WO2023048199A1 - 糖化酵素の製造方法 - Google Patents

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WO2023048199A1
WO2023048199A1 PCT/JP2022/035249 JP2022035249W WO2023048199A1 WO 2023048199 A1 WO2023048199 A1 WO 2023048199A1 JP 2022035249 W JP2022035249 W JP 2022035249W WO 2023048199 A1 WO2023048199 A1 WO 2023048199A1
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紘弥 前田
武子 児玉
望 柴田
史員 高橋
一暁 五十嵐
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花王株式会社
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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a biomass saccharifying enzyme.
  • Cassava produced in Africa and Asia is used as tapioca starch by extracting its starch, mainly in Asia.
  • the cassava residue after extracting tapioca starch has a moisture content of 70-90% and is used as livestock feed after drying, but not all the residue can be used and the rest is discarded. ing.
  • cassava residue contains a lot of starch and cellulose and is a biomass with a high glucose content, it is expected to be converted into sugar for advanced utilization.
  • cassava residue is known to contain a large amount of pectin in addition to starch and cellulose.
  • Pectin is a natural polysaccharide, and since it is a polymer present mainly in cell walls, it has a property of high viscosity.
  • cassava residue contains hemicellulose and lignin in addition to starch, cellulose and pectin, and multiple enzymes such as amylase, cellulase, pectinase and hemicellulase are essential for saccharification.
  • Non-Patent Document 1 discloses that an enzyme mixture containing cellulase, hemicellulase and pectinase from Aspergillus aculeatus reduces the viscosity of cassava roots, chips and pulp. It is disclosed that an enzyme preparation containing pectinase can reduce the moisture content and material viscosity in cassava residue and increase starch yield. However, these techniques are not practical for large-scale saccharification of cassava residues because saccharification of biomass using various enzyme mixtures is very costly. A manufacturing technology is required.
  • Patent Document 1 Chinese Patent Application Publication No. 101285058
  • Non-Patent Document 1 Aphisit Poonsrisawat et al., Process Biochemistry 49(2014) 1950-1957
  • the present invention relates to the following 1) and 2).
  • PgaB gene, PgaI gene, PgaII gene (b) PelD gene, PelF gene, 2) Recombinant filamentous fungi into which either one or both of a polygalacturonase gene selected from the gene group shown in (a) below and a pectin lyase gene selected from the gene group shown in (b) below are introduced as a biomass saccharifying agent.
  • PgaB gene, PgaI gene, PgaII gene (b) PelD gene, PelF gene,
  • the present invention relates to providing a method for producing a saccharifying enzyme that suppresses high viscosity caused by pectin in a biomass saccharifying process.
  • the present inventors cultivated a recombinant filamentous fungus into which a gene for a specific pectin-degrading enzyme (pectinase) was introduced, thereby producing a saccharifying enzyme that exerts an excellent inhibitory effect on biomass viscosity increase caused by pectin. We found that it can be produced efficiently.
  • pectinase a specific pectin-degrading enzyme
  • the present invention it is possible to inexpensively produce a saccharifying enzyme that enables efficient saccharification by suppressing increase in viscosity of slurry in the saccharification process of biomass containing pectin.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYCS Ver. 12 homology analysis (Search homology) program is used, Unit size to compare (ktup) is 2 and it is calculated by analyzing.
  • amino acid sequences or nucleotide sequences means 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more. % or more, preferably 99% or more identity.
  • amino acid sequences or nucleotide sequences having at least 90% identity to an amino acid sequence or nucleotide sequence include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, substituted, added, or inserted, one or more nucleotide sequences having deletions, substitutions, additions, or insertions of nucleotides.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 10 or less, preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more It refers to an amino acid sequence in which 5 or less, more preferably 1 to 3, amino acids have been deleted, substituted, added, or inserted.
  • a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 24 or less, more preferably 1 or more and 15 It refers to a nucleotide sequence in which no more than 1, more preferably from 1 to 9 nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted.
  • “addition" of amino acids or nucleotides includes addition of amino acids or nucleotides to one and both termini of a sequence.
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • a gene located downstream of a promoter means that a gene is present on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of the gene means the 5' side of the gene in the DNA sense strand. means the area of
  • control region in the present invention, "operably linked" between a control region and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • Procedures for "operably linking" genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • corresponding gene refers to a gene that encodes an enzyme that catalyzes a given reaction in a microorganism, and a gene that encodes an enzyme that catalyzes the same or similar reaction as that enzyme in another microorganism.
  • a gene and its corresponding gene may have the same nucleotide sequence or different nucleotide sequences, but the nucleotide sequence identity between a gene and its corresponding gene is at least 90%. % is preferred.
  • the recombinant filamentous fungus of the present invention is a filamentous fungus into which a specific pectinase gene has been introduced. Specifically, either one or both of a polygalacturonase gene selected from the gene group shown in (a) below and a pectin lyase gene selected from the gene group shown in (b) below were introduced. It is a filamentous fungus.
  • a) PgaB gene, PgaI gene, PgaII gene (b) PelD gene, PelF gene
  • Polygalacturonase is an enzyme (EC 3.2.1.15) that hydrolyzes the ⁇ -1,4-glycosidic bond of D-galacturonic acid that constitutes pectic acid
  • the polygalacturonase of the present invention Nase genes include one or more genes selected from PgaB gene, PgaI gene and PgaII gene.
  • Such polygalacturonase genes are preferably derived from filamentous fungi, for example, microorganisms belonging to the genus Aspergillus (e.g., Aspergillus niger, Aspergillus japonicus, Aspergillus japonicus, Aspergillus japonicus).
  • Rhizopus microorganisms e.g., Rhizopus oryzae, Rhizopus delemar
  • Talaromyces microorganisms e.g., Talaromyces cellulolyticus
  • Penicillium genus microorganisms for example, Penicillium roqueforti
  • the PgaB gene of Aspergillus niger or the gene corresponding to the PgaB gene, the PgaI gene or the gene corresponding to the PgaI gene, the PgaII gene or the gene corresponding to the PgaII gene, and the like are more preferable.
  • the Aspergillus niger PgaB gene is a gene registered in the public database of NCBI under the accession number XM_025597756. Specific examples of the Aspergillus niger PgaB gene or genes corresponding to the PgaB gene include the following 1) to 3).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 2) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having polygalacturonase activity 3) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having polygalacturonase activity
  • the gene corresponding to the PgaB gene of Aspergillus niger is preferably a gene derived from other filamentous fungi encoding polygalacturonase, for example, the glycoside hydrolase family 28 protein of Aspergillus aculeatus [Aspergillus aculeatus ATCC 16872].
  • the Aspergillus niger PgaI gene is a gene registered in the public database of NCBI under the accession number XM_025596768. Specific examples of the Aspergillus niger PgaI gene or genes corresponding to the PgaI gene include the following 4) to 6).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3 A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3 and encoding a protein having polygalacturonase activity 6) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encoding a protein having polygalacturonase activity
  • the gene corresponding to the PgaI gene of Aspergillus niger is preferably a gene derived from other filamentous fungi that encodes polygalacturonase.
  • session number XM_025643861 Aspergillus japonicus putative endopolygalacturonase II [Aspergillus japonicus CBS 114.51] (accession number XM_025668037), and the like.
  • the Aspergillus niger PgaII gene is a gene registered in the public database of NCBI under the accession number XM_025602343.1. Specific examples of the Aspergillus niger PgaII gene or genes corresponding to the PgaII gene include the following 7) to 9).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 and encoding a protein having polygalacturonase activity9
  • the gene corresponding to the PgaII gene of Aspergillus niger is preferably a gene derived from other filamentous fungi that encodes polygalacturonase. session number XM_020200977.1), Aspergillus japonicus CBS 114.51 putative endopolygalacturonase II (BO86DRAFT_431298) (accession number XM_025675761.1), and the like.
  • Pectin lyase is an enzyme (EC 4.2.2.10) that catalyzes the reaction of converting pectin into an oligosaccharide having an unsaturated bond between C-4 and C-5 of the terminal residues.
  • the pectin lyase gene of the invention includes one or more genes selected from PelD gene and PelF gene.
  • Such pectin lyase genes are preferably derived from filamentous fungi, for example, microorganisms of the genus Aspergillus (e.g., Aspergillus niger, Aspergillus japonicus, Aspergillus ludhuensis), microorganisms of the genus Penicillium (e.g., Penicillium ludhuensis). Penicillium digitatum, Penicillium solitum), Talaromyces microorganisms (eg, Talaromyces rugulosus, Talaromyces cerulolyticus), and the like.
  • the PelD gene of Aspergillus niger or a gene corresponding to the PelD gene is more preferable.
  • the PelD gene of Aspergillus niger is a gene registered in the NCBI database under the accession number XM_025604039.1. Examples of the PelD gene of Aspergillus niger or genes corresponding to the PelD gene include the following 10) to 12).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 11) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encoding a protein having pectin lyase activity 12) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and encoding a protein having pectin lyase activity
  • the gene corresponding to the PelD gene of Aspergillus niger is preferably a gene derived from other filamentous fungi that encodes pectin lyase. .1) ⁇ Aspergillus japonicus CBS 114.51 pectin lyase pelD (BO86DRAFT_402188)( ⁇ XM_025673839.1) ⁇ Penicillium digitatum strain Pd01 PL1 mRNA,complete cds( ⁇ JX298853.1) etc.
