CN110997701A - 具有海藻糖酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特别地源自篮状菌属的具有海藻糖酶活性的多肽。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生这些多肽的方法和使用这些多肽用于生产乙醇的方法。

Description

具有海藻糖酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
序列表的引用
本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及具有海藻糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生这些多肽的方法。本发明还涉及使用本发明的海藻糖酶生产发酵产物的方法。
背景技术
海藻糖是由两个糖单体(葡萄糖)组成的稳定的二糖。海藻糖以多至10％-15％的细胞干重作为对应激的响应积累于酵母中(GrBa等人,(1975)Eur.J.Appl.Microbiol.[欧洲应用生理学杂志]2:29-37)。海藻糖不能被酵母代谢。海藻糖酶将海藻糖切割成两个葡萄糖单元。
将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC.3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(NomenclatureCommittee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”上。两个酶类别均被称作“海藻糖酶”。中性海藻糖的实例包括来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Londesborouh等人,(1984)Characterizationof two trehalases from baker’s yeast[面包酵母两种海藻糖酶的表征]Biochem J[生物化学杂志]219,511-518；洛氏毛霉(Mucor roxii)(Dewerchin等人,(1984),“Trehalaseactivity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxiispores”[洛氏毛霉孢子早期发育过程中的海藻糖酶活性和环状AMP含量],J.Bacteriol.[细菌学杂志],158,575-579)；布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)(Thevelein等人,(1983),“Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilizationduring early germination of Phycomycesblakesleeanusspores”[布拉克须霉孢子早期萌发过程中葡萄糖诱导的海藻糖酶活化和海藻糖动员]J.Gen Microbiol.[通用与应用微生物学杂志]129,719-726)；尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporium)(Amaral等人,(1996),“Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium varLinii”[来自尖孢镰孢菌变种Linii的两个海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol.[加拿大微生物学杂志]41,1057-1062。中性海藻糖酶的实例包括但不限于，来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Parvaeh等人,(1996)“Purification and biochemicalcharacterization of the ATH1gene product,vacuolar acid trehalase fromSaccharomyces cerevisae[来自酿酒酵母液泡型酸性海藻糖酶ATH1基因产物的纯化和生物化学特性]”FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]391,273-278)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Hecker等人,(1973),“Location of trehalase in theascospores of Neurospora:Relation to ascospore dormancy and germination[海藻糖酶在脉孢菌的囊孢子中的位置：与囊孢子休眠和萌发之间的关系]”.J.Bacteriol.[细菌学杂志]115,592-599)；金黄毛壳菌(Chaetomium aureum)(Sumida等人,(1989),“Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum[来自金黄毛壳菌的海藻糖酶的纯化及部分特性]”MS-27.J.Ferment.Bioeng.[发酵和生物工程杂志]67,83-86)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(d’Enfert等人,(1997),“Molecularcharacterization of the Aspergillus nidulanstreA gene encoding an acidtrehalase required for growth on trehalose.[编码在海藻糖上生长所需的酸性海藻糖酶的构巢曲霉treA基因的分子表征]”J.Microbiol.[分子微生物学]24,203-216)；灰腐质霉(Humicolagrisea)(Zimmermann等人,(1990).“Purification and properties of anextracellular conidial trehalase from Humicolagrisea var.thermoidea[来自灰腐质霉高温变种胞外分生孢子海藻糖酶的纯化及特性]”,Biochim.Acta[生物化学与生物物理学报]1036,41-46)；灰腐质霉(Cardello 等人(1994),“Acytosolic trehalase fromthe thermophilhilic fungus Humicolagrisea var.thermoidea”[来自嗜热真菌灰腐质霉高温变种的胞液型海藻糖酶],Microbiology UK[英国微生物学]140,1671-1677；嗜热柱顶孢霉(Scytalidiumthermophilum)(Kadowaki等人,(1996),“Characterization of thetrehalose system from the thermophilic fungus Scytalidiumthermophilum[来自嗜热真菌嗜热柱顶孢霉的海藻糖系统的表征]”Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1291,199-205)；和尖孢镰孢菌(Amaral等人,(1996),“Comparative study of twotrehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii”[来自尖孢镰孢菌变体Linii的两个海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol.[加拿大微生物学杂志]41,1057-1062。
还已知海藻糖酶来自大豆(Aeschbachet等人,(1999),“Purification of thetrehalase GmTRE1from soybean nodules and cloning of its cDNA”[纯化来自大豆根瘤的海藻糖酶GmTRE1并克隆其cDNA],Plant Physiol[植物生理学杂志]119,489-496)。
海藻糖酶也存在于哺乳动物的小肠和肾中。
WO 2009/121058(诺维信公司(Novozymes))涉及使用发酵生物通过将一种或多种海藻糖酶添加入发酵培养基而将源自植物材料的糖发酵成发酵产物(如乙醇)的方法。
WO 2012/027374(并矢公司(Dyadic))披露了来自嗜热毁丝霉的海藻糖酶，其可在酶混合物中使用，该酶混合物用来将木质纤维素生物质降解成可发酵糖。
WO 2013/148993(诺维信公司)披露了通过液化、糖化和发酵含淀粉材料从所述含淀粉材料产生发酵产物(如乙醇)的方法，其中其中糖源生成酶、纤维素水解组合物和海藻糖酶存在于发酵中。披露了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的海藻糖酶。
WO 2015/065978(丹尼斯科美国公司(Danisco US Inc.))披露了在发酵反应中增加从液化物(liquefact)产生乙醇的方法，该方法包括用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化物和在发酵结束时回收所述乙醇和其他发酵产物。
WO 2016/205127(诺维信公司)披露了属于家族37糖苷水解酶(“GH37”)(如由CAZY(参见www.cazy.org)所定义的)来自瘤孢毁丝霉的海藻糖酶，该海藻糖酶具有高热稳定性和宽pH范围。还发现在乙醇方法中当将海藻糖酶添加在发酵中时可获得增加的乙醇产率。
Fujii T.,等人,2014,Taxonomic revision of the cellulose-degradingfungus Acremonium cellulolyticusnomen nudum to Talaromyces based onphylogenetic analysis[基于系统发育分析，将无记述名纤维素降解真菌解纤维素枝顶孢分类为篮状菌属]FEMS Microbiology Letters[FEMS微生物学快报],351:32-41和Uniprot:A0A0B8MYG3披露来自解纤维素篮状菌的海藻糖酶，和Uniprot:A0A1L9RM22披露来自文氏曲霉的海藻糖酶。
作为基因组序列的一部分，来自具疣篮状菌属(Talaromycesverruculosus)的海藻糖酶于2015年在网址www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001305275.1公开；(多肽被鉴定为EFP5BRM8N)。
对于提供适于以增加的产率产生发酵产物如乙醇的方法中使用的酶或酶组合物，仍然存在需要。
发明内容
本发明提供了具有海藻糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。根据本发明的海藻糖酶对蛋白酶降解具有良好的稳定性，并且具有高热稳定性。海藻糖酶优选地获得自篮状菌属的真菌。
因此，本发明涉及具有海藻糖酶活性的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少93％序列同一性或与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性、或与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸编码的多肽；
(c)SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；和
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有海藻糖酶活性。
在另外的方面中，本发明涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。在另一方面，本发明涉及包含本发明的变体的组合物。
本发明还涉及生产发酵产品的方法，该方法包括
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)葡糖淀粉酶；
ii)本发明的海藻糖酶；
iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
仍在另一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；和
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：如权利要求1-7中任一项所述的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。
定义
海藻糖酶：术语“海藻糖酶”意指将海藻糖降解成其单元单糖(即，葡萄糖)的酶。将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC.3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(Nomenclature Committee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”上。海藻糖酶是催化如下反应的酶：
EC 3.2.1.28：
Figure BDA0002336552060000051
EC 3.2.1.93：
Figure BDA0002336552060000052
出于本发明的目的，海藻糖酶活性可根据在“材料与方法”部分中所描述的“海藻糖酶测定”方法测定的。在一个方面，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的海藻糖酶活性。在另一个方面，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的海藻糖酶活性。在一个优选实施例中，本发明的海藻糖酶是家族65糖苷水解酶(“GH65海藻糖酶”)。
在一个实施例中，根据本发明的海藻糖酶(SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23)具有至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少66℃、至少67℃(如至少68℃)的变性温度Td(通过TSA测定测量的)。
在另一个实施例中，根据本发明的海藻糖酶(SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:23)在40℃下与100％的黑曲霉蛋白酶混合物孵育3天后具有残余活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。在一个实施例，催化结构域是SEQ ID NO:21的氨基酸387至769。在另一个实施例，催化结构域是SEQID NO:23的氨基酸384至799。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有海藻糖酶活性。在一方面，片段含有SEQID NO:21的氨基酸387至769。在一方面，片段至少含有SEQ ID NO:23的氨基酸384至799。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改进的变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于热稳定性，其中通过热转移测定(TSA)测量的变性温度(Td)为至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少66℃、至少67℃(如至少68℃)以及对蛋白酶降解(尤其是黑曲霉蛋白酶混合物降解)的稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:21的氨基酸19至1038。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:23的氨基酸21至1089。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有海藻糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:20的核苷酸55至2037和2085至3161。SEQ ID NO:20的核苷酸1至54编码信号肽。在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 22的核苷酸61至1740、和2026至2313、以及2367至3605。SEQ ID NO:22的核苷酸1至60编码信号肽。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。在一个实施例中，一种或多种控制序列与编码本发明多肽的编码序列是异源的(不同来源/物种)。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
亲本或亲本海藻糖酶：术语“亲本”或“亲本海藻糖酶”意指对其作出改变以产生本发明的酶变体的具有海藻糖酶活性的任何多肽。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有海藻糖酶活性的片段。在一方面，子序列至少含有SEQ ID NO:20的核苷酸1159至2037、和2085至2354。在一方面，子序列至少含有SEQ ID NO:22的核苷酸1150至1740、和2026至2313、以及2367至2735。
变体：术语“变体”意指具有海藻糖酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；以及插入意指在占据某一位置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:21的多肽的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的海藻糖酶活性。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:23的多肽的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的海藻糖酶活性。
野生型海藻糖酶：术语“野生型”海藻糖酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的海藻糖酶。
具体实施方式
具有海藻糖酶活性的多肽
在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的多肽，这些多肽具有海藻糖酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少70％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少75％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少80％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少85％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少90％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少95％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的成熟多肽的至少至少100％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的多肽，这些多肽具有海藻糖酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:23的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少70％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少75％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少80％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少85％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少90％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少95％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:23的成熟多肽的至少至少100％的海藻糖酶活性，并且其中通过TSA测量的变性温度为至少60℃。
在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或者是其具有海藻糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:21的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸19至1038或由其组成。
在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或者是其具有海藻糖酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:23的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸21至1089或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有海藻糖酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补体(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆实验指南],第2版,冷泉港,纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有海藻糖酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补体(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆实验指南],第2版,冷泉港,纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。
可使用SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的多肽或其片段来设计核酸探针，以根据本领域已知的方法来从不同属或种的菌株鉴定并克隆编码具有海藻糖酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有海藻糖酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在非常低的至非常高的严格条件下与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:20或22；(ii)SEQ ID NO:20或22的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在另一个实施例中，本发明涉及具有海藻糖酶活性的多肽，该多肽由与SEQ IDNO:20的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸所编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及具有海藻糖酶活性的多肽，该多肽由与SEQ IDNO:22的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸所编码。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:21的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:21的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:23的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:23的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的海藻糖酶活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
具有海藻糖酶活性的多肽的来源
可以从篮状菌属的微生物获得本发明的具有海藻糖酶活性的多肽。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在一方面，该多肽是篮状菌属多肽，例如，从绳状篮状菌(Talaromycesfuniculosus)或从嗜热篮状菌(Talaromycesleycettanus)获得的多肽，如例如CBS 398.68。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。
催化结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:21的氨基酸387至769具有至少至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:21的氨基酸387至769具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包含SEQ ID NO:21的氨基酸387到769；或者是其具有海藻糖酶活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:20的核苷酸1159至2037、和2085至2354或其cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸所编码的催化结构域。
编码该催化结构域的多核苷酸优选地包含SEQ ID NO:20的核苷酸1159至2037、和2085至2354或由其组成。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:21的氨基酸387至769的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:21的氨基酸387至769的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:23的氨基酸384至799具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:23的氨基酸384至799具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包含SEQ ID NO:23的氨基酸384到799或其等位基因变体或由其组成；或者是其具有海藻糖酶活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及由与SEQ ID NO:22的核苷酸1150至1740、和2026至2313、以及2367至2735或其cDNA序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸所编码的催化结构域。
编码该催化结构域的多核苷酸优选地包含SEQ ID NO:22的核苷酸1150至1740、和2026至2313、以及2367至2735或由其组成。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:23的氨基酸384至799的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:23的氨基酸384至799的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽或催化结构域的多核苷酸，如本文所述。在实施例中，编码本发明的多肽或催化结构域的多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由篮状菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。在一个具体实施例中，至少一种控制序列与编码本发明的变体的多核苷酸是异源的(不同来源/物种)。
可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导该多肽的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢菌Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地含有在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选地用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。在一个具体实施例中，重组宿主细胞包含编码本发明的海藻糖酶多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸与宿主细胞是异源的(不同来源/物种)。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是在本发明的多肽重组生产中有用的任何细胞。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母及属于半知菌纲(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据所公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。在一个具体实施例中，通过本发明的重组宿主细胞的发酵产生全培养液配制品。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的具有海藻糖酶活性的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示，该组合物的海藻糖酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶以及葡糖淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶和源自埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)的葡糖淀粉酶(例如,SEQ ID NO:4)。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶和源自粘褶菌属(Gloeophyllum)，如篱边粘褶菌(G.sepiarium)(例如,SEQ ID NO:5)或密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)(例如,SEQ ID NO:6)的葡糖淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶以及源自根毛霉属(Rhizomucor)，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)的菌株，如具有接头(例如，来自黑曲霉)和淀粉结合域(例如，来自黑曲霉)的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体的α-淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物，其中该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。所述蛋白酶可源自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素分解酶组合物以及蛋白酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶(例如源自埃默森篮状菌、篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶)、α-淀粉酶(例如源自微小根毛霉的，特别是具有接头和淀粉结合域(特别是源自黑曲霉)的，特别是具有如下取代的：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:7进行编号))；源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，和蛋白酶(例如源自桔橙嗜热子囊菌或大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus))。
