CN112592911A

CN112592911A - 一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用

Info

Publication number: CN112592911A
Application number: CN202011643891.4A
Authority: CN
Inventors: 薛业敏; 谢方; 赵红阳; 薛梦柯
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112592911B

Abstract

本发明公开了一种耐热性α‑葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对耐热α‑葡萄糖醛酸酶蛋白C末端融合7个氨基酸残基组成全新的多肽融合体，所得多肽融合体的比活力比野生型酶TmAguA提高了297％，相应的水解4‑O‑甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物的K_cat和K_cat/K_m分别提高了356％和363％，而且稳定性比野生型酶提高21.1％‑65.7％；利用本发明融合体制备葡萄糖醛酸相对其野生型酶，多肽融合体转化榉木木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量提高了21.6％‑60.3％，具有转化效率高，反应副产物少，产量和纯度高，分离纯化容易、化学污染少等优点。

Description

一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用

技术领域

本发明属于食品、医药和化工、清洁生产领域的葡萄糖醛酸，具体涉及一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用。

背景技术

葡萄糖醛酸是由葡萄糖的伯醇羟基被氧化成羧基所形成的化合物，具有高反应活性的醛基和羧基，能结合含有羟基、巯基、羧基、氨基的有毒物质，增强有毒物质的水溶性而快速排出肾脏，达到排毒作用，同时，葡萄糖醛酸能与被结合物分子上的活性基团酚羟基结合，降低相关激素和药物的生物功能。葡萄醛酸是一种重要的医药化学中间体；葡萄糖醛酸的酰胺和R-苯基酰肼衍生物用于治疗肝脏病；葡萄糖醛酸与铂的络合物具有抗肿瘤活性；葡萄醛酸与冰乙酸在一定的条件下进行内酯化反应可得到葡萄糖醛酸内酯，其常用于预防治疗慢性肝炎、肝硬化、关节炎及胶原疾病，葡萄糖醛酸内酯还可降低人体肝淀粉酶的活性，从而抑制糖原消耗，使肝糖原变多，降低人体内的脂肪含量，广泛应用于减肥药品中。的保健药物；葡萄糖醛酸内酯以及它的后续产品，因具有增强能量、滋肤润色、抗衰防老等功效，现作为主要添加剂应用于功能性饮料(例如：红牛饮料)、化妆品和食品等领域。随着人类健康观念的增强和对生活品质的不断追求，绿色食品和保健品得到大力的发展，葡萄糖醛酸及其内酯的市场需求将大幅度上升。随着学者对葡醛酸及其内酯功能的不断开发，葡醛酸及其内酯在国内外市场上的需求量还将呈上升趋势，具有广阔的市场前景。

目前葡萄糖醛酸制备方法主要是芬顿试剂氧化法，即利用芬顿试剂作用淀粉分子中的6-OH使其氧化为羧基生产氧化淀粉，再将氧化淀粉在淀粉酶、糖化酶作用下水解为葡萄糖醛酸。李祥，王丽萍，师春兰等公开了一种葡萄糖醛酸内酯制备工艺(申请号：201510679605.2)，通过对氧化淀粉进行酸浸、水洗，以除去其中的杂质，有利于氧化淀粉的液化、糖化，氧化淀粉糖化后得到葡萄糖醛酸、葡萄糖、二糖、三糖，由于葡萄糖醛酸易溶于酒精，而葡萄糖、二糖、三糖不溶于酒精，故利用此性质分离提纯葡萄糖醛酸，省去了发酵除杂工艺，生产周期缩短72h。李建新等公开了在特殊电极的电解氧化作用下合成葡萄糖酸及葡萄糖二酸的方法(CN103436910A)。这些化学法制备葡萄糖醛酸存在试剂耗费量大，污染环境等问题；而具有反应条件温和且环境污染少的微生物发酵法或酶法作为化学替代法越来越受到研究者的重视，作为微生物发酵法，现有技术有，如Prather等分别从Saccharomyces cerevisiae和小鼠体内提取肌醇-1-磷酸合成酶(Inol)和肌醇氧化酶(MIOX)用于生产葡萄糖醛酸(Applied and Environmental Microbiology，2009，75：589-595；Metabolic Engineering，2010，12：298-305)。康振等通过在大肠杆菌中表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶(MIOX)，将肌醇转化为葡萄糖醛酸(CN104312987A)；通过在酵母中表达肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，实现葡萄糖醛酸的生成途径(CN104312935A)。方芳，仇钰莹，刘晓慧，陈坚等公开了一株产游离的葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌(104357365B)，该葡萄糖酸杆菌能够以葡萄糖为底物生产葡萄醛酸，对微生物法生产葡萄糖醛酸奠定了基础。但利用发酵法生产葡萄糖二酸存在产量低(6.02g/L)、培养时间长(2天)等问题都抑制了此方法的发展，而且在分离提取方法上还没有研究(化工进展，2011,33(11)：2502-2508)。方芳和李益烽公开了一种通过鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的方法(108949851A)。该酵母能够以葡萄糖或蔗糖为底物生产葡萄糖醛酸，经优化其发酵培养基和培养条件，可使发酵产葡萄糖醛酸产量达到14.68g/L，较目前国内外微生物发酵法产量(国内2.03g/L，国外3.94g/L)高出3倍以上；通过在发酵过程中采用补料策略，使葡萄糖醛酸产量进一步提高到22.36g/L，是目前纯菌发酵法产葡萄糖醛酸的最高水平。作为酶法的现有技术有，如MypaBbeB HA等采用1％β-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸铵(其是甘草根的三萜皂甙,含有两个葡萄糖醛酸,占分子量的48％)，在最佳条件(pH为4.5,37-40度保温4小时)释放出葡萄糖醛酸，最高收率可达到90％；相比微生物发酵法，酶法具有直接作用底物且反应简单速度更快、无细胞污染、生产周期短、成本低等优势。随着葡醛内酯的市场需求不断扩大，传统的以淀粉为原料的硝酸氧化法已不能满足市场需求，同时，这种生产工艺存在氧化选择性差、原料利用率低、副产物多、能耗高、污染大等缺点，因此，具有反应条件温和且环境污染少的生物法有必要探索新的合成路线。

