JP6518107B2 - 転写因子変異株 - Google Patents

Description

本発明は、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高い生産能を有するタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属糸状菌の変異株に関する。

今日、微生物は様々な酵素生産の宿主として工業的に用いられており、例えば、セルラーゼの生産においては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）やタラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）などの糸状菌が用いられている。また、これまでにランダムな遺伝子変異の導入により、これらの糸状菌についてセルラーゼ生産能の高い変異株が取得されている。このような変異株としては、タラロマイセス・セルロリティカス（旧名：アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））変異株（例えば、ＴＮ株、Ｃ１株、ＣＦ−２６１２株等）等が挙げられる（特許文献１−３）。

さらに、セルラーゼ生産に関与する遺伝子機構の解明も進められており、タラロマイセス・セルロリティカスにおいてはセルラーゼ生産に関与する複数の転写活性因子が明らかにされている（非特許文献１、２、３）。加えて、遺伝子組み換え技術の進歩や、全ゲノム情報の解読等により、糸状菌の変異株の作製が効率的に行えるようになり、セルラーゼの高い生産能を有する変異株の開発が進められている。例えば、タラロマイセス・セルロリティカスにおいてセルラーゼ生産に関与する転写活性因子の一つであるＣｒｅ１の機能を欠損させた場合、培地中にグルコースが存在する条件下においても、効率良くセルラーゼを生産できることが報告されている（特許文献４）。

一方、近年、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを用いてバイオマス資源を酵素分解、糖化することにより構成単位であるグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースにし、更にこれを発酵して得られるエタノールや乳酸などを液体燃料もしくは化学原料として利用することが、注目、検討されており、その実用化技術の開発が促進されている。そのため、バイオマス資源の実用化経済性のために、上記セルラーゼ生産菌やその変異株よりも、セルラーゼやヘミセルラーゼの高い生産能を有する菌株が、依然として求められている。

特開２００２−１０１８７６号公報 特開２００３−１３５０５２号公報 特開２００８−２７１９２７号公報 特開２０１４−１６８４２４号公報

Ｆｕｊｉｉら、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５；１７５（６）：３２１８−２９． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４；７８（９）：１５６４−１５６７ Ｆｕｊｉｉら、ＡＭＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ，２０１３；３

本発明は、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高い生産能を有する微生物を提供することを目的とする。また、本発明は、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産、ならびにバイオマス資源の分解又は糖化を、効率的に行うことが可能な新たな手法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属糸状菌において、セルラーゼ生産に関与する転写活性化因子をコードする遺伝子である、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、ａｃｅ１遺伝子、及びｃｌｒ２遺伝子について、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、及びａｃｅ１遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を高発現させることによって、ならびに／あるいは、ｃｌｒ２遺伝子の機能を欠損させることによって、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高い生産能を有する変異株を作製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］ ａｃｅ１遺伝子、ｘｌｎＲ遺伝子、及びｃｌｂＲ遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を高発現する、あるいは、ｃｌｒ２遺伝子の機能が欠損している、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属糸状菌ＣＦ−２６１２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９０）又はＣ１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０８）の変異株。
［２］ ａｃｅ１遺伝子を高発現する、［１］の変異株。
［３］ ｃｌｂＲ遺伝子を高発現する、［１］の変異株。
［４］ ｘｌｎＲ遺伝子を高発現する、［１］の変異株。
［５］ ｘｌｎＲ遺伝子及びｃｌｂＲ遺伝子を高発現する、［１］の変異株。
［６］ ｃｌｒ２遺伝子が欠失している、［１］の変異株。
［７］ セルロース含有原料を含む培地中にて、［１］〜［６］のいずれかの変異株を培養することを含む、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの製造方法。
［８］ 培地がさらに糖類を含む、［７］の方法。
［９］ ［７］又は［８］の方法により得られた、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ。
［１０］ ［７］又は［８］の方法により得られたセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを用いてバイオマス資源を分解または糖化することを含む、バイオマス資源の分解または糖化方法。

本発明によれば、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高い生産能を有する、タラロマイセス属糸状菌の変異株を提供することができる。また、本発明によれば、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産、ならびにバイオマス資源の分解又は糖化を、効率的に行うことが可能な新たな手法を提供することができる。

１．変異株
本発明は、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産能が高い、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属糸状菌の変異株に関する。