具体涵盖的次要的酶的实例，例如，本文的SEQ ID NO:4中所示的源自埃默森篮状菌的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:4具有例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的葡糖淀粉酶，可见于下文的“酶”一节中。
可以根据本领域已知的方法来制备组合物，并且这些组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域已知的方法将组合物稳定化。
下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
用途
本发明的方法
使用本发明的海藻糖酶从糊化的淀粉材料产生发酵产物
在此方面，本发明涉及从糊化的和/或未糊化的含淀粉材料或纤维素材料产生发酵产物，特别是乙醇。在糖化/水解过程中生成的可发酵糖在通过发酵生物(特别是酵母)的发酵过程中转化为所述的所希望的发酵(产物)，特别是乙醇。
在实施例中，本发明涉及生产发酵产物(特别是乙醇)的方法，该方法包括：
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)葡糖淀粉酶；
ii)本发明的海藻糖酶；
iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
液化步骤(a)
根据本发明的方法,步骤(a)中的液化通过如下进行：将含淀粉材料在起始糊化温度以上的温度(特别是在80℃-90℃的温度)用α-淀粉酶和任选的蛋白酶和其他酶(如葡糖淀粉酶、普鲁兰酶和/或肌醇六磷酸酶)处理。
术语“起始糊化温度”意指含淀粉材料糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用Gorinstein和Lii，1992，Starch/
Figure BDA0002336552060000321
[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。
根据本发明，步骤(a)中的液化典型地在从70℃-100℃范围的温度进行。在实施例中，液化中的温度为75℃-95℃，如在75℃-90℃，优选80℃-90℃，如82℃-88℃，如约85℃。
液化中的pH可在3-7，优选4-6，或更优选4.5-5.5范围。
根据本发明，在步骤(a)中的液化之前，可进行喷射蒸煮(jet-cooking)步骤。该喷射蒸煮可在110℃-145℃，优选120℃-140℃，如125℃-135℃，优选约130℃的温度进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是大约5分钟。
在实施例中，本发明的方法在液化步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过干磨进行；
z)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
根据本发明,液化中的干固体含量(DS)在20-55wt.-％，优选25-45wt.-％，更优选30-40wt.-％或30-45wt-％的范围。
该含淀粉起始材料(如全谷物)可(例如通过磨制)减少粒度以打开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域中都是众所周知的。根据本发明，优选干磨。
在实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。
步骤(a)中的液化可进行0.5-5小时，如1-3小时，如典型地约2小时。
起初可将α-淀粉酶和其他任选的酶如蛋白酶添加到水性浆料中来开始液化(稀化)。在实施例中，这些酶中仅有一部分(例如，约1/3)被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分(例如，约2/3)在液化步骤(a)中添加。
α-淀粉酶的实例的非穷尽列表可见于下文“液化中存在和/或添加的α-淀粉酶”一节中。在一个优选实施例中，该a-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶典型地是热稳定的。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8中所示的。
在实施例中，液化步骤(a)中使用的α-淀粉酶是本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别是具有I181*+G182*中的双缺失，和任选地具有N193F取代，并被截短以成为长度约491个氨基酸，例如长度为480-495个氨基酸。
合适的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可见于下文“热稳定的α-淀粉酶”一节，并包括来自具有双缺失I181*+G182*，和任选的N193F取代，和另外的以下取代的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
根据本发明的方法，步骤(a)中的液化可使用α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)和蛋白酶(例如，SEQ ID NO:9中所示的激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(pfu蛋白酶))的组合进行。也可以存在葡糖淀粉酶，如本文SEQ IDNO:10中所示源自草酸青霉(Penicillium oxalicum)的(参见下文“液化步骤(a)中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”一节。
糖化与发酵
本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶和任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物可在以下步骤中存在和/或添加：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵(SSF)；任选的在步骤(b)之前的预糖化步骤。
在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶，特别是酸性真菌α-淀粉酶一起添加的。葡糖淀粉酶的实例可见于下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”一节。
当进行顺序的糖化和发酵时，糖化步骤(b)可在本领域中已知的条件下(即，适于酶糖化)进行。例如，糖化步骤(b)可持续多至约24至约72小时。
在实施例中，在步骤(b)中的糖化之前进行预糖化。预糖化在30℃-65℃，典型地约60℃的温度典型地进行40-90分钟。在实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在20℃-75℃，优选40℃-70℃，典型地约60℃的温度和在4-5的pH、一般在约pH 4.5进行。
同时糖化和发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤(b)和发酵步骤(c)。不存在针对糖化的保持阶段，意指发酵生物(特别是酵母)和酶可一起添加。然而，还涵盖分开添加发酵生物和酶。根据本发明，SSF可典型地在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃、优选大约32℃的温度进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其是24至96小时。在实施例中，pH是在4-5之间。
在本发明的一个实施例中，在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)或同时糖化发酵(SSF)或步骤(b)之前的预糖化中存在和/或添加纤维素分解组合物。此类纤维素分解组合物的实例可见于下文“糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解组合物”一节。任选的纤维素分解组合物可与葡糖淀粉酶和本发明的海藻糖酶一起存在和/或添加。蛋白酶的实例可见于下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的蛋白酶”一节。
在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS的量存在和/或添加。
含淀粉材料
根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。通常基于期望的发酵产物(特别是乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，含淀粉材料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还考虑了糯型(waxytype)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是玉米。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是小麦。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是大麦。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是黑麦。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是买罗高粱。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是西米。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是木薯。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是树薯。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是高粱。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是水稻，
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豌豆。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豆类。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是甘薯。
在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是燕麦。
使用本发明的海藻糖酶从未糊化的淀粉材料产生发酵产物
本发明的海藻糖酶可合适地用于生淀粉水解(RSH)方法用于产生所希望的发酵产物，特别是乙醇。在RSH方法中，因为该方法是在低于所述淀粉的起始糊化温度(上文定义的)的温度进行，淀粉不糊化。
在实施例中，所希望发酵产物可为从未糊化的(即未蒸煮的)、优选研磨的谷物(如玉米)或小粒谷物(例如小麦、燕麦、大麦、黑麦、水稻)或谷类(例如高粱)生产的乙醇。合适的含淀粉起始材料的实例在上文“含淀粉材料”一节中列出。
因此，在此方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
(a)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；和
(b)使用发酵生物进行发酵；和
(c)任选地回收所述发酵产物；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：本发明的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、海藻糖酶，和任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶。
在步骤(a)之前，可制备具有含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)、优选25-45wt.％干固体、更优选30-40％干固体的含淀粉材料(如颗粒状淀粉)的水性浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。因为本发明的生淀粉水解方法是在低于该起始糊化温度进行的，而因此不发生显著的粘度增加，如果希望的话，可使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有约1vol.％至约70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是约30vol.％至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。
在实施例中，在步骤(a)之前，将逆流或另一再循环流添加至浆料，或添加至糖化(步骤(a))，或添加至同时糖化和发酵步骤(组合的步骤(a)和步骤(b))。
本发明的RSH方法是在起始糊化温度以下的温度进行的，这意指进行单独的步骤(a)的温度典型地在25℃-75℃、例如30℃-70℃、或45℃-60℃的范围。
在一个优选实施例中，在步骤(b)中的发酵或步骤(a)和(b)中的同时糖化和发酵期间的温度为25℃-40℃、优选28℃-36℃、如在28℃-35℃、如28℃-34℃、如约32℃。
在本发明的一个实施例中，发酵进行30至150小时，优选48至96小时。66.
在实施例中，进行发酵使得糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如6wt.-％以下、如约3wt.-％以下、如约2wt.-％以下、如约1wt.-％以下、如约0.5％以下、或0.25％wt.-％以下、如约0.1wt.-％以下。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物可实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持在低于约0.5wt.-％，例如低于约0.2wt.-％。
本发明的方法可以在从3与7之间、优选从3至6、或更优选从3.5至5.0的pH下进行。
术语“颗粒状淀粉”意思指未蒸煮的生淀粉，即，例如在谷类、块茎或谷物中发现的呈其天然形式的淀粉。淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可吸收少量的液体并膨胀。在高至约50℃至75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度下，开始称为“糊化”的不可逆膨胀。颗粒状淀粉可为高度精制的淀粉，优选至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可为含更粗制的淀粉的材料，其包括(例如，磨制的)全谷物，所述全谷物包含非淀粉级分，例如胚残余物和纤维。
该原材料(如全谷物)可例如通过磨制减小粒度，以打开结构并且允许进一步加工。合适的粒度的实例在US 4514496和WO 2004/081193(两篇文件通过引用由此并入)中披露。根据本发明，两种方法是优选的：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨给出胚与粗粉(淀粉颗粒和蛋白)的良好分离，并且常常应用于使用淀粉水解产物生产例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨两者都是淀粉加工领域中熟知的。
在实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在一个优选实施例中，通过减小含淀粉材料的粒度(优选通过磨制)使得至少50％的含淀粉材料具有0.1-0.5mm的粒度，来制备含淀粉材料。
在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS的量存在和/或添加。
根据本发明，添加酶使得葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/g DS、优选0.01至5AGU/gDS、尤其是0.1至0.5AGU/g DS的量存在。
根据本发明，添加酶使得α-淀粉酶以0.001至10AFAU/g DS，优选地从0.01至5AFAU/g DS，尤其是0.3至2AFAU/g DS或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量存在或添加。
根据本发明，添加酶使得纤维素分解酶组合物以1-10,000微克EP/g DS，如2-5,000，如3和1,000，如4和500微克EP/g DS的量存在或添加。
根据本发明，添加酶使得纤维素分解酶组合物以0.1-100FPU/克总固体(TS)、优选0.5-50FPU/克TS、尤其是1-20FPU/克TS的量存在或添加。
在本发明的一个实施例中，添加酶使得蛋白酶以0.0001-1mg酶蛋白/gDS，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS的量存在。可替代地，将蛋白酶以0.0001至1LAPU/g DS，优选0.001至0.1LAPU/g DS和/或0.0001至1mAU-RH/gDS，优选0.001至0.1mAU-RH/g DS的量存在和/或添加。
在本发明的一个实施例中，添加酶使得蛋白酶以1-1,000μg EP/g DS，如2-500μgEP/g DS，如3-250μg EP/g DS范围的量存在或添加。
在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶之间的比率为99:1与1:2之间，如98:2与1:1之间，如在97:3与2:1之间，如在96:4与3:1之间，如97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、90:10、85:15、83:17或65:35(mg EP葡糖淀粉酶:mg EPα-淀粉酶)。
在一个优选实施例中，根据本发明，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的总剂量是从10-1,000μg/g DS，例如从50-500μg/g DS，例如75-250μg/g DS。
在一个优选实施例中，添加的纤维素分解酶组合物的总剂量是从10-500μg/g DS，例如从20-400μg/g DS，例如20-300μg/g DS。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶(如源自瓣环栓菌(Trametescingulata)的葡糖淀粉酶)与SEQ ID NO:11的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶(如源自血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)的葡糖淀粉酶)与SEQ ID NO:12的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的α-淀粉酶与SEQ ID NO:7的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在一个优选实施例中，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，这些方法包括：
(a)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；和
(b)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：
i)葡糖淀粉酶；
ii)α-淀粉酶；
iii)本发明的海藻糖酶；
iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶。
在一个优选实施例中，可以作为本发明的酶组合物来添加酶。在一个优选实施例中，同时进行步骤(a)和步骤(b)(即，一步发酵)。然而，也可以顺序地进行步骤(a)和(b)。
发酵
在发酵培养基中进行发酵。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
用于基于淀粉的发酵的发酵生物
术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其合适的发酵生物能够使糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即，转化)成所希望的发酵产物(如特别是乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，如特别是酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。在一个具体实施例中，酿酒酵母表达本发明的海藻糖酶。
在发酵(如SSF)期间，有活力的发酵生物的合适的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从105至1012，优选从107至1010的范围内，尤其是约5x107个。
可商购的酵母的实例包括例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERTSTRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。
回收
在发酵(例如，SSF)后，可将发酵产物(特别是乙醇)从发酵培养基中分离。可蒸馏该浆料以回收/提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。可替代地，可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。还可通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物(即，乙醇)。
液化中存在和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，α-淀粉酶，任选地与其他酶如蛋白酶、葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起，在液化中存在和/或添加。
在液化步骤(a)中添加的α-淀粉酶可为任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度通常是稳定的。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属菌种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用由此并入)。在实施例中，该α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQID NO:8所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在优选实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为截短的，因此它具有约491个氨基酸，例如，使得它长度为480-495个之间氨基酸，因而它缺乏功能性淀粉结合结构域(相较于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8)。
该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文件都通过引用由此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用由此并入)并包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体，这些变体在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用由此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:8所述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文件通过引用由此并入)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的S239、或WO 99/19467中的SEQID NO:3或本文的SEQ ID NO:8的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体的位置处具有取代。
在实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。
在实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。
在实施例中，细菌α-淀粉酶可为截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的，例如，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长，或者因此其缺乏功能性淀粉结合结构域。
细菌杂合α-淀粉酶
该细菌α-淀粉酶也可为杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人(2002),The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],277卷,29期,7月19日发表,267501-26507页中，称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQID NO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
热稳定的α-淀粉酶
α-淀粉酶可为热稳定的α-淀粉酶，如热稳定的细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。
在本发明的一个实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如WO 99/019467中作为SEQ ID NO:3(本文的SEQ IDNO:8)披露的嗜热脂肪芽孢杆菌，其在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有以下突变列表中的突变。
在优选实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变：
Figure BDA0002336552060000431
Figure BDA0002336552060000441
关于上面的α-淀粉酶变体的热稳定性的具体信息可见于WO 12/088303(诺维信公司)，其通过引用由此并入。
在一个优选实施例中，α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，这些变体具有I181+G182中的双缺失，和任选的N193F中的取代，以及选自以下列表的取代：
-E129V+K177L+R179E；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可为这样使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地为约491个氨基酸长，如480至-495个氨基酸长，或使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
在一个优选实施例中，该α-淀粉酶变体可为与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:8所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％同一性程度的酶。
在实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或其变体，以在0.01-10KNU-A/g Ds之间，例如，0.02-5KNU-A/g Ds，如0.03和3KNU-A，优选0.04和2KNU-A/g Ds，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS之间的浓度剂量添加至液化。在实施例中，将细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体，以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS、例如0.0005-0.5mg EP/gDS、如0.001-0.1mg EP/g DS之间的浓度投加到液化中。
液化中存在和/或添加的蛋白酶
根据本发明，蛋白酶可任选地与α-淀粉酶、和任选的葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起存在和/或添加至液化。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在一个优选实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。
对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。
该蛋白酶可为，例如，野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶是热稳定的。在一个优选实施例中，该热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，尤其是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)。
在实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文作为SEQ ID NO:13所示的，进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
关于上述的蛋白酶变体的热稳定性的具体信息可见于WO 12/088303(诺维信公司)，其通过引用由此并入。
在一个优选实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文的SEQ ID NO:13中所示的，进一步具有选自以下列表的突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:13具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。
该热稳定性蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。
在实施例中，该热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如激烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(Takara ShuzoCompany))中的SEQ ID NO:1、或本文的SEQ ID NO:9所示的一种。