葡萄糖醛酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸残基广泛分布于葡萄糖醛酸木聚糖(硬木)、阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖(软木、禾本科植物：秸秆)等半纤维素中，半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类可再生资源，含量占木质纤维生物量的20-35％。通常木聚糖类半纤维素是一条以β-1,4糖苷键相联的木聚糖主链中平均每6个木糖单元就带有一个1,2-4-O-甲基葡萄糖醛酸基，软木、禾本科植物来源木聚糖含有大量葡萄糖醛酸基，这个4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝能够被α-D-葡萄糖醛酸酶(EC.3.2.1.133)水解移去，释放出葡萄糖醛酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸残基。由于α-D-葡萄糖醛酸酶专一用于攻击木寡糖骨架上的4-O-甲基葡萄糖醛酸，即木聚糖需经β-1.4内切木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase,EC3.2.1.8)水解成木寡糖后方被葡萄糖醛酸酶作用释放出葡萄糖醛酸基，因此，以木质纤维植物中提取的木聚糖为原料，采用耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶联合水解工艺制备葡萄糖醛酸，既不耗费粮食资源，大大降低生产成本，又解决了农作物废弃物给环境带来污染问题，具有重要的经济效益和社会效益。

极端嗜热袍菌属Thermotoga所产的α-葡萄糖醛酸酶(TmAguA)属于水解酶家族67，其在85℃下保温1h保留65％活性以上，极具工业应用潜力。但是满足工业规模的应用需要α-葡萄糖醛酸酶能达到高催化效率和高耐酸碱稳定性的要求。尽管定点诱变可用于改善α-葡萄糖醛酸酶的催化效率和酸碱及氧化稳定性，但是，位点定向诱变需要明确酶结构和功能之间的关系，定向进化需要直接和高效的高通量筛选方法。寡肽与酶的N或C端融合不仅促进蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达而且亦会影响其结构，因此，通过寡肽融合α-葡萄糖醛酸酶有可能改善其催化效率和稳定性。如果在保持TmAguA热稳定性不变基础上，利用蛋白质工程和酶工程技术手段提高TmAguA水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物能力，并用于酶解木聚糖类半纤维素制备葡萄糖醛酸中，为酶法转化半纤维素制备葡萄糖醛酸的工业化奠定了基础，目前未见有相关α-葡萄糖醛酸酶的寡肽融合修饰的报道。中国是农业大国，每年秸秆产量不低于10亿吨，占世界秸秆总产量的25％-30％，若仅烧以作肥料，既浪费资源又造成环境污染。因此，利用这些生物废料制备葡萄糖醛酸具有一定的经济效益和社会效益。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用。本发明合成了一种全新的耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体，所得多肽融合体的比活力更强、耐碱稳定性更高，多肽融合体转化产生葡萄糖醛酸时具有转化效率高，反应副产物少，产量和纯度高，分离纯化容易、化学污染少等优点。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用，所述耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体基因(DNA)序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体是糖苷水解酶家族67的α-葡萄糖醛酸酶的C末端融合7个氨基酸残基组成的多肽。

其中，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体TmAguAPL1基因(DNA)进行扩增的引物为SEQ ID NO.3和5，模板为含热袍菌属野生型α-葡萄糖醛酸酶基因的重组质粒pET-28a-xynB-Hspr-aguA。

其中，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸。

作为优选，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸的水解条件为：pH 6.0-9.5，温度55-95℃下，保温时间30min～10h。

作为优选，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸时(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物中耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体用量为2.5-20U/g底物。此外，木聚糖酶的用量为3-100U/g底物。

其中，所述(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物为从硬木、软木或者禾(草)5本科植物中提取的木聚糖中的一种。

作为优选，所述(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物为从玉米芯、稻草或桦木中提取的木聚糖中的一种。

本发明所述应用制备的葡萄糖醛酸。

本发明通过寡肽融合策略提高α-葡萄糖醛酸酶的催化效率和稳定性。首先，对糖苷水解酶家族67的嗜热袍菌属(Thermotiga)α-葡萄糖醛酸酶TmAguA进行蛋白结构指导建模，并与4-O-甲基葡萄糖醛酸木二糖(MeGlcAX₂)进行分子对接和计算模拟建立TmAguA-MeGlcAX复合体结构，并对其结构解析，确定对TmAguA蛋白C末端进行寡肽融合修饰；然后合成三个寡肽PL1(HQAFFHA)、PL2(AAGSGSG)、PL3(GGGGSGG)，将其与TmAguA的C末端融合，获得三个多肽融合体即TmAguAPL1、TmAguAPL2和TmAguAPL3的融合基因，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，所得多肽融合体经过制备、纯化和比酶活力分析发现，多肽融合体TmAguAPL1和TmAguAPL2的比酶活力比野生型酶TmAguA提高了297％，141％，但TmAguAPL3比野生型酶TmAguA下降了21.8％，所获得TmAguAPL1是比酶活力最高多肽融合体；进一步比较TmAguAPL1和野生型酶TmAguA的酶动力学性质发现，TmAguAPL1水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物的K_cat和K_cat/K_m分别提高了356％和363％，而且在碱性pH8.0-10.0的稳定性比野生型酶提高了21.1％-65.7％，将其用于酶解榉木木聚糖制备葡萄糖醛酸的结果显示：相对野生型酶，多肽融合体TmAguAPL1转化榉木木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量和转化率分别提高了21.6％和15.7％，所得多肽融合体TmAguAPL1是水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖释放葡萄糖醛酸最高的融合体。利用计算机模拟构建了这个融合体TmAguAPL1与底物甲基葡萄糖醛酸木二糖(MeGlcAX₂))分子对接的复合体结构，并与未融合寡肽的TmAguA对比，明确结构改变对其催化效率和稳定性改善的关系，说明本发明特定设计的寡肽PL1的重要性，其中形成的多肽融合体即TmAguAPL1效果显著。