  • PelF gene of Aspergillus niger is a gene registered in the NCBI database under accession number: XM_001401024.2. Examples of the PelF gene of Aspergillus niger or genes corresponding to the PelF gene include the following 13) to 15).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 14) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and encoding a protein having pectin lyase activity 15) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and encoding a protein having pectin lyase activity
  • the gene corresponding to the PelF gene of Aspergillus niger is preferably a gene derived from other filamentous fungi that encodes pectin lyase.
  • the pectinase gene to be introduced may be either one or both of the polygalacturonase gene and the pectin lyase gene, but introduction of both the polygalacturonase gene and the pectin lyase gene is effective in reducing the viscosity of biomass. It is preferable from the point of
  • Examples of means for introducing the polygalacturonase gene and/or pectin lyase gene of the present invention into a filamentous fungus include introducing a vector or DNA fragment containing the above-described polynucleotide into a host filamentous fungus (parent strain). be done.
  • the vector containing the polynucleotide of the present invention is an expression vector, preferably an expression vector capable of introducing the polynucleotide into a host filamentous fungus and expressing the polynucleotide in the host. be.
  • the vector also preferably comprises a polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
  • the vector may be a vector capable of autonomous replication and replication outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • Examples of specific vectors include pUC-based vectors such as pBluescript II SK (-) (Stratagene), pUC18/19, pUC118/119 (Takara Bio), pET-based vectors (Takara Bio), pGEX-based vectors ( GE Healthcare), pCold-based vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T.
  • pUC-based vectors such as pBluescript II SK (-) (Stratagene), pUC18/19, pUC118/119 (Takara Bio), pET-based vectors (Takara Bio), pGEX-based vectors ( GE Healthcare), pCold-based vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T.
  • DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention include, for example, PCR-amplified DNA fragments and restriction enzyme-cleaved DNA fragments.
  • the DNA fragment may be an expression cassette comprising the polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
  • the control region contained in the above vector or DNA fragment is a sequence for expressing the gene of the present invention in a host into which the vector or DNA fragment has been introduced. points, etc.
  • the type of control region can be appropriately selected according to the type of host cell into which the vector or DNA fragment is introduced. If necessary, the vector or DNA fragment may further have a selectable marker such as an antibiotic resistance gene, an amino acid synthesis-related gene, and the like.
  • control region contained in the vector or DNA fragment is operably linked upstream of the polygalacturonase gene and/or the pectin lyase gene, and has the function of constitutively expressing or highly expressing the downstream gene. region (so-called strong control region).
  • strong control region examples include Trichoderma reesei cbh1 promoter, cbh2 promoter, egl1 promoter, xyn1 promoter, xyn2 promoter, xyn3 promoter, and the like.
  • strong regulatory regions include, but are not limited to, regulatory regions of rRNA operons, regulatory regions of genes encoding ribosomal proteins, and the like.
  • the target polynucleotide and control region contained in the vector or DNA fragment may be introduced into the host's nucleus, or may be introduced into the host genome.
  • the polynucleotide of interest contained in the above vector or DNA fragment may be introduced directly into the host genome and operably linked to a high expression promoter on the genome.
  • Methods for introducing polynucleotides into the genome include homologous recombination.
  • Plasmids or DNA fragments into the above host cells includes general transformation methods such as electroporation, transformation, transfection, conjugation, protoplast, particle gun, and Agrobacterium. etc. can be used.
  • Recombinant filamentous fungi into which the vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using a selectable marker.
  • a selectable marker is an antibiotic resistance gene
  • transformed cells into which the vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected by culturing the cells in the antibiotic-supplemented medium.
  • the selection marker is a gene associated with amino acid synthesis
  • the filamentous fungus strain into which the vector or DNA fragment of interest has been introduced is selected based on the presence or absence of the amino acid auxotrophy as an index. can be selected.
  • introduction of the target vector or DNA fragment can be confirmed by examining the DNA sequence of the recombinant strain by PCR or the like.
  • a recombinant filamentous fungus in which the polygalacturonase gene and/or the pectin lyase gene of the present invention have been introduced into the filamentous fungus strain can be produced.
  • the recombinant filamentous fungus of the present invention has the ability to produce cellulase and pectinase.
  • the filamentous fungus used as the parent strain in the present invention is not limited as long as it is a fungus that produces cellulase as a biomass saccharification enzyme and is of a genus or species different from the polygalacturonase gene or pectin lyase gene to be introduced. Included are filamentous fungi belonging to the phylum Eumycota and Oomycota.
  • the filamentous fungi include the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Neurospora, the genus Fusarium, the genus Chrysosporium, Genus Humicola, Genus Emericella, Genus Hypocrea, Genus Acremonium, Genus Chrysosporium, Genus Myceliophthora, Genus Piromyces, Genus Talaromyces , Thermoascus, Thielavia, and the like, preferably Trichoderma.
  • filamentous fungi of the genus Trichoderma examples include Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, and Trichoderma viride. is preferably Trichoderma reesei, more preferably Trichoderma reesei strain PCD-10 (FERM P-8172) and Trichoderma reesei strain PC-3-7 (ATCC66589).
  • the filamentous fungus that is the parent strain may be a wild-type strain, or a strain artificially bred from the wild-type strain, or a mutant in which the nucleotide sequence in the genome is substituted, added, deleted, or modified. It may be a strain (mutant) or a mutant.
  • Preferred examples of the recombinant filamentous fungus of the present invention include Trichoderma reesei strain PC-3-7 (ATCC66589) and its mutants, the PgaB gene of Aspergillus niger or a gene corresponding to the PgaB gene, or A recombinant filamentous fungus into which the PelD gene or a gene corresponding to the PelD gene has been introduced, and the PgaB gene of Aspergillus niger or the gene corresponding to the PgaB gene and the PelD gene of Aspergillus niger or the gene corresponding to the PelD gene are introduced together
  • Examples thereof include recombinant filamentous fungi, and specific examples thereof include the strains disclosed in Examples described later.
  • the recombinant filamentous strain of the present invention thus constructed has increased expression of pectinase in the cells compared to the parent strain, when biomass containing cellulose and pectin is saccharified using this strain, Slurry thickening caused by pectin is reduced compared to saccharification using the parent strain.
  • the viscosity of the slurry obtained by saccharifying cassava residue using the recombinant filamentous strain of the present invention is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 60% or more, compared to the case of saccharification using the parent strain. A reduction of 70% or more is possible.
  • the viscosity includes, for example, viscosity measured with a Brookfield viscometer at a solid content concentration of 10 to 20% by mass and 50°C. Therefore, by using the recombinant filamentous fungus of the present invention, in the saccharification treatment of biomass such as cassava containing a large amount of pectin, it is possible to suppress the increase in viscosity and improve the saccharification efficiency.
  • a biomass saccharifying enzyme is produced by culturing the above recombinant filamentous fungus in the presence of a cellulase-inducing substance, producing and accumulating enzymes including cellulase and pectinase in the culture, and collecting the enzymes from the culture. be able to.
  • the "cellulase inducer” is not limited as long as it is a substance that induces cellulase production in cellulase-producing filamentous fungi.
  • examples include cellulose; sophorose; Compounds selected from cellooligosaccharides such as hexaose can be mentioned.
  • cellulose includes polymers obtained by polymerizing glucose through ⁇ -1,4-glucosidic bonds and derivatives thereof.
  • the degree of polymerization of glucose is not particularly limited.
  • Derivatives include carboxymethylated, aldehydated, and esterified derivatives.
  • the cellulose may be ⁇ -glucoside which is a glycoside, lignocellulose which is a complex with lignin and/or hemicellulose, and a complex with pectin and the like.
  • Cellulose may be crystalline cellulose or amorphous cellulose.
  • the cellulase inducer can be added by any method such as batch (batch method), divided addition (fed-batch method) or continuous addition (feed method).
  • the amount of the cellulase-inducing substance added to the medium may be any amount that can induce cellulase and pectinase production by the filamentous fungus of the present invention. 1% by mass or more, more preferably 0.5% by mass or more, more preferably 1% by mass or more, and preferably 40% by mass or less, more preferably 35% by mass or less, more preferably 30% by mass or less . Also, it is preferably 0.1 to 40% by mass, more preferably 0.5 to 35% by mass, and more preferably 1 to 30% by mass.
  • the addition amount in the case of batch addition is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.5% by mass or more, more preferably 1% by mass or more, and preferably 16% by mass or less, and more It is preferably 14% by mass or less, more preferably 12% by mass or less. Also, it is preferably 0.1 to 16% by mass, more preferably 0.5 to 14% by mass, and more preferably 1 to 12% by mass.
  • the medium used in the method of the present invention may be either a synthetic medium or a natural medium, as long as it contains nutrients necessary for the growth of the filamentous fungus of the present invention and the production of cellulase and pectinase, such as carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, and vitamins. It's okay.