在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:22中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:9具有至少80％同一性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。
液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶
根据本发明，葡糖淀粉酶可任选地存在和/或添加到液化步骤(a)中。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和任选的蛋白酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起添加或与其分开添加。
在一个具体且优选的实施例中，该葡糖淀粉酶，优选真菌来源的，优选丝状真菌，来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉的菌株，特别是WO 2011/127802(其通过引用由此并入)中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在实施例中，该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:10具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10中所示的成熟序列进行编号)。如WO 2013/036526(其通过引用由此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在实施例中，该葡糖淀粉酶源自草酸青霉。
在实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体。在一个优选实施例中，该草酸青霉葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的，在位置79处具有Val(V)(使用本文的SEQ ID NO:23进行编号)。
涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用由此并入)中。
在实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。
在实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。
更具体地，在实施例中，该葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10用于编号)，(PE001变体)，并进一步包括以下取代或取代的组合中的至少一个：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*；
E501V+Y504T；或
T65A+K161S；或
T65A+Q405T；或
T65A+Q327W；或
T65A+Q327F；或
T65A+Q327Y；或
P11F+T65A+Q327F；或
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
P11F+T65A+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+S105P+Q327W；或
T65A+S105P+Q327F；或
T65A+Q327W+S364P；或
T65A+Q327F+S364P；或
T65A+S103N+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+
Y504T；或
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个优选实施例中，该草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10用于编号)，并进一步包括以下突变中的一种：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
该葡糖淀粉酶能以0.1-100微克EP/g，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g DS的量添加。
糖化和/或发酵中存在和/或添加的海藻糖酶
根据本发明的方法，本发明的海藻糖酶在如下步骤过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
在一个优选的实施例中，成熟海藻糖酶披露于SEQ ID NO:21中。在一个优选的实施例中，成熟海藻糖酶披露于SEQ ID NO:23中。在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP(酶蛋白)之间海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS之间，如0.5-10ugEP海藻糖酶/g DS之间的量存在和/或添加。
糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶
在如下步骤过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵；或步骤(b)之前的预糖化步骤，可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自丹麦诺维信公司，(Novozymes，Denmark))；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人.(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.301[生物化学杂志],275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人,(1998),“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticiumrolfsii[来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性]”)Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、嗜热篮状菌(美国专利登记号32,153)、Talaromycesduponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括均披露于WO 2006/069289中的瓣环栓菌(SEQ ID NO:11)、纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)；和大白桩蘑(Leucopaxillusgiganteus)；或WO 2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用由此并入)。
在实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别是如WO2011/066576中所述的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，特别是作为本文的SEQ IDNO:12所示的(对应于WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4)，或来自粘褶菌属(Gloeophyllum)的菌株，如篱边粘褶菌(Gloeophyllumsepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)的菌株，特别是如WO 2011/068803中所述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:5(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是本文的SEQID NO:6(即，WO 2014/177546中作为SEQ ID NO:3披露的密粘褶菌葡糖淀粉酶)(所有参考文件通过引用由此并入)。
还涵盖葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶与上述葡糖淀粉酶中的任一种显示高同一性，即，分别与上述酶序列的成熟部分中的任一个，如本文的SEQ ID NO:4、11、5、6或12中的任一个显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:6的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:12的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。
在实施例中，可将葡糖淀粉酶以1-1,000μg EP/g DS，优选地10-500μg/gDS，尤其是25-250μg/g DS的量添加至糖化和/或发酵中。
在实施例中，该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性。
在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含WO 99/28448中作为SEQ IDNO:34或本文的SEQ ID NO:4披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中作为SEQID NO:2和/或本文的SEQ ID NO:11披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文的SEQ ID NO:4中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、本文中作为SEQ ID NO:11披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及WO2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:7披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文中作为SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及本文中作为SEQ ID NO:7披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有以下取代：G128D+D143N。
在实施例中，该α-淀粉酶可为源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO2013/006756中的SEQ ID NO:3中所示的，或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌的菌株。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:7披露的。
在实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一种：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO2013/006756中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:7进行编号)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:5)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含WO 2011/068803中作为SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及WO 2013/006756中的SEQID NO:3和本文的SEQ ID NO:7披露的、具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉，具有以下取代：G128D+D143N。
包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL、SPIRIZYME ACHIEVETM、和AMGTME(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自杜邦-丹尼斯科公司(DuPont-Danisco))；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自杜邦-丹尼斯科公司)。
糖化和/或发酵中存在和/或添加的纤维素分解酶组合物
根据本发明，纤维素分解酶组合物可存在于糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中。
该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
合适的纤维素分解组合物的实例可见于WO 2008/151079和WO 2013/028928中，其通过引用由此并入。
在优选的实施例中，纤维素分解酶组合物源自木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。
在实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)。
在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属菌株的β-葡糖苷酶，该曲霉属菌株如米曲霉(如WO 2002/095014中披露的或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(特别是WO 2008/057637中的SEQ ID NO:73和74中分别所示的米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白，或WO 2008/057637中的SEQ ID NO:75和76中分别所示的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白-两者均通过引用由此并入))、或者烟曲霉(如WO 2005/047499中或本文的SEQ ID NO:14中披露的或WO 2012/044915(诺维信公司)中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体)，如具有如下取代中的一个或多个(如所有)的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源自青霉属(Penicillium)的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属，如桔橙嗜热子囊菌的菌株，如WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15所述的；或源自梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述的多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的多肽。
在实施例中，该纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的，如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:17中披露的Cel7a CBH I，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在实施例中，该纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株作为本文的SEQ ID NO:18披露的；或源自木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。
在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。
在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I、以及CBH II。
在实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:15)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:15)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:14)。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:14)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文的SEQ ID NO:14用于编号)。
在一个优选实施例中，该纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同系物。
在一个优选实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，其包含源自埃默森青霉的菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:14)具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(WO 2012/044915中披露的)；WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:6或本文中作为SEQ ID NO:6披露的烟曲霉Cel7ACBH I以及WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:17或本文中作为SEQ ID NO:18披露的烟曲霉Cel7ACBH II。
在实施例中，该纤维素分解组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/gDS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/gDS剂量添加。
糖化和/或发酵中存在和/或添加的蛋白酶
可将任何合适的蛋白酶添加至糖化和/或发酵，如SSF中。
在一个优选实施例中，蛋白酶是金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。在实施例中，酶组合物包含金属蛋白酶，优选源自嗜热子嚢菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株(尤其是桔橙嗜热子囊菌CGMCC编号0670)，如作为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文的SEQ ID NO:13的成熟多肽披露的金属蛋白酶。
在实施例中，蛋白酶与本文的SEQ ID NO:13的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％同一性。
在实施例中，蛋白酶源自火球菌属的菌株，例如激烈火球菌的菌株，如US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:9中所示的蛋白酶。
在实施例中，蛋白酶是WO 2014/037438(通过引用由此并入)的实例2中涉及的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3(肽酶家族S53蛋白酶)的成熟序列。在实施例中，蛋白酶是来自亚灰树花菌属，特别是大型亚灰树花菌的菌株的、WO 2014/037438(通过引用由此并入)中作为SEQ ID NO:5和本文的SEQ ID NO:19所示的成熟蛋白酶3序列。
在实施例中，该蛋白酶与本文的SEQ ID NO:19作为氨基酸1-547所示的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如100％同一性。
糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶
任何合适的α-淀粉酶，如真菌酸性α-淀粉酶，可存在和/或添加至糖化和/或发酵中。
在一个实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，特别是与SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但100％同一性。在一个优选实施例中，α-淀粉酶具有一种或多种以下取代：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。
使用本发明的海藻糖酶从纤维素材料产生发酵产物的方法
在实施例中，本发明涉及从预处理的纤维素材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；
(b)使用发酵生物进行发酵；以及
(c)任选地回收该发酵产物，
其中本发明的海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。
根据本发明的方法，水解和发酵可分别或同时进行。在实施例中，本发明的方法作为以下进行：分开的水解和发酵(SHF)；同时的糖化和发酵(SSF)；同时的糖化和共发酵(SSCF)；混合的水解和发酵(HHF)；分离的水解和共发酵(SHCF)；混合的水解和共发酵(HHCF)；或直接的微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶促水解和糖变为乙醇的发酵被组合在一个步骤中。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan J.和Himmel M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on theU.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol[酶、能源和环境：美国能源部对生物乙醇的研究和发展活动的战略角度],Biotechnol.Prog.[生物技术进展]15:817-827)。HHF涉及分离的水解步骤并且另外涉及同时的糖化和水解步骤，其可在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可在不同的温度进行，即高温酶水解，然后是在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物以产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶。
根据本发明，所述纤维素材料是植物材料碎片(chip)，植物茎段(stem segment)和/或整个植物茎。在实施例中，所述纤维素材料选自下组：芦竹、甘蔗渣、竹、玉米穗轴、玉米纤维、玉米秸秆、芒属(miscanthus)、橙皮、稻秆、柳枝稷(switchgrass)、麦秆。在一个优选实施例中，纤维素材料的来源是玉米秸秆、玉米穗轴和/或麦秆。
根据本发明，可使用任何预处理。在一个优选实施例中，使用化学预处理、物理预处理或者化学和物理预处理。在一个优选实施例中，用酸预处理该纤维素材料，如稀酸预处理。在实施例中，所述纤维素材料通过在高温、高压下用酸预处理纤维素材料来制备。
在实施例中，水解在20℃-70℃，如30℃-60℃，优选45℃-55℃的温度，在范围4-6，如4.5-5.5的pH进行。
在实施例中，所述纤维素材料在水解过程中以1-20(w/w)％的TS，如2-10(w/w)％TS(总固形物)，如约5(w/w)％TS存在。
在实施例中，水解进行1-20日，优选5-15日之间。
在实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、或卢克诺文思金孢子菌。
纤维素分解酶组合物：术语“纤维素分解酶组合物”意指水解纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人,Outlook for cellulase improvement:Screening andselection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略],2006,BiotechnologyAdvances[生物技术进展]24:452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定法是将Whatman№1滤纸用作底物的滤纸测定法。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulaseactivities[纤维素酶活性的测量],Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过
Figure BDA0002336552060000621
HPX-87H柱(美国加州赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行糖分析。
此类组合物的实例可见于上文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的纤维素分解酶组合物”一节中。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素材料的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如具有一系列取代基以复杂支链结构的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材(wood)中。纤维素材料可为，但不限于：农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等人，1995，于Handbookon Bioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑),第105-118页,Taylor和Francis,华盛顿；Wyman,1994,Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics[木质纤维素生物转化的最新进展]，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]，T.Scheper主编,第65卷,第23-40页,Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约)。在本文中应理解的是，纤维素可为任何形式的木质纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选方面中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面中，该纤维素材料是木质纤维素，其包含纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一方面中，该纤维素材料是农业残余物。在另一方面中，该纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一方面中，该纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一方面中，该纤维素材料是废纸。在另一方面中，该纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。
在另一方面中，该纤维素材料是芦竹。在另一方面中，该纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面中，该纤维素材料是竹。在另一方面中，该纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面中，该纤维素材料是玉米纤维。在另一方面中，该纤维素材料是玉米秸秆。在另一方面中，该纤维素材料是芒属。在另一方面中，该纤维素材料是橙皮。在另一方面中，该纤维素材料是稻杆。在另一方面中，该纤维素材料是柳枝稷。在另一方面中，该纤维素材料是麦秆。
在另一方面中，该纤维素材料是白杨(aspen)。在另一方面中，该纤维素材料是桉树(eucalyptus)。在另一方面中，该纤维素材料是冷杉(fir)。在另一方面中，该纤维素材料是松树(pine)。在另一个方面中，纤维素材料是杨树(poplar)。在另一个方面中，纤维素材料是云杉(spruce)。在另一方面中，该纤维素材料是柳树。
在另一方面中，该纤维素材料是海藻纤维素。在另一方面中，该纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒(cotton linter)。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一方面中，该纤维素材料是水生生物质。如在此使用，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
纤维素材料可按原样使用或可使用本领域已知的常规方法进行预处理，如本文所述。在优选的方面，对该纤维素材料进行预处理。
β-葡糖苷酶:术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据Venturi等人,2002,Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties[来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性]，J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％
Figure BDA0002336552060000641
20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5、在含有0.01％
Figure BDA0002336552060000642
20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases[结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识],Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？[里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？],Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。根据Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；vanTilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581。在本发明中，Tomme等人的方法可以用于确定纤维二糖水解酶活性。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物黏度的降低或通过还原糖测量所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61的糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指属于根据Henrissat,1991,Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities[基于氨基酸序列的相似之的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases[基于序列的糖基水解酶的分类的更新],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，Shallom和Shoham,2003,Microbial hemicellulases.[微生物半纤维素酶]Current Opinion InMicrobiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:1739-1752在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)和pH(例如5.0或5.5)对半纤维素分解酶活性进行测量。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包括50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)以及pH(例如5.0或5.5)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)相比较。在一个方面中，将在2％-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，重组产生于米曲霉中)或2％-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所描述中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白负载的存在下的