本发明通过定点突变和定向进化改善α-葡萄糖醛酸酶的催化效率和酸碱及氧化稳定性，并通过设计合成寡肽与酶的N或C端融合获得寡肽融合体促进蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达而且亦会影响其结构，改善其催化效率和稳定性。本发明在没有酶的结构信息或有效的高通量筛选方法条件下，通过寡肽融合策略提高酶的催化效率和稳定性。

本发明中耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体的酶活定义为：以4-O-甲基葡糖醛酸基木寡糖为底物，每分钟产生1μmol 4-O-甲基葡萄糖醛酸所需要的酶量，即为1个耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体活力单位。

α-葡萄糖醛酸酶作用的底物是4-O-甲基葡糖醛酸基木寡糖，其制备方法如下：在4％榉木木聚糖加入60U/g(底物)的β-1,4-内切木聚糖酶，置55℃水浴中反应16h，反应混合物经50℃真空浓缩15倍后，保存于-20℃。

木聚糖酶的酶活定义为：β-1,4-内切木聚糖酶的酶活定义为：以0.5％榉木木聚糖作为底物，每分钟产生1μmol木糖所需要的酶量,即为1个耐热木聚糖酶活力单位。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过蛋白质工程获得高活性水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物的全新的α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体，并对其进行高效表达，进一步经破细胞、热处理和离心分离所得到的α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体酶液对水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖水解获得葡萄糖醛酸产物，这不仅排除了供体菌共生的其他一系列酶系的干扰，而且相对其野生型酶，α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖的活性显著提高，具有转化效率高，反应副产物少，得到的葡萄糖醛酸产物量大等优点，可以有效应用到在制备葡萄糖醛酸中。

本发明通过对耐热α-葡萄糖醛酸酶蛋白C末端融合7个氨基酸残基组成全新的多肽融合体，所得多肽融合体的比活力比野生型酶TmAguA提高了297％，相应的水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物的Kcat和Kcat/Km分别提高356％和363％；而且在碱性pH8.0-10.0的稳定性比野生型酶提高了21.1％-65.7％，利用本发明的α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体联合木聚糖酶共同作用木聚糖制备葡萄糖醛酸，相对其野生型酶，多肽融合体转化榉木木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量和转化率分别提高了21.6％-60.3％具有转化效率高，反应副产物少，产量和纯度高，分离纯化容易、化学污染少等优点。

附图说明

图1野生型酶及其多肽融合体的比酶活力比较；

图2为pH和温度对α-葡萄糖醛酸酶活性影响的关系图，(A)：最适pH；(B)：最适温度；(C)：pH稳定性；(D)：温度稳定性；

图3为本发明实施例3中利用纯化TmAguA和TmAguAPL1水解水解榉木木聚糖制备葡萄糖醛酸的比较

图4为本发明实施例4中利用纯化TmAguA和TmAguAPL1水解水解榉木木聚糖制备葡萄糖醛酸

图5为本发明实施例6中利用纯化TmAguA和TmAguAPL1水解水解玉米芯木聚糖制备葡萄糖醛酸

图6为本发明实施例9中不同TmAguAPL1酶添加量对产葡萄糖醛酸量的影响；

图7为本发明实施例10中酶解时间对TmAguAPL1产葡萄糖醛酸量的影响；

图8为本发明实施例11中pH对TmAguAPL1产葡萄糖醛酸量的影响；

图9为本发明实施例12中酶解温度对TmAguAPL1产葡萄糖醛酸量的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

本发明中所述的溶液浓度，若无特殊说明，均指重量百分比。

实施例1

根据热袍菌属(Thermotiga)的家族67的α-葡萄糖醛酸酶基因序列(Ncbid的GenBank数据库的登录号：GeneID:896879)，即编码野生型TmAguA的核苷酸序列设计引物，具体是：

上游引物

F:5’CATGCCATGGACTACAGGATGTGCTGGCT-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物(四种)

R1:5’CCGCTCGAGCGGATATATCTTTCTTCCCTT-3’(SEQ ID NO.4)

R2:5’CCGCTCGAGTGCATGAAAGAATGCCTGATGCGGATATATCTTTCTTCCC-3’(SEQ IDNO.5)

R3:5’CCGCTCGAGGCCGCTGCCGCTGCCCGCCGCCGGATATATCTTTCTTCCC-3’(SEQ IDNO.6)

R4:5’CCGCTCGAGGCCGCCGCTGCCGCCGCCGCCCGGATATATCTTTCTTCCC-3’(SEQ IDNO.7)

