CN117999349A - 糖化酶的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在生物质的糖化处理工序中抑制因果胶而引起的高粘度化的糖化酶的制造方法。生物质糖化酶的制造方法包括对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养的工序。(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；(b)PelD基因、PelF基因。

Description

糖化酶的制造方法
技术领域
本发明涉及一种生物质糖化酶的制造方法。
背景技术
由于能源或原材料所使用的化石资源的枯竭以及全球变暖等环境问题，世界上正在进行将化石资源替代成可再生资源的技术开发。其中，从碳中和的观点考虑，要求纤维素系生物质的高度利用，期待产业废弃物的有效应用。
非洲、亚洲所生产的木薯主要在亚洲提取淀粉，以木薯淀粉的形式被利用。提取木薯淀粉后的木薯残渣的含水率为70～90％，干燥后作为家畜的饲料使用，但无法使用全部残渣，剩余部分被废弃。然而，木薯残渣中含有大量淀粉、纤维素，是葡萄糖量丰富的生物质，因此通过转变成糖，期待高度利用。另一方面，已知在木薯残渣中，除了淀粉、纤维素以外，还含有大量果胶。果胶是天然的多糖类，是主要存在于细胞壁的高分子，因此具有成为高粘度的性质。
为了将木薯残渣中的纤维素等转变成糖，需要利用由纤维素酶等构成的生物质糖化酶进行处理的糖化工序，但技术问题在于：因果胶而引起的高粘度化会对转变成糖的效率产生影响。另外，木薯残渣中，除了淀粉、纤维素、果胶以外，还含有半纤维素、木质素，在糖化中，淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等多种酶必不可缺。
在非专利文献1中公开了含有来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物降低木薯的根、片和浆的粘度，另外，在专利文献1中公开了含有纤维素酶和果胶酶的酶制备物降低木薯残留物中的水分含量和材料粘度，能够增加淀粉的产量。
然而，使用多种酶混合物使生物质糖化的成本非常高，因此在大规模的木薯残渣糖化的实施中，这些技术是不实用的，需求能够廉价地制造糖化酶的技术。
〔专利文献1〕中国专利申请公开第101285058号说明书
〔非专利文献1〕Aphisit Poonsrisawat et al.,Process Biochemistry49(2014)1950-1957
发明内容
本发明涉及以下的1)～2)。
1)一种生物质糖化酶的制造方法，其中，包括对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养的工序，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；
(b)PelD基因、PelF基因。
2)一种生物质的糖化方法，其中，对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养，使用所得到的培养物作为生物质糖化剂，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；
(b)PelD基因、PelF基因。
具体实施方式
本发明提供一种在生物质的糖化处理工序中抑制因果胶而引起的高粘度化的糖化酶的制造方法。
本发明的发明人发现，通过对导入有特定的果胶分解酶(果胶酶)的基因的重组丝状菌进行培养，能够高效地制造对因果胶而引起的生物质的高粘度化发挥优异的抑制效果的糖化酶。
根据本发明，能够抑制含有果胶质的生物质的糖化处理工序中的浆料的高粘度化，廉价地制造能够进行有效的糖化处理的糖化酶。
(1.定义)
在本发明中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性根据利普曼-皮尔森(Lipman-Pearson)法(Science，1985，227：1435-1441)进行计算。具体而言，可以使用遗传信息处理软件GENETYCS Ver.12的同源性分析(Search homology)程序，将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析而算出。
在本发明中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、进一步优选99％以上的同一性。
作为与某个氨基酸序列或核苷酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列或核苷酸序列的例子，可以列举缺失、取代、添加或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列；缺失、取代、添加或插入1个或多个核苷酸的核苷酸序列。
其中，“缺失、取代、添加或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、取代、添加或插入1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸的氨基酸序列。另外，“缺失、取代、添加或插入1个或多个核苷酸的核苷酸序列”是指缺失、取代、添加或插入1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步更优选1个以上9个以下的核苷酸的核苷酸序列。在本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加氨基酸或核苷酸。
在本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，“配置在启动子下游的基因”是指在DNA有义链中在启动子的3’侧存在基因，基因的上游是指DNA有义链中的该基因的5’侧的区域。
在本发明中，调控区与基因的“可操作连接”是指将基因和调控区以该基因能够在该调控区的控制下表达的方式连接。基因和调控区的“可操作连接”的方法对于本领域技术人员是众所周知的。
在本发明中，“相当的基因”是指相对于在某种微生物中编码对规定的反应进行催化的酶的基因，在其它微生物中编码对与该酶相同或类似的反应进行催化的酶的基因。某种基因和与其相当的基因可以具有相同的核苷酸序列，也可以具有不同的核苷酸序列，但某种基因和与某种基因相当的基因的核苷酸序列的同一性优选为至少90％。
(2.重组丝状菌及其制造)
本发明的重组丝状菌为导入有特定的果胶酶的基因的丝状菌。具体为导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的丝状菌。
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；
(b)PelD基因、PelF基因。
“多聚半乳糖醛酸酶”为将构成果胶酸的D-半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键水解的酶(EC3.2.1.15)，作为本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因，可以列举选自PgaB基因、PgaI基因和PgaII基因中的1种或2种以上的基因。