Figure BDA0002336552060000671
1.5L(诺维信公司，Bagsvaerd，丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是在37℃在0.01％
Figure BDA0002336552060000672
X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
用于基于纤维素的发酵的发酵生物
“发酵生物”或“发酵微生物”指适合用于所希望的发酵过程以产生发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可为己糖和/或戊糖发酵生物，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物两者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。由Lin等人,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]69:627-642描述了产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例。
能够发酵己糖类的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母菌属、以及酿酒酵母属的菌株，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、以及酿酒酵母。
可以发酵处于其天然状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，例如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属的菌株，优选休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，优选是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)的菌株。不能发酵戊糖类(如木糖和阿拉伯糖)的生物可通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。
可以将己糖和戊糖有效地发酵为乙醇的细菌的实例包括例如凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、热纤维梭菌、弗陶菲尔门塔斯梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属、嗜热厌氧糖分解菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(菲利普斯(Philippidis)，1996，同上)。
其他发酵生物包括以下的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如萨纳瑞西斯假丝酵母、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candidautilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和植物发酵梭菌；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属，例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)；以及发酵单胞菌属，例如运动发酵单胞菌。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)。在另一个优选方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是布朗克假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是嗜虫假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一个优选方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是耐热克鲁维酵母。在另一个优选方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选方面，细菌是植物发酵梭菌。在另一个更优选方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个优选方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选方面，细菌是运动发酵单胞菌。
可商购的适合乙醇生产的酵母包括例如，BIOFERMTMAFT和XR(North AmericanBioproducts Corporation公司，佐治亚州，美国)、ETHANOL REDTM酵母(ermentis/Lesaffre公司，美国)、FALITM(Fleischmann’s Yeast公司，美国)、FERMIOLTM(DSM Specialties公司)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB公司，瑞典)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology公司，威斯康星州，美国)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经过遗传修饰以提供发酵戊糖类的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆进不同发酵微生物已经构建了能够将己糖和戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae[在酿酒酵母中克隆和改进树干毕赤酵母木糖还原酶基因的表达],Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]39-40:135-147；Ho等人,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose[能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae[酿酒酵母发酵木糖],Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]38:776-783；Walfridsson等人,1995,Xylose-metabolizingSaccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1and TAL1genesencoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase andtransaldolase[过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]61:4184-4190；Kuyper等人,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae forefficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle[用于高效厌氧发酵木糖的酿酒酵母的最小的代谢工程研究：原理的证明],FEMS Yeast Research[FEMS酵母研究]4:655-664；Beall等人,1991,Parametric studies of ethanol production fromxylose and other sugars by recombinant Escherichia coli[通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究],Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]38:296-303；Ingram等人,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production[用于乙醇产生的细菌的代谢工程化],Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]58:204-214；Zhang等人,1995,Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonasmobilis[产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化],Science[科学]267:240-243；Deanda等人,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering[通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62:4465-4470；WO 2003/062430，木糖异构酶)。
在一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中熟知的是，以上所述的生物体还可以用于产生其他物质，如本文所述。
典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且发酵进行约8小时至约96小时，例如，约24小时至约60小时。温度典型地为约26℃至约60℃(例如约32℃或50℃)，并且约pH 3至约pH 8(例如pH 4-5、6、或7)。
在一方面，将酵母和/或另一种微生物施加至降解的纤维素材料并且发酵进行约12至约96小时，如典型地24-60小时。在另一方面，温度优选地为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约105至1012，优选从大约107至1010，特别是大约2×108个活细胞计数的量应用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于，例如，“The AlcoholTextbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编辑，Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]，英国1999),其通过引用由此并入。
对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。
发酵刺激剂可与本申请中所述的任何方法组合使用，以进一步改善发酵方法，而且特别地，改善发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇产率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别地，酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如，参见Alfenore等人，Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process[通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的存活力]，Springer-Verlag[施普林格出版社](2002)，将其通过引用由此并入。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
发酵产物
根据本发明，术语“发酵产物”可为由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是，不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可为作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，该醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，该醇是异丁醇。在另一个更优选方面，该醇是乙醇。在另一个更优选方面，该醇是甲醇。在另一个更优选方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，该醇是丁二醇。在另一个更优选方面，该醇是乙二醇。在另一个更优选方面，该醇是丙三醇。在另一个更优选方面，该醇是甘油。在另一个更优选方面，该醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选方面，该醇是山梨醇。在另一个更优选方面，该醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.、Cao,N.J.、Du,J.以及Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources[利用可再生资源生产乙醇],于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展],Scheper,T.编,海德堡,德国，65:207-241；Silveira,M.M.和Jonas,R.,2002,Thebiotechnological production of sorbitol[山梨醇的生物技术生产],Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh,1995,Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute[木糖醇-糖的替代品-的发酵生产方法],Process Biochemistry[过程生物化学]30(2):117-124；Ezeji等人,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping[由拜氏梭菌BA101生产丙酮，丁醇和乙醇并通过气提进行原位回收]，World Journal of Microbiology andBiotechnology[微生物与生物技术世界杂志]19(6):595-603。
在另一个优选的方面，该发酵产物是烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在另一个更优选方面，该烷烃是戊烷。在另一个更优选方面，该烷烃是己烷。在另一个更优选方面，该烷烃是庚烷。在另一个更优选方面，该烷烃是辛烷。在另一个更优选方面，该烷烃是壬烷。在另一个更优选方面，该烷烃是癸烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十一烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十二烷。
在另一个优选方面，发酵产物是环烷烃。在另一个更优选方面，该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环己烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环辛烷。
在另一个优选方面，发酵产物是烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在另一个更优选方面，该烯烃是戊烯。在另一个更优选方面，该烯烃是己烯。在另一个更优选方面，该烯烃是庚烯。在另一个更优选方面，该烯烃是辛烯。
在另一个优选方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选方面，该有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是苏氨酸。参见例如,Richard and Margaritis,2004,Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production andother microbial biopolymers[用于聚(谷氨酸)生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的实验建模],Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程]87(4):501-515。
在另一个优选的方面，该发酵产物是气体。在另一个更优选方面，该气体是甲烷。在另一个更优选方面，该气体是H2。在另一个更优选方面，该气体是CO2。在另一个更优选方面，该气体是CO。参见例如,Kataoka,Miya以及Kiriyama,1997,Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria[关于通过产氢厌氧细菌连续培养系统产生氢气的研究],Water Science andTechnology[水科学与技术]36(6-7):41-47；以及Gunaseelan,1997,Anaerobic digestionof biomass for methane production:Areview[用于甲烷生产的厌氧消化：综述],Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源]13(1-2):83-114。
在另一个优选方面，该发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选方面，发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖含有一个或多个(例如几个)酮模块的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面，该有机酸是己二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面，该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选方面，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是甲酸。在另一个更优选方面，该有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选方面，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乳酸。在另一个更优选方面，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是草酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面，该有机酸是木糖酸。参见例如Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production fromcellulosic biomass[用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵]Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术],63-65:435-448。
回收
在发酵之后，任选地使用本领域已知的任何方法回收发酵产物，该方法包括但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的材料分离并纯化醇，如乙醇。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。
在以下编号的实施例中进一步披露本发明。
实施例1.一种具有海藻糖酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少93％序列同一性或与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性、或与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸编码的多肽；
(c)SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有海藻糖酶活性。
实施例2.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施例3.如实施例1-2中任一项所述的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施例4.如实施例1-3中任一项所述的多肽，该多肽包含以下或由以下组成：SEQID NO:21或SEQ ID NO:21的显示为氨基酸19-1038的SEQ ID NO:21的成熟多肽。
实施例5.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施例6.如实施例1所述的多肽，该多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ IDNO:22的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
实施例7.如实施例1所述的多肽，该多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:23的显示为氨基酸21-1089的SEQ ID NO:23的成熟多肽。
实施例8.如前述实施例中任一项的多肽，该多肽具有通过TSA确定的至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少66℃、至少67℃，例如至少68℃的热变性温度Td。
实施例9.一种组合物，该组合物包含如实施例1-8中任一项所述的多肽。
实施例10.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如实施例1-8中任一项所述的多肽。
实施例11.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如实施例1-8中任一项所述的多肽。
实施例12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如实施例11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个异源控制序列。
实施例13.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例12所述的核酸构建体。
实施例14.如实施例13所述的重组宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞，特别是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞，最特别是酿酒细胞。
实施例15.一种产生具有海藻糖酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例13或14所述的宿主细胞。
实施例16.如实施例15所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
实施例17.一种生产发酵产物的方法，该方法包括
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)葡糖淀粉酶；
ii)如实施例1-8中任一项所述的海藻糖酶；
iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
实施例18.如实施例17所述的方法，其中该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，特别是芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8中所示的α-淀粉酶。
实施例19.如实施例18所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选为485-495个氨基酸长，如约491个氨基酸长。
实施例20.如实施例17-19中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有在位置I181+G182处的双缺失，和任选的N193F取代、或R179+G180缺失(使用SEQ IDNO:8进行编号)。
实施例21.如实施例17-20中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置S242具有取代，优选S242A、E或Q取代(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
实施例22.如实施例17-21中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置E188具有取代，优选E188P取代(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
实施例23.如实施例17-22中任一项所述的方法，其中液化步骤(a)中的α-淀粉酶选自下组的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S
-
I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V以及
-
I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。
实施例24.如实施例17-23中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌，或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌。
实施例25.如实施例17-24中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，例如本文的SEQ ID NO:4中所示的那种。
实施例26.如实施例17-25中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:4的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
实施例27.如实施例17-24中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如本文的SEQ ID NO:5中所示的那种。
实施例28.如实施例27所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:5的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
实施例29.如实施例17-24中任一项所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自密褐褶孔菌，如本文的SEQ ID NO:6中所示的那种。
实施例30.如实施例29中所述的方法，其中在糖化中存在和/或添加的该葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:6的多肽的葡糖淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
实施例31.如实施例17-30中任一项所述的方法，其中在以下步骤期间进一步存在和/或添加α-淀粉酶：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵；或步骤(b)之前任选的预糖化步骤。
实施例32.如实施例31所述的方法，其中该α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。
实施例33.如实施例31或32所述的方法，其中该α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中所示的那种，如具有黑曲霉接头和淀粉结合域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如本文的SEQ ID NO:7中所示的那种。
实施例34.如实施例31-33中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在和/或添加的该α-淀粉酶选自由以下组成的组：
(i)包含本文的SEQ ID NO:7的多肽的α-淀粉酶；
(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:7的多肽具有至少60％、至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
实施例35.如实施例31-34中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶是SEQ ID NO:7中所示的具有以下取代或取代组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:7进行编号)。
实施例36.如实施例33-35中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶源自特别地具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选如本文的SEQ ID NO:7披露的，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ IDNO:7进行编号)。
实施例37.如实施例35-36中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％同一性、如至少70％，优选至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
实施例38.如实施例17-37中任一项的方法，其中该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或卢克诺文思金孢子菌。
实施例39.如实施例17-38中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶以及任选的GH61多肽。