选择含海栖热袍菌属野生型α-葡萄糖醛酸酶基因的重组质粒pET-28a-xynB-Hspr-aguA(J.Carbohydrate Chemistry,2018,37(4)210-224.)为模板，分别以F和R1(野生型TmAguA)、F和R2(TmAguAPL1)、F和R3(TmAguAPL2)、F和R4(TmAguAPL3)四对引物进行PCR扩增，获得多肽融合体即TmAguAPL1、TmAguAPL2、TmAguAPL3的融合基因的核苷酸片段，将这些核苷酸片段经Ncol和Xhol双酶切后插入同样双酶切的表达载体pET28a，获得重组质粒pET28a-TmAguA，和含有多肽融合体核苷酸片段的重组质粒pET28a-TmAaguAPL1、pET28a-TmAaguAPL2和pET28a-TmAaguAPL3，进一步将重组质粒pET28a-TmAguA、pET28a-TmAaguAPL1、pET28a-TmAaguAPL2和pET28a-TmAaguAPL3分别转化至宿主E.coli BL21(DE3)，并在含有卡那霉素Kna抗性的LB培养基37℃下生长至OD＝0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导培养12h，在4℃、4000rpm下离心去上清，沉淀用水洗涤3次，用三倍体积的pH7.0缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎获得破碎液，在0-4℃、10000rpm条件下离心30min，取上清即得α-葡萄糖醛酸酶及其多肽融合体的细胞抽提液，进一步将这些抽提液经热处理和镍亲和纯化获得纯化TmAguA、TmAguAPL1、TmAguAPL2和TmAguAPL3，并经SDS-PAGE检测后进行比酶活力分析发现，多肽融合体TmAguAPL1和TmAguAPL2的比酶活力比野生型酶TmAguA提高了297％，141％，但TmAguAPL3比野生型酶TmAguA下降了21.8％，所获得的TmAguAPL1是比酶活力最高多肽融合体结果如图1所示。

实施例2

采用实施例1相同的方法获得纯化TmAguA、TmAguAPL1，进一步比较pH和温度对TmAguA和TmAguAPL1酶活力的影响：

(1)最适反应pH：将重组酶TmAguA和TmAguAPL1置于在75℃下测定不同pH对酶活力的影响，以最高酶活为100％，计算酶的相对活性，作相对活性-pH曲线。酶反应在50mM邻苯咪唑缓冲液(pH 5.5-10.0)中进行，缓冲液pH在室温下调配。以上测定重复三次，相对标准偏差小于10％。

(2)pH稳定性：将重组酶TmAguA和TmAguAPL1分别置于pH值5.5-10的缓冲液下37℃保温1h后，测定酶的残余活力，以未保温的酶活力为100％，计算酶的相对活性，作pH稳定性曲线。所用缓冲液为50mM邻苯咪唑缓冲液(pH6.0-10.0)。以上测定重复三次，相对标准偏差小于5％。

(3)最适反应温度：将TmAguA和TmAguAPL1置于pH6.050 mM邻苯咪唑缓冲液，测定其分别在不同温度(55-95℃)下保温10分钟后的酶活力。以最高酶活力为100％，计算酶的相对活性，作相对活性-温度曲线。以上测定重复三次，相对标准偏差小于5％。

(4)温度稳定性：将TmAguA和TmAguAPL1置于pH6.0的50mM邻苯咪唑缓冲液中，分别在不同温度(55-95℃)下保温1h后，在最适条件下测定酶的残余活力，以未保温的酶活力为100％，计算酶的相对活性，作温度稳定性曲线。以上测定重复三次，相对标准偏差小于5％。

结果见图2表明：TmAguAPL1的最适温度和最适pH分别为75℃和8.5，相比野生型酶TmAguA的最适温度85℃和最适pH7.5，分别下降10℃和提高一pH单位，其碱性pH8.0-10.0的稳定性比野生型酶提高21.1％-65.7％。

以不同终浓度的4-O-甲基葡糖醛酸和基木寡糖(0.02g/mL、0.04g/mL、0.06g/mL、0.08g/mL、0.10g/mL，0.12g/mL)为底物在最适反应条件下检测野生酶TmAguA和TmAguAPL1催化动力学参数结果见表1：相比野生型酶，TmAguAPL1水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖底物的转换数k_cat和催化效率k_cat/K_m分别提高356％和363％。

表1 TmAguA和TmAguAPL1动力学参数比较

实施例3

与实施例2方法相同，不同之处在于进一步选择等摩尔量TmAguA和TmAguAPL1进行酶水解木聚糖制备葡萄糖醛酸效果评估，具体方法：

将榉木木聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的榉木木聚糖溶液，加入20U/g(底物)的β-1,4-内切木聚糖酶，然后加入1.82μmol/L的纯化TmAguA在85℃和pH7.5下保温2小时作对照组；样本组加入等摩尔浓度(1.82μmol/L)的纯化TmAguAPL1在75℃和pH8.5下保温2小时，结果(见图3)表明：相比对照组(野生型酶)，样本组(TmAguAPL1)转化榉木木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量提高48.6-60.3％，所得TmAguAPL1是水解4-O-甲基葡萄糖醛酸木寡糖释放葡萄糖醛酸最高的，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ：ID NO.1:α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体(TmAguAPL1)TmAguAPL1

