CN107365806B

CN107365806B - 一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-nadh氧化酶和应用

Info

Publication number: CN107365806B
Application number: CN201710651838.0A
Authority: CN
Inventors: 薛业敏; 李亚贤; 张宗慧
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2037-08-02
Also published as: CN107365806A

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶‑NADH氧化酶和应用；该制备方法以木质纤维植物中提取的木聚糖为原料，采用耐高温木聚糖酶和α‑葡萄糖醛酸酶酶水解工艺制备葡萄糖醛酸，再通过双功能性糖醛酸脱氢酶‑NADH氧化酶将生成的葡萄糖醛酸氧化制备葡萄糖二酸。本发明制备方法可以有效的节约NAD的使用量，利用NADH氧化酶为糖醛酸脱氢酶原位再生NAD促进辅酶循环，使得糖醛酸脱氢酶不断地催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸，从而提高催化效率，转化率可以达100％。同时该制备方法具有高效快速、专一，反应条件温和的优势，整个制备过程中不使用酸碱等化学物质，能耗低，污染小，操作简单易控。

Description

一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶- NADH氧化酶和应用

技术领域

本发明涉及食品、医药和化工、清洁生产领域的葡萄糖二酸，具体地涉及一种葡萄糖二酸的酶法制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用。

背景技术

葡萄糖二酸是一种葡萄糖衍生物，可作为原料制备多种聚合物和生物质新能源，在化工领域具有广泛的应用价值，被认为是“最具价值的生物炼制产品”之一。例如，可作为合成聚酰胺类、羟基化的尼龙(PHPAs)及聚二甲基硅氧烷(BDMS)聚酰胺等聚合物的基本单体，合成无毒、可生物降解材料，用于家用洗涤剂、防腐剂和混凝土外加剂等。葡萄糖二酸也具有调控体内激素、提高机体免疫功能、减少癌症病发的作用，它在食品和医药领域的关注度和市场需求逐年增加。因此，葡萄糖二酸作为最具价值的生物炼制产品成为食品工业研究开发的热点之一。葡萄糖酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸残基广泛分布于葡萄糖醛酸木聚糖(硬木)、阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖(软木、禾本科植物：秸秆)等半纤维素中，半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类可再生资源，含量占木质纤维生物量的20-35％。我国是农业大国，每年秸秆产量不低于10亿吨，占世界秸秆总产量的25％-30％，若仅烧以作肥料，既浪费资源又造成环境污染。因此，利用这些生物废料制备低聚木糖具有一定的经济效益和社会效益。

由葡萄糖制备葡萄糖二酸是将其末端的羰基和伯羟基氧化为羧基，而其它的4个仲羟基不被氧化。葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸生产方法包括：化学法、微生物发酵法和酶法等。现有的葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的共催化氧化方法。李建新等公开了有机电化学合成技术领域的一种葡萄糖酸及葡萄糖二酸的制备方法(CN103436910A)。这些化学法制备葡萄糖二酸存在试剂耗费量大，污染环境等问题；而具有反应条件温和且环境污染少的微生物发酵法或酶法作为化学替代法越来越受到研究者的重视，作为微生物发酵法，现有技术有，如Prather等分别从Saccharomyces cerevisiae和小鼠体内提取肌醇-1-磷酸合成酶(Inol)和肌醇氧化酶(MIOX)用于生产葡萄糖醛酸，将Pseudomonas syringae醛酸脱氢酶(Udh)等关键酶克隆到E.coli中，完成从D-葡萄糖生成D-葡萄糖二酸的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology，2009，75：589-595；Metabolic Engineering，2010，12：298-305)。王淼等(CN105802896A)发明了利用能产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡糖醋杆菌将葡萄糖或淀粉质食品原料水解的可发酵性糖类为底物发酵生产葡萄糖二酸-1,4-内酯的方法；小西一诚等提供了具有显著改善的葡萄糖二酸的合成能力的转化体和用该转化体有效生产葡萄糖二酸的方法(CN104080918B)康振等通过在大肠杆菌中表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶(MIOX)，将肌醇转化为葡萄糖醛酸，再通过表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，将生成的葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸(CN104312987A)；通过在酵母中表达肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，实现葡萄糖醛酸的生成途径(CN104312935A)，同时表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了葡萄糖二酸的合成途径(葡萄糖二酸产量60mg/L)(CN104312935A)。通过将肌醇加氧酶(MIOX)及醛酸脱氢酶(Udh)融合，采用直接融合及添加不同连接肽的方式，克隆表达至酵母菌株中，强化了葡萄糖二酸的合成途径。通过定点突变获得酶活提升的肌醇加氧酶突变体，并将其与醛酸脱氢酶(udh)在酵母中共表达，强化了葡萄糖二酸合成途径(CN104911117A)。但利用发酵法生产葡萄糖二酸存在产量低(6.02g/L)、培养时间长(2天)等问题都抑制了此方法的发展，而且在分离提取方法上还没有研究(化工进展，2011,33(11)：2502-2508)。相比微生物发酵法，酶法具有直接作用底物且反应速度更快、生产周期短等优势，作为酶法的现有技术有，如Marsh等以小鼠腺体的葡糖醛酸酶为催化剂，在H₂O₂和Fe²⁺存在条件下转化葡萄糖醛酸产生葡萄糖二酸(Carbohydrate Research，1986，153：119-131)；专利W002/074926利用己糖氧化酶、醛氧化酶、醛脱氢酶作用于D-葡萄糖而将其转化D-葡萄糖二酸，日本国专利第3713530号利用葡萄糖氧化酶作用于D-葡萄糖的方法。但是仍未能很好解决转化时间长，酶反应性低，成本高等问题。

发明内容：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种葡萄糖二酸的制备方法，通过该酶法制备葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸，具有高效快速、专一，反应条件温和的优势，并且葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸的转化率可以达100％。

本发明还提供了该制备方法中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种葡萄糖二酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)从木质纤维植物中提取的木聚糖为原料；

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶混合酶液中，进行水解反应，水解结束后加入乙醇进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶混合反应液中进行酶氧化反应；