「セルラーゼ」とは、ＦＰアーゼ、ＣＭＣアーゼ、アビセラーゼ、セロビアーゼ等のセルロースの分解に関与する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本明細書において「セルラーゼ」に含まれる。「セルロース」とは、グルコースがβ−１，４グルコシド結合により高度に重合したグルコースポリマーであり、全ての植物の細胞壁構成成分として存在する。

「ヘミセルラーゼ」とは、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ等のへミセルロースを分解する酵素の総称であり、へミセルロースの分解活性を有していれば、本明細書において「ヘミセルラーゼ」に含まれる。「へミセルロース」とは、陸上植物細胞の細胞壁を構成する多糖類のうち、セルロースとペクチン以外のものをいう。

「セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産能」とは、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを生産する能力を指し、セルラーゼの総酵素活性及び／又はヘミセルラーゼの総酵素活性が高いほど当該酵素の生産能が高いことを意味する。

セルラーゼの総酵素活性及びヘミセルラーゼの総酵素活性はそれぞれ、公知の手法に基づいて測定することができる。すなわち、下記の詳述する、当該酵素を含む粗酵素液又は精製した酵素に、適当な基質（例えば、濾紙、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）、サリシン、セロビオース、キシラン等）を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をＳｏｍｏｇｙ−Ｎｅｌｓｏｎ法又はＤＮＳ法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することができる。

Ｓｏｍｏｇｙ−Ｎｅｌｓｏｎ法においては、一定時間反応させた上記反応溶液にＳｏｍｏｇｙ銅試薬（和光純薬）を加えて反応を停止する。その後およそ２０分間煮沸し、煮沸終了後急速に水道水にて冷却する。冷却後、Ｎｅｌｓｏｎ試薬を注入して還元銅沈殿を溶解し発色させ、およそ３０分静置した後蒸留水を加え、吸光度を測定する。

ＤＮＳ法を用いる場合は、基質液に酵素液を加え、一定時間酵素反応を行わせたのち、煮沸などによって酵素反応を停止する。この反応液にジニトロサリチル酸を加えて、５分間煮沸し、冷却後吸光度を測定する（柏木豊「発酵糸状菌の酵素」、微生物遺伝資源利用マニュアル（１６）、独立行政法人農業生物資源研究所発行、２００４年２月２９日発行）。

本発明の変異株は、タラロマイセス属糸状菌において、セルラーゼ生産に関与する転写活性化因子をコードする遺伝子である、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、ａｃｅ１遺伝子、及びｃｌｒ２遺伝子について、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、及びａｃｅ１遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を高発現させることによって、ならびに／あるいは、ｃｌｒ２遺伝子の機能を欠損させることにより得ることができる。

タラロマイセス属糸状菌の「ｘｌｎＲ遺伝子」、「ｃｌｂＲ遺伝子」、「ａｃｅ１遺伝子」、及び「ｃｌｒ２遺伝子」は公知であり、公開されたデータベースにその配列情報が公開されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにｘｌｎＲ遺伝子はＡＢ９１５７８４として、ｃｌｂＲ遺伝子はＬＣ０１２３５４として、ａｃｅ１遺伝子はＬＣ０１２３５２として、ｃｌｒ２遺伝子はＬＣ０１５７５０として、それぞれ登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。なお、ｃｌｂＲ遺伝子、ａｃｅ１遺伝子、及びｃｌｒ２遺伝子はそれぞれ、ｔｃｌＡ遺伝子、ｔａｃＡ遺伝子、及びｔｃｌＢ２遺伝子と称される場合があり、公開されたデータベースには後者の名称で登録されている場合がある。

タラロマイセス属糸状菌のこれらの遺伝子及び／又は染色体上のその周辺領域（以下、「その周辺領域」と記載する）のＤＮＡは、公知の手法により得ることができる。すなわち、上記公知の配列情報をもとにタラロマイセス属糸状菌のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーに対してスクリーニングを行い、目的の遺伝子及び／又はその周辺領域のＤＮＡを得ることができる。スクリーニングは、目的の遺伝子及び／又はその周辺領域の配列情報をもとに設計されたプローブと、上記ライブラリーとを、低い、中程度又は高いストリンジェントな条件下にてハイブリダイゼーションさせることによって行ってよいし、あるいは目的の遺伝子及び／又はその周辺領域を増幅するために設計されたプライマー用い、上記ライブラリーを鋳型としたとしたＰＣＲ法によって行ってもよい。