这样的多聚半乳糖醛酸酶基因优选来自丝状菌，例如适合列举来自曲霉(Aspergillus)属微生物(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus))、根霉(Rhizopus)属微生物(例如米根霉(Rhizopus oryzae)、戴尔根霉(Rhizopus delemar))、篮状菌(Talaromyces)属微生物(例如解纤维篮状菌(Talaromyces cellulolyticus))、青霉(Penicillium)属微生物(例如娄地青霉(Penicillium roqueforti))等的多聚半乳糖醛酸酶基因。
其中，更优选黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因、PgaI基因或与该PgaI基因相当的基因、PgaII基因或与该PgaII基因相当的基因等。
黑曲霉的PgaB基因是在NCBI的公开数据库中以登录号XM＿025597756登录的基因。作为黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因，具体可以列举以下的1)～3)。
1)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
2)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
3)编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
作为与黑曲霉的PgaB基因相当的基因，优选为来自编码多聚半乳糖醛酸酶的其它丝状菌的基因，例如棘孢曲霉的糖苷水解酶家族28蛋白(glycoside hydrolase family28protein)[Aspergillus aculeatus ATCC16872](登录号XM＿020201835)、日本曲霉的假定的细胞外内切多聚半乳糖醛酸酶(putative extracellular endo-polygalacturonase)[Aspergillus japonicus CBS114.51](登录号XM＿025671777)、娄地青霉的碳水化合物活性酶家族(CAZyme family)GH28[Penicillium roqueforti](登录号XM＿039076692)等适合。
黑曲霉的PgaI基因是在NCBI的公开数据库中以登录号XM＿025596768登录的基因。作为黑曲霉的PgaI基因或与该PgaI基因相当的基因，具体可以列举以下的4)～6)。
4)由序列号3所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
5)由与序列号3所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
6)编码由与序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
作为与黑曲霉的PgaI基因相当的基因，优选为来自编码多聚半乳糖醛酸酶的其它丝状菌的基因，例如棘孢曲霉的假定的内切多聚半乳糖醛酸酶II(putativeendopolygalacturonase II)[Aspergillus aculeatinus CBS121060](登录号XM＿025643861)、日本曲霉的假定的内切多聚半乳糖醛酸酶II(putativeendopolygalacturonase II)[Aspergillus japonicus CBS114.51](登录号XM＿025668037)等适合。
黑曲霉的PgaII基因是在NCBI的公开数据库中以登录号XM＿025602343.1登录的基因。作为黑曲霉的PgaII基因或与该PgaII基因相当的基因，具体可以列举以下的7)～9)。
7)由序列号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
8)由与序列号5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
9)编码由与序列号6所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
作为与黑曲霉的PgaII基因相当的基因，优选为来自编码多聚半乳糖醛酸酶的其它丝状菌的基因，例如棘孢曲霉的Aspergillus aculeatus ATCC 16872未表征的蛋白(uncharacterized protein)(ASPACDRAFT＿41690)(登录号XM＿020200977.1)、Aspergillus japonicus CBS114.51假定的内切多聚半乳糖醛酸酶II(putativeendopolygalacturonase II)(BO86DRAFT＿431298)(登录号XM＿025675761.1)等适合。
“果胶裂合酶”是对将果胶转变成末端残基的C-4、C-5间具有不饱和键的寡醣的反应进行催化的酶(EC4.2.2.10)，作为本发明的果胶裂合酶基因，可以列举选自PelD基因和PelF基因中的1或2种以上的基因。
这样的果胶裂合酶基因优选来自丝状菌，例如可以列举来自曲霉属微生物(例如黑曲霉、日本曲霉、琉球曲霉(Aspergillus ludhuensis))、青霉属微生物(例如指状青霉(Penicillium digitatum)、离生青霉(Penicillium solitum))、篮状菌属微生物(例如微皱篮状菌(Talaromyces rugulosus)、解纤维篮状菌)等的果胶裂合酶基因。
其中，更优选黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因。
上述黑曲霉的PelD基因是在NCBI数据库中以登录号XM＿025604039.1登录的基因。作为黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因，可以列举以下的10)～12)。
10)由序列号7所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
11)由与序列号7所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸；
12)编码由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸。
作为与黑曲霉的PelD基因相当的基因，优选为来自编码果胶裂合酶的其它丝状菌的基因，例如琉球曲霉的Aspergillus luchuensis未表征的蛋白(uncharacterizedprotein)(AKAW2＿50059S)(登录号XM＿041689835.1)、日本曲霉的Aspergillusjaponicus CBS114.51果胶裂合酶pelD(pectin lyase pelD)(BO86DRAFT＿402188)(登录号XM＿025673839.1)、指状青霉的Penicillium digitatum strain Pd01 PL1mRNA，complete cds(登录号JX298853.1)等适合。
上述黑曲霉的PelF基因是在NCBI数据库中以登录号：XM＿001401024.2登录的基因。作为黑曲霉的PelF基因或与该PelF基因相当的基因，可以列举以下的13)～15)。
13)由序列号9所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
14)由与序列号9所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸；
15)编码由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸。
