JP4998991B2 - セルラーゼの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)炭素源としてセルロースを含有する原料とラクトースを含有する原料とを含む培地中にてセルラーゼ生産菌を培養し、セルラーゼを製造する方法。
(2)セルロースを含有する原料が、粉末セルロース(アビセルを含む)、古紙類、瀘紙、一般紙類、木材、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、バガス、加水分解残渣、またはそれらの混合物を含む、(1)に記載のセルラーゼの製造方法。
(3)ラクトースを含有する原料が、ラクトース、ラクトース水和物、乳清(ホエイ)、乳製品、またはそれらの混合物を含む、(1)または(2)に記載のセルラーゼの製造方法。
(4)培養が、液体培養または固体培養である、(1)〜(3)のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
(5)セルラーゼ生産菌がアクレモニウム属に属する微生物である(1)〜(4)のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
(6)アクレモニウム属に属する微生物がアクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)である(5)に記載のセルラーゼの製造方法。
(7)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法により製造し、得られたセルラーゼを用いてセルロースを分解または糖化することを特徴とするセルロースの分解または糖化方法。
(8)セルラーゼ生産菌がアクレモニウム属に属する微生物である(7)に記載のセルロースの分解または糖化方法。
(9)アクレモニウム属に属する微生物がアクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)である(8)に記載のセルロースの分解または糖化方法。
セルロースは、グルコースがβ−1,4グルコシド結合により高度に重合したグルコースポリマーであり、全ての植物の細胞壁構成成分として存在する。本発明において、「セルロースを含有する原料」は、例えば、粉末セルロース(例えば、Solka Floc(登録商標)CAS9004-34-6, Fiber Sales & Development Co. Urbana, OH、およびアビセルなど)、古紙類、瀘紙、一般紙類、木材、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、バガス、加水分解残渣等を含むが、セルラーゼ生産菌の培養のための炭素源となり得る限り、これらに限定されない。加水分解残渣とは、セルロースを含有する原料を、酸や酵素などを用いて加水分解処理したものをいう。本発明において、使用するセルロースを含有する原料としては、上記のものが例示されるが、粉末セルロースが好ましく、特にSolka Floc(登録商標)が好ましい。
セルラーゼ生産菌は、下記の実施例において具体的に記載されるように培養することが可能である。
セルラーゼは、上記上清液より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒(エタノール、メタノール、アセトン等)による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を1つまたは複数組み合わせて用いて精製することが可能である。
精製したセルラーゼを、固定化して用いることもできる。固定化することによって、安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。セルラーゼの固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、セルラーゼを水不溶性の担体(例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など)に、物理的吸着、イオン結合および共有結合を用いて結合させることができる。架橋法では、2個またはそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、セルラーゼとセルラーゼを架橋することによって固定化する。架橋試薬としては、Schiff塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、N,N’-エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するN,N’-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中にセルラーゼを取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によってセルラーゼを皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂などの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる(福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、1981年)。
セルラーゼ活性は、上記上清液または精製したセルラーゼに、濾紙、カルボキシメチルセルロース(CMC)、微結晶セルロース(Avicel)、サリシンおよびセロビオースなどの基質を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をSomogy-Nelson法およびDNS法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することが可能である。
セルロースの分解または糖化は、公知の方法を用いることができる。例えば、セルロース系物質を水性媒体中に懸濁し、セルラーゼを含む培養上清または精製したセルラーゼを加え、撹拌または振とうしながら加温して、セルロース系物質を分解または糖化することができる。この方法において、反応液のpHおよび温度は、セルラーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は5〜95℃、pHは1〜11の範囲でよい。例えば、50gの粉砕した稲わらに、0.25〜1Lの酢酸緩衝液(0.05M、pH 4.8)および0.01〜0.2Lのセルラーゼを含む培養上清または精製したセルラーゼを添加して、45〜60℃で攪拌または振とうしながら、セルロースの分解または糖化を行う。また、この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
(セルラーゼ生産菌の培養)
本実施例においては、セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)を用いた。培地は下記の組成を有するセルラーゼ生産菌培養培地を用いた。
炭素源 50g/Lまたは 60g/L
硫酸アンモニウム 5g/L
尿素 4g/L
硫酸マグネシウム 1.2g/L
リン酸2水素カリウム 24g/L
酒石酸カリウム 4.7g/L
硫酸亜鉛 10 mg/L
硫酸マンガン 10 mg/L
硫酸銅 10 mg/L
Tween 80 1 g/L
pH 4.0
本実施例において、セルラーゼの酵素活性は、濾紙を基質として用いて行った。具体的には、濾紙(ワットマンNo.1、1×6cm)を基質とし、これに適宜希釈した培養上清液0.5mLとクエン酸緩衝液(pH4.8、0.05M)1.0mLを加え、50℃で1.0時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬3.0mLを加え、100℃で5分間加熱し発色させた。冷却後、蒸留水2.5mLにこれを200μl加え、540nmの波長で比色定量した。
Claims (5)
- 炭素源としてセルロースを含有する原料とラクトースを含有する原料とを含む培地中にてアクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)を培養し、セルラーゼを製造する方法であって、該培地がセルロースおよびラクトースをそれぞれ40〜50g/Lおよび5〜20g/L含む、上記セルラーゼの製造方法。
- セルロースを含有する原料が、粉末セルロース、アビセル、古紙類、瀘紙、一般紙類、木材、麦わら、稲わら、ふすま、もみがら、バガス、加水分解残渣、またはそれらの混合物を含む、請求項1に記載のセルラーゼの製造方法。
- ラクトースを含有する原料が、ラクトース、ラクトース水和物、乳清、乳製品、またはそれらの混合物を含む、請求項1または2に記載のセルラーゼの製造方法。
- 培養が、液体培養または固体培養である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のセルラーゼの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法によりセルラーゼを製造する工程、ならびに得られたセルラーゼを用いてセルロースを分解または糖化する工程を含む、セルロースの分解または糖化方法。
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Long et al. | Patents and literature |
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