MDYRMCWLEYRGLPADVAGKLKDWFSSVSILEPGSSVLKDEIRRFSERSIGITPRFYSRPLKKEKYIMVGRLESLPIKLDVNLGEEGFMLRTIEWNGSKILLVTGETKKALVYGIFDLMKRIRLGEDIEKMNVLAKPKAKFRMLNHWDNLDGTIERGYAGNSIFFKDNRIIINQRTKDYARLLASIGINGVVINNVNVKKREVYLIDSIYLKKLKKLADIFREYGIKIYLSINFASPVYLGGLDTADPLDERVARWWREKARGIYDYIPDFGGFLVKADSEFNPGPHMFGRTHAEGANMLARALAPFGGVVIWRAFVYNCLQDWRDYKTDRAKAAYDNFKPLDGQFDDNVIIQIKYGPMDFQVREPVNPLFGGMEKTNQILELQITQEYTGQQIHLCFLGTLWKEILEFDTFAKGEGSYVKRIVDGTLFDRENNGFAGVSNVGDSVNWTGHDLAQANLYAFGRLAWNPDEEIERIVEEWIKLTFGDDEKVLENVSYMLMKSHRTYEKYTTPFGLGWMVNPGHHYGPNPEGYEYSKWGTYHRANWEAIGVDRTSRGTGYTLQYHSPWKEIYDDINTCPEDLLLFFHRVRYDHRLKSGKTLLQTMYDLHFEGVEEVEEFIKKWEELKDRVSPDIFERVKERLHMQLEHAKEWRDVINTYFYRRTGIPDEKGRKIYPHQAFFHA

SEQ：ID NO.2：α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体基因(TmAguAPL1)(DNA)序列

atggattatcgtatgtgttggctggaatatcgtggtctgccggcagatgttgcaggtaaactgaaagattggtttagcagcgttagcattctggaaccgggtagcagcgttctgaaagatgaaattcgtcgttttagcgaacgtagcattggtattaccccgcgtttttatagccgtccgctgaaaaaagaaaaatatattatggttggtcgtctggaaagcctgccgattaaactggatgttaatctgggtgaagaaggttttatgctgcgtaccattgaatggaatggtagcaaaattctgctggttaccggtgaaaccaaaaaagcactggtttatggtatttttgatctgatgaaacgtattcgtctgggtgaagatattgaaaaaatgaatgttctggcaaaaccgaaagcaaaatttcgtatgctgaatcattgggataatctggatggtaccattgaacgtggttatgcaggtaatagcattttttttaaagataatcgtattattattaatcagcgtaccaaagattatgcacgtctgctggcaagcattggtattaatggtgttgttattaataatgttaatgttaaaaaacgtgaagtttatctgattgatagcatttatctgaaaaaactgaaaaaactggcagatatttttcgtgaatatggtattaaaatttatctgagcattaattttgcaagcccggtttatctgggtggtctggataccgcagatccgctggatgaacgtgttgcacgttggtggcgtgaaaaagcacgtggtatttatgattatattccggattttggtggttttctggttaaagcagatagcgaatttaatccgggtccgcatatgtttggtcgtacccatgcagaaggtgcaaatatgctggcacgtgcactggcaccgtttggtggtgttgttatttggcgtgcatttgtttataattgtctgcaggattggcgtgattataaaaccgatcgtgcaaaagcagcatatgataattttaaaccgctggatggtcagtttgatgataatgttattattcagattaaatatggtccgatggattttcaggttcgtgaaccggttaatccgctgtttggtggtatggaaaaaaccaatcagattctggaactgcagattacccaggaatataccggtcagcagattcatctgtgttttctgggtaccctgtggaaagaaattctggaatttgatacctttgcaaaaggtgaaggtagctatgttaaacgtattgttgatggtaccctgtttgatcgtgaaaataatggttttgcaggtgttagcaatgttggtgatagcgttaattggaccggtcatgatctggcacaggcaaatctgtatgcatttggtcgtctggcatggaatccggatgaagaaattgaacgtattgttgaagaatggattaaactgacctttggtgatgatgaaaaagttctggaaaatgttagctatatgctgatgaaaagccatcgtacctatgaaaaatataccaccccgtttggtctgggttggatggttaatccgggtcatcattatggtccgaatccggaaggttatgaatatagcaaatggggtacctatcatcgtgcaaattgggaagcaattggtgttgatcgtaccagccgtggtaccggttataccctgcagtatcatagcccgtggaaagaaatttatgatgatattaatacctgtccggaagatctgctgctgttttttcatcgtgttcgttatgatcatcgtctgaaaagcggtaaaaccctgctgcagaccatgtatgatctgcattttgaaggtgttgaagaagttgaagaatttattaaaaaatgggaagaactgaaagatcgtgttagcccggatatttttgaacgtgttaaagaacgtctgcatatgcagctggaacatgcaaaagaatggcgtgatgttattaatacctatttttatcgtcgtaccggtattccggatgaaaaaggtcgtaaaatttatccgcatcaggcattctttcatgca

实施例4

与实施例2方法相同，不同之处在于将榉木木聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为40mg/mL的木聚糖溶液，加入60U/g(底物)的β-1,4-内切木聚糖酶，然后分别加入等摩尔浓度(3.6μmol/L)的纯化TmAguA(对照组)和TmAguAPL1(样本组)，在相同反应条件：65℃和pH8.0下震荡保温1-12小时，酶解产物葡萄糖醛酸释放量采用间羟基联苯比色法测定，结果(见图4)显示：相比对照组(野生型酶)的产量7.65mg/mL和转化率77.3％，样本组(TmAguAPL1)转化木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量和转化率(9.3mg/mL，93.0％)分别提高了21.6％和15.7％，进一步将酶解后的木聚糖水解液经浓缩后加入95％的乙醇，在低速搅拌下充分平衡20-30min后过滤，收集滤液，浓缩回收酒精，制得浓缩物即可得葡萄糖醛酸。TmAguAPL1在高底物浓度下进行水解作用的效果。