作为与黑曲霉的PelF基因相当的基因，优选为来自编码果胶裂合酶的其它丝状菌的基因，例如哥斯达黎加曲霉(Aspergillus costaricaensis)的Aspergilluscostaricaensis CBS115574果胶裂合酶A(BO79DRAFT＿237612)(登录号XM＿025684723.1)、日本曲霉的Aspergillus japonicus CBS114.51果胶裂合酶1(BO86DRAFT＿306335)(XM＿025667691.1)(登录号XM＿025673839.1)、灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)的Penicillium griseofulvum果胶裂合酶折叠/毒力因子(Pectin lyasefold/virulence factor)(PGRI＿010780)(登录号XM＿040788791.1)等适合。
所导入的果胶酶基因可以为上述的多聚半乳糖醛酸酶基因和果胶裂合酶基因的任一方或双方，从对生物质的粘度降低效果的方面考虑，优选导入多聚半乳糖醛酸酶基因和果胶裂合酶基因的双方。
作为将本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因和/或果胶裂合酶基因导入至丝状菌的方法，例如可以列举将含有上述的多核苷酸的载体或DNA片段导入至宿主丝状菌(亲本株)。
其中，含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体，优选为能够将该多核苷酸导入至宿主丝状菌并且能够在宿主内表达该多核苷酸的表达载体。另外，该载体优选包含本发明的多核苷酸和与其可操作连接的调控区。该载体可以为能够在质粒等染色体外自增殖和复制的载体，或者也可以为掺入染色体内的载体。
作为具体的载体的例子，例如可以列举pBluescript II SK(-)(Stratagene)、pUC18/19、pUC118/119等pUC系载体(Takara Bio)、pET系载体(Takara Bio)、pGEX系载体(GE Healthcare)、pCold系载体(Takara Bio)、pHY300PLK(Takara Bio)、pUB110(Mckenzie，T.et al.，1986，Plasmid 15(2)：93-103)、pBR322(Takara Bio)、pRS403(Stratagene)、pMW218/219(Nippon Gene)、pRI909/910等pRI系载体(Takara Bio)、pBI系载体(Clontech)、IN3系载体(Inplanta Innovations Inc)、pPTR1/2(Takara Bio)、pDJB2(D.J.Ballance et al.，Gene，36，321-331，1985)、pAB4-1(van Hartingsveldt W et al.，Mol Gen Genet，206，71-75，1987)、pLeu4(M.I.G.Roncero et al.，Gene，84，335-343，1989)、pPyr225(C.D.Skory et al.，Mol Genet Genomics，268，397-406，2002)、pFG1(Gruber，F.et al.，Curr Genet，18，447-451，1990)等。
作为含有本发明的多核苷酸的DNA片段的例子，例如可以列举PCR扩增DNA片段和限制酶切断DNA片段。优选该DNA片段可以为包含本发明的多核苷酸和与其可操作连接的调控区的表达盒。
上述载体或DNA片段所含的调控区是在导入了该载体或DNA片段的宿主内用于表达本发明的基因的序列，例如可以列举启动子或终止子等表达调节区、复制开始点等。该调控区的种类可以根据导入载体或DNA片段的宿主细胞的种类适当选择。根据需要，该载体或DNA片段还可以具有抗生物质耐受性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。
优选上述载体或DNA片段所含的调控区与多聚半乳糖醛酸酶基因和/或果胶裂合酶基因的上游可操作连接，是具有结构上表达或高表达下游基因的功能的调控区(所谓的强调控区)。作为该强调控区的例子，例如可以列举里氏木霉的cbh1启动子、cbh2启动子、egl1启动子、xyn1启动子、xyn2启动子、xyn3启动子等。
作为强调控区的其它例子，并不限定于这些，可以列举rRNA操纵子的调控区、编码核糖体蛋白质的基因的调控区等。
上述载体或DNA片段所含的目标多核苷酸和调控区可以导入至宿主的核，也可以导入至宿主基因组。或者，也可以将上述载体或DNA片段所含的目标多核苷酸直接导入至宿主基因组，与该基因组上的高表达启动子可操作连接。作为将多核苷酸导入至基因组的方法，可以列举同源重组法。
载体或DNA片段向上述宿主细胞的导入可以使用一般的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、基因枪法、土壤杆菌法等。
导入有目标载体或DNA片段的重组丝状菌可以利用选择标记进行选择。例如在选择标记为抗生物质耐受性基因的情况下，通过在添加该抗生物质的培养基中培养细胞，能够选择导入有目标载体或DNA片段的转化细胞。另外，例如在选择标记为氨基酸合成相关基因的情况下，可以在对该氨基酸需求性的丝状菌株进行基因导入后，以有无该氨基酸需求性为指标，选择导入有目标载体或DNA片段的丝状菌株。或者，通过利用PCR等考查重组株的DNA序列，也能够确认目标载体或DNA片段的导入。
按照以上的步骤，能够制作在丝状菌株中导入有本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因和/或果胶裂合酶基因的重组丝状菌。本发明的重组丝状菌具有纤维素酶和果胶酶生产能力。
本发明中的作为亲本株使用的丝状菌只要是生产作为生物质糖化酶的纤维素酶的菌，并且是与所导入的多聚半乳糖醛酸酶基因或果胶裂合酶基因不同的属或种的丝状菌，就没有限定，可以列举属于真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的丝状菌。具体而言，作为上述丝状菌，可以列举木霉(Trichoderma)属、曲霉(Aspergillus)属、青霉(Penicillium)属、链孢霉(Neurospora)属、镰刀菌(Fusarium)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、腐质霉(Humicola)属、裸胞壳(Emericella)属、肉座菌(Hypocrea)属、枝顶孢(Acremonium)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、梨囊鞭菌(Piromyces)属、篮状菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳(Thielavia)属等的丝状菌，优选为木霉属的丝状菌。
作为上述木霉属的丝状菌，可以列举里氏木霉、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichodermakoningii)和绿色木霉(Trichoderma viride)等，优选为里氏木霉，更优选为里氏木霉PCD-10株(FERM P-8172)和里氏木霉PC-3-7株(ATCC66589)。
作为亲本株的丝状菌可以为野生型株，也可以为由该野生型株人工育种而成的株，还可以为其基因组中的核苷酸序列被取代、添加、缺失或修饰而成的突变型株(突变体)或突变体。