  • the carbon source may be any carbon source that can be assimilated by the recombinant filamentous fungus of the present invention.
  • sugars such as glucose and fructose, ethanol, and glycerol can be used. and organic acids such as acetic acid. These can be used singly or in combination.
  • Sugars such as glucose and fructose are preferable as the carbon source, and glucose is more preferable.
  • the amount of glucose added at that time is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.5% by mass or more, more preferably 2.5% by mass or more, and preferably 15% by mass, relative to the medium.
  • the mass ratio of the cellulase inducer and glucose in the medium is preferably 10:1 to 1:1, more preferably 4:1 to 2:1.
  • nitrogen sources include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amines, peptone, and natural nitrogen sources such as soybean hydrolysates.
  • inorganic salts include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, and potassium carbonate.
  • vitamins examples include biotin and thiamine. Furthermore, substances required for the growth of the recombinant filamentous fungus of the present invention can be added as necessary.
  • Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 10° C. or higher, more preferably 20° C. or higher, more preferably 25° C. or higher, and preferably 50° C. or lower, more preferably 42° C. or lower, more preferably 35° C. or lower. Also, it is preferably 10 to 50°C, more preferably 20 to 42°C, and more preferably 25 to 35°C.
  • the pH during culture is 3-9, preferably 4-5.
  • the culture time is 10 hours to 10 days, preferably 2 to 7 days.
  • the culture is collected, and if necessary, the bacterial cells are disrupted by ultrasonic waves or pressurization.
  • solid-liquid separation by filtration or centrifugation, ultrafiltration, salting out, dialysis, chromatography Saccharifying enzymes including cellulase and pectinase can be obtained by appropriately combining photography and the like.
  • the degree of separation and purification is not particularly limited.
  • the culture supernatant or its crude separation and purification itself can also be used as the biomass saccharifying enzyme.
  • cellulase is a generic term for enzymes that degrade cellulose, endoglucanase (EC 3.2.1.4) that cleaves from the inside of the cellulose molecule; It includes exoglucanases (cellobiohydrolases, EC 3.2.1.91) and ⁇ -glucosidases (EC 3.2.1.21) that release cellobiose.
  • pectinase is a general term for a group of enzymes that decompose pectin (polysaccharide composed of ⁇ -1,4 bonds of D-galacturonic acid), and includes polygalacturonase, pectin lyase, and pectinesterase.
  • preferred saccharifying enzymes of the present invention are polygalacturonase and pectin lyase.
  • biomass can be decomposed and saccharified to produce monosaccharides, and such methods can be carried out using known methods. That is, the above-described culture obtained by culturing the recombinant filamentous fungus of the present invention in the presence of a cellulase inducer is used as a biomass saccharifying agent, and this and biomass are allowed to coexist in an aqueous medium and are added while stirring or shaking. By heating, the biomass can be saccharified to produce monosaccharides.
  • biomass includes cellulose- and pectin-containing substances such as cassava, cassava residue, corn, corn hulls, apple residue, citrus peel, etc., preferably cassava residue.
  • the pH and temperature of the reaction solution may be within a range in which cellulase and pectinase are not deactivated. 11 range.
  • the biomass saccharification process may be performed in a batch mode or in a continuous mode.
  • the present invention also includes the following as exemplary embodiments. However, the invention is not limited to these embodiments.
  • Recombinant filament into which either one or both of a polygalacturonase gene selected from the gene group shown in (a) below and a pectin lyase gene selected from the gene group shown in (b) are introduced A method for producing a biomass saccharifying enzyme, comprising culturing a fungus.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the filamentous fungus is a cellulase-producing filamentous fungus.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the filamentous fungus is a Trichoderma filamentous fungus.
  • ⁇ 7> The method according to ⁇ 6>, wherein the filamentous fungus is Trichoderma reesei.
  • ⁇ 8> Recombinant filament into which either one or both of a polygalacturonase gene selected from the gene group shown in (a) below and a pectin lyase gene selected from the gene group shown in (b) are introduced
  • PgaB gene, PgaI gene, PgaII gene (b) PelD gene, PelF gene ⁇ 9> The method according to ⁇ 8>, in which an increase in the viscosity of the slurry is suppressed.
  • ⁇ 10> The method according to any one of ⁇ 8> or ⁇ 9>, wherein the filamentous fungus is a cellulase-producing filamentous fungus.
  • ⁇ 11> The method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10>, wherein the filamentous fungus is a Trichoderma filamentous fungus.
  • ⁇ 12> The method according to ⁇ 11>, wherein the filamentous fungus is Trichoderma reesei.
  • ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the Aspergillus niger PgaB gene or a gene corresponding to the PgaB gene is any one of the following 1) to 3).
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 2) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having polygalacturonase activity 3) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having polygalacturonase activity ⁇ 14> Aspergillus niger PgaI gene or the PgaI gene The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the gene corresponding to is any one of 4) to 6) below.
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:5 and encoding a protein having polygalacturonase activity9
  • the PelF gene of Aspergillus niger or a gene corresponding to the PelF gene which consists of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and encodes a protein having pectin lyase activity is any one of the following 13) to 15), the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>.
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 14) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 and encoding a protein having pectin lyase activity 15) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and encoding a protein having pectin lyase activity
  • NBRC105649 strain, pectin medium 1% Pectin , from citrus (Wako Pure Chemical), 0.14% ( NH4 ) 2SO4 , 0.2 % KH2PO4 , 0.03% CaCl2.2H2O , 0.03% MgSO4.7H2O , 0.1% Bacto Polypepton , 0.05% Bacto Yeast extract, 0.1% Tween 80, 0.1% Trace element 2, 50 mM tartaric acid buffer (pH 4.0); % are all w/v%) were inoculated.
  • the composition of Trace element 2 is as follows: 6mg H3BO3, 26mg ( NH4 ) 6Mo7O24.4H2O , 100mg FeCl3.6H2O , 40mg CuSO4.5H2O , 8mg MnCl2. - 4H2O , 200mg ZnCl2 , made up to 100mL with distilled water. Shaking culture was performed at 28° C. for 3 days, and the cultured cells were collected using Miracloth (Millipore), frozen in liquid nitrogen, and crushed using a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.).
  • RNA was extracted from the disrupted cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the protocol. Thereafter, the RNA solution was subjected to SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) to synthesize cDNA of Aspergillus niger NBRC105649 strain.
  • a fragment (B) was amplified by PCR using Trichoderma reesei genomic DNA as a template and Fw primer 2 (SEQ ID NO: 14) and Rv primer 2 (SEQ ID NO: 15) shown in Table 1. .
  • the obtained DNA fragments (A) and (B) were processed according to the protocol of In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to construct a plasmid pUCf-xyn2 in which the cbh1 terminator was ligated to the xyn2 gene.
  • Fragment (G) was amplified by PCR using pUCf-xyn2-pyr4rec as a template and Fw primer 7 (SEQ ID NO: 24) and Rv primer 7 (SEQ ID NO: 25) shown in Table 1.
  • Fw primer 8 SEQ ID NO: 26
  • Rv primer 8 SEQ ID NO: 27
  • Fw primer 9 SEQ ID NO: 28
  • Rv primer 9 SEQ ID NO: 28
  • Table 1 29 Fw primer 10 (SEQ ID NO: 30) and Rv primer 10 (SEQ ID NO: 31)
  • Fw primer 11 SEQ ID NO: 32
  • Rv primer 11 SEQ ID NO: 33
  • Fw primer 12 (SEQ ID NO: 34) and Rv primer 12 SEQ ID NO: 35
  • Trichoderma reesei strain E1AB1 (Enzyme and Microbial Technology Volume 82, January 2016, Pages 89-95) was transformed with the vector constructed in (1) above into the uracil-requiring strain. rice field. Introduction was performed by the protoplast PEG method. Transformants were grown in selective medium (2% glucose, 1.1 M sorbitol, 2% agar, 0.2% KH2PO4 (pH 5.5 ) , 0.06% CaCl2.2H2O , 0.06% CsCl 2 , 0.06% MgSO 4 .7H 2 O, 0.5% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Trace element 1; all percentages are w/v%).
  • Trace element 1 is as follows: 0.5g FeSO4.7H2O , 0.2g CoCl2 , 0.16g MnSO4.H2O , 0.14g ZnSO4.7H2O in distilled water. up to 100 mL. After stabilizing the selected transformants by passaging, strains stably retaining the target gene were further screened by colony PCR.
  • the composition of Trace element 2 is as follows: 6 mg H3BO3, 26 mg ( NH4 ) 6 Mo7O24.4H2O , 100 mg FeCl3.6H2O , 40 mg CuSO4.5H2O , 8 mg MnCl2.4H. 2 O, 200 mg ZnCl 2 made up to 100 mL with distilled water. Each culture supernatant was obtained by performing filter filtration after centrifuging the obtained culture. The obtained culture supernatant was used for the study as a saccharification enzyme solution.
  • Example 2 Saccharification of biomass (1) The protein concentration of the saccharifying enzyme solution was quantified by the Bradford method. A Quick Start protein assay (BioRad) based on the Bradford method was used to calculate the protein concentration of the supernatant based on a calibration curve with bovine gamma globulin as the standard protein.