实施例5

将风干玉米芯经粉碎后，称取10g玉米芯粉加入160mL甲醇溶液避光震荡24小时去除脂肪和木质素后，加入100mg/mL氢氧化钠溶液，固液比为15∶1(mg/mL)在60℃下低速搅拌8小时，然后收集滤液并用酸中和至微酸性，然后用四倍体积乙醇沉淀即得木聚糖。将木聚糖用50mmol/L pH8.5磷酸钠缓冲液配成80mg/mL木聚糖溶液，酶用量β-1,4-内切木聚糖酶100U/g，然后分别加入等摩尔浓度(2.5μmol/L)的纯化TmAguA(对照组)和TmAguAPL1(样本组)，在相同反应条件：pH8.5和水解温度75℃，震荡保温4小时，采用铜试剂-砷钼酸钠比色测定法测定葡萄糖醛酸的释放量，结果见图5所示：随着保温时间增加，葡萄糖醛酸的产量逐渐升高；当保温4小时后，葡萄糖醛酸的产量最高，TmAguA(对照组)产葡萄糖醛酸2.31mg/mL，相应的TmAguAPL1(样本组)产葡萄糖醛酸2.82mg/mL，相比对照组(野生型酶)，样本组(TmAguAPL1)转化木聚糖产生葡萄糖醛酸的产量和转化率提高22.1％。酶解后的木聚糖水解液经浓缩后加入三倍体积的95％的乙醇，在低速搅拌下充分平衡20-30min后过滤，收集滤液，浓缩回收酒精，制得浓缩物即可得葡萄糖醛酸。

实施例6

重组菌培养与粗酶液制备：分别将含有TmAguAPL1基因的重组质粒转化宿主宿主E.coli BL21(DE3)，在培养基中37℃温度培养至OD600值0.8-1.0后，加IPTG在30℃温度诱导培养10h，然后将菌液在4℃、转速5000rpm条件下离心，用水洗涤沉淀物3次，在用1/10体积0.25M pH7.2的柠檬酸缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎，破碎后的菌液在70℃温度条件下热处理15min，在4℃、10000rpm条件下离心30min，取上清即得α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体TmAguAPL1粗酶液。

实施例7

与实施例5相同，不同之处在于采用的α-葡萄糖醛酸酶是TmAguAPL1粗酶液，所用木聚糖底物是从稻草粉中提取的，其制备方法由下述：稻草木聚糖，将风干稻草经粉碎后,先用清水浸泡后离心除去水分，按固液比8∶1(mg/mL)加入5.5％氢氧化钠溶液，室温下低速搅拌12小时，然后收集滤液并用酸中和至微酸性，然后用四倍体积乙醇沉淀即得木聚糖。将稻草木聚糖用50mmol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液配成30mg/mL溶液，β-1,4-内切木聚糖酶用量50U/g，TmAguAPL1粗酶液用量10U/g，pH 7.0水解温度65℃，水解5小时。酶解后的木聚糖水解液经浓缩后加入三倍体积95％的乙醇，在低速搅拌下充分平衡20-30min后过滤，收集滤液，浓缩回收酒精，制得浓缩物即可得葡萄糖醛酸。

实施例8

水解桦木木聚糖制备葡萄糖醛酸

与实施例7相同，不同之处在于所用木聚糖底物是从桦木粉中提取的，其制备方法由下述：将风干桦木经粉碎后,称取30g桦木粉加入100mL过氧化氢溶液避光震荡24小时去除脂肪和木质素后，按固液比10∶1(mg/mL)，加24％KOH在室温下连续提取24小时后，然后用三倍体积的酸性乙醇沉淀即得粗提桦木木聚糖；再用10％KOH在室温下溶解沉淀物30min后加入20倍沉淀物体积的Ba(OH)₂.饱和溶液，向碱抽提溶液中加入四倍体积的乙醇，混匀后用酸调节溶液pH；离心或过滤收集沉淀物即为净化的桦木木聚糖。将桦木木聚糖溶于柠檬酸缓冲液，配制成浓度为6％的桦木木聚糖溶液。

实施例9

与实施例4相同，不同之处在于采用的α-葡萄糖醛酸酶是TmAguAPL1粗酶液，加入不同量的TmAguAPL1粗酶液(1.25、2.5、5、10、15、20U/g底物)在75℃和pH8.0条件下反应4h，酶解结束后，采用间羟基联苯法测定葡萄糖醛酸的释放量，结果见图6所示。随着TmAguAPL1添加量的增加，葡萄糖醛酸的产量先上升后趋于平稳，加酶量为5U/g时，产量为27.5mg/mL，继续增加酶量葡萄糖醛酸的产量趋于平稳。

实施例10

与实施例9相同，不同之处在于TmAguAPL1粗酶液的添加量为20U/g，酶解时间分别为0.5、1、2、4、6、8、10h后，测定葡萄糖醛酸的释放量，结果如图7所示。由图7可知，当水解时间低于4h时，葡萄糖醛酸的产量随着反应时间的延长不断增加，水解时间为4h时，葡萄糖醛酸的产量达到22.9mg/mL，继续延长反应时间其产量增加并不显著。

实施例11

与实施例9相同，不同之处在于水解木聚糖的反应pH分别在6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5下，TmAguAPL1粗酶液的添加量为20U/g，维持反应温度75℃震荡保温4小时后，测定葡萄糖醛酸的释放量，结果如图8所示。由图8可知，随pH值的升高，葡萄糖醛酸产量呈先上升后下降的趋势。在pH 8.5时葡萄糖醛酸产量达到最大25.8mg/mL。