作为本发明的重组丝状菌的优选例，可以列举在里氏木霉PC-3-7株(ATCC66589)或其突变体中导入有黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因、或者黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因的重组丝状菌、同时导入有黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因和黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因的重组丝状菌，具体可以列举后述的实施例所公开的株。
如此构建的本发明的重组丝状菌株由于菌体内的果胶酶的表达与亲本株相比增加了，因此在使用其对含有纤维素和果胶的生物质进行糖化处理的情况下，与使用亲本株进行糖化的情况相比，能够降低因果胶而产生的浆料的高粘度化。具体而言，与使用亲本株进行糖化处理的情况相比，使用本发明的重组丝状菌株对木薯残渣进行糖化处理，能够将所得到的浆料的粘度降低50％以上、优选60％以上、更优选70％以上。
另外，作为粘度，例如可以列举利用B型粘度计、在固体成分浓度10-20质量％和50℃的条件下进行测定得到的粘度。
因此，使用本发明的重组丝状菌时，在含有大量果胶质的木薯等生物质的糖化处理中，能够抑制高粘度化，提高糖化效率。
(3.生物质糖化酶的制造)
在纤维素酶诱导物质的存在下对上述的重组丝状菌进行培养，使培养物中生成、蓄积含有纤维素酶和果胶酶的酶，从该培养物中采集该酶，由此能够制造生物质糖化酶。
其中，作为“纤维素酶诱导物质”，只要是诱导纤维素酶生产性丝状菌的纤维素酶生产的物质，就没有限制，例如可以列举：纤维素；槐糖；以及选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖等纤维寡醣中的化合物。
其中，纤维素包含葡萄糖通过β-1,4-葡糖苷键聚合而成的聚合物及其衍生物。葡萄糖的聚合度没有特别限定。另外，作为衍生物，可以列举羧甲基化、醛化或酯化等的衍生物。另外，纤维素也可以为作为配糖体的β葡糖苷、作为与木质素和/或半纤维素的复合体的木质纤维素、以及与果胶等的复合体。纤维素可以为结晶性纤维素，也可以为非结晶性纤维素。
纤维素酶诱导物质可以按照一次性(分批法)、分次添加(补料分批法)或连续添加(进料法)等任意的方法添加。向培养基中添加的纤维素酶诱导物质的量只要是本发明的丝状菌能够诱导纤维素酶和果胶酶产生的量即可，因添加方法而不同，相对于培养基，以总量计优选为0.1质量％以上，更优选为0.5质量％以上，更优选为1质量％以上，并且优选为40质量％以下，更优选为35质量％以下，更优选为30质量％以下。另外，优选为0.1～40质量％，更优选为0.5～35质量％，更优选为1～30质量％。
其中，一次性添加时的添加量优选为0.1质量％以上，更优选为0.5质量％以上，更优选为1质量％以上，并且优选为16质量％以下，更优选为14质量％以下，更优选为12质量％以下。另外，优选为0.1～16质量％，更优选为0.5～14质量％，更优选为1～12质量％。
本发明的方法中所使用的培养基只要含有碳源、氮源、无机盐、维生素等本发明的丝状菌的增殖以及纤维素酶和果胶酶的生产所必需的营养素，可以为合成培养基、天然培养基中的任意种。
作为碳源，只要是本发明的重组丝状菌能够利用的碳源即可，具体而言，除了上述的纤维素酶诱导物质以外，还可以列举葡萄糖、果糖这样的糖质、乙醇、甘油这样的醇类、乙酸这样的有机酸类等。这些可以单独使用，或者将多种组合使用。作为碳源，希望是葡萄糖、果糖这样的糖质，更优选葡萄糖。此时的葡萄糖的添加量相对于培养基，优选为0.1质量％以上，更优选为0.5质量％以上，更优选为2.5质量％以上，并且优选为15质量％以下，更优选为10质量％以下，更优选为5质量％以下。另外，优选为0.1～15质量％，更优选为0.5～10质量％，更优选为2.5～5质量％。另外，培养基中的纤维素酶诱导物质和葡萄糖的量以质量比计优选为10:1～1:1，更优选为4:1～2:1。
作为氮源，可以列举氨、硫酸铵等铵盐、胺等氮化合物、蛋白胨、大豆水解物这样的天然氮源等。
作为无机盐，可以列举磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钾等。
作为维生素，可以列举生物素、硫胺素等。根据需要，还可以添加本发明的重组丝状菌生长所要求的物质。
培养优选在振荡培养或通气搅拌培养这样的好气的条件下进行。培养温度优选为10℃以上，更优选为20℃以上，更优选为25℃以上，并且优选为50℃以下，更优选为42℃以下，更优选为35℃以下。另外，优选为10～50℃，更优选为20～42℃，更优选为25～35℃。
培养时的pH为3～9，优选为4～5。培养时间为10小时～10天，优选为2～7天。
培养结束后，回收培养物，根据需要进行利用超声波或加压等的菌体破碎处理，通过过滤和离心分离等进行固液分离后，将超滤、盐析、透析、色谱等适当组合，由此能够获得含有纤维素酶和果胶酶的糖化酶。其中，分离精制的程度没有特别限定。也可以利用培养上清或其粗分离精制物自身作为生物质糖化酶。
另外，“纤维素酶”是分解纤维素的酶的总称，包括：从纤维素的分子内部进行切断的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；从纤维素的还原末端或非还原末端开始分解，释放纤维二糖的外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶、EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。
另外，“果胶酶”是分解果胶质(由D-半乳糖醛酸的α-1,4键构成的多糖类)的酶群的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、果胶酯酶，作为本发明的糖化酶，优选为多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂合酶。
(4.生物质的糖化)
通过使用本发明的重组丝状菌，能够将生物质分解、糖化，制造单糖，这样的方法可以利用公知的方式进行。
即，将上述的对本发明的重组丝状菌在纤维素酶诱导物质的存在下进行培养而得到的培养物作为生物质糖化剂，使其与生物质在水性介质中共存，一边搅拌或振荡一边加温，由此能够使生物质糖化，制造单糖。
在本发明中，作为生物质，可以列举含有纤维素和果胶的物质，例如木薯、木薯残渣、玉米、玉米渣、苹果的残渣、柑橘类的皮等，优选为木薯残渣。
在生物质的糖化中，反应液的pH和温度只要在纤维素酶和果胶酶不失活的范围内即可，通常，在常压下进行反应时，在温度5～95℃、pH 1～11的范围内进行。
生物质的糖化工序可以以间歇式进行，也可以以连续式进行。
作为例示的实施方式，本发明还包括以下的方式。但是，本发明并不限定于这些实施方式。
＜1＞一种生物质糖化酶的制造方法，其中，包括对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养的工序，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；
(b)PelD基因、PelF基因。
＜2＞如＜1＞所述的方法，其中，多聚半乳糖醛酸酶基因为黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因，果胶裂合酶基因为黑曲霉的PelD或与该PelD基因相当的基因。
＜3＞如＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，生物质为含有纤维素和果胶的生物质。