  • Cassava residue was used as biomass.
  • the dried cassava residue was pulverized by 100 g each using an absolute mill (ABS-W, manufactured by Osaka Chemical Co., Ltd.) with a speed control of 10 and a pulverization time of 30 seconds.
  • Composition analysis of the cassava residue was performed by Tokai Techno Co., Ltd. and Japan Food Research Laboratories. The compositional analysis results (wt%) were as follows. Glucose 63.1% Xylose 5.2% Arabinose 2.2% Galactose 6.5% Lignin 7.4% Galacturonic acid 7.0% Rhamnose 0.7%
  • a saccharification test was carried out using the saccharifying enzyme solution in which the 6 kinds of pectinase obtained in Example 1 were expressed, and the pulverized cassava residue as a substrate.
  • 40 g-dry of the ground cassava residue was weighed into a 500 mL baffle flask, and ⁇ -amylase (manufactured by Sigma-Aldrich, ⁇ -Amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A) was added to 0.07 mg-protein and milli-Q water to a substrate concentration of It was added so as to be 15 wt%. The flask was then shaken well by hand.
  • the baffle flask was sealed with a cotton stopper, covered with aluminum foil, and autoclaved (LSX-700 manufactured by TOMY) at 90° C. for 2 hours (gelatinization). Then, it was allowed to stand at room temperature until it reached about 60°C, and was shaken at 210 rpm for 1 hour with a shaker (PRXY-30-R-3F manufactured by PRECI) set at 50°C. Thereafter, 2.0 mg-protein of glucoamylase (manufactured by Sigma-Aldrich, Amyloglucosidase from Aspergillus niger) and 8 mg-protein of pectinase-expressing enzyme were added to the cassava residue slurry, and reacted at 50° C. and 200 rpm for 24 hours.
  • glucoamylase manufactured by Sigma-Aldrich, Amyloglucosidase from Aspergillus niger
  • pectinase-expressing enzyme were added to the cassava residue s
  • the slurry viscosity after saccharifying enzyme treatment of the cassava residue was measured using a Brookfield viscometer VISCOMETER TVB-10 (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.) at a rotation speed of 60 rpm, a rotation time of 180 sec, and a temperature of 50. °C, and the viscosity values obtained with the six types of pectinase-expressing enzymes and with the enzymes not expressing pectinase were compared.
  • the viscosity of the enzyme expressing pectinase was generally lower than that of the enzyme not expressing pectinase, and the viscosity of the enzyme co-expressing a heterologous pectinase was the lowest.
  • Pgx1 is exopolygalacturonase, a type of pectinase, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:41, and the Pgx1 gene consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:40.
  • the obtained DNA fragments (A) and (B) were processed according to the protocol of In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to construct a ligated plasmid pD912-PgxC.
  • a fragment (C) was amplified by PCR using Fw primer 15 (SEQ ID NO: 46) and Rv primer 15 (SEQ ID NO: 47) shown in Table 3 using the cDNA of the NBRC105649 strain as a template.
  • the obtained DNA fragments (A) and (C) were treated according to the protocol of the In-Fusion HD Cloning Kit to construct a ligated plasmid pD912-RgxC. Artificially synthesized F.
  • a fragment (D) was amplified by PCR using the oxysporum-derived pgx1 gene as a template and Fw primer 16 (SEQ ID NO: 48) and Rv primer 16 (SEQ ID NO: 49) shown in Table 3.
  • the obtained DNA fragments (A) and (D) were processed according to the protocol of the In-Fusion HD Cloning Kit to construct a ligated plasmid pD912-Pgx1.
  • the amplified fragment (E) was amplified by PCR using the Fw primer 17 (SEQ ID NO: 50) and the Rv primer 18 (SEQ ID NO: 51) shown in Table 3 using cDNA of the NBRC105649 strain as a template.
  • the obtained DNA fragments (A) and (E) were processed according to the protocol of the In-Fusion HD Cloning Kit to construct a ligated plasmid pD912-PgaB.
  • a fragment (D) was amplified by PCR using the Fw primer 18 (SEQ ID NO: 52) and Rv primer 18 (SEQ ID NO: 53) shown in Table 3 using cDNA of the NBRC105649 strain as a template.
  • the resulting DNA fragments (A) and (D) were treated according to the protocol of the In-Fusion HD Cloning Kit to construct a ligated plasmid pD912-PelD.
  • PgxC is exopolygalacturonase, a type of pectinase, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:37, and the PgxC gene consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:36.
  • RgxC is an exorhamnogalacturonan hydrolase, which is a type of pectinase, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:39, and the RgxC gene consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:38.
  • the culture of S. pastoris was carried out as follows. Each transformant was inoculated in BMD 1% medium (0.2 M potassium phosphate (pH 6.0), 13.4 g/L Yeast Nitrogen Base, 0.4 mg/L Biotin, 1.1% glucose) and incubated at 28°C. After culturing with shaking, when the cells have increased to a certain amount, methanol is added to induce expression. Each culture supernatant was obtained by performing filter filtration after centrifuging the material. The obtained culture supernatant was concentrated and used as an enzyme solution for various pectinases (PgxC, RgxC, Pgx1, PgaB, PelD).
  • pectinases PgxC, RgxC, Pgx1, PgaB, PelD.
  • ⁇ Comparative Test Example 1> The cassava residue was weighed to a dry weight of 4 g in a 100 mL baffled Erlenmeyer flask, and ⁇ -amylase (manufactured by Sigma-Aldrich, ⁇ -Amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A) was added to 0.002 mg-protein/g-substrate. , milli-Q water was added so that the substrate concentration was 15 wt %. Thereafter, the baffle flask was thoroughly mixed, sealed with a cotton plug, covered with aluminum foil, and subjected to gelatinization treatment at 90° C. for 2 hours (autoclave, LSX-700 manufactured by TOMY).
  • ⁇ -amylase manufactured by Sigma-Aldrich, ⁇ -Amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A
  • glucoamylase manufactured by Sigma-Aldrich, Amyloglucosidase from Aspergillus niger
  • the saccharifying enzyme obtained by culturing E1AB1 strain according to Example 1 with protein/g-substrate was added so as to give a total of 0.2 mg-protein/g-substrate, and reacted at 50° C. and 200 rpm for 18 hours.
  • the viscosity was measured using a tuning fork vibration viscometer (SV-10H manufactured by A&D Co., Ltd.). The slurry after saccharification did not become liquid, and the viscosity could not be measured.
  • ⁇ Comparative Test Example 2> The same examination as in Test Example 1 was performed, except that 0.14 mg-protein/g-substrate of E1AB1 strain-derived saccharifying enzyme and 0.06 mg-protein/g-substrate of PgxC were added to the substrate after gelatinization treatment. rice field. The slurry after saccharification did not become liquid, and the viscosity could not be measured.
  • ⁇ Comparative Test Example 3> The same examination as in Test Example 1 was performed, except that 0.14 mg-protein/g-substrate of E1AB1 strain-derived saccharifying enzyme and 0.06 mg-protein/g-substrate of RgxC were added to the substrate after gelatinization treatment. rice field. The slurry after saccharification did not become liquid, and the viscosity could not be measured.
  • ⁇ Comparative Test Example 4> The same examination as in Test Example 1 was performed, except that 0.14 mg-protein/g-substrate of E1AB1-derived saccharifying enzyme and 0.06 mg-protein/g-substrate of Pgx1 were added to the substrate after gelatinization treatment. rice field. The slurry after saccharification did not become liquid, and the viscosity could not be measured.
  • ⁇ Reference Test Example 1> The same examination as in Test Example 1 was performed, except that 0.18 mg-protein/g-substrate of E1AB1 strain-derived saccharifying enzyme and 0.02 mg-protein/g-substrate of PgaB were added to the substrate after gelatinization treatment. rice field. The viscosity of the slurry after saccharification was 84 mPa ⁇ s.
  • ⁇ Reference Test Example 2> The same examination as in Test Example 1 was performed except that 0.14 mg-protein/g-substrate of E1AB1 strain-derived saccharifying enzyme and 0.06 mg-protein/g-substrate of PelD were added to the substrate after gelatinization treatment. rice field. The viscosity of the slurry after saccharification was 459 mPa ⁇ s. From the above, it was considered that PgaB, PelD, etc. are effective in reducing the viscosity.