本発明において、「ｘｌｎＲ遺伝子」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。

また、本発明において、「ｃｌｂＲ遺伝子」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。

さらに、本発明において、「ａｃｅ１遺伝子」としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。

そして、本発明において、「ｃｌｒ２遺伝子」としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。

本発明において「ｘｌｎＲ遺伝子」、「ｃｌｂＲ遺伝子」、「ａｃｅ１遺伝子」、及び「ｃｌｒ２遺伝子」として、これら遺伝子の変異体も利用することができる。このような「変異体」としては、上記配列番号１〜４で示される各アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列を有し、かつ、セルラーゼ生産に関与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ここで「複数」とは１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個を意味する。さらに、「変異体」には、上記配列番号１〜４で示される各アミノ酸配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を有し、かつ、セルラーゼ生産に関与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。

具体的な例示として、「ｘｌｎＲ遺伝子」として配列番号５で示される塩基配列を含むＤＮＡ、「ｃｌｂＲ遺伝子」として配列番号６で示される塩基配列を含むＤＮＡ、「ａｃｅ１遺伝子」として配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ、「ｃｌｒ２遺伝子」として配列番号８で示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられ、本発明においてはこれらの遺伝子及びその配列情報を利用することができる。

本発明の変異株は、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、及びａｃｅ１遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を高発現する高発現変異株、ならびに、ｃｌｒ２遺伝子の機能が欠損した機能欠損株である。これらの変異株は、自然突然変異によるものであってもよいし、タラロマイセス属糸状菌を紫外線照射や変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処理することによって得られたものであってもよいが、より効率的には、これらの変異株は、当業者に公知である一般的な分子生物学的手法を用いた遺伝子組換え技術に基づいて得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、“ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ／ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。

すなわち、本発明の高発現変異株は、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、及びａｃｅ１遺伝子から選択される遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを宿主となるタラロマイセス属糸状菌に導入し、形質転換することにより得ることができる。なお、「高発現」とは、変異株における導入された遺伝子の発現量が、宿主における当該遺伝子の発現量よりも高い、好ましくは宿主における当該遺伝子の発現量の１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、又はそれ以上であることを意味する。

ベクターとしては、遺伝子の導入及び発現のために当業者に公知である一般的な発現ベクターを用いることができる。このようなベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋やｐＵＣ１９等が挙げられる。

ベクターには、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、及びａｃｅ１遺伝子をそれぞれ別個に含めてもよいし、これら遺伝子より選択される２つ以上の組合せ（例えば、ｘｌｎＲ遺伝子とｃｌｂＲ遺伝子、ｘｌｎＲ遺伝子とａｃｅ１遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子とａｃｅ１遺伝子など）を一つのベクターに含めてもよい。

ベクターには、上記遺伝子を発現調節配列に操作可能に連結して含めることができる。「発現調節配列」には遺伝子の転写を促すプロモーターが含まれる。上記遺伝子は発現調節配列に操作可能に連結されることによって、導入された宿主細胞において当該発現調節配列の制御のもと、遺伝子発現（転写）が駆動される。プロモーターとしては、宿主となるタラロマイセス属糸状菌にて、連結された遺伝子の発現を駆動できるものであればよく特に限定されないが、連結された遺伝子の高発現を可能とするプロモーターが好ましい。このようなプロモーターとして、例えば、ｐｙｒ４プロモーター、ｃｂｈｌプロモーター、ｇｐｄプロモーター等が挙げられるが、これらに限定はされない。

ベクターにはさらに、エンハンサー、宿主における複製を可能とする複製起点、形質転換体を同定する選択マーカー（例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子等）、ターミネーター領域等を含めることができる。

宿主となるタラロマイセス属糸状菌の形質転換は、ｘｌｎＲ遺伝子、ｃｌｂＲ遺伝子、又はａｃｅ１遺伝子のいずれかを含む単一のベクターを用いて行ってよいし、これら遺伝子のいずれかを含むベクターを複数種組合せて用いて行ってよいし、あるいはこれら遺伝子より選択される２つ以上の遺伝子の組合せを含むベクターを単独で、又は他のベクターと組合せて用いて行ってもよい。

本発明の機能欠損株は、ｃｌｒ２遺伝子について一又は複数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入などを含むために、当該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が、正常なタンパク質の活性と比較して７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は全く活性を有さない状態を指す。好ましくは、本発明の機能欠損株は、ｃｌｒ２遺伝子遺伝子の一部又は全体が欠失した状態にあり、当該遺伝子によってコードされるタンパク質が全く活性を有さない状態にある。