＜4＞如＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，生物质为木薯。
＜5＞如＜1＞～＜4＞中任一项所述的方法，其中，丝状菌为生产纤维素酶的丝状菌。
＜6＞如＜1＞～＜5＞中任一项所述的方法，其中，丝状菌为木霉属丝状菌。
＜7＞如＜6＞所述的方法，其中，丝状菌为里氏木霉。
＜8＞一种生物质的糖化方法，其中，对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养，使用所得到的培养物作为生物质糖化剂，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因；
(b)PelD基因、PelF基因。
＜9＞如＜8＞所述的方法，其中，抑制浆料的高粘度化。
＜10＞如＜8＞或＜9＞中任一项所述的方法，其中，丝状菌为生产纤维素酶的丝状菌。
＜11＞如＜8＞～＜10＞中任一项所述的方法，其中，丝状菌为木霉属丝状菌。
＜12＞如＜11＞所述的方法，其中，丝状菌为里氏木霉。
＜13＞如＜1＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因为以下的1)～3)中的任意种，
1)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
2)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
3)编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
＜14＞如＜1＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，黑曲霉的PgaI基因或与该PgaI基因相当的基因为以下的4)～6)中的任意种，
4)由序列号3所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
5)由与序列号3所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
6)编码由与序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
＜15＞如＜1＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，黑曲霉的PgaII基因或与该PgaII基因相当的基因为以下的7)～9)中的任意种，
7)由序列号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
8)由与序列号5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸；
9)编码由与序列号6所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质的多核苷酸。
＜16＞如＜1＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因为以下的10)～12)中的任意种，
10)由序列号7所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
11)由与序列号7所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸；
12)编码由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸。
＜17＞如＜1＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，作为黑曲霉的PelF基因或与该PelF基因相当的基因，为以下的13)～15)中的任意种，
13)由序列号9所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
14)由与序列号9所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成并且编码具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸；
15)编码由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成并且具有果胶裂合酶活性的蛋白质的多核苷酸。
实施例
＜实施例1生物质糖化酶的制造＞
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)NBRC105649株的cDNA合成
黑曲霉(Aspergillus niger)NBRC105649株由制品评价技术基盘机构Biotechnology Center购入。将NBRC105649株植菌于果胶培养基(1％的果胶(Pectin)、来自柑橘(from citrus)(和光纯药)、0.14％的(NH4)2SO4、0.2％的KH2PO4、0.03％的CaCl2·2H2O、0.03％的MgSO4·7H2O、0.1％的Bacto多价蛋白胨(Polypepton)、0.05％的Bacto酵母提取物(Yeast extract)、0.1％的Tween 80、0.1％的微量元素2(Trace element 2)、50mM的酒石酸缓冲液(pH4.0)；％均为w/v％)。微量元素2(Trace element 2)的组成如下所述：将6mg的H3BO3、26mg的(NH4)6Mo7O24·4H2O、100mg的FeCl3·6H2O、40mg的CuSO4·5H2O、8mg的MnCl2·4H2O、200mg的ZnCl2用蒸馏水定容至100mL。以28℃进行3天振荡培养，使用Miracloth(Millipore)回收培养后的菌体后，用液氮进行冻结，使用多珠振荡器(安井器械)进行破碎。此时，粉碎介质使用金属锥，以1700rpm进行30秒破碎。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)，按照操作规范从破碎后的菌体中提取RNA。之后，RNA溶液供于用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统(SuperScript III First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR)(Thermo Fisher Scientific)，从而合成黑曲霉(Aspergillus niger)NBRC105649株的cDNA。
(2)PgaI、PgaII、PgaB、PelD、PelF表达用载体的制作
在pUC118(Takara Bio)的HincII限制酶切断点插入来自里氏木霉的xyn2基因的上游至下游的区域(序列号11)，以所得到的质粒为模板，使用表1所示的Fw引物1(序列号12)和Rv引物1(序列号13)进行PCR，从而对片段(A)进行扩增。另外，以里氏木霉的基因组DNA为模板，使用表1所示的Fw引物2(序列号14)和Rv引物2(序列号15)进行PCR，从而对扩增得到的片段(B)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(B)按照In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio)的操作规范进行处理，构建使xyn2的基因连接cbh1终止子而成的质粒pUCf-xyn2。然后，对于以该pUCf-xyn2为模板并使用表1所示的Fw引物3(序列号16)和Rv引物3(序列号17)进行PCR而扩增得到的片段(C)、和以里氏木霉的基因组DNA为模板并使用表1所示的Fw引物4(序列号18)和Rv引物4(序列号19)进行PCR而扩增得到的片段(D)，同样利用In-Fusion HD Cloning Kit进行处理，从而得到质粒pUCf-xyn2-pyr4。接着，对于以该pUCf-xyn2-pyr4为模板并使用表1所示的Fw引物5(序列号20)和Rv引物5(序列号21)进行PCR而扩增得到的片段(E)、和以里氏木霉的基因组DNA为模板并使用表1所示的Fw引物6(序列号22)和Rv引物6(序列号23)进行PCR而扩增得到的片段(F)，同样利用In-Fusion HD CloningKit进行处理，从而得到质粒pUCf-xyn2-pyr4rec。