Abstract

バイオマスの糖化処理工程において、ペクチンに起因する高粘度化を抑制する糖化酵素の製造方法を提供する。　下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養することを含む、バイオマス糖化酵素の製造方法。　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子

Description

糖化酵素の製造方法
　本発明は、バイオマス糖化酵素の製造方法に関する。
　エネルギーや素材に用いられる化石資源の枯渇、及び地球温暖化等の環境問題から、化石資源を再生可能な資源へ代替する技術開発が世界中で行われている。その中でも、カーボンニュートラルの観点からセルロース系バイオマスの高度利用が求められており、産業廃棄物の活用が期待されている。
　アフリカ、アジアで生産させるキャッサバは、主にアジアではでんぷんを抽出し、タピオカでんぷんとして利用されている。タピオカでんぷんを抽出した後のキャッサバ残渣は、含水率が７０～９０％であり、乾燥させた後に家畜の飼料として使用されるが、全ての残渣を使用することはできておらず残りは廃棄されている。しかし、キャッサバ残渣には、でんぷん、セルロースが多く含まれ、グルコース量が豊富なバイオマスであることから、糖に変換することで高度利用が期待されている。一方、キャッサバ残渣にはでんぷん、セルロース以外にもペクチンが多く含まれることが知られている。ペクチンは天然の多糖類であり、主に細胞壁に存在する高分子であることから、高粘度となる性質を持つ。
　キャッサバ残渣中のセルロースなどを糖に変換するためには、セルラーゼなどで構成されるバイオマス糖化酵素にて処理する糖化工程が必要となるが、ペクチンによる高粘度化が糖への変換効率に影響を及ぼすことが課題となっている。また、キャッサバ残渣にはでんぷん、セルロース、ペクチンの他にヘミセルロース、リグニンが含まれており、糖化にはアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ等複数の酵素が必要不可欠となる。
　非特許文献１には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼを含む酵素混合物が、キャッサバの根、チップ及びパルプの粘度を低下させることが開示され、また、特許文献１には、セルラーゼ及びペクチナーゼを含む酵素調製物がキャッサバ残留物中の水分含量及び材料粘度を低減し、デンプンの収量を増加できることが開示されている。
　しかしながら、多種の酵素混合物を使用してバイオマスを糖化するには非常にコストがかかることから、大規模でのキャッサバ残渣の糖化の実施にはこれらの技術は実用的ではなく、糖化酵素を安価に製造できる技術が求められている。
　　〔特許文献１〕中国特許出願公開第１０１２８５０５８号明細書
　　〔非特許文献１〕Aphisit Poonsrisawat et al., Process Biochemistry 49(2014)1950-1957
　本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
　１）下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養することを含む、バイオマス糖化酵素の製造方法。
　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子、
　２）下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子、
発明の詳細な説明
　本発明は、バイオマスの糖化処理工程において、ペクチンに起因する高粘度化を抑制する糖化酵素の製造方法を提供することに関する。
　本発明者らは、特定のペクチン分解酵素（ペクチナーゼ）の遺伝子を導入した組み換え糸状菌を培養することにより、ペクチンに起因するバイオマスの高粘度化に対して優れた抑制効果を発揮する糖化酵素を効率よく製造できることを見出した。
　本発明によれば、ペクチン質を含むバイオマスの糖化処理工程におけるスラリーの高粘度化を抑制し、効率的な糖化処理を可能とする糖化酵素を安価に製造することができる。　
（１．定義）
　本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＣＳ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　あるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の例としては、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。
　ここで、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　本発明において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
　本発明において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本発明において、「相当する遺伝子」とは、ある微生物において所定の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に対して、別の微生物において当該酵素と同じまたは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をいう。ある遺伝子と、それに相当する遺伝子が同じヌクレオチド配列を有していてもよく、異なるヌクレオチド配列を有していてもよいが、ある遺伝子とある遺伝子に相当する遺伝子のヌクレオチド配列の同一性は少なくとも９０％であるのが好ましい。
（２．組み換え糸状菌及びその製造）
　本発明の組換え糸状菌は、特定のペクチナーゼの遺伝子が導入された糸状菌である。具体的には、下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した糸状菌である。
　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子
　「ポリガラクツロナーゼ」とは、ペクチン酸を構成するＤ－ガラクツロン酸のα－１，４－グリコシド結合を加水分解する酵素（ＥＣ３．２．１．１５）であり、本発明のポリガラクツロナーゼ遺伝子としては、ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子及びＰｇａＩＩ遺伝子から選ばれる１又は２種以上の遺伝子が挙げられる。
　斯かるポリガラクツロナーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ））、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物（例えば、タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物（例えば、ペニシリウム・ロッケフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ））等に由来するものが好適に挙げられる。
　このうち、アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩ遺伝子に相当する遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩＩ遺伝子に相当する遺伝子等がより好ましい。
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５５９７７５６として登録されている遺伝子である。アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、具体的には以下の１）～３）が挙げられる。
　１）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　２）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　３）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、ポリガラクツロナーゼをコードする他の糸状菌由来の遺伝子であるのが好ましく、例えば、アスペルギルス・アクリータスのｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　２８　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ　ＡＴＣＣ　１６８７２］（アクセッション番号ＸＭ＿０２０２０１８３５）、アスペルギルス・ジャポニクスのｐｕｔａｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅｎｄｏ－ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＢＳ　１１４．５１］（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６７１７７７）、ペニシリウム・ロッケフォーティのＣＡＺｙｍｅ　ｆａｍｉｌｙ　ＧＨ２８［Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ］（アクセッション番号ＸＭ＿０３９０７６６９２）等が該当する。
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５５９６７６８として登録されている遺伝子である。アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩ遺伝子に相当する遺伝子としては、具体的には以下の４）～６）が挙げられる。
　４）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　５）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　６）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子に相当する遺伝子としては、ポリガラクツロナーゼをコードする他の糸状菌由来の遺伝子であるのが好ましく、例えば、アスペルギルス・アクリータスのｐｕｔａｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ　ＩＩ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｉｎｕｓ　ＣＢＳ　１２１０６０］（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６４３８６１）、アスペルギルス・ジャポニクスのｐｕｔａｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ　ＩＩ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＢＳ　１１４．５１］（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６６８０３７）等が該当する。
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５６０２３４３．１として登録されている遺伝子である。アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩＩ遺伝子に相当する遺伝子としては、具体的には以下の７）～９）が挙げられる。
　７）配列番号５示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　８）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　９）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子に相当する遺伝子としては、ポリガラクツロナーゼをコードする他の糸状菌由来の遺伝子であるのが好ましく、例えば、アスペルギルス・アクリータスの　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ　ＡＴＣＣ　１６８７２　ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＡＳＰＡＣＤＲＡＦＴ＿４１６９０）（アクセッション番号ＸＭ＿０２０２００９７７．１）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＢＳ　１１４．５１　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ　ＩＩ（ＢＯ８６ＤＲＡＦＴ＿４３１２９８）（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６７５７６１．１）等が該当する。
　「ペクチンリアーゼ」とは、ペクチンを末端残基のＣ－４、Ｃ－５間に不飽和結合をもつオリゴ糖に変換する反応を触媒する酵素（ＥＣ４．２．２．１０）であり、本発明のペクチンリアーゼ遺伝子としては、ＰｅｌＤ遺伝子及びＰｅｌＦ遺伝子から選ばれる１又は２種以上の遺伝子が挙げられる。
　斯かるペクチンリアーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｄｈｕｅｎｓｉｓ））、ペニシリウム属微生物（例えば、ペニシリウム・ディギタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｏｌｉｔｕｍ））、タラロマイセス属微生物（例えば、タラロマイセス・ルガロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｇｕｌｏｓｕｓ）、タラロマイセス・セルロリティカス）等に由来するものが挙げられる。
　このうち、好ましくは、アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子、がより好ましい。
　上記アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５６０４０３９．１として登録されている遺伝子である。アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の１０）～１２）が挙げられる。
　１０）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　１１）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　１２）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子としては、ペクチンリアーゼをコードする他の糸状菌由来の遺伝子であるのが好ましく、例えば、アスペルギルス・ルチュエンシスのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ　ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＫＡＷ２＿５００５９Ｓ）（アクセッション番号ＸＭ＿０４１６８９８３５．１）、アスペルギルス・ジャポニクスのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＢＳ　１１４．５１　ｐｅｃｔｉｎ　ｌｙａｓｅ　ｐｅｌＤ　（ＢＯ８６ＤＲＡＦＴ＿４０２１８８）（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６７３８３９．１）、ペニシリウム・ディギタータムのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　Ｐｄ０１　ＰＬ１　ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ（アクセッション番号ＪＸ２９８８５３．１）等が該当する。
　上記アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号：ＸＭ＿００１４０１０２４．２として登録されている遺伝子である。アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子又は当該ＰｅｌＦ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の１３）～１５）が挙げられる。
　１３）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　１４）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　１５）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子に相当する遺伝子としては、ペクチンリアーゼをコードする他の糸状菌由来の遺伝子であるのが好ましく、例えば、アスペルギルス・コスタリカエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｏｓｔａｒｉｃａｅｎｓｉｓ）のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｏｓｔａｒｉｃａｅｎｓｉｓ　ＣＢＳ　１１５５７４　ｐｅｃｔｉｎ　ｌｙａｓｅ　Ａ（ＢＯ７９ＤＲＡＦＴ＿２３７６１２）（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６８４７２３．１）、アスペルギルス・ジャポニクスのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＢＳ　１１４．５１　ｐｅｃｔｉｎ　ｌｙａｓｅ　１（ＢＯ８６ＤＲＡＦＴ＿３０６３３５）（ＸＭ＿０２５６６７６９１．１）（アクセッション番号ＸＭ＿０２５６７３８３９．１）、ペニシリウム・グリセオフルバム　（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ）のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ　Ｐｅｃｔｉｎ　ｌｙａｓｅ　ｆｏｌｄ／ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＧＲＩ＿０１０７８０）（アクセッション番号ＸＭ＿０４０７８８７９１．１）等が該当する。