本発明の機能欠損株の作製は、相同組換え手法を利用する公知の手法（相同組換え法によるダブルクロスオーバー等）により行うことができる。例えば、ｃｌｒ２遺伝子を遺伝子導入のための当業者に公知である一般的なベクターにクローニングする。その後、クローン化したｃｌｒ２遺伝子の配列中に外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）を挿入することで、外来遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）により分断されたｃｌｒ２遺伝子を含むベクターを調製する。このベクターを宿主となるタラロマイセス属糸状菌に導入することにより、ベクター上の分断されたｃｌｒ２遺伝子と当該宿主の染色体上のｃｌｒ２遺伝子とが相同組換えを生じ、宿主のｃｌｒ２遺伝子が外来遺伝子により分断されることにより、当該遺伝子の機能を欠損させることができる。あるいは、ｃｌｒ２遺伝子に外来遺伝子を挿入して分断するかわりに、ｃｌｒ２遺伝子の塩基配列においてその一部または全体を欠失させるべく、その欠失させるべき部位に隣接する上流領域及び下流領域の塩基配列をそれぞれクローニングし、これらの領域のＤＮＡを連結して含むベクターを調製する。これを宿主に導入することにより、ベクター上の上流領域及び下流領域と当該宿主の染色体上の対応する塩基配列とが相同組換えを生じ、宿主のｃｌｒ２遺伝子の塩基配列においてその一部又は全体が欠失することにより、当該遺伝子の機能を欠損させることができる。上流領域及び下流領域の塩基配列は、宿主由来のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲ法により得ることができる。

本発明の高発現変異株及び機能欠損株の作製において、宿主としては、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを生産することができるタラロマイセス属糸状菌を用いることができ、好ましくはタラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）である。より好ましくは、タラロマイセス・セルロリティカスの野生株であるＹ−９４株や、タラロマイセス・セルロリティカスのセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高生産変異株であるＴＮ株、Ｃ１株、及びＣＦ−２６１２株であり、特に好ましくはＣ１株及びＣＦ−２６１２株である。Ｃ１株は、平成１３年９月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現：独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０８にて寄託されている。また、ＣＦ−２６１２株は、平成１９年４月１０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（同上）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２９０にて寄託されている。なお、これら寄託された微生物の表示は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属とされているが、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）は近年のリボソーマルＤＮＡの遺伝子配列解析結果に基づいて、タラロマイセス属へ属名が変更されている。

上記ベクターの宿主への導入は、リン酸カルシウム法又は塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃等を用いる方法により行うことができる。

本発明の変異株は、好ましくはセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高生産能を有する従来公知のタラロマイセス属糸状菌及びその変異株よりも高いセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産能を有するものであり、特に好ましくはＣ１株及びＣＦ−２６１２株よりも高いセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産能を有するものである。より詳細には、本発明の変異株は、ｘｌｎＲ遺伝子を高発現する変異株、ｃｌｂＲ遺伝子を高発現する変異株、ｘｌｎＲ遺伝子及びｃｌｂＲ遺伝子を高発現する変異株、ａｃｅ１遺伝子を高発現する変異株、ならびにｃｌｒ２遺伝子の機能が欠損した機能欠損変異株である。

本発明の変異株は、固相支持体（例えば、ポリマー、鉱物、金属、ゲル、多糖類等）に固定化されていてもよい。変異株の固相支持体への固定化は、共有結合又は非共有結合を用いて行うことができる。

２．セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産
セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産は、上記本発明の変異株を培養することにより行うことができる。

培養のための培地には、炭素源としてセルロース含有原料、窒素源として、硫安、硝安等の無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、及びタンパク質分解物などの有機窒素含有物、ならびに無機塩類（酒石酸カリウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化鉄、塩化マンガン等）を含めることができる。「セルロース含有原料」としては、粉末セルロース（例えば、Ｓｏｌｋａ−Ｆｌｏｃ（登録商標，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏ．）及びアビセル等）、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、バガス、古紙類、瀘紙、一般紙類、製紙汚泥、スイッチグラス、パーム残渣、木材等が挙げられるが、本発明の変異株の培養において炭素源となり得る限り、これらに限定されない。セルロース含有原料は、酸処理、酵素処理、アルカリ処理、水熱処理などを用いた加水分解処理、あるいは粗粉砕又は細断処理などにより予め前処理されることが好ましい。セルロース含有原料に前処理を行うことでセルロース間の結合を緩め、本発明の変異株がより効率的に炭素源として利用することができる。