以pUCf-xyn2-pyr4rec为模板，使用表1所示的Fw引物7(序列号24)和Rv引物7(序列号25)进行PCR，从而对片段(G)进行扩增。另外，以黑曲霉(Aspergillus niger)NBRC105649株的cDNA为模板，使用表1所示的Fw引物8(序列号26)和Rv引物8(序列号27)、Fw引物9(序列号28)和Rv引物9(序列号29)、Fw引物10(序列号30)和Rv引物10(序列号31)、Fw引物11(序列号32)和Rv引物11(序列号33)、Fw引物12(序列号34)和Rv引物12(序列号35)进行PCR，从而分别对扩增片段(H)～(L)进行扩增。使用片段(G)和各片段(H)～片段(L)，利用In-Fusion HD Cloning Kit进行处理，从而分别得到作为PgaI、PgaII、PgaB、PelD、PelF的表达用载体的pUCf-Pxyn2-pgaI-pyr4rec、pUCf-Pxyn2-pgaII-pyr4rec、pUCf-Pxyn2-pgaB-pyr4rec、pUCf-Pxyn2-pelD-pyr4rec、pUCf-Pxyn2-pelF-pyr4rec。
[表1]
基因片段扩增用引物
引物名 序列 序列号
Fw引物1 GACAACGTAGCCGAGCTCTTCTTTTGTGATGTGTG 12
Rv引物1 TTTCGCCACGGAGCTTTAGCTGACGGTGATGGAAG 13
Fw引物2 AGCTCCGTGGCGAAAGCCTG 14
Rv引物2 CTCGGCTACGTTGTCATCGT 15
Fw引物3 ATATCTGGTGGATCTCTCTTCTTTTGTGATGTGTG 16
Rv引物3 ACAACGAGAAAAGAACTCGGCTACGTTGTCATCGT 17
Fw引物4 TTCTTTTCTCGTTGTCTCAC 18
Rv引物4 AGATCCACCAGATATGTCAG 19
Fw引物5 TTCTTTTCTCGTTGTCTCAC 20
Rv引物5 CTCGGCTACGTTGTCATCGTCT 21
Fw引物6 GACAACGTAGCCGAGCTCTTCTTTTGTGATGTGTG 22
Rv引物6 ACAACGAGAAAAGAAAATGATACCTACTGATACCG 23
Fw引物7 TAAAGCTCCGTGGCGAAAGC 24
Rv引物7 GTTGATGTCTTCTTGCTTCA 25
Fw引物8 CAAGAAGACATCAACATGCACTCTTACCAGCTTCT 26
Rv引物8 CGCCACGGAGCTTTAGCAAGAAGCACCGGAAGGAA 27
Fw引物9 CAAGAAGACATCAACATGCACTCGTTTGCTTCTCT 28
Rv引物9 CGCCACGGAGCTTTAACAAGAGGCCACCGAAGGGA 29
Fw引物10 CAAGAAGACATCAACATGCATTTCCTCCAGAACGC 30
Rv引物10 CGCCACGGAGCTTTAATCGCTGCAGGAAGCGCCCG 31
Fw引物11 CAAGAAGACATCAACATGAAGTACGCTGCTGCTCT 32
Rv引物11 CGCCACGGAGCTTTACAGGTTACCCTGACCAGCGT 33
Fw引物12 CAAGAAGACATCAACATGAAGTACTCTACTATCTT 34
Rv引物12 CGCCACGGAGCTTTACAGGTTGCCCTGACCGGCGT 35
(3)转化体的制作
对里氏木霉E1AB1株(Enzyme and Microbial Technology Volume82,January2016,Pages 89-95)的尿嘧啶需求性株进行上述(1)中所构建的载体的转化。导入利用原生质体PEG法进行。转化体利用选择培养基(2％的葡萄糖、1.1M的山梨糖醇、2％的琼脂、0.2％的KH2PO4(pH5.5)、0.06％的CaCl2·2H2O、0.06％的CsCl2、0.06％的MgSO4·7H2O、0.5％的(NH4)2SO4、0.1％的微量元素1(Trace element 1)；％均为w/v％)进行选取。微量元素1(Trace element 1)的组成如下所述：将0.5g的FeSO4·7H2O、0.2g CoCl2、0.16g的MnSO4·H2O、0.14g的ZnSO4·7H2O用蒸馏水定容至100mL。通过继代培养使所选取的转化体稳定化后，通过菌落PCR，进一步选择稳定保持有目标基因的菌株。
(4)转化体的培养
在微晶纤维素培养基(1％的微晶纤维素(Sigma-Aldrich)、0.14％的(NH4)2SO4、0.2％的KH2PO4、0.03％的CaCl2·2H2O、0.03％的MgSO4·7H2O、0.1％的Bacto多价蛋白胨(Polypepton)、0.05％的Bacto酵母提取物(Yeast extract)、0.1％的Tween 80、0.1％的微量元素2(Trace element 2)、50mM的酒石酸缓冲液(pH4.0)；％均为w/v％)上进行植菌，使上述(3)中所选择的菌株的胞子成为2×105个/mL，以28℃进行5天振荡培养。微量元素2(Trace element 2)的组成如下所述：将6mg的H3BO3、26mg的(NH4)6Mo7O24·4H2O、100mg的FeCl3·6H2O、40mg的CuSO4·5H2O、8mg的MnCl2·4H2O、200mg的ZnCl2用蒸馏水定容至100mL。对所得到的培养物进行离心分离后，进行过滤器过滤，从而获得各培养上清。所得到的培养上清作为糖化酶溶液用于研究。
＜实施例2生物质的糖化＞
(1)糖化酶溶液的蛋白质浓度的定量利用bradford法进行测定。使用基于bradford法的Quick Start蛋白质分析(BioRad)，以将牛γ球蛋白作为标准蛋白质的校正曲线为基础，计算上清的蛋白质浓度。
(2)生物质使用木薯残渣。对于干燥后的木薯残渣，使用ABSOLUTE MILL(ABS-W、大阪化学株式会社制造)，以速度控制10、粉碎时间30秒对每100g进行粉碎。木薯残渣的组成分析在株式会社东海Techno和日本食品分析中心进行。组成分析结果(wt％)如下所述。
葡萄糖：63.1％
木糖：5.2％
阿拉伯糖：2.2％
半乳糖：6.5％
木质素：7.4％
半乳糖醛酸：7.0％
鼠李糖：0.7％