实施例40.如实施例17-39中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属的菌株如米曲霉的β-葡糖苷酶，如WO 2002/095014中披露的β-葡糖苷酶或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或如烟曲霉的β-葡糖苷酶，如在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:14中披露的β-葡糖苷酶，或WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；特别是具有如下取代中的一个或多个，如所有的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
实施例41.如实施例17-40中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:17中披露的Cel7a CBH I，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的纤维二糖水解酶I。
实施例42.如实施例17-41中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；如披露为本文的SEQ ID NO:18的纤维二糖水解酶II，或木霉属，如里氏木霉的菌株，或源自梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如是来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
实施例43.如实施例17-42中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属如桔橙嗜热子囊菌的菌株的GH61多肽，如在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15描述的GH61多肽；或源自梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8描述的多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如WO2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的多肽。
实施例44.如实施例17-43中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:15)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:14。
实施例45.如实施例17-44中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽；以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ IDNO:14或其具有以下取代中的一个或多个如所有的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
实施例46.如实施例17-45中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/gDS，更优选0.005-0.5mgEP/g DS，甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS剂量添加。
实施例47.如实施例17-46中任一项所述的方法，其中该预糖化在40℃-75℃，如50℃-70℃，优选60℃的温度；在4-6，优选5的pH；进行30-360分钟，如60-420分钟，如约150-180分钟的时间。
实施例48.如实施例17-47中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)葡糖淀粉酶；
ii)如实施例1-8中任一项所述的海藻糖酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
实施例49.如实施例17-48中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)来自埃默森篮状菌或篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶；
ii)如实施例1-8中任一项中所示的海藻糖酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
实施例50.如实施例17-49中任一项所述的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)来自埃默森篮状菌或篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶；
ii)如实施例1-8中任一项中所示的海藻糖酶；
iii)源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
实施例51.如实施例17-50中任一项所述的方法，其中糖化步骤(a)和发酵步骤(b)分开或同时进行。
实施例52.如实施例17-51中任一项所述的方法，其中在发酵之后回收该发酵产物。
实施例53.如实施例17-52中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是选自以下的植物材料：玉米(玉蜀黍)、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、水稻、豌豆、豆类、甘薯、或它们的混合物，优选玉米。
实施例54.如实施例17-53中任一项所述的方法，其中该液化中的温度为起始糊化温度以上，特别是70℃-100℃的范围，如75℃-95℃之间，如75℃-90℃之间，优选80℃-90℃之间，如在82℃-88℃，如约85℃。
实施例55.如实施例17-54中任一项所述的方法，其中该液化步骤(a)在3与7之间、优选从4至6、或更优选从4.5至5.5的范围的pH进行。
实施例56.如实施例17-55中任一项所述的方法，其中液化中的该干固体含量(DS)是在20-55wt.-％、优选25-45wt.-％、更优选30-40wt.-％或30-45wt-％的范围。
实施例57.如实施例17-56中任一项所述的方法，该方法在液化步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过干磨进行；
y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。
实施例58.如实施例17-57中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。
实施例59.如实施例17-58中任一项所述的方法，其中将该含淀粉材料的粒度减小，如通过干磨或湿磨或者使用粒度乳化技术。
实施例60.如实施例17-59中任一项所述的方法，其中将该发酵进行30至150小时，优选48至96小时。
实施例61.如实施例17-60中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵或步骤(a)和(b)中的同时糖化和发酵期间的温度是在25℃和40℃之间、优选在28℃和36℃之间、例如28℃和35℃之间、例如28℃和34℃之间、例如约32℃。
实施例62.如实施例17-61中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵期间进一步存在蛋白酶。
实施例63.如实施例17-62中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/g DS、优选从0.01至5AGU/g DS、尤其是0.1至0.5AGU/gDS的量存在和/或添加。
实施例64.如实施例17-63中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
实施例65.如权利要求17-64中任一项所述的方法，其中进一步地在以下步骤期间存在和/或添加蛋白酶
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
实施例66.如实施例17-65中任一项所述的方法，其中该蛋白酶源自嗜热子囊菌属，特别是桔橙嗜热子囊菌，尤其是本文的SEQ ID NO:13中所示的桔橙嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(分类为EC 3.4.24.39)。
实施例67.如实施例66所述的方法，其中该蛋白酶是本文的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶或是与本文的SEQ ID NO:13具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。
实施例68.如实施例17-65中任一项所述的方法，其中该蛋白酶源自亚灰树花菌属，特别是大型亚灰树花菌，特别是本文中作为SEQ ID NO:19所示的。
实施例69.如实施例68所述的方法，其中该蛋白酶是本文的SEQ ID NO:19中所示的蛋白酶或是与本文的SEQ ID NO:19具有至少60％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。
实施例70.如实施例17-69中任一项所述的方法，其中该发酵生物源自酵母，如酿酒酵母的菌株。
实施例71.如实施例17-70中任一项所述的方法，其中该酵母发酵生物表达如实施例1-8所述的海藻糖酶。
实施例72.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：如实施例1-8任一项所述的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。
实施例73.一种从预处理的纤维素材料产生发酵产物的方法，该方法包括：
(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；
(b)使用发酵生物进行发酵；以及
(c)任选地回收该发酵产物，
其中如实施例1-8中任一项中所示的海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。
实施例74.如实施例17-73中任一项所述的方法，其中将该海藻糖酶以0.01-20ugEP海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS之间，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS之间的量添加。
实施例75.如实施例17-74中任一项的方法，其中该纤维素分解酶制备物源自里氏木霉、特异腐质霉或卢克诺文思金孢子菌。
实施例76.如实施例72-75中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶以及任选的GH61多肽。
实施例77.如实施例72-76中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属的菌株如米曲霉的β-葡糖苷酶，如WO 2002/095014中披露的β-葡糖苷酶或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或如烟曲霉的β-葡糖苷酶，如在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:14中披露的β-葡糖苷酶，或WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；特别是具有如下取代中的一个或多个，如所有的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
实施例78.如实施例72-77中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:17中披露的Cel7a CBH I，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株的纤维二糖水解酶I。
实施例79.如实施例72-78中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；如披露为本文的SEQ ID NO:18的纤维二糖水解酶II，或木霉属，如里氏木霉的菌株，或源自梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如是来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
实施例80.如实施例72-79中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属如桔橙嗜热子囊菌的菌株的GH61多肽，如在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15描述的GH61多肽；或源自梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8描述的多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如WO2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的多肽。
实施例81.如实施例72-80中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:15)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:14。
实施例82.如实施例72-81中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包含WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽；以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ IDNO:14或其具有以下取代中的一个或多个如所有的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
实施例83.如实施例72-82中任一项所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/g DS，优选0.001-1mg/gDS，更优选0.005-0.5mgEP/g DS，甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS剂量添加。
本发明进一步通过以下实例进行描述。
实例
材料与方法
使用的酶和酵母：
α-淀粉酶BE369(AA369)：本文中披露为SEQ ID NO:8并且其进一步具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
蛋白酶PfuS示于本文的SEQ ID NO:9中。
葡糖淀粉酶X：包含以下的共混物：如WO 99/28448中的SEQ ID NO:34(本文的SEQID NO:4)披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、如WO 06/69289中的SEQ ID NO:2(本文的SEQID NO:11)披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及本文的SEQ ID NO:7披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:7进行编号)(以AGU:AGU:FAU-F表示的活性比为约29:8:1)。
酵母：
Figure BDA0002336552060000871
海藻糖酶活性:
原理：
海藻糖+H2O海藻糖酶>2葡萄糖
T＝37℃,pH＝5.7,A340nm,光路＝1cm
光度法停止率测定(Spectrophotometric Stop Rate Determination)
单位定义：
在pH 5.7，在37℃，一个单位每分钟将1.0毫摩尔的海藻糖转化为2.0毫摩尔的葡萄糖(在pH 7.5，测定的释放的葡萄糖)。
(参见Dahlqvist,A.(1968)Analytical Biochemistry 22,99-107)
用于实例3的海藻糖酶测定。
将10微升样品与190μl底物溶液(1％海藻糖的50mM乙酸钠溶液，pH 4.3)混合，并在32℃下孵育1小时。然后取出10μl溶液，并添加200μl葡萄糖CII测试WAKO。在室温下孵育15min后测量A505。
菌株
构建了与WO 2016026938A1中披露的实例5中描述的相当的改善的米曲霉宿主/载体系统。通过将位于质粒pDAu724的PART-II上的FLPase表达盒(参见WO 2016026938A1中第34页，图7和SEQ ID NO:30)移至宿主菌株的基因组中的整合基因座amy2中，做出了改善以减小转化DNA的大小。通过从pDAu724扩增FLPase表达盒并在pDAu703的FRT-F3和amdS选择标记之间克隆，将FLPase表达盒克隆到pDAu703(WO 2016026938A1，第32页和图6以及SEQID:29)，以给出质粒pDAu770。使用与WO 2016026938A1第33页中描述的相同的方案将线性化的质粒pDAu770转化进入米曲霉菌株Jal1338的原生质体中(披露于WO 12160097A1中)。在AmdS选择板上选择转化体以获得菌株DAu785。所得重组宿主菌株DAu785具有与DAU716(WO 2016026938A1)中相似的经修饰的amy2基因座，其中添加了FLPase表达盒。该宿主菌株DAu785构成性地表达FLPase位点特异重组酶(在这一情况下允许在转化DNA的FRT位点处整合通过重叠延伸PCR反应获得的PCR片段)描述于下文中。此菌株用于海藻糖酶多肽SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:23的异源表达。
绳状篮状菌NRRL 1035在1992二月友好获得自Pr.Jens Frisvad(DenmarkTechnical University,Department of Biotechnology and Biomedicine[丹麦技术大学，生物技术和生物医学系])。绳状篮状菌最初由George Smith于1936年在英国分离。将菌株接种到PDA板上并且在26℃于黑暗中孵育8天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100mlYPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在26℃以100rpm振荡孵育5天以产生生物质。
嗜热篮状菌参考CBS 398.68(于1968年在英国分离)购自CBS-KNAW真菌生物多样性中心，Uppsalalaan 8,3584CT，乌特勒支，荷兰，并接种到PDA板上并在26℃下于黑暗中孵育8天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将烧瓶在26℃以100rpm振荡孵育5天以产生生物质。
培养基和溶液
PDA板由39g马铃薯右旋糖琼脂(参考70139)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，慕尼黑，德国)、和补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
LB肉汤(LB-Bouillon)由25g LB肉汤(参考L3152)(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，慕尼黑，德国)、和补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
LB琼脂由37g LB琼脂(参考L3027)(西格玛奥德里奇公司，慕尼黑，德国)、5g可溶性淀粉、0.01M K2PO4、0.04％葡萄糖、和补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。将培养基冷却到50℃并且添加50mM的氨苄青霉素。
COVE-N-琼脂板由218g的山梨醇、25g的琼脂粉、50ml的COVE盐溶液及补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。将该培养基冷却至50℃并且添加10mM乙酰胺、和Triton X-100(50μl/500ml)。
蔗糖琼脂10mM NaNO3由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。将该培养基冷却至50℃并且添加10mM NaNO3、和Triton X-100(50μl/500ml)。
COVE盐溶液由26g的MgSO4.7H2O、26g的KCL、76g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液及补足至1000ml的去离子水构成。将溶液无菌过滤。
COVE痕量金属溶液由0.04g的Νa2Β4Ο7.10Η2Ο、0.4g的CuSO4.5H2O,1、1.2g的FeSO4.7H2O、0.7g的MnSO4.H2O、0.8g的Na2MoO4.2H2O、10g的ZnSO4.7H2O、以及补足至1000ml的去离子水构成。将溶液无菌过滤。
DAP4C-1培养基由0.5g酵母提取物、10g麦芽糖、20g右旋糖、11gMgSO4.7H2O、1gKH2PO4、2g C6H8O7.H2O、5.2g K3PO4.H2O、1ml Dowfax 63N10(消泡剂)、2.5g碳酸钙、补充以0,5ml KU6痕量金属溶液以及去离子水至1000ml构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。在使用之前，每150ml的DAP4C-1培养基添加3.5ml的无菌的50％(NH4)2HPO4和5ml的无菌的20％乳酸。
MDU-2培养基由45g麦芽糖，1g MgSO4.7H2O、1g NaCl、2g K2SO4、12g KH2PO4、0.5ml KU6痕量金属、0.1ml Dowfax 63N10(消泡剂)和去离子水补足至1000ml构成。将pH调节至pH 5并且将该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(BacteriologicalAnalytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。高压灭菌后，添加15ml 50％无菌过滤尿素。
YP2％葡萄糖由10g的酵母提取物、20g的细菌用蛋白胨、20g的右旋糖、以及补足至1000ml的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
KU6痕量金属溶液由6.8g的ZnCl2、2.5g的CuSO4.5H2O、0.13g的NiCl2、13.9g的FeSO4.7H2O、8.45g的MnSO4.H2O、3g的C6H8O7.H2O、以及补足至1000ml的去离子水构成。将溶液无菌过滤。
实例1：海藻糖酶序列的克隆
从绳状篮状菌和嗜热篮状菌的gDNA中PCR扩增出篮状菌属DNA序列，并通过重叠延伸PCR进行克隆。在反应中，将pDAu724质粒(参见上述菌株部分)用作DNA模板以扩增两种PCR产物(F1和F3)，该反应由以下项构成：10μL的KAPA聚合酶缓冲液5x、1μl 10mM的KAPAPCR核苷酸混合物、1μl 10μM的适合的正向引物(F1的SEQ ID NO:24和F3的SEQ ID NO:26)、1μl 10μM的适合的反向引物(F1的SEQ ID NO:25和F3的SEQ ID NO:27)、1至10ng的pDAu724质粒、1μl的KAPA生物系统聚合酶KK2502(1单位)和PCR级水补充至50μL。在
Figure BDA0002336552060000911
Dual-Block热循环仪(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上进行PCR扩增反应，程序为在98℃下2min，并随后进行在98℃下10sec和在72℃下2min的35个循环，以及在72℃下10min的最后一个循环。使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析五μlPCR反应，其中观察到适当大小的DNA条带。根据制造商的说明，使用ILLUSTRATMGFXTMPCRDNA和凝胶带纯化试剂盒纯化剩余的PCR反应。
用于对分别从绳状篮状菌和嗜热篮状菌扩增的海藻糖酶基因进行克隆的重叠延伸PCR反应由以下项构成：10μl KAPA聚合酶缓冲液(5X)、1μl 10mM的KAPA PCR核苷酸混合物、50ng的PCR片段F1和等摩尔量的PCR片段F3、和编码SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的海藻糖酶基因、1μl的KAPA生物系统聚合酶KK2502(1单位)以及PCR级水补充至48μL。使用以下构成的程序在
Figure BDA0002336552060000912
Dual-Block热循环仪(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上将反应进行孵育：在98℃下2min；随后进行5个循环，各自由以下项构成：在98℃下10sec、在68℃下30sec、和在72℃下5min，以及最后在72℃下8min的最后的延伸。在重叠延伸PCR反应期间，通过正向克隆引物(SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:30)中包含的重叠序列SEQ ID NO:28确保片段F1与编码SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23的海藻糖酶基因之间的退火。通过反向克隆引物(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32)中包含的重叠序列SEQID NO:29确保片段F3与编码SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23的海藻糖酶基因之间的退火。最初五个循环后，将1μl的10μM引物SEQ ID NO:24和1μl的10μM引物SEQ ID NO:27添加至重叠延伸PCR反应中，并且使用以下构成的程序在
Figure BDA0002336552060000913
Dual-Block热循环仪(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上将这些反应在98℃下第二次孵育2min；随后进行25个循环，各自由以下构成：在98℃下10sec，和在72℃下4min，以及最后在72℃下10min的最后的延伸。PCR反应产生两种产物：SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22。使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析五μl PCR反应，其中观察到适当大小的DNA条带。通过在60℃下加热管将剩余的PCR反应浓缩升至20μl。将10μl的这些反应用于米曲霉DAu785原生质体转化。
实例2：海藻糖酶的异源表达
米曲霉DAu785菌株的原生质体是根据WO 95/002043制备的。将100μl米曲霉原生质体与编码绳状篮状菌、嗜热篮状菌海藻糖酶多肽(SEQ ID NO:21的氨基酸19-1038和SEQID NO:23的氨基酸21-1089)的10μl浓缩的重叠延伸PCR、270μl 60％PEG 4000(艾普利公司，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5并轻轻混合。将混合物在37℃孵育30分钟并将这些原生质体涂布到含有10mMNaNO3的蔗糖琼脂板上。在37℃孵育4-7天后，将八个菌落的孢子接种到来自赛默飞世尔公司(生命科技公司欧洲私人有限公司(Life Technologies Europe BV)，奈鲁姆，丹麦)的96孔X50微量滴定板PS中的MDU-2培养基中，并用半透胶带覆盖。在30℃静置培养4天后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析培养液，以鉴别产生最高量海藻糖酶多肽的菌落。将最佳转化体的孢子涂布于含有0.01％
Figure BDA0002336552060000921
X-100和10mM NaNO3的蔗糖琼脂板上以分离单个菌落。重复涂布两次。
实例3：本发明的海藻糖酶的表征
海藻糖酶 生物体 GH
Ms-海藻糖酶 瘤孢毁丝霉 37
Tr-海藻糖酶 里氏木霉 65
An-海藻糖酶 黑曲霉 65
Tl-海藻糖酶 嗜热篮状菌 65
Tf-海藻糖酶 绳状篮状菌 65
纯化
通过两个步骤(脱盐柱和阳离子交换柱色谱法)对海藻糖酶进行纯化。最后，使用12k-14k MWCO(截留分子量)透析膜用10L的20mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)透析样品并且然后使用30k MWCO离心过滤装置浓缩。
TSA热稳定性测定(TSA)
将纯化的酶用50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将十八微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。
TSA的设备参数：
仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))
扫描速率：0.02℃/sec
扫描范围：37℃-96℃
积分时间：1.0sec
激发波长465nm
发射波长580nm
将获得的荧光信号标准化到0和1的范围内。变性温度(Td)定义为标准化值最接近0.5时的温度。将最大信号强度(标准化值为1)的温度定义为Td2，并将其用作M-tre PE变体的热稳定性指数。
海藻糖酶测定
将10微升样品与190μl底物溶液(1％海藻糖的50mM乙酸钠溶液，pH 4.3)混合，并在32℃下孵育1小时。然后取出10μl溶液，并添加200μl葡萄糖CII测试WAKO。在室温下孵育15min后测量A505。
SF培养法制备蛋白酶混合物
用于制备蛋白酶混合物的黑曲霉菌株是NN059095的衍生物，其是由诺维信公司分离并经过基因修饰以破坏从土壤中分离的黑曲霉NN049184的淀粉葡萄糖苷酶活性的表达。
将黑曲霉菌株的孢子接种进100ml的MLC培养基，并且在30℃下培养2天。将10ml的MLC接种至100ml的MU-1培养基，并在30℃培养7天。通过离心获得上清液。
MLC由以下构成：40g葡萄糖、50g大豆粉、4g柠檬酸(pH 5)以及水补足至1升。
MU-1-glu由以下构成：260g的葡萄糖、3g的MgSO4·7H2O、5g KH2PO4、6g K2SO4、0.5ml的淀粉糖苷酶痕量金属溶液和2g尿素(pH 4.5)以及水补足至1升。
痕量金属溶液由以下构成：6.8g的ZnCl2·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、0.24g的NiCl2·6H2O、13.9g的FeSO4·7H2O、13.5g的MnSO4·H2O和3g的柠檬酸以及水补足至1升。
蛋白酶稳定性测定
用pH 4.0的50mM乙酸钠缓冲液将纯化的酶稀释至2mg/ml，并将100μl的样品与100μl制备的蛋白酶混合物混合。然后将该溶液在-20℃、4℃、30℃和40℃下孵育3天并将通过海藻糖酶测定测量残留活性。
结果
Figure BDA0002336552060000941
*在与蛋白酶混合物的掺和物孵育3天后的残余活性(-20℃，100％)
实例4：根据本发明的海藻糖酶的热稳定性，与两种现有技术的海藻糖酶相比