培地にはさらに、糖類を含めることができる。培地に加える糖類としては、単糖類、二糖類、多糖類などが挙げられ、例えば、グルコースを利用することができる。培地中のセルロース含有原料とグルコースの量は、１：０〜９、好ましくは１：４（重量比）で含めることができる。

培地は、寒天やゼラチンを加えて固化した固体培地、低濃度の寒天を加えた半流動培地、又は液体培地を用いることができるが、液体培地が好ましい。

培養は、２５〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃にて、４８時間〜１０日ほど培養を行う。培養温度及び培養時間は、変異株の種類、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ生産能に応じて適宜調節することができる。培養は、バッチ式、フェドバッチ式、半連続式、又は連続式にて適宜行うことができる。

培養に用いることができる培養槽としては、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などが挙げられる。

培養終了後、次いで培養液を回収する。得られた培養液は、さらなる処理に付すことなくそのままセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの粗酵素液として利用することができる。

また、得られた培養液から、遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し、上清液を回収する。得られた上清液は、さらなる処理に付すことなくそのままセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの粗酵素液として利用することができる。

さらに、上記得られた上清液より、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを精製してもよい。セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な手法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質又は抗体等を利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等）、濾過処理（例えば、限外ろ過、逆浸透ろ過、精密ろ過等）を一又は複数組み合わせて用いて精製することができる。

精製したセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼは、固定化してもよい。固定化することによって、安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。酵素の固定化は、担体結合法、架橋法、包括法により行うことができる。担体結合法では、酵素を水不溶性の担体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物等）に、物理的吸着、イオン結合又は共有結合を用いて結合させることができる。架橋法では、２個又はそれ以上の官能基を持つ架橋試薬を用いて、酵素を架橋して固定化することができる。架橋試薬としては、グルタルアルデヒド、イソシアン酸誘導体、Ｎ，Ｎ’−エチレンマレイミド、ビスジアゾベンジン、あるいはＮ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂などの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、１９８１年）。

３．バイオマス資源の分解又は糖化
上記生産されたセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ、ならびにそれらの粗酵素液は、バイオマス資源の分解又は糖化に用いることができる。

「バイオマス資源」とは、植物や藻類が生産するセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスを含み、例えば、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、バガス、古紙類、瀘紙、一般紙類、製紙汚泥、スイッチグラス、パーム残渣、木材、大豆粕、大豆おから、コーヒー粕、米ぬか等が挙げられる。バイオマス資源は、酸処理、酵素処理、アルカリ処理、水熱処理などを用いた加水分解処理により予め前処理されたものが好ましい。また、バイオマス資源は、乾燥物でも、また湿潤物でもよいが、処理速度を高めるために予め１００〜１０００μｍのサイズに粗粉砕又は細断されたものが好ましい。

「バイオマス資源の分解又は糖化」とは、バイオマス資源に含まれるセルロース及び／又はヘミセルロースを分解し、オリゴ糖類、二糖類、単糖類及びそれらの混合物にすることをいう。すなわち、「バイオマス資源の分解又は糖化」とは、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼによって、多糖類のグリコシド結合を加水分解することをいう。

バイオマス資源の分解又は糖化は、公知の方法を用いることができる。すなわち、バイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、そこに精製したセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ、あるいは上記それらの粗酵素液を加え、撹拌又は振とうしながら加温して酵素反応を行う。この方法において、反応液のｐＨ及び温度は、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲とすることができる。

バイオマス資源の分解又は糖化の工程は、バッチ式、フェドバッチ式、半連続式、又は連続式にて行うことができる。

また、上記「セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産」において、培地に含める炭素源として「バイオマス資源」を利用することにより、「セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの生産」と「バイオマス資源の分解又は糖化」とは、同一の装置（培養槽）内にて同時に行うことができる。