(4)氧化反应结束后，反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。

其中，步骤(1)所述木质纤维植物为硬木、软木或禾本科植物，优选从硬木来源半纤维素中提取的葡萄糖醛酸木聚糖。

其中，木聚糖制备可参考Pellerin P等的方法(Pellerin P,Gosselin M,Lepoutre JP,Samain E and Debeire P(1991)Enzymic production ofoligosaccharides from corncob xylan.Enzyme Microb Technol 132:617-621)用碱从玉米芯、稻草和甘蔗渣、桦木、松木等植物纤维中提取，用作酶转化底物；也可从生物公司购买。

作为优选，步骤(2)所述混合酶液中木聚糖浓度为10-100mg/ml，混合酶液pH为4.0-7.5；酶液中耐高温木聚糖酶活性为1-20U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为0.2-5.0U/mL。

所述耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶,是根据热袍菌属Thermotiga的GH10木聚糖酶基因(TmXynB)和GH67α-葡萄糖醛酸酶基因(TmAguA)序列设计引物，并以热袍菌属Thermotiga的基因组为模板进行PCR扩增获得基因，然后插入表达质粒并转化宿主令其表达，即而获得耐热木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶。

进一步地，步骤(2)所述水解反应温度60℃～90℃，时间40min～10h。

其中，步骤(2)所述乙醇体积分数80％以上的乙醇水溶液，用量为混合酶液体积的4-5倍。

作为优选，步骤(3)所述混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为0.16～10.0mg/mL；反应液pH为6.0-8.2，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为0.1-5.0U/mL，NADH氧化酶活性为0.1-5.0U/mL。更进一步地，糖醛酸脱氢酶和NADH氧化酶的活性比为1。

其中，步骤(3)所述混合反应液中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.2-2.0mM。

进一步地，步骤(3)所述酶氧化反应温度30℃～65℃，时间40min～2.0h。

本发明所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；或者与SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列有80％以上相同的氨基酸序列。SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸分子量为76,700+Da或84,700+Da。

本发明所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶所述双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的基因的碱基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，是通过将编码双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的碱基序列SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4克隆至表达载体并令其表达，即而获得耐热双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶氨基酸序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

本发明所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶在氧化葡萄糖醛酸生成葡萄糖二酸中的应用。具体为在葡萄糖醛酸和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)存在下，使用双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶基因的基因重组生物及其处理物生产葡萄糖二酸；所述处理物是细胞破碎液、细胞抽提液及固体粉末，优选细胞抽提液。

本发明以木质纤维植物中提取的木聚糖为原料，采用耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶酶水解工艺制备葡萄糖醛酸，再通过糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶双功能酶将生成的葡萄糖醛酸氧化制备葡萄糖二酸；为了达到好的效果，在制备方法中所用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，是能够使得两酶在空间上相互靠近进而形成辅酶传递的通道，利用NADH氧化酶为糖醛酸脱氢酶原位再生NAD促进辅酶循环，使得糖醛酸脱氢酶不断的催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸，从而提高催化效率。同时采用本发明的酶法制备可以针对农作物废弃物经汽瀑法进行预处理得到的汽瀑物，同样可以有效地得到葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明通过酶法制备葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸，具有高效快速、专一，反应条件温和的优势，整个制备过程中不使用酸碱等化学物质，能耗低，污染小，操作简单易控，同时产物易纯化，产品保持天然品质；由于所用原料为来源广泛的农作物废弃物，不耗费粮食资源，大大降低生产成本，同时解决了农作物废弃物给环境带来污染问题，具有重要的经济效益和社会效益。

(2)本发明制备过程中采用双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，可以有效的节约NAD的使用量，利用NADH氧化酶为糖醛酸脱氢酶原位再生NAD促进辅酶循环，比单独使用糖醛酸脱氢酶进行氧化可以大量减少NAD的消耗；使得糖醛酸脱氢酶不断的催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸，从而提高催化效率，葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸的转化率可以达100％。

(3)本发明采用酶工程的策略，成功构建了从木聚糖到葡萄糖二酸的合成途径，为生物法转化生成葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸提供了新的路径。

附图说明

图1为温度和pH对双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的糖醛酸脱氢酶活性影响的关系图，A：最适温度；B：最适pH；C：温度稳定性；D：pH稳定性；

图2为温度和pH对双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的NADH氧化酶活性影响的关系图，A：最适温度；B：最适pH；C：温度稳定性；D：pH稳定性；

图3为本发明实施例5中双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶氧化葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸的关系图；

图4为本发明实施例6双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶氧化葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸关系图；

图5为本发明对比例2糖醛酸脱氢酶氧化葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸的关系图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

由上海生工合成糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的基因，如SEQ ID NO.3碱基序列所示，该序列由嗜热双孢菌Thermobispora bispora嗜热双孢菌糖醛酸脱氢酶(TbUDH)(WP_013131340)基因通过Linker连接着海栖热袍菌Thermotigamaritima NADH氧化酶(TmNOX)基因组成并经密码子优化获得，其中TbUDH是从嗜热双孢菌全基因组测序中筛选到的NAD依赖性脱氢酶基因，TmNOX是从海栖热袍菌全基因组测序中筛选到的氧化还原酶基因(Tm1433)，SEQ ID NO.3碱基序列与表达质粒pET-28a(+)一起用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，经T4DNA连接酶16℃连接过夜并转化宿主E.coli JM109(DE3)，在LB培养基37℃下生长至OD＝0.6-0.8时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导培养8-12h，在4℃、4000rpm下离心去上清，沉淀用水洗涤3次，用三倍体积的pH7.0缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎获得破碎液，在0-4℃、10000-13000rpm条件下离心10-30min，取上清即得双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的细胞抽提液，该细胞抽提液的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

由上海生工合成糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的基因，如SEQ ID NO.4碱基序列所示，该序列由嗜热双孢菌Thermobispora bispora嗜热双孢菌糖醛酸脱氢酶(TbUDH)(WP_013131340)基因通过Linker连接着海栖热袍菌Thermotiga maritima NADH氧化酶(TmNOX)基因组成并经密码子优化获得，其中TbUDH是从嗜热双孢菌全基因组测序中筛选到的NAD依赖性脱氢酶基因，TmNOX是从海栖热袍菌全基因组测序中筛选到的假设蛋白基因(Tm1432)，采用相同的方法得到细胞抽提液，该细胞抽提液提取液的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3