　導入されるペクチナーゼ遺伝子は、上記のポリガラクツロナーゼ遺伝子及びペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方でも良いが、ポリガラクツロナーゼ遺伝子とペクチンリアーゼ遺伝子の両方を導入するのが、バイオマスに対する粘度低下効果の点から好ましい。
　本発明のポリガラクツロナーゼ遺伝子及び／又はペクチンリアーゼ遺伝子を糸状菌に導入する手段としては、例えば、上記のポリヌクレオチドを含有するベクター又はＤＮＡ断片を宿主糸状菌（親株）に導入することが挙げられる。
　ここで、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは発現ベクターであり、好ましくは該ポリヌクレオチドを宿主糸状菌に導入することができ、かつ宿主内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。また、該ベクターは、好ましくは本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　II　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ　１５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片の例としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
　上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主内で、本発明の遺伝子を発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
　好ましくは、上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、ポリガラクツロナーゼ遺伝子及び／又はペクチンリアーゼ遺伝子の上流に作動可能に連結され、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域（いわゆる強制御領域）である。当該強制御領域の例としては、例えば、トリコデルマ・リーセイのｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２プロモーター、ｅｇｌ１プロモーター、ｘｙｎ１プロモーター、ｘｙｎ２プロモーター、ｘｙｎ３プロモーター等が挙げられる。
　強制御領域のさらなる例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子の制御領域等が挙げられる。
　上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチド及び制御領域は、宿主の核に導入されてもよいが、宿主ゲノムに導入されてもよい。あるいは、上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチドを、宿主ゲノムに直接導入して、該ゲノム上の高発現プロモーターと作動可能に連結させてもよい。ポリヌクレオチドをゲノムに導入する手段としては、相同組換え法が挙げられる。
　上記宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
　目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された組み換え糸状菌は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で細胞を培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の糸状菌株に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された糸状菌株を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって組み換え株のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
　以上の手順で、糸状菌株に、本発明のポリガラクツロナーゼ遺伝子及び／又はペクチンリアーゼ遺伝子とが導入された組換え糸状菌を作製することができる。本発明の組換え糸状菌はセルラーゼ及びペクチナーゼ生産能を有している。
　本発明における親株として用いる糸状菌は、バイオマス糖化酵素としてセルラーゼを生産する菌であって、導入するポリガラクツロナーゼ遺伝子又はペクチンリアーゼ遺伝子と異なる属又は種の糸状菌であれば、限定されず、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する糸状菌が挙げられる。具体的には、上記糸状菌としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属等の糸状菌が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ属の糸状菌である。
　前記トリコデルマ属の糸状菌としては、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）及びトリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）等が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ・リーセイであり、より好ましくはトリコデルマ・リーセイＰＣＤ－１０株（ＦＥＲＭ　Ｐ－８１７２）及びトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）である。
　親株である糸状菌は、野生型株であってもよく、当該野生型株から人工的に育種された株でもよく、そのゲノム中のヌクレオチド配列が置換、付加、欠失又は修飾された変異型株（変異体）又は突然変異体であってもよい。
　本発明の組み換え糸状菌の好適な例としては、トリコデルマ・リーセイ　ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やその変異体にアスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子、又はアスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子を導入した組み換え糸状菌、アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子とアスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子を伴に導入した組み換え糸状菌が挙げられ、具体的には、後述する実施例に開示した株を挙げることができる。
　斯くして構築された本発明の組み換え糸状菌株は、菌体内のペクチナーゼの発現が親株と比べて増加していることから、これを用いてセルロース及びペクチンを含有するバイオマスを糖化処理した場合に、ペクチンにより生じるスラリーの高粘度化が親株を用いて糖化した場合に比べて低減される。具体的には、本発明の組み換え糸状菌株を用いてキャッサバ残渣を糖化処理したスラリーの粘度を、親株を用いて糖化処理した場合に比べて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上低下することが可能となる。
　尚、粘度としては、例えば、Ｂ型粘度計で、固形分濃度１０－２０質量％及び５０℃にて測定される粘度が挙げられる。
　したがって、本発明の組み換え糸状菌を用いれば、ペクチン質を多く含むキャッサバ等のバイオマスの糖化処理において、高粘度化を抑制し、糖化効率を高めることができる。　
（３．バイオマス糖化酵素の製造）
　上記の組み換え糸状菌をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養し、培養物中にセルラーゼ及びペクチナーゼを含む酵素を生成、蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することにより、バイオマス糖化酵素を製造することができる。
　ここで、「セルラーゼ誘導物質」としては、セルラーゼ生産性糸状菌のセルラーゼ生産を誘導する物質であれば制限はないが、例えばセルロース；ソホロース；並びにセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース及びセロヘキサオース等のセロオリゴ糖から選ばれる化合物を挙げることができる。
　ここで、セルロースには、グルコースがβ－１，４－グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が包含される。グルコースの重合度は特に限定されない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、又はエステル化等の誘導体が挙げられる。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチン等との複合体であってもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。
　セルラーゼ誘導物質は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。培地中に添加するセルラーゼ誘導物質の量は、本発明の糸状菌がセルラーゼ及びペクチナーゼ産生を誘導できる量であればよく、添加法によっても異なるが、培地に対して、総量で、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、かつ好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下である。また、好ましくは０．１～４０質量％、より好ましくは０．５～３５質量％、より好ましくは１～３０質量％である。
　このうち、一括添加する場合の添加量は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、かつ好ましくは１６質量％以下、より好ましくは１４質量％以下、より好ましくは１２質量％以下である。また、好ましくは０．１～１６質量％、より好ましくは０．５～１４質量％、より好ましくは１～１２質量％である。
　本発明の方法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン等、本発明の糸状菌の増殖並びにセルラーゼ及びペクチナーゼの生産に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
　炭素源としては、本発明の組み換え糸状菌が資化できる炭素源であればいずれでもよく、具体的には、上記したセルラーゼ誘導物質の他、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類等を挙げることができる。これらは単独で、又は複数を組み合わせて使用することができる。炭素源としては、グルコース、フラクトースのような糖質が望ましく、グルコースがより好ましい。その際のグルコースの添加量は、培地に対して、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは２．５質量％以上であり、かつ好ましくは１５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。また、好ましくは０．１～１５質量％、より好ましくは０．５～１０質量％、より好ましくは２．５～５質量％である。また、培地中のセルラーゼ誘導物質とグルコースの量は、質量比で１０：１～１：１であるのが好ましく、４：１～２：１であるのがより好ましい。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源等をあげることができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウム等をあげることができる。
　ビタミンとしては、ビオチンやチアミン等を挙げることができる。さらに必要に応じて本発明の組み換え糸状菌が生育に要求する物質を添加することができる。
　培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３５℃である。
　培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。
　培養終了後、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過や遠心分離等によって固液分離した後、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることによりセルラーゼ及びペクチナーゼを含む糖化酵素を取得できる。なお、分離精製の程度は特に限定されない。培養上清やその粗分離精製物自体をバイオマス糖化酵素として利用することもできる。
　尚、「セルラーゼ」とは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分子内部から切断するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）；セルロースの還元末端又は非還元末端から分解し、セロビオースを遊離するエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ、ＥＣ　３．２．１．９１）及びβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）を包含する。
　また、「ペクチナーゼ」とは、ペクチン質（Ｄ－ガラクチュロン酸のα－１，４結合からなる多糖類）を分解する酵素群の総称であり、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼが包含されるが、本発明の糖化酵素としては、好ましくはポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼである。
（４．バイオマスの糖化）
　本発明の組み換え糸状菌を用いることにより、バイオマスを分解、糖化し、単糖を製造することができるが、斯かる方法は公知の手法を用いて行うことができる。
　すなわち、上述した、本発明の組み換え糸状菌をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤とし、これとバイオマスを水性媒体中に共存させ、撹拌または振とうしながら加温することにより、バイオマスを糖化し、単糖を製造することができる。
　本発明において、バイオマスとしては、セルロース及びペクチン含有物質、例えば、キャッサバ、キャッサバ残渣、コーン、コーンハル、リンゴの残渣、柑橘類の皮等が挙げられ、好ましくはキャッサバ残渣である。
　バイオマスの糖化において、反応液のｐＨ及び温度は、セルラーゼ及びペクチナーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５～９５℃、ｐＨは１～１１の範囲で行われる。
　バイオマスの糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
　本発明はまた、例示的実施形態として以下を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
　＜１＞下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養することを含む、バイオマス糖化酵素の製造方法。
　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子
　＜２＞ポリガラクツロナーゼ遺伝子がアスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子であり、ペクチンリアーゼ遺伝子がアスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子である、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞バイオマスがセルロース及びペクチンを含むバイオマスである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞バイオマスがキャッサバである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜５＞糸状菌がセルラーゼを生産する糸状菌である＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法。
　＜６＞糸状菌がトリコデルマ属糸状菌である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