(3)使用实施例1中所得到的表达6种果胶酶的糖化酶溶液，以粉碎后的木薯残渣为底物，实施糖化试验。量取粉碎后的干燥木薯残渣40g至500mL挡板烧瓶中，添加α-淀粉酶(Sigma-Aldrich公司制造、来自地衣芽孢杆菌的XII-A型α-淀粉酶(α-Amylase fromBacillus licheniformis Type XII-A))0.07mg-protein和milli-Q水，使底物浓度成为15wt％。之后，用手充分振荡烧瓶。用棉塞密闭挡板烧瓶，覆盖铝箔，以90℃、2小时进行高压釜(TOMY公司制造的LSX-700)处理(糊化)。之后，室温下放置至60℃前后，利用设定为50℃的振荡机(PRECI公司制造的PRXY-30-R-3F)，以210rpm振荡1小时。之后，向木薯残渣浆料中添加葡糖淀粉酶(Sigma-Aldrich公司制造、来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶(Amyloglucosidase from Aspergillus niger))2.0mg-protein和果胶酶表达酶8mg-protein，以50℃、200rpm进行24小时反应。
(4)浆料粘度的测定
使用B型粘度计VISCOMETER TVB-10(东机产业株式会社制造)，在转速60rpm、旋转时间180秒、温度50℃的条件下，测定对木薯残渣进行糖化酶处理后的浆料粘度，在6种果胶酶表达酶和不表达果胶酶的酶中，对所得到的粘度值分别进行比较。作为结果，相对于不表达果胶酶的酶，在表达果胶酶的酶中，粘度全部下降了，在共表达异种果胶酶的酶中，粘度下降最多。
[表2]
没有果胶酶 PgaⅠ PgaⅡ PgaB PelD PelF PgaB、PelD
mPa.s 1144.0 445.5 561.0 453.0 403.5 207.0 179.5
＜比较例果胶酶的制备＞
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)NBRC105649株的cDNA合成
黑曲霉(A.niger)NBRC105649株由制品评价技术基盘机构Biotechnology Center购入。将NBRC105649株植菌于果胶培养基(1％的果胶(Pectin)、来自柑橘(from citrus)(和光纯药)、0.14％的(NH4)2SO4、0.2％的KH2PO4、0.03％的CaCl2·2H2O、0.03％的MgSO4·7H2O、0.1％的Bacto蛋白胨(Peptone)、0.05％的Bacto酵母提取物(Yeast extract)、0.1％的微量元素(Trace element)、50mM的酒石酸缓冲液(pH4.0)。以28℃进行3天振荡培养，将所培养的菌体用Miracloth(Millipore)回收后，用液氮进行冻结，使用多珠振荡器(安井器械)进行破碎。此时，粉碎介质使用金属锥，以1700rpm进行30秒破碎。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)，按照操作规范从破碎后的菌体中提取RNA。之后，RNA溶液供于用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统(SuperScript III First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR)(Thermo Fisher Scientific)，从而合成NBRC105649株的cDNA。
(2)来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的DNA的人工合成以已公开的DNA信息为基础，人工合成来自尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的pgx1基因。
Pgx1是作为一种果胶酶的外切多聚半乳糖醛酸酶，其氨基酸序列用序列号41表示，Pgx1基因由序列号40所示的核苷酸序列构成。
(3)PgxC、RgxC、Pgx1、PgaB、PelD表达用载体的制作
以毕赤酵母(Pichia)表达载体pD912(ATUM公司)为模板，使用表3所示的Fw引物13(序列号42)和Rv引物13(序列号43)进行PCR，从而对片段(A)进行扩增。以NBRC105649株的cDNA为模板，使用表1所示的Fw引物14(序列号44)和Rv引物14(序列号45)进行PCR，从而对扩增得到的片段(B)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(B)按照In-Fusion HD CloningKit(Takara Bio)的操作规范进行处理、连接，构建质粒pD912-PgxC。
以NBRC105649株的cDNA为模板，使用表3所示的Fw引物15(序列号46)和Rv引物15(序列号47)进行PCR，从而对扩增得到的片段(C)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(C)按照In-Fusion HD Cloning Kit的操作规范进行处理、连接，构建质粒pD912-RgxC。
以人工合成的来自尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的pgx1基因为模板，使用表3所示的Fw引物16(序列号48)和Rv引物16(序列号49)进行PCR，从而对扩增得到的片段(D)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(D)按照In-Fusion HD Cloning Kit的操作规范进行处理、连接，构建质粒pD912-Pgx1。
以NBRC105649株的cDNA为模板，使用表3所示的Fw引物17(序列号50)和Rv引物18(序列号51)进行PCR，从而对扩增得到的片段(E)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(E)按照In-Fusion HD Cloning Kit的操作规范进行处理、连接，构建质粒pD912-PgaB。
以NBRC105649株的cDNA为模板，使用表3所示的Fw引物18(序列号52)和Rv引物18(序列号53)进行PCR，从而对扩增得到的片段(D)进行扩增。对所得到的DNA片段(A)和(D)按照In-Fusion HD Cloning Kit的操作规范进行处理、连接，构建质粒pD912-PelD。
其中，上述PgxC是作为一种果胶酶的外切多聚半乳糖醛酸酶，其氨基酸序列用序列号37表示，PgxC基因由序列号36所示的核苷酸序列构成。
另外，RgxC是作为一种果胶酶的外切鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶(exo-rhamnogalacturonan hydrolase)，其氨基酸序列用序列号39表示，RgxC基因由序列号38所示的核苷酸序列构成。
[表3]
基因片段扩增用引物
引物名 序列 序列号
Fw引物13 TAAAGGGGCGGCCGCTCAAGAG 42
Rv引物13 AGCTTCGGCCTCTCTTTTCT 43
Fw引物14 AGAGAGGCCGAAGCTGTTCCACACTCCAGCAGAGC 44
Rv引物14 GCGGCCGCCCCTTTATTAATTAGATAATGGGCTGT 45
Fw引物15 AGAGAGGCCGAAGCTGGTAATGTGGAAAACAACCA 46
Rv引物15 GCGGCCGCCCCTTTATCAACACCCACTCAACCCAT 47
Fw引物16 AGAGAGGCCGAAGCTGTGGTTGGTACTTCTTCCCG 48
Rv引物16 GCGGCCGCCCCTTTATTAGCCGTTTGTGGTGTCCC 49
Fw引物17 AGAGAGGCCGAAGCTGCTCCTCTCGAGAAGCGCTC 50
Rv引物17 GCGGCCGCCCCTTTATTAATCGCTGCAGGAAGCGC 51
Fw引物18 AGAGAGGCCGAAGCTGTCGGTGTCTCCGGCACTCC 52