根据海栖热袍菌Thermotiga maritima的GH10木聚糖酶基因(TmXynB)设计引物SEQ ID NO.5：5’-CCGTTCCATGGACTACAGGATGTGC-3’和SEQ ID NO.6：5’-CCGCTCGAGCGGATATATCTTTCTTCCCTT-3’；根据海栖热袍菌T.maritima的GH67α-葡萄糖醛酸酶基因(TmAguA)序列设计引物SEQ ID NO.7：5’-GGAATTCCATATGAAAATATTACCTTCTGTGTTGAT-3’和SEQ ID NO.8：5’-CCCTCGAGTCTTTCTTCTATCTTTTTCTCCAG-3’，选择T.maritima菌的基因组DNA(南京师范大学金陵女子学院提供)为模板进行PCR扩增获得目的基因,然后插入表达质粒，将含有木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶基因的重组质粒转化宿主，在培养基中25～37℃温度培养至OD600值0.8-1.0后，加IPTG或乳糖在℃温度诱导培养6-10h，然后将菌液在0-10℃、转速4000-6000rpm条件下离心，用水洗涤沉淀物3次，在用1/10体积0.02-0.5M pH6.0-8.0的缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎，破碎后的菌液在60-70℃温度条件下热处理10-20min,在0-4℃、10000-13000rpm条件下离心10-30min，取上清即得木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶的细胞抽提液。

实施例4

(1)取颗粒直径为2-3mm左右的风干玉米芯纤维(禾本科植物)，先用清水浸泡后离心除去水分，加入10倍体积的质量分数10％的NaOH水溶液，煮沸2h，过滤，弃去滤渣；滤液用酸中和至微酸性，然后用三倍体积乙醇沉淀即得木聚糖；参照(Pellerin P,Gosselin M,Lepoutre JP,Samain E and Debeire P(1991)Enzymic production ofoligosaccharides from corncob xylan.Enzyme Microb Technol 132:617-621)的方法；

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到实施例3制备的耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶细胞抽提液混合酶液中，混合酶液中木聚糖的浓度为10mg/ml，混合酶液pH为4.0；酶液中耐高温木聚糖酶活性为1U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为0.2U/mL；在60℃条件下，水解10h；水解结束后加入体积分数80％乙醇水溶液进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和实施例1制备的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶细胞抽提液混合反应液中进行酶氧化反应；混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为0.4mg/mL；反应液pH为7.8，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为0.3U/mL，NADH氧化酶活性为0.3U/mL；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.2mM、反应温度50℃，反应时间1h。

实施例5

(1)通过碱抽提法从硬木纤维植物榉木中提取木聚糖；参照(Bian,J.,Peng,F.,Peng,X.P.,Xu,F.,Sun,R.C.,Kennedy,J.F.,2012.Isolation of hemicelluloses fromsugarcane bagasse at different temperatures:structure andproperties.Carbohydr.Polym.88,638–645.)的碱抽提方法；

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到实施例2制备的耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶细胞抽提液混合酶液中，混合酶液中木聚糖的浓度为40mg/ml，混合酶液pH为6；酶液中耐高温木聚糖酶活性为10U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为2.5U/mL；在75℃条件下，水解6h；水解结束后加入体积分数90％乙醇水溶液进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和实施例1制备的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶细胞抽提液混合反应液中进行酶氧化反应；混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为0.16mg/mL；反应液pH为7.0，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为0.1U/mL，NADH氧化酶活性为0.1U/mL；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为2.0mM，反应温度65℃，反应时间40min。

(4)氧化反应结束后，反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。本实施例葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸如图3所示。

实施例6

(1)通过碱抽提法从松树(软木)木屑中提取木聚糖；参照(Bian,J.,Peng,F.,Peng,X.P.,Xu,F.,Sun,R.C.,Kennedy,J.F.,2012.Isolation of hemicelluloses fromsugarcane bagasse at different temperatures:structure andproperties.Carbohydr.Polym.88,638–645.)的碱抽提方法；

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到实施例2制备的耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶混合酶液中，混合酶液中木聚糖的浓度为100mg/ml，混合酶液pH为7.5；酶液中耐高温木聚糖酶活性为20U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为5U/mL；在90℃条件下，水解40min；水解结束后加入体积分数90％乙醇水溶液进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶混合反应液中进行酶氧化反应；混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为10mg/mL；反应液pH为8.2，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为5.0U/mL，NADH氧化酶活性为5U/mL；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为1.5mM，反应温度45℃，反应时间1.5h。

(4)氧化反应结束后，反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸。本实施例葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸如图4所示。

实施例7

(1)对比例1与实施例5原料和制备方法相同，

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到实施例2制备的耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶混合酶液中，木聚糖与混合酶液的浓度控制在80mg/mL，混合酶液pH为7.8；酶液中耐高温木聚糖酶活性为12U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为2U/mL；在80℃条件下，水解4h；水解结束后加入体积分数80％乙醇水溶液进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶混合反应液中进行酶氧化反应；混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为8mg/mL；反应液pH为7.8，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为1.0U/mL，NADH氧化酶活性为1.0U/mL；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.2mM，在反应温度30℃，时间2.0h。

试验例1

双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶氧化葡萄糖醛酸底物的酶学特性研究，包括最适温度；最适pH；温度稳定性；pH稳定性；所用葡萄糖醛酸由实施例5的方法制备，糖醛酸脱氢酶和NADH氧化酶为实施例1中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶按实施例1的原核表达方法分开制备得到，具体如下：

由上海生工合成糖醛酸脱氢酶的基因，如SEQ ID NO.9碱基序列所示，该序列由嗜热双孢菌Thermobispora bispora嗜热双孢菌糖醛酸脱氢酶(TbUDH)(WP_013131340)基因并经密码子优化获得，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，获得糖醛酸脱氢酶。

由上海生工合成糖醛酸脱氢酶的基因，如SEQ ID NO.10碱基序列所示，该序列由海栖热袍菌全基因组测序中筛选到的氧化还原酶基因(Tm1433)并经密码子优化获得，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，获得NADH氧化酶。