あるいは、「バイオマス資源の分解又は糖化」は、生成した糖類を原料（発酵基質）とする微生物（酵母など）による発酵処理を同一の装置にて同時に行う、いわゆる同時糖化発酵（ＳＳＦ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）にて行うことができる。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：ゲノムＤＮＡの抽出
タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）Ｃ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０８）（以下、「Ｃ１株」と記載する）をＰＤ（ポテトデキストロース）培地で一晩培養し、得られた培養液を遠心分離によって集菌した。次に、菌体の２倍量から３倍量のＴＥ緩衝液（２％ＳＤＳ含有）で菌体を懸濁し、５０℃で１時間保温し、５Ｍ酢酸カリウム溶液を全量の１０分の１量加えて、氷上で１時間冷却した後、遠心して上清を回収した。得られた上清に対し、フェノール・クロロホルム処理を２回行い、１００％エタノールを２．５倍量加えて、マイナス２０℃で１時間以上冷却した後、遠心処理により核酸を沈殿させた。得られた沈殿を７０％エタノールで２回洗い、適当量のＴＥ緩衝液に懸濁した後、ＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で１時間保温し、Ｃ１株のゲノムＤＮＡを得た。

実施例２：Ｃ１株由来ウラシル要求性株の取得
（２−１）ｐｙｒＦ遺伝子破壊用プラスミドの調製
ｐｙｒＦ遺伝子（ＡＢ６６８０５６）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、ｐｙｒＦ遺伝子の上流領域及び下流領域をそれぞれ増幅した。

増幅した上流領域及び下流領域を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＸｂａＩ−ＳｍａＩサイト及びＳｍａＩ−ＡｐａＩサイトへそれぞれ導入し、ｐｙｒＦ遺伝子破壊用プラスミドを得た。

（２−２）Ｃ１株由来ウラシル要求性株の作製
ＰＤ培地を用いて一晩培養したＣ１株を遠心分離によって回収し、０．８Ｍ ＮａＣｌを用いて洗浄した。

得られた菌体に対し、１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．８Ｍ ＮａＣｌに懸濁した０．２％Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を加え、３０℃下で１時間穏やかに振盪した。顕微鏡下で菌体がプロトプラスト化していることを確認し、これを遠心分離により回収した後に、０．８Ｍ ＮａＣｌを用いて菌体を洗浄した。得られた菌体を溶液Ａ（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））へ懸濁し、プロトプラスト溶液を得た。

プロトプラスト溶液０．２ｍＬに、ｐｙｒＦ遺伝子破壊用プラスミド（約１０μｇ）および５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２：ｐＨ７．５）を加え、氷上に３０分静置後、１ｍＬのＰＥＧ溶液を加え、十分に混合して室温下で３０分間静置した。次に、得られた溶液を０．２ｍＬずつ、１Ｍスクロース、１．２％５−ＦＯＡ、１％ウラシル、１％ウリジンを加えたＭＭ寒天培地に塗布し、５〜７日後生育してきたコロニーを選択した。

得られたコロニーの全ＤＮＡを回収し、サザン解析によりｐｙｒＦ遺伝子が破壊された株を選抜・取得した。以下、ｐｙｒＦ遺伝子が破壊された株を「ＣＰ４株」と記載する。

実施例３：ｃｌｒ２遺伝子破壊用プラスミドの作製
ｃｌｒ２遺伝子（配列番号８）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、ｃｌｒ２遺伝子の上流領域及び下流領域をそれぞれ増幅した。

増幅した上流領域及び下流領域を、ｐｂｓ−ｐｙｒＦ（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７８（２０１４））のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶサイト及びＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトへそれぞれ導入し、ｃｌｒ２遺伝子破壊用プラスミドを得た。

実施例４：ｘｌｎＲ遺伝子高発現用プラスミドの作製
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＢ８４７４２５）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、当該遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域をそれぞれ増幅した。

増幅したプロモーター領域及びターミネーター領域を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩサイト及びＳａｌＩ−ＡｐａＩサイトへそれぞれ導入し、ｐｂｓ−ｇｐｄを得た。

次に、ｐｙｒＦ遺伝子（ＡＢ６６８０５６）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、当該遺伝子の全長を増幅した。

増幅した全長遺伝子を、ｐｂｓ−ｇｐｄのＮｏｔＩ−ＸｂａＩサイトへ導入し、ｐｂｓ−ｇｐｄ−ｐｙｒＦを得た。

次に、ｘｌｎＲ遺伝子（配列番号５）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、当該遺伝子の全長を増幅した。

増幅した全長遺伝子を、ｐｂｓ−ｇｐｄ−ｐｙｒＦのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトへ導入し、ｘｌｎＲ遺伝子高発現用プラスミドを得た。

実施例５：ｃｌｂＲ遺伝子高発現用プラスミドの作製
ｃｌｂＲ遺伝子（配列番号６）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、当該遺伝子の全長を増幅した。