实施例12

与实施例9相同，不同之处在于水解木聚糖的反应温度分别为55℃、65℃、75℃、85℃、95℃，反应pH 8.5，TmAguAPL1粗酶液的添加量为20U/g，震荡保温4小时后，测定葡萄糖醛酸的释放量，结果如图9所示。由图9可以看出，随着水解温度的升高，葡萄糖醛酸的产量先平稳上升而后下降。当水解温度为75℃时，葡萄糖醛酸的产量最高，达到25.8mg/mL。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Arg Met Cys Trp Leu Glu Tyr Arg Gly Leu Pro Ala Asp

1 5 10 15

Val Ala Gly Lys Leu Lys Asp Trp Phe Ser Ser Val Ser Ile Leu Glu

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Leu Lys Asp Glu Ile Arg Arg Phe Ser Glu Arg

35 40 45

Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Phe Tyr Ser Arg Pro Leu Lys Lys Glu

50 55 60

Lys Tyr Ile Met Val Gly Arg Leu Glu Ser Leu Pro Ile Lys Leu Asp

65 70 75 80

Val Asn Leu Gly Glu Glu Gly Phe Met Leu Arg Thr Ile Glu Trp Asn

85 90 95

Gly Ser Lys Ile Leu Leu Val Thr Gly Glu Thr Lys Lys Ala Leu Val

100 105 110

Tyr Gly Ile Phe Asp Leu Met Lys Arg Ile Arg Leu Gly Glu Asp Ile

115 120 125

Glu Lys Met Asn Val Leu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Phe Arg Met Leu

130 135 140

Asn His Trp Asp Asn Leu Asp Gly Thr Ile Glu Arg Gly Tyr Ala Gly

145 150 155 160

Asn Ser Ile Phe Phe Lys Asp Asn Arg Ile Ile Ile Asn Gln Arg Thr

165 170 175

Lys Asp Tyr Ala Arg Leu Leu Ala Ser Ile Gly Ile Asn Gly Val Val

180 185 190

Ile Asn Asn Val Asn Val Lys Lys Arg Glu Val Tyr Leu Ile Asp Ser

195 200 205

Ile Tyr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Asp Ile Phe Arg Glu Tyr

210 215 220

Gly Ile Lys Ile Tyr Leu Ser Ile Asn Phe Ala Ser Pro Val Tyr Leu

225 230 235 240

Gly Gly Leu Asp Thr Ala Asp Pro Leu Asp Glu Arg Val Ala Arg Trp

245 250 255

Trp Arg Glu Lys Ala Arg Gly Ile Tyr Asp Tyr Ile Pro Asp Phe Gly

260 265 270

Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe Asn Pro Gly Pro His Met

275 280 285

Phe Gly Arg Thr His Ala Glu Gly Ala Asn Met Leu Ala Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Pro Phe Gly Gly Val Val Ile Trp Arg Ala Phe Val Tyr Asn Cys

305 310 315 320

Leu Gln Asp Trp Arg Asp Tyr Lys Thr Asp Arg Ala Lys Ala Ala Tyr

325 330 335

Asp Asn Phe Lys Pro Leu Asp Gly Gln Phe Asp Asp Asn Val Ile Ile

340 345 350

Gln Ile Lys Tyr Gly Pro Met Asp Phe Gln Val Arg Glu Pro Val Asn

355 360 365

Pro Leu Phe Gly Gly Met Glu Lys Thr Asn Gln Ile Leu Glu Leu Gln

370 375 380

Ile Thr Gln Glu Tyr Thr Gly Gln Gln Ile His Leu Cys Phe Leu Gly

385 390 395 400

Thr Leu Trp Lys Glu Ile Leu Glu Phe Asp Thr Phe Ala Lys Gly Glu

405 410 415

Gly Ser Tyr Val Lys Arg Ile Val Asp Gly Thr Leu Phe Asp Arg Glu

420 425 430

Asn Asn Gly Phe Ala Gly Val Ser Asn Val Gly Asp Ser Val Asn Trp

435 440 445

Thr Gly His Asp Leu Ala Gln Ala Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Arg Leu

450 455 460

Ala Trp Asn Pro Asp Glu Glu Ile Glu Arg Ile Val Glu Glu Trp Ile

465 470 475 480

Lys Leu Thr Phe Gly Asp Asp Glu Lys Val Leu Glu Asn Val Ser Tyr

485 490 495

Met Leu Met Lys Ser His Arg Thr Tyr Glu Lys Tyr Thr Thr Pro Phe

500 505 510

Gly Leu Gly Trp Met Val Asn Pro Gly His His Tyr Gly Pro Asn Pro

515 520 525

Glu Gly Tyr Glu Tyr Ser Lys Trp Gly Thr Tyr His Arg Ala Asn Trp

530 535 540

Glu Ala Ile Gly Val Asp Arg Thr Ser Arg Gly Thr Gly Tyr Thr Leu

545 550 555 560

Gln Tyr His Ser Pro Trp Lys Glu Ile Tyr Asp Asp Ile Asn Thr Cys

565 570 575

Pro Glu Asp Leu Leu Leu Phe Phe His Arg Val Arg Tyr Asp His Arg

580 585 590

Leu Lys Ser Gly Lys Thr Leu Leu Gln Thr Met Tyr Asp Leu His Phe

595 600 605

Glu Gly Val Glu Glu Val Glu Glu Phe Ile Lys Lys Trp Glu Glu Leu

610 615 620

Lys Asp Arg Val Ser Pro Asp Ile Phe Glu Arg Val Lys Glu Arg Leu

625 630 635 640

His Met Gln Leu Glu His Ala Lys Glu Trp Arg Asp Val Ile Asn Thr

645 650 655

Tyr Phe Tyr Arg Arg Thr Gly Ile Pro Asp Glu Lys Gly Arg Lys Ile

660 665 670

Tyr Pro His Gln Ala Phe Phe His Ala

675 680

<210> 3

<211> 2043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattatc gtatgtgttg gctggaatat cgtggtctgc cggcagatgt tgcaggtaaa 60