本发明的海藻糖酶(本文披露为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23)的热稳定性与以下两种现有技术的海藻糖酶相比：一种来自解纤维素篮状菌属(SEQ ID NO:34)(Fujii T,Hoshino T,Inoue H,Yano S.2014.Taxonomic revision of the cellulose-degradingfungus Acremonium cellulolyticusnomen nudum to Talaromyces based onphylogenetic analysis.[基于系统发育分析，将无记述名纤维素降解真菌解纤维素枝顶孢分类为篮状菌属].FEMS Microbiology Letters[FEMS微生物学通讯].351:32-41)和一种来自具疣篮状菌(SEQ ID NO:35)(作为基因组序列的一部分于2015年公开在www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001305275.1上；多肽被鉴定为EFP5BRM8N)。使用热转移测定(TSA)将热稳定性测量为变性温度。
样品
Figure BDA0002336552060000942
菌株培养
将在30℃下在COVE N-gly琼脂板上培养1周的菌株的琼脂片接种到500ml摇瓶中的100ml MS9中，并将其在30℃下以220rpm振荡培养1天。将3ml种子培养物转移到500ml摇瓶中的100ml MDU-2BP-FuPE中，并在30℃、在220rpm下将其培养3天。将培养上清液用0.2μm的乙酸纤维素滤膜过滤。培养基组分如下描述。
COVE甘氨酸琼脂
218g/L山梨醇、10g/L甘油、2.02g/L硝酸钾、50ml/L COVE盐溶液、pH 5.3
COVE盐溶液
26g/L氯化钾、26g/L七水硫酸镁、76g/L磷酸二氢钾、50ml/L COVE的痕量金属溶液
COVE的痕量金属溶液
0.04g/L四硼酸钠十水合物、0.4g/L五水硫酸铜(II)、1.2g/L七水硫酸亚铁(II)、1g/L五水硫酸锰(II)、0.8g/L水钼酸钠、10g/L七水硫酸锌MS9
30g/L大豆粉、20g/L甘油
MDU-2BP FuPE
45g/L麦芽糊精、7g/L酵母提取物、1g/L七水硫酸镁、1g/L氯化钠、2g/L硫酸钾、0.75g/L氯化铵、12g/L磷酸二氢钾、0.5ml/L AMG的痕量金属溶液(MU-1)
AMG的痕量金属溶液(MU-1)
1.39％七水硫酸亚铁(II)、1.356％五水硫酸锰(II)、0.68％氯化锌、0.25％五水硫酸铜(II)、0.024g/L六水氯化镍(II)、0.3％柠檬酸
纯化
通过两个步骤(脱盐柱和阳离子交换柱色谱法)对WT海藻糖酶进行纯化。最后，使用12k-14k MWCO透析膜用10L的20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)透析样品并且然后使用30kMWCO离心过滤装置浓缩。
TSA热稳定性测定(TSA)
将纯化的酶用50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将十八微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。
TSA的设备参数
仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))
扫描速率：0.02℃/sec
扫描范围：37℃-96℃
积分时间：1.0sec
激发波长465nm
发射波长580nm
将获得的荧光信号标准化到0和1的范围内。变性温度(Td)定义为标准化值最接近0.5时的温度。Td列于表1。
表1Td的列表
海藻糖酶 Td[℃]
EXP13116 51.7
EXP13117 47.1
Tl-海藻糖酶 67.5
Tf-海藻糖酶 64.7
实例5：本发明的Tf-海藻糖酶在产生乙醇的方法中的用途。
使用的酶和酵母：
α-淀粉酶BE369(AA369)：本文中披露为SEQ ID NO:8并且其进一步具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(使用SEQ ID NO:8进行编号)。
蛋白酶PfuS示于本文的SEQ ID NO:9中。
葡糖淀粉酶X：包含以下的共混物：如WO 99/28448中的SEQ ID NO:34(本文的SEQID NO:4)披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、如WO 06/69289中的SEQ ID NO:2(本文的SEQID NO:11)披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及本文的SEQ ID NO:7披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，其具有以下取代：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:7进行编号)(以AGU:AGU:FAU-F表示的活性比为约29:8:1)。酵母：
Figure BDA0002336552060000971
通过单独使用葡糖淀粉酶混合物X或添加Ms或Tf海藻糖酶进行糖化和发酵(SSF)来评估海藻糖酶还原海藻糖的能力。该Ms海藻糖酶的剂量设置为每克干固体(DS)1μg酶蛋白(EP)，而三种Tf海藻糖剂量用于比较(0.6、0.7和0.8ug EP/g DS)。葡糖淀粉酶共混物X的剂量为0.6AGU/gDS并根据以下计算。使用了两种植物醪液(使用α-淀粉酶BE369或BE369和蛋白酶PfuS液化的玉米淀粉)。醪液1表示BE369+PfuS，并且醪液2表示BE369醪液。对于醪液1BE369和PfuS的剂量分别为2.3μg EP/g DS和2.6μg EP/g DS。对于醪液2BE369的剂量为2.81μg EP/g DS。醪液1和醪液2的尿素的剂量分别为400ppm和1000ppm。
Figure BDA0002336552060000972
表2：在两种工业植物醪液的SSF中的酶处理
Figure BDA0002336552060000973
使用两种液化的工业植物玉米醪液醪液1和醪液2，在SSF中评估该共混物。该醪液补充有3ppm青霉素。添加至醪液1和醪液2尿素的量分别为400ppm和1000ppm。在将醪液分散到烧瓶之前，使用40％H2SO4将两种植物醪液的pH调整至pH 5.1。将大约60g(55±0.03)的醪液添加至每个125mL中且一式两份进行。康宁公司(Corning)一次性锥形瓶在瓶盖具有0.048”孔用于排气。每个烧瓶中加入根据表2的酶和1.2mL再水化的乙醇红酵母。通过用100mL自来水悬浮5.5g酵母使乙醇红再水化，并在32℃下孵育30-40min。将烧瓶在32℃下孵育总计52hr，同时在120rpm下振荡。在52hr收集样品。通过去除大约4克的发酵样品并且将其与40uL的40％H2SO4混合，制备收集的样品用于HPLC。将混合物在3500x g下离心10分钟，并且通过0.2μM沃特曼尼龙过滤器过滤。在具有化学工作站软件的Agilent HPLC 1100/1200系列上分析过滤的样品。在具有阳离子H保护柱的Bio-Rad HPX-87H离子排阻柱(300mmx 7.8mm)上分离样品。在65℃下按0.8ml/min运行流动相5mM H2SO4，并且RI检测器温度设置在55℃。该方法使用针对糊精(DP4+)、麦芽三糖(DP3)、麦芽糖(DP2)、葡萄糖(DP1)、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇的校准标准品(具有强制过零4点校准)对若干种分析物进行定量。针对乙醇、DP2(麦芽糖)的HPLC结果示于表3中。由于这些糖还含有海藻糖，因此分析了DP2。除了HPLC分析外，还使用Chromeleon 5软件在Dionex ICS-3000离子色谱仪(IC)上分析了仅Mash 1的过滤样品，以将海藻糖与其他DP2糖(如异麦芽糖、麦芽糖和纤维二糖)分离。使用Carbopack PA1色谱柱分离样品。流动相是水、0.2M NaOH、1M乙酸钠以及1mL/min的流速，并且色谱柱和检测器(带有一次性金电极的PAD检测器)均为30℃。将IC运行65分钟且海藻糖水平报告在表4。Tf-海藻糖酶比Ms-海藻糖酶具有略好的性能，因为0.6-0.8ug Tf的EP在SSF处理52hr后具有相似的DP2水平。在不添加任何海藻糖酶的情况下，发酵结束时会残留大量的DP2。比较了Ms和Tf-海藻糖酶处理两种植物醪液之间的乙醇水平，两者之间无统计学意义。因此，相对于Ms-海藻糖酶，Tf-海藻糖酶的蛋白质剂量低20％至40％，与在SSF中的使用两种不同类型的植物的醪液的Ms-海藻糖酶的具有相似的应用性能。
表3：在两种植物醪液中SSF持续52Hr后的乙醇和DP2水平
Figure BDA0002336552060000981
表4.在两种植物醪液中SSF持续52Hr后的海藻糖水平
Figure BDA0002336552060000982
Figure BDA0002336552060000991
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途
<130> 14422-WO-PCT
<160> 35
<170> 专利版本3.5
<210> 1
<211> 694
<212> PRT
<213> 瘤孢毁丝霉
<400> 1
Met Ala Leu Arg His Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ala Gly Leu Ala Ser
1 5 10 15
Arg Thr Ala Ala Leu Tyr Ile Asn Gly Ser Val Thr Ala Pro Cys Asp
20 25 30
Ser Pro Ile Tyr Cys Gln Gly Glu Leu Leu Lys Ala Val Glu Leu Ala
35 40 45
Arg Pro Phe Val Asp Ser Lys Thr Phe Val Asp Met Pro Thr Ile Lys
50 55 60
Pro Val Asp Glu Val Leu Ala Ala Phe Ser Lys Leu Ser Leu Pro Leu
65 70 75 80
Ser Asn Asn Ser Glu Leu Asn Ala Phe Leu Tyr Glu Asn Phe Ala Gln
85 90 95
Ala Gly His Glu Leu Glu Glu Val Pro Asp Ser Glu Leu Glu Thr Asp
100 105 110
Ala Lys Phe Leu Asp Lys Leu Glu Asp Arg Thr Ile Lys Glu Phe Val
115 120 125
Gly Lys Val Ile Asp Ile Trp Pro Asp Leu Thr Arg Arg Tyr Ala Gly
130 135 140
Pro Ser Asn Cys Thr Glu Cys Ala Asn Ser Phe Ile Pro Val Asn Arg
145 150 155 160
Thr Phe Val Val Ala Gly Gly Arg Phe Arg Glu Pro Tyr Tyr Trp Asp
165 170 175
Ser Tyr Trp Ile Val Glu Gly Leu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Phe Thr
180 185 190
His Ile Ser Lys Asn Ile Ile Glu Asn Phe Leu Asp Phe Val Asp Thr
195 200 205
Ile Gly Phe Ile Pro Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Arg Ser
210 215 220
Gln Pro Pro Leu Leu Thr Leu Met Val Lys Ser Tyr Val Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Asn Asp Thr Ser Ile Leu Asp Arg Ala Leu Pro Leu Leu Ile Lys Glu
245 250 255
His Glu Phe Phe Met Asn Asn Arg Thr Val Ser Ile Thr Gly Ser Asn
260 265 270
Gly Lys Glu Tyr Thr Leu Asn Arg Tyr His Val Glu Asn Asn Gln Pro
275 280 285
Arg Pro Glu Ser Phe Arg Glu Asp Tyr Ile Thr Ala Asn Asn Gly Ser
290 295 300
Tyr Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Ile Tyr Pro Val Lys Thr Pro Leu Asn
305 310 315 320
Glu Thr Glu Lys Ala Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Thr Gly Ala Glu
325 330 335
Ser Gly Trp Asp Tyr Thr Ser Arg Trp Leu Gly Val Pro Ser Asp Ala
340 345 350
Ala Arg Asp Val Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Leu Asn Val Arg Asp Ile
355 360 365
Val Pro Val Asp Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Gln Asn Glu Val Ile Ile
370 375 380
Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Ala Ala Lys Arg Phe
385 390 395 400
Ala Thr Ala Ala Glu Gln Arg Ser Glu Ala Met Tyr Ser Leu Met Trp
405 410 415
Asn Ala Thr His Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Thr Asp Asn Thr
420 425 430
Gln His Ile Phe Val Pro Ala Asp Glu Asp Thr Ala Pro Gln Asp Arg
435 440 445
Ile Glu Ala Pro Pro Gly Gln Gln Val Phe Phe His Ile Ala Gln Leu
450 455 460
Tyr Pro Phe Trp Thr Gly Ala Ala Pro Ala Ser Leu Lys Ala Asn Pro
465 470 475 480
Leu Ala Val Gln Gln Ala Tyr Ala Arg Val Ala Arg Met Leu Asp Ile
485 490 495
Lys Lys Gly Ala Ile Pro Ala Thr Asn Tyr Arg Thr Gly Gln Gln Trp
500 505 510
Asp Gln Pro Asn Val Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Leu Met Lys Gly
515 520 525
Leu Leu Asn Thr Pro Ala Thr Phe Gly Lys Ser Asp Pro Ala Tyr Gln
530 535 540
Ser Val Gln Asn Leu Ala Leu Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Ser
545 550 555 560
Thr Phe Cys Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ser Asp Phe Pro
565 570 575
Gln Leu Glu Gly Val Thr Pro Gly Ala Thr Gly Val Met Phe Glu Lys
580 585 590
Tyr Ala Asp Asn Ala Thr Asn Val Ala Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Glu
595 600 605
Val Val Glu Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Leu Ile Trp Ala Ala
610 615 620
Asp Val Phe Gly Asn Lys Leu Lys Arg Pro Asp Cys Gly Asn Ile Thr
625 630 635 640
Ala Ala His Thr His Ser Ser Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Asn Lys
645 650 655
Leu Pro Arg Arg Ala Val Glu Leu Asp Pro Trp Asp Ala Ala Trp Thr
660 665 670
Lys Met Phe Gly Arg Ser Lys Leu Arg Arg Arg Glu Ala Glu Asp Val
675 680 685
Arg Lys Arg Trp Met Ser
690
<210> 2
<211> 1079
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 2
Met Arg Ser Thr Val Thr Ser Ala Ala Ala Leu Leu Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Leu Val Ser Pro Val His Gly Thr Thr Leu Val Asp Arg Val Thr Lys
20 25 30
Cys Leu Ser Arg His Asp Gly Ser Asp Ala Glu Ser His Phe Ser Lys
35 40 45
Asn Val Tyr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Val Thr Trp Asp Glu Asp Asn
50 55 60
Trp Leu Leu Ser Thr Thr Gln Leu Lys Gln Gly Ala Phe Glu Ala Arg
65 70 75 80
Gly Ser Val Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Ile Asn Val Ala Ser Val Gly
85 90 95
Pro Phe Phe Glu Val Asp Thr Glu Glu Asp Gly Asp Val Ile Ser Gly
100 105 110
Trp Pro Leu Phe Ser Arg Arg Gln Ser Phe Ala Thr Val Ala Gly Phe
115 120 125
Trp Asp Ala Gln Pro Gln Met Asn Gly Thr Asn Phe Pro Trp Leu Ser
130 135 140
Gln Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Ile Ser Gly Ile Pro His Trp Ser Gly
145 150 155 160
Leu Val Leu Asp Leu Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Asp Ala Thr Val Ser
165 170 175
Asn Lys Thr Ile Ser His Phe Arg Ser Thr Tyr Asp Tyr Lys Ala Gly
180 185 190
Val Leu Ser Trp Ser Tyr Lys Trp Thr Pro Lys Gly Asn Lys Gly Ser
195 200 205
Phe Asp Ile Ser Tyr Arg Leu Phe Ala Asn Lys Leu His Val Asn Gln
210 215 220
Ala Val Val Asp Met Gln Val Thr Ala Ser Lys Asn Val Gln Ala Ser
225 230 235 240
Ile Val Asn Val Leu Asp Gly Phe Ala Ala Val Arg Thr Asp Phe Val
245 250 255
Glu Ser Gly Glu Asp Gly Ser Ala Ile Phe Ala Ala Val Arg Pro Asn
260 265 270
Gly Val Ala Asn Val Thr Ala Tyr Val Tyr Ala Asp Ile Thr Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Val Asn Leu Ser Ser Arg Lys Ile Val His Asn Lys Pro Tyr
290 295 300
Val His Ala Asn Ala Ser Ser Ile Ala Gln Ala Val Pro Val Lys Phe
305 310 315 320
Ala Ala Gly Arg Thr Val Arg Val Thr Lys Phe Val Gly Ala Ala Ser
325 330 335
Ser Asp Ala Phe Lys Asn Pro Lys Gln Val Ala Lys Lys Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Leu Ser Asn Gly Tyr Thr Lys Ser Leu Lys Ala His Val Glu
355 360 365
Glu Trp Ala Thr Val Met Pro Glu Ser Ser Val Asp Ser Phe Ala Asp
370 375 380
Pro Lys Thr Gly Lys Leu Pro Ala Asp Ser His Ile Val Asp Ser Ala
385 390 395 400
Ile Ile Ala Val Thr Asn Thr Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr Val Gly
405 410 415
Lys Asn Gly Ile Lys Ala Val Asp Gly Ala Pro Val Asn Val Asp Ser
420 425 430
Ile Ser Val Gly Gly Leu Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Gly Gln Ile Phe
435 440 445
Trp Asp Ala Asp Leu Trp Met Gln Pro Gly Leu Val Ala Ala His Pro
450 455 460
Glu Ala Ala Glu Arg Ile Thr Asn Tyr Arg Leu Ala Arg Tyr Gly Gln
465 470 475 480
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ala Tyr Ala Gly Ser Gln Asn Glu Thr
485 490 495
Phe Phe Ser Ala Ser Ala Ala Val Phe Pro Trp Thr Ser Gly Arg Tyr
500 505 510
Gly Asn Cys Thr Ala Thr Gly Pro Cys Trp Asp Tyr Glu Tyr His Leu
515 520 525
Asn Gly Asp Ile Gly Ile Ser Leu Val Asn Gln Trp Val Val Asn Gly
530 535 540
Asp Thr Lys Asp Phe Glu Lys Asn Leu Phe Pro Val Tyr Asp Ser Val
545 550 555 560
Ala Gln Leu Tyr Gly Asn Leu Leu Arg Pro Asn Lys Thr Ser Trp Thr
565 570 575
Leu Thr Asn Met Thr Asp Pro Asp Glu Tyr Ala Asn His Val Asp Ala
580 585 590
Gly Gly Tyr Thr Met Pro Leu Ile Ala Glu Thr Leu Gln Lys Ala Asn
595 600 605
Ser Phe Arg Gln Gln Phe Gly Ile Glu Gln Asn Lys Thr Trp Asn Asp
610 615 620
Met Ala Ser Asn Val Leu Val Leu Arg Glu Asn Gly Val Thr Leu Glu
625 630 635 640
Phe Thr Ala Met Asn Gly Thr Ala Val Val Lys Gln Ala Asp Val Ile
645 650 655
Met Leu Thr Tyr Pro Leu Ser Tyr Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Gln Asp
660 665 670
Ala Leu Asn Asp Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Gln Ser Pro Asp Gly
675 680 685
Pro Ala Met Thr Tyr Ala Phe Phe Ser Ile Val Ala Asn Glu Ile Ser
690 695 700
Pro Ser Gly Cys Ser Ala Tyr Thr Tyr Ala Gln Asn Ala Phe Lys Pro
705 710 715 720
Tyr Val Arg Ala Pro Phe Tyr Gln Ile Ser Glu Gln Leu Ile Asp Asp
725 730 735
Ala Ser Val Asn Gly Gly Thr His Pro Ala Tyr Pro Phe Leu Thr Gly
740 745 750
His Gly Gly Ala His Gln Val Val Leu Phe Gly Tyr Leu Gly Leu Arg
755 760 765
Leu Val Pro Asp Asp Val Ile His Ile Glu Pro Asn Leu Pro Pro Gln
770 775 780
Ile Pro Tyr Leu Arg Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp Pro Ile
785 790 795 800
Ser Ala Trp Ser Asn Tyr Thr His Thr Thr Leu Ser Arg Ala Ala Gly
805 810 815
Val Ala Ala Leu Glu Gly Ala Asp Gln Arg Phe Ala Arg Lys Pro Ile
820 825 830
Thr Ile His Ala Gly Pro Glu Gln Asp Pro Thr Ala Tyr Arg Leu Pro
835 840 845
Val Lys Gly Ser Val Val Ile Pro Asn Lys Gln Ile Gly Ser Gln Gln
850 855 860
Thr Tyr Ala Gly Asn Leu Val Gln Cys His Ala Ala Ser Ser Pro Asn
865 870 875 880
Asp Tyr Val Pro Gly Gln Phe Pro Ile Ala Ala Val Asp Gly Ala Thr
885 890 895
Ser Thr Lys Trp Gln Pro Ala Ser Ala Asp Lys Val Ser Ser Ile Thr
900 905 910
Val Ser Leu Asp Lys Glu Asp Val Gly Ser Leu Val Ser Gly Phe His
915 920 925
Phe Asp Trp Ala Gln Ala Pro Pro Val Asn Ala Thr Val Ile Phe His
930 935 940
Asp Glu Ala Leu Ala Asp Pro Ala Thr Ala Leu Ala Ser Ala His Lys
945 950 955 960
His Asn Ser Lys Tyr Thr Thr Val Thr Ser Leu Thr Asn Ile Glu Leu
965 970 975
Ser Asp Pro Tyr Val Ser Thr Lys Asp Leu Asn Ala Ile Ala Ile Pro
980 985 990
Ile Gly Asn Thr Thr Asn Val Thr Leu Ser His Pro Val Ala Ala Ser
995 1000 1005
Arg Tyr Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Asn Gln Gly Leu Asp Pro
1010 1015 1020
Val Asp Val Lys Ala Lys Asn Gly Thr Gly Ala Thr Val Ala Glu
1025 1030 1035
Trp Ala Ile Phe Gly His Gly Lys Glu His Ser Gly Lys Pro Ser
1040 1045 1050
Ser His Ser Lys Arg Arg Leu Asn Val Arg Thr Ala Ala Thr Leu
1055 1060 1065
Ser Asn Pro Arg Ser Phe Met Arg Arg Arg Leu
1070 1075
<210> 3
<211> 1072
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 3
Met Gln Val Lys Phe Leu Ala Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu His Leu
1 5 10 15
Pro Ala Ala Val Asp Gly Leu Pro Gly Lys Asn Ala Arg Ile Ser Ala
20 25 30
Ser Leu Lys Arg His Ala Gly Arg Asp Val Pro Gln Thr Ala Leu Asn
35 40 45
Ser Thr Asn Val Tyr Gln Thr Lys Phe Ser Gly Val Thr Trp Asp Glu
50 55 60
Asp His Trp Leu Leu Thr Thr Thr Thr Pro Asp Gln Gly His Tyr Gln
65 70 75 80
Ser Arg Gly Ser Val Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Ile Asn Val Ala Asn
85 90 95
Ile Gly Pro Phe Phe Glu Leu Asp Glu Pro Val Asn Gly Asp Val Ile
100 105 110
Asn Gly Trp Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Gln Ser Phe Ala Thr Ile Ser
115 120 125
Gly Phe Trp Asp Arg Gln Ala His Thr Asn Gly Ser Asn Phe Pro Trp
130 135 140
Leu Ser Gln Tyr Gly Asp Asp Ser Val Ile Ser Gly Val Pro His Trp
145 150 155 160
Ser Gly Leu Ile Leu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Tyr Leu Asp Ala Thr