糖醛酸脱氢酶活性测定采用分光光度法测定，反应液总体积为1mL，含有2mM葡萄糖醛酸底物，5mM NAD和100mM磷酸钠缓冲液，反应时间为5min，冰水冷却，在340nm处测定光吸收值的增加量。一个酶单位定义为在该反应条件下，1min内催化产生1μmol NADH所需要的酶量。

NADH氧化酶活性测定采用分光光度法测定，反应液总体积为1mL，含有0.15mMNADH和100mM磷酸钠缓冲液，反应时间为1min，冰水冷却，在340nm处测定光吸收值的减少量。一个酶单位定义为在该反应条件下，1min内催化减少1μmol NADH所需要的酶量。

具体如下：

温度对酶活力的影响：(1)纯酶最适反应温度的测定：在20～70℃(糖醛酸脱氢酶活性)或40-90℃(NADH氧化酶活性)范围内每隔5℃分别测定酶活力，反应条件为pH7.5，10min以最高活力为100％。(2)纯酶的热稳定性测定：分别将酶置于温度25-65℃(糖醛酸脱氢酶活性)或55-80℃(NADH氧化酶活性)下保温1h，加入底物于30℃，pH 7.5测定残留活力，以保存于冰浴中的酶活力为100％。

pH对酶活力的影响：(1)酶促反应的最适pH值分析：在50℃(糖醛酸脱氢酶活性)或80℃(NADH氧化酶活性)下测定pH值的变化在4.2～8.2范围对酶活力的影响，以最高活力为100％。(2)pH稳定性的分析：纯酶置于不同pH值的缓冲液中，在37℃保温60min，再加入底物测定残留活力，以冰浴保存的酶在相对应的pH条件下的活力为100％，比较酶在不同pH的稳定性。所用缓冲液为100mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5～5.5)，100mM磷酸钠缓冲液(pH5.5～7.0)，100mM TrisHCl缓冲液(pH 7.0～9.0)。

由图1和图2结果显示，糖醛酸脱氢酶最适反应温度和pH分别为60℃，7.0，在60℃保温1h，残留活性在58％；NADH氧化酶最适反应温度和pH分别为80℃，7.8，在80℃保温1h，残留活性在80％以上。

试验例2

测试本发明实施例4-7制备方法中葡萄糖二酸的转化率和(NAD)的用量测试，结果如表1所示。

对比例1与实施例5原料和制备方法相同，不同之处在与步骤(3)不添加NAD。

对比例2与实施例5原料和制备方法相同，不同之处在与步骤(3)反应液中不含有NADH氧化酶。本对比例葡萄糖醛酸生产葡萄糖二酸如图5所示。

对比例3与实施例5原料和制备方法相同，不同之处在与步骤(3)反应液中不含有NADH氧化酶，同时糖醛酸脱氢酶是由是来源于Fulvimarina pelagiHTCC2506(ZP_01440880.1)的糖醛酸脱氢酶的糖醛酸脱氢酶基因表达制得，碱基序列如SEQ ID NO.11所示。

对比例4与对比例2原料、制备方法相同，不同之处在与步骤(3)中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为5.0mM。

对比例5与实施例6原料和制备方法相同，不同之处在与步骤(3)反应液中不含有NADH氧化酶，且尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为10.0mM，

表1葡萄糖二酸的转化率与葡萄糖醛酸和NAD浓度

由表1可知，本发明实施例制备葡萄糖二酸的方法，葡萄糖二酸的转化率可以达到100％，同时NAD消耗量小，在相同浓度葡萄糖醛酸条件下不加入NADH氧化酶，即使提高NAD含量，葡萄糖二酸的转化率依然低于本发明；此外，即使大量提高葡萄糖醛酸和NAD的浓度，葡萄糖二酸的转化率依然很低；而采用本发明的所述活性的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶如实施例7，在高浓度的葡萄糖醛酸条件下，采用低浓度的NAD，葡萄糖二酸的转化率依然可以达到100％，同时反应时间短。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用

<130> 2017

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Arg Ile Leu Ile Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Gly Thr Leu Leu

1 5 10 15

Arg Pro Arg Leu Ala Arg Gln Gly Arg Val Leu Arg Leu Leu Asp Ile

20 25 30

Ala Pro Ile Glu Ala Gly Pro Gly Glu Glu Ala Val Thr Ala Asp Ile

35 40 45

Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Glu Ala Met Asp Gly Val Asp Ala Val

50 55 60

Leu His Leu Gly Gly His Ser Leu Glu Arg Ala Trp Glu Glu Ile Leu

65 70 75 80

His Val Asn Ile His Gly Thr Tyr Val Val Leu Glu Ala Ala Arg Arg

85 90 95

Ala Gly Val Arg His Ala Val Leu Ala Ser Ser Asn His Ala Ala Gly

100 105 110

Phe His Pro Arg Ser Ala Gly Glu Ala Pro Asp Tyr Leu Phe Pro Arg

115 120 125

Pro Asp Thr Tyr Tyr Gly Val Ser Lys Val Ala Val Glu Ala Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Tyr His Asp Arg Tyr Gly Met His Val Thr Cys Leu Arg Ile

145 150 155 160

Gly Ser Cys Phe Glu Arg Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Ser Thr Trp

165 170 175

Leu Ser Pro Asp Asp Cys Ala Arg Leu Val Glu Ala Ala Leu Thr Ala

180 185 190

Glu Gly Phe His Val Val Trp Gly Ile Ser Ala Asn Thr Arg Arg Trp

195 200 205

Trp Ser Leu Glu Glu Gly Arg Ala Ile Gly Tyr Glu Pro Gln Asp Asp

210 215 220

Ala Glu Val Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ala Glu His Gly Glu Pro Asp

225 230 235 240

Pro Glu Asp Ile Ala His Arg Tyr Leu Gly Gly Ala Phe Cys Gly Pro

245 250 255

Arg Tyr His Ala Asp Asn Leu Thr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Arg Val Asp Val Met