　＜７＞糸状菌がトリコデルマ・リーセイである、＜６＞に記載の方法。
　＜８＞下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子
　＜９＞スラリーの高粘度化を抑制する、＜８＞に記載の方法。
　＜１０＞糸状菌がセルラーゼを生産する糸状菌である＜８＞又は＜９＞のいずれかに記載の方法。
　＜１１＞糸状菌がトリコデルマ属糸状菌である、＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載の方法。
　＜１２＞糸状菌がトリコデルマ・リーセイである、＜１１＞に記載の方法。
　＜１３＞アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子が、以下の１）～３）のいずれかである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
　１）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　２）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　３）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　＜１４＞アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩ遺伝子に相当する遺伝子が、以下の４）～６）のいずれかである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
　４）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　５）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　６）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　＜１５＞アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子又は当該ＰｇａＩＩ遺伝子に相当する遺伝子が、以下の７）～９）のいずれかである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
　７）配列番号５示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　８）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　９）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　＜１６＞アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子が、以下の１０）～１２）のいずれかである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
　１０）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　１１）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　１２）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　＜１７＞アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子又は当該ＰｅｌＦ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の１３）～１５）のいずれかである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
　１３）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　１４）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　１５）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つペクチンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
＜実施例１　バイオマス糖化酵素の製造＞
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡ合成
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株は、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより購入した。ＮＢＲＣ１０５６４９株を、ペクチン培地（１％　Ｐｅｃｔｉｎ，　ｆｒｏｍ　ｃｉｔｒｕｓ（和光純薬）、０．１４％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％　Ｂａｃｔｏ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．０５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　８０、０．１％　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２、５０ｍＭ　酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）；％はいずれもｗ／ｖ％）に、植菌した。Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下のとおりである：６ｍｇ　Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ　ＺｎＣｌ２を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。２８℃にて３日間振とう培養を行い、培養した菌体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ミリポア）を用いて回収後、液体窒素にて凍結し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。この際、粉砕媒体にはメタルコーンを使用し１７００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。破砕した菌体からはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。その後、ＲＮＡ溶液はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供することで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを合成した。
（２）ＰｇａＩ、ＰｇａII、ＰｇａＢ、ＰｅｌＤ、ＰｅｌＦ発現用ベクターの作製
　ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点にトリコデルマ・リーセイ由来のｘｙｎ２遺伝子の上流から下流までの領域（配列番号１１）を挿入したプラスミドを鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー１（配列番号１２）とＲｖプライマー１（配列番号１３）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。また、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー２（配列番号１４）とＲｖプライマー２（配列番号１５）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、ｘｙｎ２の遺伝子にｃｂｈ１ターミネーターが連結されたプラスミドｐＵＣｆ－ｘｙｎ２を構築した。さらに、このｐＵＣｆ－ｘｙｎ２を鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー３（配列番号１６）とＲｖプライマー３（配列番号１７）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｃ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー４（配列番号１８）とＲｖプライマー４（配列番号１９）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）とを、同様にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣｆ－ｘｙｎ２－ｐｙｒ４を得た。続いて、このｐＵＣｆ－ｘｙｎ２－ｐｙｒ４を鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー５（配列番号２０）とＲｖプライマー５（配列番号２１）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｅ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー６（配列番号２２）とＲｖプライマー６（配列番号２３）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｆ）とを、同様にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣｆ－ｘｙｎ２－ｐｙｒ４ｒｅｃを得た。
　ｐＵＣｆ－ｘｙｎ２－ｐｙｒ４ｒｅｃを鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー７（配列番号２４）とＲｖプライマー７（配列番号２５）を用いてＰＣＲすることで断片（Ｇ）を増幅した。また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー８（配列番号２６）とＲｖプライマー８（配列番号２７）、Ｆｗプライマー９（配列番号２８）とＲｖプライマー９（配列番号２９）、Ｆｗプライマー１０（配列番号３０）とＲｖプライマー１０（配列番号３１）、Ｆｗプライマー１１（配列番号３２）とＲｖプライマー１１（配列番号３３）、Ｆｗプライマー１２（配列番号３４）とＲｖプライマー１２（配列番号３５）を用いてＰＣＲすることで、それぞれ増断片（Ｈ）～（Ｌ）を増幅した。断片（Ｇ）とそれぞれ断片（Ｈ）～断片（Ｌ）を用い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔによって処理することで、それぞれＰｇａＩ、ＰｇａII、ＰｇａＢ、ＰｅｌＤ、ＰｅｌＦの発現用ベクターであるｐＵＣｆ－Ｐｘｙｎ２－ｐｇａＩ－ｐｙｒ４ｒｅｃ、ｐＵＣｆ－Ｐｘｙｎ２－ｐｇａＩＩ－ｐｙｒ４ｒｅｃ、ｐＵＣｆ－Ｐｘｙｎ２－ｐｇａＢ－ｐｙｒ４ｒｅｃ、ｐＵＣｆ－Ｐｘｙｎ２－ｐｅｌＤ－ｐｙｒ４ｒｅｃ、ｐＵＣｆ－Ｐｘｙｎ２－ｐｅｌＦ－ｐｙｒ４ｒｅｃを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）形質転換体の作製
　トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株（Enzyme and Microbial Technology Volume 82, January 2016, Pages 89-95）のウラシル要求性株に対して上記（１）で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法で行った。形質転換体は選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ２、０．０６％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ１；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ１の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ２、０．１６ｇ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。
（４）形質転換体の培養
　アビセル培地（１％ アビセル（シグマアルドリッチ）、０．１４％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ　８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２、５０ｍＭ 酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）；％はいずれもｗ／ｖ％）に、上記（３）で選択した菌株の胞子を２×１０５個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃にて５日間振とう培養を行った。Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下のとおりである：６ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ２を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。得られた培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清は糖化酵素溶液として検討に使用した。
＜実施例２　バイオマスの糖化＞
（１）糖化酵素溶液のタンパク質濃度の定量は、ｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づくＱｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとに上清のタンパク質濃度を計算した。
（２）バイオマスにはキャッサバ残渣を使用した。乾燥させたキャッサバ残渣をアブソルートミル（ＡＢＳ－Ｗ、大阪ケミカル株式会社製）を使用しスピードコントロール１０、粉砕時間３０秒で１００ｇずつ粉砕した。キャッサバ残渣の組成分析は株式会社東海テクノ及び日本食品分析センターで行った。組成分析結果（ｗｔ％）は、下記の通りであった。
　グルコース　６３．１％
　キシロース　５．２％
　アラビノース　２．２％
　ガラクトース　６．５％
　リグニン　７．４％
　ガラクツロン酸　７．０％
　ラムノース　０．７％
（３）実施例１で得られた６種のペクチナーゼを発現させた糖化酵素溶液を用い、粉砕したキャッサバ残渣を基質として糖化試験を実施した。粉砕したキャッサバ残渣を５００ｍＬバッフルフラスコに４０ｇ－ｄｒｙ量りとり、α－アミラーゼ（シグマアルドリッチ社製、α－Ａｍｙｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｔｙｐｅ　ＸＩＩ－Ａ）を０．０７ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎとｍｉｌｌｉ－Ｑ水を基質濃度が１５ｗｔ％となるように加えた。その後、手でフラスコを十分に振盪させた。バッフルフラスコは綿栓で密閉し、アルミホイルを被せて、９０℃、２ｈでオートクレーブ（ＴＯＭＹ社製ＬＳＸ－７００）処理を行った（糊化）。その後、室温で６０℃前後になるまで放置し、５０℃に設定した振盪機（ＰＲＥＣＩ社製ＰＲＸＹ－３０－Ｒ－３Ｆ）で２１０ｒｐｍ、１ｈ振盪した。その後、キャッサバ残渣スラリーに、グルコアミラーゼ（シグマアルドリッチ社製、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）を２．０ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎと、ペクチナーゼ発現酵素を８ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ添加し、５０℃、２００ｒｐｍで２４ｈ反応させた。
（４）スラリー粘度の測定
　キャッサバ残渣を糖化酵素処理した後のスラリー粘度を、Ｂ型粘度計ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ　ＴＶＢ－１０（東機産業株式会社製）を用いて、回転速度　６０ｒｐｍ、回転時間　１８０ｓｅｃ、温度　５０℃の条件にて測定し、ペクチナーゼ発現酵素６種と、ペクチナーゼを発現させていない酵素で、得られた粘度の値をそれぞれ比較した。結果、ペクチナーゼを発現させていない酵素に対し、ペクチナーゼを発現させた酵素では総じて粘度が低下し、異種のペクチナーゼを共発現させた酵素では最も粘度が低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜比較例　ペクチナーゼの調製＞
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡ合成