Rv引物18 GCGGCCGCCCCTTTATTACAGGTTACCCTGACCAG 53
(4)转化体的制作
对于毕赤酵母(Pichia pastoris)PPS-90102(ATUM公司)，按照ATUM公司的操作规范对(3)中所制作的各目标基因表达载体进行转化。
(5)转化体的培养
毕赤酵母(P.pastoris)的培养如下所述地进行。在BMD1％培养基(0.2M的磷酸钾(pH6.0)、13.4g/L的酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)、0.4mg/L的生物素(Biotin)、1.1％的葡萄糖)上植菌各转化体，以28℃振荡培养，菌体增加到一定量后，添加甲醇，进行表达诱导，3-5天后，对于所得到的各培养物，利用SDS-PAGE确认酶表达量后，对各培养物进行离心分离后，进行过滤器过滤，从而获得各培养上清。将所得到的培养上清浓缩，作为各种果胶酶(PgxC、RgxC、Pgx1、PgaB、PelD)的酶液使用。
＜比较试验例1＞
量取木薯残渣至100mL容积的带挡板的三角烧瓶，使其以干燥重量计为4g，添加α-淀粉酶(Sigma-Aldrich公司制造、来自地衣芽孢杆菌的XII-A型α-淀粉酶(α-Amylase fromBacillus licheniformis Type XII-A))0.002mg-protein/g-底物、milli-Q水，使底物浓度成为15wt％。之后，对于挡板烧瓶，进行充分混和，用棉塞密封后，覆盖铝箔，以90℃进行2小时(高压釜、TOMY公司制造的LSX-700)的糊化处理。之后，利用设定为50℃的振荡机(PRECI社制PRXY-30-R-3F)冷却至50℃后，以0.05mg-protein/g-底物添加葡糖淀粉酶(Sigma-Aldrich公司制造、来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶(Amyloglucosidase fromAspergillus niger))，以计0.2mg-protein/g-底物添加按照实施例1培养E1AB1株而得到的糖化酶，以50℃、200rpm反应18小时。之后，使用音叉振动式粘度计(株式会社A&D制造的SV-10H)测定粘度。糖化后的浆料不是液体的状态，粘度不可测定。
＜比较试验例2＞
向糊化处理后的底物以0.14mg-protein/g-底物添加来自E1AB1株的糖化酶，以0.06mg-protein/g-底物添加PgxC，除此以外，进行与试验例1相同的研究。糖化后的浆料不是液体的状态，粘度不可测定。
＜比较试验例3＞
向糊化处理后的底物中以0.14mg-protein/g-底物添加来自E1AB1株的糖化酶，以0.06mg-protein/g-底物添加RgxC，除此以外，进行与试验例1相同的研究。糖化后的浆料不是液体的状态，粘度不可测定。
＜比较试验例4＞
向糊化处理后的底物中以0.14mg-protein/g-底物添加来自E1AB1株的糖化酶，以0.06mg-protein/g-底物添加Pgx1，除此以外，进行与试验例1相同的研究。糖化后的浆料不是液体的状态，粘度不可测定。
＜参考试验例1＞
向糊化处理后的底物中以0.18mg-protein/g-底物添加来自E1AB1株的糖化酶，以0.02mg-protein/g-底物添加PgaB，除此以外，进行与试验例1相同的研究。糖化后的浆料的粘度为84mPa·s。
＜参考试验例2＞
向糊化处理后的底物中以0.14mg-protein/g-底物添加来自E1AB1株的糖化酶，以0.06mg-protein/g-底物添加PelD，除此以外，进行与试验例1相同的研究。糖化后的浆料的粘度为459mPa·s。根据以上研究，可以认为在降低粘度方面，PgaB和PelD等是有效的。

Claims (9)

1.一种生物质糖化酶的制造方法，其中，
包括对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养的工序，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因，
(b)PelD基因、PelF基因。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
多聚半乳糖醛酸酶基因为黑曲霉的PgaB基因或与该PgaB基因相当的基因，果胶裂合酶基因为黑曲霉的PelD基因或与该PelD基因相当的基因。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
生物质为含有纤维素和果胶的生物质。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，
生物质为木薯。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
丝状菌为生产纤维素酶的丝状菌。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
丝状菌为里氏木霉。
7.一种生物质的糖化方法，其中，
对导入有选自下述的(a)所示的基因群中的多聚半乳糖醛酸酶基因和选自(b)所示的基因群中的果胶裂合酶基因的任一方或双方的重组丝状菌进行培养，使用所得到的培养物作为生物质糖化剂，
(a)PgaB基因、PgaI基因、PgaII基因，
(b)PelD基因、PelF基因。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
抑制浆料的高粘度化。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，
丝状菌为生产纤维素酶的丝状菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5937953B2 (ja) * 1981-02-27 1984-09-12 工業技術院長 澱粉質原料の処理方法
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
EP0421919A3 (en) * 1989-09-02 1992-04-15 Ciba-Geigy Ag Polygalacturonase encoding fungal expression system
DE102008024778A1 (de) * 2008-05-23 2009-11-26 Ab Enzymes Gmbh Verwendung von pektinolytischen Enzymen zur Behandlung von Obst- und Gemüsemaische und Enzymsequenzen dazu
CN101285058B (zh) 2008-06-11 2010-06-02 吴鹏 木薯渣工业用复合酶制剂
JP5824074B2 (ja) * 2012-01-30 2015-11-25 サッポロビール株式会社 バイオエタノールの製造方法及び製造システム
WO2018099877A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Dsm Ip Assets B.V. Process for preparing soluble fibre
CN108004153B (zh) * 2017-12-07 2021-05-28 潍坊康地恩生物科技有限公司 一株高产果胶裂解酶的里氏木霉菌株及其应用

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