275 280 285

Val Ile Gly Ala Gly Ala Ala Gly Met Ala Ala Ala Leu Lys Ala Lys

290 295 300

Glu Glu Gly Ala Glu Val Leu Leu Val Glu Arg Asp Glu Arg Thr Gly

305 310 315 320

Gly Ile Leu Asn Gln Cys Ile His Asn Gly Phe Gly Leu His Tyr Phe

325 330 335

Arg Gln Glu Leu Thr Gly Pro Glu Tyr Ala Glu Arg Phe Gln Glu Lys

340 345 350

Met Glu Lys Met Gly Ile Arg Ala Leu Thr Asn Ala Tyr Val Lys Arg

355 360 365

Val Glu Asp Arg Arg Val Ile Leu Val Thr Glu Gln Gly Ile Glu Glu

370 375 380

Val Glu Val Gly Ala Leu Val Tyr Ala Thr Gly Ala Arg Glu Arg Pro

385 390 395 400

Phe Gly Ser Leu Met Ile Pro Gly Asp Arg Pro Ser Gly Ile Phe Thr

405 410 415

Ala Gly Val Ala Gln Arg Leu Ile Asn Ile Glu Asn Arg Leu Pro Gly

420 425 430

Lys Arg Ala Leu Ile Leu Gly Ser Gly Asp Ile Gly Leu Ile Met Ala

435 440 445

Arg Arg Leu Thr Leu Glu Gly Met Glu Val Val Gly Val Val Glu Arg

450 455 460

Leu Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Leu Arg Asn Val Ile Gln Cys Leu Glu

465 470 475 480

Asp Tyr Asn Ile Pro Leu Tyr Leu Ser Ser Thr Val Val Glu Val Arg

485 490 495

Gly Arg Glu Arg Leu Glu Glu Val Val Val Ala Lys Val Asp Glu Gln

500 505 510

Phe Arg Pro Ile Pro Arg Thr Glu Arg Val Phe Lys Val Asp Thr Leu

515 520 525

Val Leu Ser Val Gly Leu Ile Pro Gln Val Glu Leu Ile Glu Asn Leu

530 535 540

Val Val Lys Asn Pro Thr Ser Arg Gly Val Gly Val Ser Asn Ile Gly

545 550 555 560

Gln Thr Ser Arg Asp Trp Ile Phe Ser Ala Gly Asn Cys Thr Val Ile

565 570 575

Phe Asp Leu Val Asp Tyr Val Ser Tyr Glu Gly Glu Thr Ala Gly Arg

580 585 590

Tyr Ala Ala Lys Phe Val Lys Gly Glu Ile Pro Arg Glu Lys Ile Pro

595 600 605

Val Arg Pro Gly Lys Asn Val Met Val Val His Pro Ile Trp Tyr Thr

610 615 620

Pro Ala Glu Pro Leu Thr Leu Tyr Leu Arg Val Lys Lys Pro Met Glu

625 630 635 640

Lys Gly Arg Leu Val Val Gly Arg Phe Ala Arg Glu Phe Glu Asp Leu

645 650 655

Val Pro Ser Glu Met Leu Arg Val Lys Ile Ser Asp Arg Asp Leu Glu

660 665 670

Gly Leu Asp Glu Ile Val Val Ser Val Glu Glu Val Asn

675 680 685

<210> 2

<211> 761

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Arg Ile Leu Ile Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Gly Thr Leu Leu

1 5 10 15

Arg Pro Arg Leu Ala Arg Gln Gly Arg Val Leu Arg Leu Leu Asp Ile

20 25 30

Ala Pro Ile Glu Ala Gly Pro Gly Glu Glu Ala Val Thr Ala Asp Ile

35 40 45

Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Glu Ala Met Asp Gly Val Asp Ala Val

50 55 60

Leu His Leu Gly Gly His Ser Leu Glu Arg Ala Trp Glu Glu Ile Leu

65 70 75 80

His Val Asn Ile His Gly Thr Tyr Val Val Leu Glu Ala Ala Arg Arg

85 90 95

Ala Gly Val Arg His Ala Val Leu Ala Ser Ser Asn His Ala Ala Gly

100 105 110

Phe His Pro Arg Ser Ala Gly Glu Ala Pro Asp Tyr Leu Phe Pro Arg

115 120 125

Pro Asp Thr Tyr Tyr Gly Val Ser Lys Val Ala Val Glu Ala Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Tyr His Asp Arg Tyr Gly Met His Val Thr Cys Leu Arg Ile

145 150 155 160

Gly Ser Cys Phe Glu Arg Pro Lys Asp Thr Arg Met Leu Ser Thr Trp

165 170 175

Leu Ser Pro Asp Asp Cys Ala Arg Leu Val Glu Ala Ala Leu Thr Ala

180 185 190

Glu Gly Phe His Val Val Trp Gly Ile Ser Ala Asn Thr Arg Arg Trp

195 200 205

Trp Ser Leu Glu Glu Gly Arg Ala Ile Gly Tyr Glu Pro Gln Asp Asp

210 215 220

Ala Glu Val Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ala Glu His Gly Glu Pro Asp

225 230 235 240

Pro Glu Asp Ile Ala His Arg Tyr Leu Gly Gly Ala Phe Cys Gly Pro

245 250 255

Arg Tyr His Ala Asp Asn Leu Thr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ala Val Val Ile

275 280 285

Gly Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Ile Ala Arg Glu Leu Thr Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Glu Val Thr Leu Ile Glu Lys Asn Leu Asp Val Gly Trp Gly

305 310 315 320

Val Thr Lys Ala Asn Ser Ala Val Val His Ala Gly Tyr Asp Asp Pro

325 330 335

Pro Glu Ser Val Arg Ala Gln Phe Cys Ala Ser Gly Asn Ala Met Tyr

340 345 350

Glu Asp Leu Ser Lys Glu Leu Asp Phe Asp Phe Lys Arg Ile Gly Ser

355 360 365

Phe Val Val Ala Phe Asn Asp Glu Glu Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu

370 375 380

Leu Lys Gln Gly Glu Glu Asn Gly Val Pro Gly Leu Thr Ile Leu Glu

385 390 395 400

Arg Asp Glu Val Leu Ser Met Glu Pro Asn Leu Asn Pro Glu Val Lys

405 410 415

Tyr Ala Leu Tyr Ala Pro Thr Ala Gly Ile Thr Glu Pro Trp Met Val

420 425 430

Ala Ile Ala Ala Val Glu Asn Ala Val Gln Asn Gly Leu Lys Leu Val

435 440 445

Leu Gly Glu Ser Val Val Gly Phe Glu Lys Val Asn Gly Arg Val Arg

450 455 460

Lys Val His Thr Ser Arg Gly Glu Tyr Glu Ala Asp Ile Val Ile Asn

465 470 475 480

Cys Ala Gly Leu His Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Ala Glu

485 490 495

Tyr Val Pro Leu His Pro Arg Lys Gly Glu Tyr Ile Leu Leu Asp Lys

500 505 510

Lys Leu Gln Gly Leu Val Lys Arg Val Ile Phe Pro Thr Pro Thr Lys

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Ile Ser Lys Gly Ile Leu Val Leu Pro Thr Val Asp Gly Gly Ile Leu

530 535 540

Leu Gly Pro Thr Ala Glu Asp Leu Pro Glu Glu Met Lys Asp Arg Pro

545 550 555 560

Ile Thr Thr Arg Glu Gly Leu Glu Lys Val Arg Glu Phe Thr Arg Arg

565 570 575

Leu Val Pro Ser Leu Asp Phe Ser Leu Val Val Lys Thr Phe Ser Gly

580 585 590

Leu Arg Pro Glu Ser Pro Gln Lys Asp Phe Phe Ile Lys Val Ser Glu

595 600 605

Thr Val Lys Asn Phe Val Asn Val Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Leu

610 615 620

Thr Ala Ala Pro Ala Val Ala Lys Tyr Val Val Glu Glu Leu Ile Gln

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Glu Lys Met Arg Ile Pro Leu Glu Lys Lys Lys Asp Phe Lys Pro Glu

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Arg Glu Ile Glu Arg Asp Pro Arg Ala Gly Arg Leu Val Cys Phe Cys

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Arg Thr Leu Asn Gly Val Lys Phe Arg Thr Arg Ala Met Phe Gly Arg

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Cys Gln Gly Gly Phe Cys Met Ala Arg Ile Leu Lys Ile Leu Glu Arg

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Glu Leu Gly Val Asp Met Ser Glu Ile Lys Met Lys Ser Glu Asn Ser

740 745 750

Trp Val Val Asn Gly Lys Val Arg Glu

755 760

<210> 3

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgccatatgc gtatcctgat caccggcgcg gcgggcggcg tgggcaccct gctgcgtccg 60

cgtctggcgc gtcagggccg tgtgctgcgt ctgctggata tcgcgccgat cgaagcgggc 120

ccgggcgaag aagcggtgac cgcggatatc accgatccga aagcgatggc ggaagcgatg 180

gatggcgtgg atgcggtgct gcatctgggc ggccatagcc tggaacgtgc gtgggaagaa 240

atcctgcatg tgaacatcca tggcacctat gtggtgctgg aagcggcgcg tcgtgcgggc 300

gtgcgtcatg cggtgctggc gagcagcaac catgcggcgg gctttcatcc gcgtagcgcg 360

ggcgaagcgc cggattatct gtttccgcgt ccggatacct attatggcgt gagcaaagtg 420

gcggtggaag cgctgggcag cctgtatcat gatcgttatg gcatgcatgt gacctgcctg 480

cgtatcggca gctgctttga acgtccgaaa gatacccgta tgctgagcac ctggctgagc 540

ccggatgatt gcgcgcgtct ggtggaagcg gcgctgaccg cggaaggctt tcatgtggtg 600

tggggcatca gcgcgaacac ccgtcgttgg tggagcctgg aagaaggccg tgcgatcggc 660

tatgaaccgc aggatgatgc ggaagtgttt gcggcggaac tgatcgcgga acatggcgaa 720

ccggatccgg aagatatcgc gcatcgttat ctgggcggcg cgttttgcgg cccgcgttat 780

catgcggata acctgaccgg cggccgtggc ggcggtggtt ctggtggcgg tggctccggc 840

ggtggcggta gcatgcgtgt ggatgtgatg gtgatcggcg cgggcgcggc gggcatggcg 900

gcggcgctga aagcgaaaga agaaggcgcg gaagtgctgc tggtggaacg tgatgaacgt 960

accggcggca tcctgaacca gtgcatccat aacggctttg gcctgcatta ttttcgtcag 1020

gaactgaccg gcccggaata tgcggaacgt tttcaggaaa aaatggaaaa aatgggcatc 1080

cgtgcgctga ccaacgcgta tgtgaaacgt gtggaagatc gtcgtgtgat cctggtgacc 1140

gaacagggca tcgaagaagt ggaagtgggc gcgctggtgt atgcgaccgg cgcgcgtgaa 1200

cgtccgtttg gcagcctgat gatcccgggc gatcgtccga gcggcatctt taccgcgggc 1260

gtggcgcagc gtctgatcaa catcgaaaac cgtctgccgg gcaaacgtgc gctgatcctg 1320

ggcagcggcg atatcggcct gatcatggcg cgtcgtctga ccctggaagg catggaagtg 1380

gtgggcgtgg tggaacgtct gccgtatgcg ggcggcctgc tgcgtaacgt gatccagtgc 1440

ctggaagatt ataacatccc gctgtatctg agcagcaccg tggtggaagt gcgtggccgt 1500

gaacgtctgg aagaagtggt ggtggcgaaa gtggatgaac agtttcgtcc gatcccgcgt 1560

accgaacgtg tgtttaaagt ggataccctg gtgctgagcg tgggcctgat cccgcaggtg 1620

gaactgatcg aaaacctggt ggtgaaaaac ccgaccagcc gtggcgtggg cgtgagcaac 1680

atcggccaga ccagccgtga ttggatcttt agcgcgggca actgcaccgt gatctttgat 1740

ctggtggatt atgtgagcta tgaaggcgaa accgcgggcc gttatgcggc gaaatttgtg 1800

aaaggcgaaa tcccgcgtga aaaaatcccg gtgcgtccgg gcaaaaacgt gatggtggtg 1860

catccgatct ggtatacccc ggcggaaccg ctgaccctgt atctgcgtgt gaaaaaaccg 1920

atggaaaaag gccgtctggt ggtgggccgt tttgcgcgtg aatttgaaga tctggtgccg 1980

agcgaaatgc tgcgtgtgaa aatcagcgat cgtgatctgg aaggcctgga tgaaatcgtg 2040

gtgagcgtgg aagaagtgaa ctgactcgag 2070

<210> 4

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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cgtctggcgc gtcagggccg tgtgctgcgt ctgctggata tcgcgccgat cgaagcgggc 120