165 170 175
Val Asp Asn Arg Thr Ile Ser Asn Phe Lys Ser Thr Tyr Asp Phe Lys
180 185 190
Ser Gly Val Leu Ser Trp Ser Tyr Thr Trp Thr Pro Gln Gly Asn Lys
195 200 205
Gly Ser Tyr Ala Ile Thr Tyr Arg Leu Phe Ala His Lys Leu Tyr Val
210 215 220
Asn Arg Ala Val Val Asp Met Glu Ile Thr Pro Leu Thr Asn Gly Asn
225 230 235 240
Ala Thr Val Val Asn Val Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Val Arg Thr Asp
245 250 255
Phe Val Ala Ser Gly Gln Glu Glu Gly Ala Ile Phe Ser Ala Val Arg
260 265 270
Pro Trp Gly Val Asn Asn Val Thr Ala Tyr Val Tyr Ala Thr Leu Asp
275 280 285
Gly Ser Asp Ser Val Asp Leu Ser Ser Arg Arg Ile Val Thr Asp Lys
290 295 300
Pro Tyr Val Ser Thr Asn Ser Ser Ser Val Ala Gln Ala Val Asp Val
305 310 315 320
Met Phe Thr Ala Asn Glu Thr Val Arg Ile Thr Lys Phe Val Gly Gly
325 330 335
Ala Thr Thr Asp Tyr Phe Leu Ala Thr Gln Glu Thr Ala Lys Ala Ala
340 345 350
Cys Leu Ala Gly Leu Ala Asp Gly Tyr Val Lys Ser Leu Gln Ser His
355 360 365
Val Gly Glu Trp Ala Thr Ile Met His Asp His Ser Val Asp Arg Phe
370 375 380
Thr Asp Pro Ala Thr Gly Lys Leu Pro Glu Asp Ser His Ile Val Asp
385 390 395 400
Ser Ala Ile Ile Ala Val Thr Asn Thr Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr
405 410 415
Ala Gly Thr Asn Ala Ile Val Ala Ala Gly Gly Ile Pro Val Asn Val
420 425 430
Asp Ser Cys Ala Pro Gly Gly Leu Thr Ser Asp Ser Tyr Gly Gly Gln
435 440 445
Ile Phe Trp Asp Ala Asp Leu Trp Met Gln Pro Gly Leu Val Ala Ser
450 455 460
His Pro Glu Ser Ala Gln Arg Phe Thr Asn Tyr Arg Ile Ala Leu His
465 470 475 480
Tyr Gln Ala Gln Ala Asn Ile Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ser Lys Asn
485 490 495
Gln Thr Ser Phe Ser Ser Ser Ala Ala Ile Tyr Pro Trp Thr Ser Gly
500 505 510
Arg Phe Gly Asn Cys Thr Ala Thr Gly Pro Cys Trp Asp Tyr Gln Tyr
515 520 525
His Leu Asn Gly Asp Ile Gly Leu Ala Met Ile Asn Gln Trp Val Ala
530 535 540
Ser Gly Asp Thr Ala Trp Phe Lys Asn Tyr Leu Phe Pro Ile Tyr Asp
545 550 555 560
Ala Ala Ala Thr Leu Tyr Ser Glu Leu Val Glu Arg Asn Gly Ser Ser
565 570 575
Trp Thr Leu Thr Asn Met Thr Asp Pro Asp Glu Tyr Ala Asn Ser Ile
580 585 590
Asn Ala Gly Gly Tyr Thr Met Pro Leu Ile Ala Glu Thr Leu Gln Asn
595 600 605
Ala Asn Lys Leu Arg Lys Gln Phe Gly Leu Glu Pro Asn Glu Thr Trp
610 615 620
Asp Glu Ile Ala Glu Asp Val Leu Ile Leu Arg Glu Asn Gly Val Thr
625 630 635 640
Leu Glu Tyr Thr Ser Met Asn Gly Ser Ala Val Val Lys Gln Ala Asp
645 650 655
Ile Val Leu Asn Thr Phe Pro Leu Thr Tyr Glu Ser Asp Asn Tyr Thr
660 665 670
Ala Thr Asn Ser Leu Thr Asp Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Gln Ser
675 680 685
Ala Asp Gly Pro Ala Met Thr Tyr Ala Ile Phe Ala Ile Val Ala Ser
690 695 700
Asp Val Ser Pro Ser Gly Cys Ser Ala Phe Thr Tyr His Gln Tyr Ser
705 710 715 720
Tyr Ala Pro Tyr Ala Arg Gly Pro Trp Tyr Gln Leu Ser Glu Gln Met
725 730 735
Ile Asp Asp Ala Ser Ile Asn Gly Gly Thr His Pro Ala Phe Pro Phe
740 745 750
Leu Thr Gly His Gly Gly Ala Asn Gln Val Ala Leu Tyr Gly Tyr Leu
755 760 765
Gly Leu Arg Leu His Pro Asp Asp Thr Ile Tyr Ile Asp Pro Asn Leu
770 775 780
Pro Pro Gln Ile Pro His Ile Thr Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp His Gly
785 790 795 800
Trp Pro Ile Ser Ala Trp Ser Asn Tyr Thr His Thr Thr Ile Gln Arg
805 810 815
Asp Ser Ser Leu Ala Pro Leu Ala Ser Ala Asp Leu Leu Phe Ser Asn
820 825 830
Val Ser Ile Lys Val Gln Val Gly Gln Ser Thr Ala Ser Ala Asp Glu
835 840 845
Ala Thr Ile Tyr Tyr Leu Pro Leu Ser Gly Ala Leu Thr Val Pro Asn
850 855 860
Arg Met Ile Gly Ser Val Asn Thr Thr Pro Gly Asn Gln Val Gln Cys
865 870 875 880
His Pro Val Tyr Ser Pro Asp Ala Tyr Glu Pro Gly Gln Phe Pro Ile
885 890 895
Ser Ala Val Asp Gly Ala Thr Ser Thr Lys Trp Gln Pro Ser Thr Ser
900 905 910
Asp Leu Thr Ser Leu Thr Val Thr Leu Ser Thr Thr Ala Glu Ala Gly
915 920 925
Ala Glu Glu Val Ser Gly Phe Tyr Phe Asp Trp Ser Gln Ala Pro Pro
930 935 940
Glu Asn Leu Thr Val Ile Phe His Asp Ser Pro Ile Gly Asn Pro Ser
945 950 955 960
Thr Val Phe Ala Ala Ala Gly Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Arg Val Ile
965 970 975
Thr Ser Met Ser Asn Ile Val Gln Ser Lys Pro Tyr Asn Ala Ile Ser
980 985 990
Ala Glu Glu Leu Asn Val Val Ser Ile Pro Thr Ala Asn Thr Thr Thr
995 1000 1005
Ile Thr Leu Asp Ala Pro Val Gln Lys Ala Arg Tyr Ala Thr Leu
1010 1015 1020
Leu Ile Ala Gly Asn Gln Ala Asn Glu Thr Ala Gly Ala Thr Val
1025 1030 1035
Ala Glu Trp Val Ile Leu Gly Gln Asn Ser Thr Ser Ser Ser Ser
1040 1045 1050
Ala Gln Ala Lys Arg Lys Met Ser Ala Arg Ser Lys Ala Thr Leu
1055 1060 1065
Ala Gln Leu Ser
1070
<210> 4
<211> 598
<212> PRT
<213> 埃默森篮状菌
<400> 4
Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu
1 5 10 15
Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly
20 25 30
Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala
35 40 45
Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp
50 55 60
Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn
65 70 75 80
Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys
85 90 95
Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu
100 105 110
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp
115 120 125
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile
130 135 140
Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp
145 150 155 160
Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln
165 170 175
Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser
180 185 190
Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn
195 200 205
Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln
210 215 220
Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr
225 230 235 240
Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn
245 250 255
Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp
260 265 270
Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys
275 280 285
Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile
290 295 300
Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr
305 310 315 320
Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln
325 330 335
Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile
340 345 350
Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala
355 360 365
Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser
370 375 380
Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly
405 410 415
Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu
420 425 430
Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu
435 440 445
Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr
450 455 460
Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser
465 470 475 480
Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser
485 490 495
Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr
500 505 510
Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala
515 520 525
Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu
530 535 540
Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys
545 550 555 560
Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro
565 570 575
Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile
580 585 590
Leu Asp Asp Ser Trp Gln
595
<210> 5
<211> 556
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌
<400> 5
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 6
<211> 559
<212> PRT
<213> 密粘褶菌
<400> 6
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu
465 470 475 480
Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro
485 490 495
Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile
500 505 510
Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg
515 520 525
Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 7
<211> 583
<212> PRT
<213> 微小根毛霉
<400> 7
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580
<210> 8
<211> 515
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌
<400> 8
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
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420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp Pro
515
<210> 9
<211> 413
<212> PRT
<213> 强烈火球菌
<400> 9
Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val
35 40 45
Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp
50 55 60
His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala
85 90 95
Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile
100 105 110
Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile
115 120 125
Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr
130 135 140
Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val
145 150 155 160
Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly
165 170 175
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys
180 185 190
Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly
195 200 205
Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala
210 215 220
Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr
225 230 235 240
Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys
260 265 270
Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala
275 280 285
Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn
290 295 300
Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys
305 310 315 320
Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr
325 330 335
Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu
340 345 350
Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr
355 360 365
Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr
370 375 380
Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val
385 390 395 400
Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro
405 410
<210> 10
<211> 595
<212> PRT
<213> 草酸青霉
<400> 10
Arg Pro Asp Pro Lys Gly Gly Asn Leu Thr Pro Phe Ile His Lys Glu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn Leu Gly Gly Arg Gly
20 25 30
Lys Lys Thr Pro Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe Ile Ala Ser Pro Asn
35 40 45
Thr Glu Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Lys Cys Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp Ser Arg Ala Lys Phe
65 70 75 80
Pro Ile Asp Arg Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile Arg Asp Tyr Lys Ser
85 90 95
Ser Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Lys
100 105 110
Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Ile Asp Leu Asn Pro
115 120 125
Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg
130 135 140
Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Ser His Gly Gln
145 150 155 160
Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro Ile Ile Ala Asn Asp Leu
165 170 175
Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu
180 185 190
Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala
195 200 205
Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu Gln Ser Phe
225 230 235 240
Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn Thr Gln Ala Ser Arg
245 250 255
Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp
260 265 270
Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg
275 280 285
Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr
290 295 300
Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala Ala Asn Val Gly Arg
305 310 315 320
Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr
325 330 335
Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Arg
340 345 350
Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu Ser Phe Phe Lys Asp
355 360 365
Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr Ser Arg Asn Ser Lys Thr
370 375 380
Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr Ala Asp Gly Phe Ile
385 390 395 400
Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ser Leu Ala Glu Gln
405 410 415
Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala Asn Asp Leu Thr Trp
420 425 430
Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg Arg Asp Ala Val Val
435 440 445
Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys Val Pro Thr Thr Cys
450 455 460
Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala Pro Thr Ala Thr Phe
465 470 475 480
Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp Ile Val Pro Ile Thr
485 490 495
Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Val Phe Met Ser
500 505 510
Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala Lys Lys Gly Phe Pro
515 520 525
Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn Leu Trp Phe Ala Ser
530 535 540
Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu Tyr Lys Tyr Tyr Lys
545 550 555 560
Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Gly Pro Asn Arg Val
565 570 575
Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro His Ser Asn Asp Val
580 585 590
Trp Gln Phe
595
<210> 11
<211> 556
<212> PRT
<213> 瓣环栓菌
<400> 11
Gln Ser Ser Ala Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala
1 5 10 15
Lys Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Ser Gly Ser Lys Ser Asn
20 25 30
Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro
35 40 45
Asn Tyr Leu Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ala
50 55 60
Leu Ile Asp Gln Phe Thr Thr Gly Glu Asp Thr Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Glu Phe Thr Ser Ala Glu Ala Ile Leu Gln Gln Val Pro Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Ile Asp Glu Thr Ala Phe Thr Asp Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Asp Asn Lys Asn Thr Thr Tyr Val Thr Asn Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Lys Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Ser Asn Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Ile Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Asn Arg Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asn Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Val Leu
245 250 255
Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala Val Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Ile Val Trp Asn Lys Leu Gly Ala Leu Asn Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Val Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Phe Lys Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Thr Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Ser Asn Gly Ser Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ser Phe
420 425 430
Ala Ala Arg Ser Gly Lys Thr Tyr Ala Ser Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Thr Cys Ser Gly Ser Gly Gly Ala Gly Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Ile Thr Gly Ser Val Pro Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Ile Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Thr Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Phe Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Thr Phe Thr Gln Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 12