　Ａ．ｎｉｇｅｒ　ＮＢＲＣ１０５６４９株は、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより購入した。ＮＢＲＣ１０５６４９株を、ペクチン培地（１％　Ｐｅｃｔｉｎ，　ｆｒｏｍ　ｃｉｔｒｕｓ（和光純薬）、０．１４％　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％　ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％　Ｃａｃｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％　Ｂａｃｔｏ　Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ　酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）に植菌した。２８℃にて３日間振とう培養を行い、培養した菌体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ミリポア）を用いて回収後、液体窒素にて凍結し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。この際、粉砕媒体にはメタルコーンを使用し１７００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。破砕した菌体からはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。その後、ＲＮＡ溶液はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供することで、ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを合成した。
（２）Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来ＤＮＡの人工合成
　公開されているＤＮＡ情報をもとに、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のｐｇｘ１遺伝子を人工合成した。
　Ｐｇｘ１はペクチナーゼの一種であるエキソポリガラクチュロナーゼであり、そのアミノ酸配列は配列番号４１で示され、Ｐｇｘ１遺伝子は配列番号４０で示されるヌクレオチド配列からなる。
（３）ＰｇｘＣ、ＲｇｘＣ、Ｐｇｘ１、ＰｇａＢ、ＰｅｌＤ発現用ベクターの作製
　ピキア発現ベクターｐＤ９１２（ＡＴＵＭ社）を鋳型とし、表３に示したＦｗプライマー１３（配列番号４２）とＲｖプライマー１３（配列番号４３）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー１４（配列番号４４）とＲｖプライマー１４（配列番号４５）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＰｇｘＣを構築した。
　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表３に示したＦｗプライマー１５（配列番号４６）とＲｖプライマー１５（配列番号４７）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｃ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｃ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＲｇｘＣを構築した。
　人工合成したＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のｐｇｘ１遺伝子を鋳型として表３に示したＦｗプライマー１６（配列番号４８）とＲｖプライマー１６（配列番号４９）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｄ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｐｇｘ１を構築した。
　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表３に示したＦｗプライマー１７（配列番号５０）とＲｖプライマー１８（配列番号５１）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｅ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｅ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＰｇａＢを構築した。
　ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表３に示したＦｗプライマー１８（配列番号５２）とＲｖプライマー１８（配列番号５３）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｄ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＰｅｌＤを構築した。
　なお、上記ＰｇｘＣはペクチナーゼの一種であるエキソポリガラクチュロナーゼであり、そのアミノ酸配列は配列番号３７で示され、ＰｇｘＣ遺伝子は配列番号３６で示されるヌクレオチド配列からなる。
　また、ＲｇｘＣはペクチナーゼの一種であるエキソラムノガラクチュロナンハイドロラーゼであり、そのアミノ酸配列は配列番号３９で示され、ＲｇｘＣ遺伝子は配列番号３８で示されるヌクレオチド配列からなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（４）形質転換体の作製
　（３）で作製した各目的遺伝子発現ベクターをＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＰＰＳ－９０１０２（ＡＴＵＭ社）に対して、ＡＴＵＭ社のプロトコルに従って形質転換を行った。
（５）形質転換体の培養
　Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養は以下のように行った。ＢＭＤ１％培地（０．２Ｍ　リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１３．４ｇ／Ｌ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ、０．４ｍｇ／Ｌ　Ｂｉｏｔｉｎ、１．１％　グルコース）に各形質転換体を植菌し、２８℃で振とう培養し、菌体が一定量に増えたらメタノールを添加し、発現誘導を行い、３－５日後に得られた各培養物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで酵素発現量を確認した後、各培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清を濃縮し、各種ペクチナーゼ（ＰｇｘＣ、ＲｇｘＣ、Ｐｇｘ１、ＰｇａＢ、ＰｅｌＤ）の酵素液として使用した。
＜比較試験例１＞
　キャッサバ残渣を１００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに乾燥重量として４ｇとなるよう量りとり、α－アミラーゼ（シグマアルドリッチ社製、α－Ａｍｙｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｔｙｐｅ　ＸＩＩ－Ａ）を０．００２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を基質濃度が１５ｗｔ％となるように加えた。その後、バッフルフラスコを十分に混和し、綿栓で封をした上にアルミホイルを被せ、９０℃、２ｈ（オートクレーブ、ＴＯＭＹ社製ＬＳＸ－７００）の糊化処理を行った。その後、５０℃に設定した振盪機（ＰＲＥＣＩ社製ＰＲＸＹ－３０－Ｒ－３Ｆ）にて５０℃になるまで冷却した後、グルコアミラーゼ（シグマアルドリッチ社製、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）を０．０５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で、実施例１に従ってＥ１ＡＢ１株を培養して得られた糖化酵素を計０．２ｍｇ―ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質となるように添加し、５０℃、２００ｒｐｍで１８時間反応させた。その後、音叉振動式粘度計（株式会社エー・アンド・デイ社製ＳＶ－１０Ｈ）を用いて粘度を測定した。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜比較試験例２＞
　糊化処理後の基質に、Ｅ１ＡＢ１株由来糖化酵素を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＰｇｘＣを０．０６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜比較試験例３＞
　糊化処理後の基質に、Ｅ１ＡＢ１株由来糖化酵素を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＲｇｘＣを０．０６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜比較試験例４＞
　糊化処理後の基質に、Ｅ１ＡＢ１株由来糖化酵素を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、Ｐｇｘ１を０．０６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜参考試験例１＞
　糊化処理後の基質に、Ｅ１ＡＢ１株由来糖化酵素を０．１８ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＰｇａＢを０．０２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度は８４ｍＰａ・ｓであった。
＜参考試験例２＞
　糊化処理後の基質に、Ｅ１ＡＢ１株由来糖化酵素を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＰｅｌＤを０．０６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度は４５９ｍＰａ・ｓであった。以上から粘度低減にはＰｇａＢやＰｅｌＤなどが有効であると考えられた。

Claims (9)

  1. 　下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養することを含む、バイオマス糖化酵素の製造方法。
    　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
    　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子
  2. 　ポリガラクツロナーゼ遺伝子がアスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子又は当該ＰｇａＢ遺伝子に相当する遺伝子であり、ペクチンリアーゼ遺伝子がアスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ又は当該ＰｅｌＤ遺伝子に相当する遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  3. 　バイオマスがセルロース及びペクチンを含むバイオマスである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　バイオマスがキャッサバである、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　糸状菌がセルラーゼを生産する糸状菌である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　糸状菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　下記の（ａ）で示される遺伝子群から選択されるポリガラクツロナーゼ遺伝子、及び（ｂ）で示される遺伝子群から選択されるペクチンリアーゼ遺伝子のいずれか一方又は両方を導入した組み換え糸状菌を培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
    　（ａ）ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子
    　（ｂ）ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子
  8. 　スラリーの高粘度化を抑制する、請求項７に記載の方法。
  9. 　糸状菌がセルラーゼを生産する糸状菌である請求項７又は８に記載の方法。 
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57141298A (en) * 1981-02-27 1982-09-01 Agency Of Ind Science & Technol Treatment of starchy raw material
JPH03224489A (ja) * 1989-09-02 1991-10-03 Ciba Geigy Ag 真核生物発現系
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
CN101285058A (zh) 2008-06-11 2008-10-15 吴鹏 木薯渣工业用复合酶制剂
US20110086133A1 (en) * 2008-05-23 2011-04-14 Ab Enzymes Gmbh Use of pectinolytic enzymes for the treatment of fruit and vegetable mash and enzyme sequences therefor
WO2013114962A1 (ja) * 2012-01-30 2013-08-08 サッポロビール株式会社 バイオエタノールの製造方法及び製造システム
CN108004153A (zh) * 2017-12-07 2018-05-08 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用
WO2018099877A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Dsm Ip Assets B.V. Process for preparing soluble fibre

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57141298A (en) * 1981-02-27 1982-09-01 Agency Of Ind Science & Technol Treatment of starchy raw material
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
JPH03224489A (ja) * 1989-09-02 1991-10-03 Ciba Geigy Ag 真核生物発現系
US20110086133A1 (en) * 2008-05-23 2011-04-14 Ab Enzymes Gmbh Use of pectinolytic enzymes for the treatment of fruit and vegetable mash and enzyme sequences therefor
CN101285058A (zh) 2008-06-11 2008-10-15 吴鹏 木薯渣工业用复合酶制剂
WO2013114962A1 (ja) * 2012-01-30 2013-08-08 サッポロビール株式会社 バイオエタノールの製造方法及び製造システム
WO2018099877A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Dsm Ip Assets B.V. Process for preparing soluble fibre
CN108004153A (zh) * 2017-12-07 2018-05-08 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. XM_001401024.2
APHISIT POONSRISAWAT ET AL., PROCESS BIOCHEMISTRY, vol. 49, 2014, pages 1950 - 1957
C. D. SKORY ET AL., MOL GENET GENOMICS, vol. 268, 2002, pages 397 - 406
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "pectin lyase D [Aspergillus luchuensis IFO 4308]", XP093053450, retrieved from NCBI *
GRUBER, F. ET AL., CURR GENET, vol. 18, 1990, pages 447 - 451
J. BALLANCE ET AL., GENE, vol. 36, 1985, pages 321 - 331
M. I. G. RONCERO ET AL., GENE, vol. 84, 1989, pages 335 - 343
MCKENZIE, T. ET AL., PLASMID, vol. 15, no. 2, 1986, pages 93 - 103
SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441
VAN HARTINGSVELDT W ET AL., MOL GEN GENET, vol. 206, 1987, pages 71 - 75

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