀释为10-4、10-5、10-6，在无菌环境下采用涂布法进行试验，每个浓度梯度培养三个平板，各取150μL稀释液进行涂布培养，置于34℃的恒温箱中培养，挑选长势良好的单菌进行划线培养3次。
S2、菌株发酵性能分析
将S1中筛选出的30株菌株传代稳定后，接种到茶糖水培养基中发酵10 d，测定发酵过程中的葡萄糖醛酸含量。根据发酵性能结果，将高产葡萄糖醛酸的菌株进行鉴定。
S3菌株鉴定
结合菌株发酵性能结果，提取菌株DNA，并将PCR扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，得到一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii）。
S4、活化培养
挑选在-80℃的甘油管中保存的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii），并划线于YPD固体培养基上，在25-30℃下培养3 d，直至长出单菌落；
S5、种子液的制备
从步骤S4中的所述YPD固体培养基中挑选单菌落，并接种于50 mL YPD液体培养基中在28℃、200 r/min条件下培养19 h；
S6、康普茶的制备
将5 g绿茶与90 g蔗糖溶解在水中，并在115℃下高温高压灭菌15 min，其后进行紫外照射至常温，并进行过滤，向滤液中接种所述种子液，接种量为2%（v/v）, 在28℃下静置培养时间为10 d；
S7、生长曲线的测定
将步骤S4活化的菌株按4%（v/v）、菌液浓度为1×107CFU/mL接种在YPD液体培养基及步骤S6中的茶糖水培养基上，在28℃、200 r/min下摇床培养，每隔2 h进行取样，菌落总数采用血球计数板计数，绘制生长曲线；
实施例3
一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母 （Pichia  guilliermondii）于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo : 62236。所述季也蒙毕赤酵母从康普茶中筛选得到，筛选方法包括以下步骤：
S1、菌株筛选
采用YPD及HS固体培养基对康普茶中微生物进行筛选；取自然发酵康普茶发酵液1mL，分别加入无菌水中按照梯度依次稀释为10-4、10-5、10-6，在无菌环境下采用涂布法进行试验，每个浓度梯度培养三个平板，各取200μL稀释液进行涂布培养，置于37℃的恒温箱中培养，挑选长势良好的单菌进行划线培养3次。
S2、菌株发酵性能分析
将S1中筛选出的30株菌株传代稳定后，接种到茶糖水培养基中发酵10 d，测定发酵过程中的葡萄糖醛酸含量。根据发酵性能结果，将高产葡萄糖醛酸的菌株进行鉴定。
S3、菌株鉴定
结合菌株发酵性能结果，提取菌株DNA，并将PCR扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，得到一株高产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii）。
S4、活化培养
挑选在-80℃的甘油管中保存的季也蒙毕赤酵母 （Pichia guilliermondii），并划线于YPD固体培养基上，在30℃下培养3 d，直至长出单菌落；
S5、种子液的制备
从步骤S1中的所述YPD固体培养基中挑选单菌落，并接种于50 mL YPD液体培养基中在30℃、220 r/min条件下培养20 h；
S6、康普茶的制备
将5 g绿茶与100 g蔗糖溶解在水中，并在115℃下高温高压灭菌15min，其后进行紫外照射至常温，并进行过滤，向滤液中接种所述种子液，接种量为3%（v/v）, 在30℃下静置培养时间为10 d；
S7、生长曲线的测定
将步骤S4活化的菌株按5%（v/v）、菌液浓度为1×108CFU/mL接种在YPD液体培养基及步骤S6中的茶糖水培养基上，在30℃、220 r/min下摇床培养，每隔2 h进行取样，菌落总数采用血球计数板计数，绘制生长曲线（见图4）；
（1）对实施例1-实施例3筛选的季也蒙毕赤酵母进行菌株鉴定：
菌株DNA的提取参照北京索莱宝科技有限公司的酵母菌基因组试剂盒方法进行，引物为酵母菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），PCR扩增参照PCR纯化试剂盒，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析，同时构建系统发育树，见图2。
由图3可知季也蒙毕赤酵母（菌株 MCJ-1）的基因序列经过比对与季也蒙毕赤酵母 Pichia guiliermondii3449 具有高度的同源性，同源性高度达 100%以上。
（2）对实施例1-实施例3筛选的季也蒙毕赤酵母发酵液中的葡萄糖醛酸含量进行测定：
参照 Vitas, J. S., Cvetanovic, A. D., Maskovic, P. Z., et al..Chemical composition and biological activity of novel typesof kombuchabeverages with yarrow. Journal of Functional Foods, 2018，44, 95-102中的方法测定了发酵液中的葡萄糖醛酸含量，对流动相、柱温、波长及流速做了修改。具体操作如下：色谱柱为 ZORBAXSB-C18( 250 mm×4.6 mm)，流动相 A（95%） 为稀磷酸水溶液 ( pH=2.3)，流动相 B 为甲醇（5%），流速为 0.8 mL/min，柱温为30℃， 进样量为 10μL，检测波长为210 nm，检测器为 DAD 检测器。在优化的色谱条件下上机检测，标准品采用外部标准方法进行校准。结果以 g/L 表示，见图6。
由图6可知，随着发酵时间的延长，葡萄糖醛酸含量也在上升，但第7 d样品的含量偏低，为1.33 g/L；发酵9 d的样品中醛酸含量最高，达到2.75 g/L。
（3）将实施例筛选的季也蒙毕赤酵母菌株与醋酸菌C-2、H-5、H-III在相同的接种量下发酵生产康普茶，各菌株产葡萄糖醛酸的含量见图1。
由图2可知，季也蒙毕赤酵母菌株（MCJ-1）产生的葡萄糖醛酸含量最高。
表1：实验使用药品及设备
表2：实验涉及的培养基成分表
 [注]图5中A为YPD液态培养基，B为茶糖水培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一株产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母，其特征在于：所述季也蒙毕赤酵母（Pichia  guilliermondii）于2022年1月27日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo : 62236。
2.一株如权利要求1所述的产葡萄糖醛酸的季也蒙毕赤酵母的应用，其特征在于：将所述季也蒙毕赤酵母应用于康普茶的制备。
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