ctgaaagatt ggtttagcag cgttagcatt ctggaaccgg gtagcagcgt tctgaaagat 120

gaaattcgtc gttttagcga acgtagcatt ggtattaccc cgcgttttta tagccgtccg 180

ctgaaaaaag aaaaatatat tatggttggt cgtctggaaa gcctgccgat taaactggat 240

gttaatctgg gtgaagaagg ttttatgctg cgtaccattg aatggaatgg tagcaaaatt 300

ctgctggtta ccggtgaaac caaaaaagca ctggtttatg gtatttttga tctgatgaaa 360

cgtattcgtc tgggtgaaga tattgaaaaa atgaatgttc tggcaaaacc gaaagcaaaa 420

tttcgtatgc tgaatcattg ggataatctg gatggtacca ttgaacgtgg ttatgcaggt 480

aatagcattt tttttaaaga taatcgtatt attattaatc agcgtaccaa agattatgca 540

cgtctgctgg caagcattgg tattaatggt gttgttatta ataatgttaa tgttaaaaaa 600

cgtgaagttt atctgattga tagcatttat ctgaaaaaac tgaaaaaact ggcagatatt 660

tttcgtgaat atggtattaa aatttatctg agcattaatt ttgcaagccc ggtttatctg 720

ggtggtctgg ataccgcaga tccgctggat gaacgtgttg cacgttggtg gcgtgaaaaa 780

gcacgtggta tttatgatta tattccggat tttggtggtt ttctggttaa agcagatagc 840

gaatttaatc cgggtccgca tatgtttggt cgtacccatg cagaaggtgc aaatatgctg 900

gcacgtgcac tggcaccgtt tggtggtgtt gttatttggc gtgcatttgt ttataattgt 960

ctgcaggatt ggcgtgatta taaaaccgat cgtgcaaaag cagcatatga taattttaaa 1020

ccgctggatg gtcagtttga tgataatgtt attattcaga ttaaatatgg tccgatggat 1080

tttcaggttc gtgaaccggt taatccgctg tttggtggta tggaaaaaac caatcagatt 1140

ctggaactgc agattaccca ggaatatacc ggtcagcaga ttcatctgtg ttttctgggt 1200

accctgtgga aagaaattct ggaatttgat acctttgcaa aaggtgaagg tagctatgtt 1260

aaacgtattg ttgatggtac cctgtttgat cgtgaaaata atggttttgc aggtgttagc 1320

aatgttggtg atagcgttaa ttggaccggt catgatctgg cacaggcaaa tctgtatgca 1380

tttggtcgtc tggcatggaa tccggatgaa gaaattgaac gtattgttga agaatggatt 1440

aaactgacct ttggtgatga tgaaaaagtt ctggaaaatg ttagctatat gctgatgaaa 1500

agccatcgta cctatgaaaa atataccacc ccgtttggtc tgggttggat ggttaatccg 1560

ggtcatcatt atggtccgaa tccggaaggt tatgaatata gcaaatgggg tacctatcat 1620

cgtgcaaatt gggaagcaat tggtgttgat cgtaccagcc gtggtaccgg ttataccctg 1680

cagtatcata gcccgtggaa agaaatttat gatgatatta atacctgtcc ggaagatctg 1740

ctgctgtttt ttcatcgtgt tcgttatgat catcgtctga aaagcggtaa aaccctgctg 1800

cagaccatgt atgatctgca ttttgaaggt gttgaagaag ttgaagaatt tattaaaaaa 1860

tgggaagaac tgaaagatcg tgttagcccg gatatttttg aacgtgttaa agaacgtctg 1920

catatgcagc tggaacatgc aaaagaatgg cgtgatgtta ttaataccta tttttatcgt 1980

cgtaccggta ttccggatga aaaaggtcgt aaaatttatc cgcatcaggc attctttcat 2040

gca 2043

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg actacaggat gtgctggc 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc ggatatatct ttcttccctt 30

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagt gcatgaaaga atgcctgatg cggatatatc tttcttccc 49

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagg ccgctgccgc tgcccgccgc cggatatatc tttcttccc 49

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctcgagg ccgccgctgc cgccgccgcc cggatatatc tttcttccc 49

Claims

1.一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用，其特征在于，所述耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体是糖苷水解酶家族67的α-葡萄糖醛酸酶的C末端融合7个氨基酸残基组成的多肽。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体TmAguAPL1基因序列进行扩增的引物为SEQ ID NO.3和5，模板为含热袍菌属野生型α-葡萄糖醛酸酶基因的重组质粒pET-28a-xynB-Hspr-aguA。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸的水解条件优选为：pH 6.0-9.5，温度55-95℃下，保温时间30min～10h。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述耐热α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体水解(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物制备葡萄糖醛酸时(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物中耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体用量为2.5-20U/g底物。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物为从硬木、软木或者禾(草)本科植物中提取的木聚糖中的一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述(4-O-甲基)葡萄糖醛酸木聚糖底物为从玉米芯、稻草或桦木中提取的木聚糖中的一种。

10.一种利用权利要求1所述应用制备的葡萄糖醛酸。