ccgggcgaag aagcggtgac cgcggatatc accgatccga aagcgatggc ggaagcgatg 180

gatggcgtgg atgcggtgct gcatctgggc ggccatagcc tggaacgtgc gtgggaagaa 240

atcctgcatg tgaacatcca tggcacctat gtggtgctgg aagcggcgcg tcgtgcgggc 300

gtgcgtcatg cggtgctggc gagcagcaac catgcggcgg gctttcatcc gcgtagcgcg 360

ggcgaagcgc cggattatct gtttccgcgt ccggatacct attatggcgt gagcaaagtg 420

gcggtggaag cgctgggcag cctgtatcat gatcgttatg gcatgcatgt gacctgcctg 480

cgtatcggca gctgctttga acgtccgaaa gatacccgta tgctgagcac ctggctgagc 540

ccggatgatt gcgcgcgtct ggtggaagcg gcgctgaccg cggaaggctt tcatgtggtg 600

tggggcatca gcgcgaacac ccgtcgttgg tggagcctgg aagaaggccg tgcgatcggc 660

tatgaaccgc aggatgatgc ggaagtgttt gcggcggaac tgatcgcgga acatggcgaa 720

ccggatccgg aagatatcgc gcatcgttat ctgggcggcg cgttttgcgg cccgcgttat 780

catgcggata acctgaccgg cggccgtggc ggcggtggtt ctggtggcgg tggctccggc 840

ggtggcggta gcatgaaagc ggtggtgatc ggcggcggcg tgtttggcag cctgatcgcg 900

cgtgaactga ccaaatatga tctggaagtg accctgatcg aaaaaaacct ggatgtgggc 960

tggggcgtga ccaaagcgaa cagcgcggtg gtgcatgcgg gctatgatga tccgccggaa 1020

agcgtgcgtg cgcagttttg cgcgagcggc aacgcgatgt atgaagatct gagcaaagaa 1080

ctggattttg attttaaacg tatcggcagc tttgtggtgg cgtttaacga tgaagaactg 1140

aaagaactgg aacgtctgct gaaacagggc gaagaaaacg gcgtgccggg cctgaccatc 1200

ctggaacgtg atgaagtgct gagcatggaa ccgaacctga acccggaagt gaaatatgcg 1260

ctgtatgcgc cgaccgcggg catcaccgaa ccgtggatgg tggcgatcgc ggcggtggaa 1320

aacgcggtgc agaacggcct gaaactggtg ctgggcgaaa gcgtggtggg ctttgaaaaa 1380

gtgaacggcc gtgtgcgtaa agtgcatacc agccgtggcg aatatgaagc ggatatcgtg 1440

atcaactgcg cgggcctgca tgcggatgaa atcgcgaaac tggcgggcgc ggaatatgtg 1500

ccgctgcatc cgcgtaaagg cgaatatatc ctgctggata aaaaactgca gggcctggtg 1560

aaacgtgtga tctttccgac cccgaccaaa atcagcaaag gcatcctggt gctgccgacc 1620

gtggatggcg gcatcctgct gggcccgacc gcggaagatc tgccggaaga aatgaaagat 1680

cgtccgatca ccacccgtga aggcctggaa aaagtgcgtg aatttacccg tcgtctggtg 1740

ccgagcctgg attttagcct ggtggtgaaa acctttagcg gcctgcgtcc ggaaagcccg 1800

cagaaagatt tttttatcaa agtgagcgaa accgtgaaaa actttgtgaa cgtgatggcg 1860

acccgtagcc cgggcctgac cgcggcgccg gcggtggcga aatatgtggt ggaagaactg 1920

atccaggaaa aaatgcgtat cccgctggaa aaaaaaaaag attttaaacc ggaacgtaaa 1980

cgtatcgtgc attatagcga actgccgctg gaagaatggc gtcgtgaaat cgaacgtgat 2040

ccgcgtgcgg gccgtctggt gtgcttttgc aacgaagtga ccgaaaaaga aatcgtggaa 2100

gcgatccgtc gtggcgcgcg taccctgaac ggcgtgaaat ttcgtacccg tgcgatgttt 2160

ggccgttgcc agggcggctt ttgcatggcg cgtatcctga aaatcctgga acgtgaactg 2220

ggcgtggata tgagcgaaat caaaatgaaa agcgaaaaca gctgggtggt gaacggcaaa 2280

gtgcgtgaat gactcgag 2298

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccgttccatg gactacagga tgtgc 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccgctcgagc ggatatatct ttcttccctt 30

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggaattccat atgaaaatat taccttctgt gttgat 36

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccctcgagtc tttcttctat ctttttctcc ag 32

<210> 9

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgccatatgc gtatcctgat caccggcgcg gcgggcggcg tgggcaccct gctgcgtccg 60

cgtctggcgc gtcagggccg tgtgctgcgt ctgctggata tcgcgccgat cgaagcgggc 120

ccgggcgaag aagcggtgac cgcggatatc accgatccga aagcgatggc ggaagcgatg 180

gatggcgtgg atgcggtgct gcatctgggc ggccatagcc tggaacgtgc gtgggaagaa 240

atcctgcatg tgaacatcca tggcacctat gtggtgctgg aagcggcgcg tcgtgcgggc 300

gtgcgtcatg cggtgctggc gagcagcaac catgcggcgg gctttcatcc gcgtagcgcg 360

ggcgaagcgc cggattatct gtttccgcgt ccggatacct attatggcgt gagcaaagtg 420

gcggtggaag cgctgggcag cctgtatcat gatcgttatg gcatgcatgt gacctgcctg 480

cgtatcggca gctgctttga acgtccgaaa gatacccgta tgctgagcac ctggctgagc 540

ccggatgatt gcgcgcgtct ggtggaagcg gcgctgaccg cggaaggctt tcatgtggtg 600

tggggcatca gcgcgaacac ccgtcgttgg tggagcctgg aagaaggccg tgcgatcggc 660

tatgaaccgc aggatgatgc ggaagtgttt gcggcggaac tgatcgcgga acatggcgaa 720

ccggatccgg aagatatcgc gcatcgttat ctgggcggcg cgttttgcgg cccgcgttat 780

catgcggata acctgaccgg cggccgtctc gag 813

<210> 10

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgccatatgc gtgtggatgt gatggtgatc ggcgcgggcg cggcgggcat ggcggcggcg 60