増幅した全長遺伝子を、上記ｐｂｓ−ｇｐｄ−ｐｙｒＦのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトへ導入し、ｃｌｂＲ遺伝子高発現用プラスミドを得た。

実施例６：ａｃｅ１遺伝子高発現用プラスミドの作製
ａｃｅ１遺伝子（配列番号７）の配列情報をもとに以下のプライマーを設計し、上記実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型として、当該遺伝子の全長を増幅した。

増幅した全長遺伝子を、上記ｐｂｓ−ｇｐｄ−ｐｙｒＦのＥｃｏＲＶ−ＳｂｆＩサイトへ導入し、ａｃｅ１遺伝子高発現用プラスミドを得た。

実施例７：ｘｌｎＲ−ｃｌｂＲ遺伝子高発現用プラスミドの作製
上記実施例４で得たｘｌｎＲ遺伝子高発現用プラスミドを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、ｘｌｎＲ遺伝子を含む断片Ａを増幅した。

次に、上記実施例５で得たｃｌｂＲ遺伝子高発現用プラスミドを鋳型とし、以下のプライマーを用いて、ｃｌｂＲ遺伝子を含む断片Ｂを増幅した。

次に、増幅した断片Ａと断片ＢとをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて連結し、ｘｌｎＲ−ｃｌｂＲ遺伝子高発現用プラスミドを得た。

実施例８：形質転換体の作製
上記実施例２で得たＣＰ４株をＰＤ培地を用いて一晩培養し、遠心分離によって菌体を回収した後、０．８Ｍ ＮａＣｌを用いて洗浄した。

得られた菌体に対し、１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．８Ｍ ＮａＣｌに懸濁した０．２％Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を加え、３０℃下で１時間穏やかに振盪した。顕微鏡下で菌体がプロトプラスト化していることを確認し、これを遠心分離により回収した後に、０．８Ｍ ＮａＣｌを用いて菌体を洗浄した。得られた菌体を溶液Ａ（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））へ懸濁し、プロトプラスト溶液を得た。

プロトプラスト溶液０．２ｍＬに、上記実施例３〜７で作製した各プラスミド（約１０μｇ）及び５０μＬのＰＥＧ溶液（４０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２：ｐＨ７．５）を加え、氷上に３０分静置後、１ｍＬのＰＥＧ溶液を加え、十分に混合して室温下で３０分間静置した。次に、得られた溶液を０．２ｍＬずつ、１Ｍスクロースを加えたＭＭ寒天培地に塗布し、５〜７日後生育してきたコロニーを選択した。

得られたコロニーの全ＤＮＡを回収し、サザン解析により標的遺伝子が破壊された株及び標的遺伝子の全長を高発現する株をそれぞれ選抜・取得した。以下、上記実施例３〜７で作製した各プラスミドを用いて形質転換し、上記のとおり選抜・取得された菌株をそれぞれ、Ｃｌｒ２破壊株、ＸｌｎＲ高発現株、ＣｌｂＲ高発現株、Ａｃｅ１高発現株、及びＸｌｎＲ−ＣｌｂＲ高発現株と記載する。

実施例９：酵素活性の評価
Ｃ１株（対照）、ならびにＣｌｒ２破壊株、ＸｌｎＲ高発現株、ＣｌｂＲ高発現株、Ａｃｅ１高発現株、及びＸｌｎＲ−ＣｌｂＲ高発現株をそれぞれ、（１）ソルカフロック５０ｇ／Ｌ、（２）ソルカフロック１０ｇ／Ｌ＋グルコース４０ｇ／Ｌ、又は（３）微粉砕イナワラ１００ｇ／Ｌを炭素源とする以下の組成の培地に接種して、３０℃で８日間好気的に培養した。なお、（２）ソルカフロック１０ｇ／Ｌ＋グルコース４０ｇ／Ｌを利用する培養については、グルコース４０ｇ／Ｌを培養初期に全量添加する方式（バッチ式）にて行った。

各培養液を回収し、遠心分離して得た上澄液について、酵素活性を測定した。

セルラーゼ（ＦＰアーゼ）活性は、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１）を基質として用い、培養液を混合して５０℃で６０分間インキュベートし、次いで、遊離されたグルコースをＤＮＳ法を用いて比色定量することにより算出した。

ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）活性は、キシラン（Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ、ＳＩＧＭＡ）を基質として用い、培養液を混合して４５℃で３０分間インキュベートし、次いで、遊離されたキシロースをＤＮＳ法を用いて比色定量することにより算出した。

各炭素源を利用した培養条件下における、Ｃ１株（対照）、ならびにＣｌｒ２破壊株、ＸｌｎＲ高発現株、ＣｌｂＲ高発現株、Ａｃｅ１高発現株、及びＸｌｎＲ−ＣｌｂＲ高発現株の培養液中の各酵素活性の測定値を以下の表に示す。なお、表中の値は、Ｃ１株（対照）の測定値を「１００」とする相対値にて示す。

上記結果より明らかなとおり、Ｃｌｒ２破壊株はいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能を示した。また、セルロース（ソルカフロック）及び天然のバイオマス資源（イナワラ）を炭素源としたいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いヘミセルラーゼ生産能を示したが、特に、炭素源としてセルロース（ソルカフロック）を用いた場合に、高いヘミセルラーゼ生産能を示した。

Ａｃｅ１高発現株はセルロース（ソルカフロック）を炭素源とした培養条件において、Ｃ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能及び高いヘミセルラーゼ生産能を示した。特に、炭素源としてグルコースを主体した場合に、高いセルラーゼ生産能を示した。

ＸｌｎＲ高発現株はいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能を示した。特に、炭素源としてセルロース（ソルカフロック）を用いた場合に、高いセルラーゼ生産能を示した。

ＣｌｂＲ高発現株はいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能を示した。特に、炭素源としてグルコースを主体した場合、及び天然のバイオマス資源（イナワラ）を用いた場合に、高いセルラーゼ生産能を示した。また、セルロース（ソルカフロック）及び天然のバイオマス資源（イナワラ）を炭素源としたいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いヘミセルラーゼ生産能を示したが、特に、炭素源として天然のバイオマス資源（イナワラ）を用いた場合に、高いヘミセルラーゼ生産能を示した。

ＸｌｎＲ−ＣｌｂＲ高発現株は、いずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能を示した。特に、炭素源としてグルコースを主体した場合、及び天然のバイオマス資源（イナワラ）を用いた場合に、高いセルラーゼ生産能を示した。また、セルロース（ソルカフロック）及び天然のバイオマス資源（イナワラ）を炭素源としたいずれの培養条件においても、Ｃ１株と比べて、高いヘミセルラーゼ生産能を示したが、特に、炭素源として天然のバイオマス資源（イナワラ）を用いた場合に、高いヘミセルラーゼ生産能を示した。

以上より、Ｃｌｒ２破壊株、ＸｌｎＲ高発現株、ＣｌｂＲ高発現株、Ａｃｅ１高発現株、及びＸｌｎＲ−ＣｌｂＲ高発現株は、セルラーゼの高生産株として公知であるＣ１株と比べて、高いセルラーゼ生産能を有することが明らかとなった。

本発明によるタラロマイセス属糸状菌の変異株は、従来公知のセルラーゼ高生産株と比べて、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの高い生産能を有し、これにより、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ生産の低コスト化、ならびにバイオマス資源の分解又は糖化を効率的に行うことができる。故に、本発明はセルラーゼ等の酵素生産の分野、及びバイオマス資源の分解又は糖化の分野において大いに貢献することが期待される。

Claims (10)

1. ａｃｅ１遺伝子、ｘｌｎＲ遺伝子、及びｃｌｂＲ遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を高発現する、あるいは、ｃｌｒ２遺伝子の機能が欠損している、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属糸状菌Ｃ１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５０８）の変異株。
2. ａｃｅ１遺伝子を高発現する、請求項１に記載の変異株。
3. ｃｌｂＲ遺伝子を高発現する、請求項１に記載の変異株。
4. ｘｌｎＲ遺伝子を高発現する、請求項１に記載の変異株。
5. ｘｌｎＲ遺伝子及びｃｌｂＲ遺伝子を高発現する、請求項１に記載の変異株。
6. ｃｌｒ２遺伝子が欠失している、請求項１に記載の変異株。
7. セルロース含有原料を含む培地中にて、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異株を培養することを含む、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼの製造方法。
8. 培地がさらに糖類を含む、請求項７に記載の方法。
9. セルロース含有原料を含む培地中にて請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異株を培養する工程を含む、バイオマス資源の分解又は糖化方法。
10. 培地がさらに糖類を含む、請求項９に記載の方法。