ctgaaagcga aagaagaagg cgcggaagtg ctgctggtgg aacgtgatga acgtaccggc 120

ggcatcctga accagtgcat ccataacggc tttggcctgc attattttcg tcaggaactg 180

accggcccgg aatatgcgga acgttttcag gaaaaaatgg aaaaaatggg catccgtgcg 240

ctgaccaacg cgtatgtgaa acgtgtggaa gatcgtcgtg tgatcctggt gaccgaacag 300

ggcatcgaag aagtggaagt gggcgcgctg gtgtatgcga ccggcgcgcg tgaacgtccg 360

tttggcagcc tgatgatccc gggcgatcgt ccgagcggca tctttaccgc gggcgtggcg 420

cagcgtctga tcaacatcga aaaccgtctg ccgggcaaac gtgcgctgat cctgggcagc 480

ggcgatatcg gcctgatcat ggcgcgtcgt ctgaccctgg aaggcatgga agtggtgggc 540

gtggtggaac gtctgccgta tgcgggcggc ctgctgcgta acgtgatcca gtgcctggaa 600

gattataaca tcccgctgta tctgagcagc accgtggtgg aagtgcgtgg ccgtgaacgt 660

ctggaagaag tggtggtggc gaaagtggat gaacagtttc gtccgatccc gcgtaccgaa 720

cgtgtgttta aagtggatac cctggtgctg agcgtgggcc tgatcccgca ggtggaactg 780

atcgaaaacc tggtggtgaa aaacccgacc agccgtggcg tgggcgtgag caacatcggc 840

cagaccagcc gtgattggat ctttagcgcg ggcaactgca ccgtgatctt tgatctggtg 900

gattatgtga gctatgaagg cgaaaccgcg ggccgttatg cggcgaaatt tgtgaaaggc 960

gaaatcccgc gtgaaaaaat cccggtgcgt ccgggcaaaa acgtgatggt ggtgcatccg 1020

atctggtata ccccggcgga accgctgacc ctgtatctgc gtgtgaaaaa accgatggaa 1080

aaaggccgtc tggtggtggg ccgttttgcg cgtgaatttg aagatctggt gccgagcgaa 1140

atgctgcgtg tgaaaatcag cgatcgtgat ctggaaggcc tggatgaaat cgtggtgagc 1200

gtggaagaag tgaactgact cgag 1224

<210> 11

<211> 808

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccgttccatg gtggaaaaac tgctgatcac cggcgcgggc ggcggcctgg gcgcgctgct 60

gcgtggcaac ctgagcgatg tggcgaaaac cgtgcgtctg agcgatatcg tggatatcgg 120

cagcccgggc gcgaaagaag aagtgatcag ctgcgatctg agcgatcgtg atgcggtgaa 180

agcgctggtg gaaggctgcg atggcatcct gcatctgggc ggcgtgagcg tggaaaaaag 240

ctttgatacc atcctgccgg cgaacatcgt gggcgtgtat aacctgtatg aagcggcgcg 300

tgcggcgggc atgccgcgta tcctgtttgc gagcagcaac cataccatcg gctattatac 360

ccaggatacc catctgaccg cggatgtgcc gctgcgtccg gatggcctgt atggcgtgag 420

caaatgcttt ggcgaagcga tcgcgaacct gtatcatgat aaatttggcc aggaaaccgc 480

gatcgtgcgt atcggcagct gctttgcgga accgcgtgat catcgtatgc tgagcacctg 540

gatgagcccg agcgattttg tgagcatgat cgaatgcgtg tttcgtgtgc cgcgtctggg 600

ctgcccggtg atctggggcg tgagcgataa cgatggccgt tggtgggata acagcgcggc 660

ggcgtatctg ggctggcgtc cgcgtgataa cagcgaagcg tatcgtcgta aaatcgatgc 720

ggaacaggcg cgtccggcgc cggatgcgcc ggatgcggtg tatcagggcg gcaaatttac 780

cgcggaaccg atccatagcc tcgagcgg 808

Claims

1.一种葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从木质纤维植物中提取的木聚糖为原料；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶混合反应液进行酶氧化反应；

(4)氧化反应结束后，反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸；

所述耐高温木聚糖酶为来源于海栖热袍菌Thermotiga maritima的GH10木聚糖酶基因(TmXynB)；所述α-葡萄糖醛酸酶为来源于海栖热袍菌T.maritima的GH67α-葡萄糖醛酸酶基因(TmAguA)；所述糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶由嗜热双孢菌Thermobispora bispora嗜热双孢菌糖醛酸脱氢酶(TbUDH)基因通过Linker连接着海栖热袍菌Thermotiga maritima NADH氧化酶(TmNOX)基因组成并经密码子优化获得，所述糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述木质纤维植物为硬木、软木或禾本科植物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述木聚糖与混合酶液的木聚糖浓度为10-100mg/mL，混合酶液pH为4.0-7.5；酶液中耐高温木聚糖酶活性为1-20U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为0.2-5.0U/mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水解反应温度60℃～90℃，时间40min～10h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为0.16～10.0mg/mL；反应液pH为6.0-8.2，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为0.1-5U/mL，NADH氧化酶活性为0.1-5U/mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合反应液中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.2-2.0mM。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酶氧化反应温度30℃～65℃，时间40min～2.0h。

8.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶在氧化葡萄糖醛酸生成葡萄糖二酸中的应用。