<211> 555
<212> PRT
<213> 血红密孔菌
<400> 12
Gln Ser Ser Ala Val Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala
1 5 10 15
Lys Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala His
20 25 30
Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Glu Asn Pro
35 40 45
Asp Tyr Leu Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Leu
50 55 60
Leu Ile Asp Gln Phe Thr Ser Gly Asp Asp Thr Ser Leu Arg Gly Leu
65 70 75 80
Ile Asp Asp Phe Thr Ser Ala Glu Ala Ile Leu Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Ile Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Asp Asn Gly Asn Thr Thr Tyr Val Ser Asn Thr Leu Trp Pro Val
145 150 155 160
Ile Gln Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Asp Asn Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Ser Arg Ile
195 200 205
Gly Gln Ser Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Val Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ser Asn Thr Val Leu
245 250 255
Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Ile Asn Asn Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Tyr Val Trp Asp Gln Leu Gly Gly Leu Asn Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Ser Thr Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ala Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Thr Ser Ala Ile Arg
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ala
385 390 395 400
Asp Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Asn Asp Gly Thr Pro Leu
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Ala Ala Arg Glu Gly Lys Thr Tyr Gly Ser Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Ala Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Val Ala Val
450 455 460
Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile Tyr Ile
465 470 475 480
Thr Gly Ser Val Ala Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp Asn Ala Leu
485 490 495
Ile Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn Leu
500 505 510
Pro Ala Asn Thr Val Val Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Phe Asn Gly
515 520 525
Gln Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Gln Ile Thr Thr Pro Ser
530 535 540
Gly Gly Ser Phe Thr Gln Asn Asp Val Trp Arg
545 550 555
<210> 13
<211> 177
<212> PRT
<213> 桔橙嗜热子囊菌
<400> 13
Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr
1 5 10 15
Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser
35 40 45
Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg
50 55 60
Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp
65 70 75 80
Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser
85 90 95
Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala
100 105 110
Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Ala Leu His
115 120 125
Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu
130 135 140
Ala Tyr Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val
145 150 155 160
Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly
165 170 175
Cys
<210> 14
<211> 844
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 14
Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asp
1 5 10 15
Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val Glu Ile Val
20 25 30
Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly
35 40 45
Trp Glu Met Asp Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser Val Pro Arg Leu
50 55 60
Gly Ile Asn Trp Gly Leu Cys Gly Gln Asp Ser Pro Leu Gly Ile Arg
65 70 75 80
Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn Val Ala Ala
85 90 95
Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala Met Gly Glu
100 105 110
Glu Phe Asn Asp Lys Gly Val Asp Ile Leu Leu Gly Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu Gly Phe Ser
130 135 140
Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly
145 150 155 160
Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Leu Asn
165 170 175
Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Tyr
180 185 190
Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr Met His
195 200 205
Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly
210 215 220
Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln
225 230 235 240
Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln
245 250 255
Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala His His Ser Gly Val Gly Ala
260 265 270
Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Ser Phe Asp
275 280 285
Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Val Leu Asn
290 295 300
Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met
305 310 315 320
Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile Pro Pro Asn
325 330 335
Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His Ser Ala Val
340 345 350
Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn Val Gln Arg
355 360 365
Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser Thr Val Leu
370 375 380
Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Val Lys Val
385 390 395 400
Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly Ala Asn Gly
405 410 415
Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala Trp Gly
420 425 430
Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile
435 440 445
Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp
450 455 460
Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln Ser Ser Val
465 470 475 480
Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe Ile Ser Val
485 490 495
Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Lys Asn Gly
500 505 510
Glu Ala Val Ile Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn Thr Ile Val
515 520 525
Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Arg Trp Tyr Asp Asn
530 535 540
Pro Asn Val Thr Ala Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser
545 550 555 560
Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Ser Ala
565 570 575
Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr Gly Ala Pro
580 585 590
Leu Leu Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Asp Asp Phe
595 600 605
Asn Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys Arg Asn Glu
610 615 620
Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Gly
625 630 635 640
Tyr Ser His Leu Arg Val Gln Ala Leu Asn Ser Ser Ser Ser Ala Tyr
645 650 655
Val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr Gly Glu Ile
660 665 670
Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys Arg Ile Thr
675 680 685
Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu Asp Ser Ser
690 695 700
Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Gly
705 710 715 720
Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly Gly Ala Pro
725 730 735
Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val Ser Ala Thr
740 745 750
Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro Gln Leu Tyr
755 760 765
Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu Arg Lys Phe
770 775 780
Asp Arg Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys Val Trp Thr Thr Thr
785 790 795 800
Leu Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Glu Ala Gln Asp Trp
805 810 815
Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser Ser Ser Arg
820 825 830
Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr
835 840
<210> 15
<211> 227
<212> PRT
<213> 桔橙嗜热子囊菌
<400> 15
Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser Asn Pro Pro Glu Val Ile Ala
20 25 30
Trp Ser Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr
35 40 45
Gln Thr Pro Asp Ile Ile Cys His Arg Gly Ala Lys Pro Gly Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Pro Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro
65 70 75 80
Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile Asn Tyr Leu Ala Pro Cys
85 90 95
Asn Gly Asp Cys Ser Thr Val Asp Lys Thr Gln Leu Glu Phe Phe Lys
100 105 110
Ile Ala Glu Ser Gly Leu Ile Asn Asp Asp Asn Pro Pro Gly Ile Trp
115 120 125
Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Ala Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile
130 135 140
Pro Thr Thr Ile Ala Pro Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile Ile
145 150 155 160
Ala Leu His Ser Ala Gln Asn Gln Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln
165 170 175
Cys Ile Asn Leu Gln Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp Asn Pro Ala Gly
180 185 190
Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile
195 200 205
Asn Ile Tyr Gln Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Ile Pro Gly Pro Pro Leu
210 215 220
Tyr Thr Gly
225
<210> 16
<211> 228
<212> PRT
<213> 埃默森青霉菌
<400> 16
His Gly Phe Val Gln Gly Ile Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Asn Pro Pro Pro Val Ile
20 25 30
Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly
35 40 45
Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile Cys His Arg Asn Ala Thr Pro Ala Pro
50 55 60
Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr
65 70 75 80
Pro Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile Thr Tyr Leu Ala Pro
85 90 95
Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr Val Asp Lys Thr Thr Leu Glu Phe Phe
100 105 110
Lys Ile Asp Gln Gln Gly Leu Ile Asp Asp Thr Ser Pro Pro Gly Thr
115 120 125
Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Asn Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr
130 135 140
Ile Pro Asn Ser Val Ala Pro Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile
145 150 155 160
Ile Ala Leu His Ser Ala Asn Asn Lys Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro
165 170 175
Gln Cys Ile Asn Ile Glu Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ala Pro Glu
180 185 190
Gly Thr Leu Gly Glu Asp Leu Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu
195 200 205
Val Asp Ile Tyr Glu Pro Ile Ala Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro
210 215 220
Glu Pro Thr Phe
225
<210> 17
<211> 506
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 17
Gln Gln Val Gly Thr Ser Gln Ala Glu Val His Pro Ser Met Thr Trp
1 5 10 15
Gln Ser Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Asn Asn Gly Lys Val
20 25 30
Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Lys Val Gly Asp Tyr Thr
35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Thr Ile Cys Pro Asp Asp
50 55 60
Ala Thr Cys Ala Ser Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asn Tyr Glu Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Ala Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val
85 90 95
Thr Thr Ser Gln Gln Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Met Met Lys
100 105 110
Asp Asp Ser Thr Tyr Glu Met Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr
115 120 125
Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys
165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp
180 185 190
Gln Pro Ser Ser Asn Asp Ala Asn Ala Gly Thr Gly Asn His Gly Ser
195 200 205
Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala
210 215 220
Phe Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly
225 230 235 240
Asp Ala Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys
245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Phe Arg Gln Gly Asn Lys Thr
260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Gly Met Thr Val Asp Thr Lys Ser Lys Phe Thr Val
275 280 285
Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Ser Ser Gly Thr Leu Lys
290 295 300
Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser
305 310 315 320
Glu Ser Thr Trp Thr Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr
325 330 335
Cys Thr Ala Gln Lys Ser Leu Phe Gln Asp Gln Asn Val Phe Glu Lys
340 345 350
His Gly Gly Leu Glu Gly Met Gly Ala Ala Leu Ala Gln Gly Met Val
355 360 365
Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ser Ala Asn Met Leu Trp Leu
370 375 380
Asp Ser Asn Tyr Pro Thr Thr Ala Ser Ser Thr Thr Pro Gly Val Ala
385 390 395 400
Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ala
405 410 415
Asn His Pro Asp Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro
420 425 430
Ile Gly Ser Thr Phe Asn Ser Gly Gly Ser Asn Pro Gly Gly Gly Thr
435 440 445
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Gly
450 455 460
Asn Pro Gly Gly Thr Gly Val Ala Gln His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly
465 470 475 480
Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln
485 490 495
Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
500 505
<210> 18
<211> 435
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 18
Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly Pro
1 5 10 15
Thr Ser Cys Val Ala Gly Ala Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr
20 25 30
Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr Leu Thr Thr
35 40 45
Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ser Gln Thr Thr Thr Lys Pro Thr Thr
50 55 60
Thr Gly Pro Thr Thr Ser Ala Pro Thr Val Thr Ala Ser Gly Asn Pro
65 70 75 80
Phe Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ser Ser Glu Val
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100 105 110
Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Val Trp Leu Asp Val Ala Ala
115 120 125
Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asp Ile Gln Ala Lys Asn
130 135 140
Lys Ala Gly Ala Asn Pro Pro Ile Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp
145 150 155 160
Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser
165 170 175
Ile Ala Asn Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr Ile Asp Ala Ile
180 185 190
Arg Ala Gln Leu Val Lys Tyr Ser Asp Val His Thr Ile Leu Val Ile
195 200 205
Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Asn Val Ala Lys
210 215 220
Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Val Asp Tyr Ala Leu
225 230 235 240
Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His
245 250 255
Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu
260 265 270
Phe Ala Lys Val Tyr Thr Asp Ala Gly Ser Pro Ala Ala Val Arg Gly
275 280 285
Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Leu Ser Thr Cys
290 295 300
Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ile
305 310 315 320
Asn Ala Met Ala Pro Leu Leu Lys Glu Ala Gly Phe Asp Ala His Phe
325 330 335
Ile Met Asp Thr Ser Arg Asn Gly Val Gln Pro Thr Lys Gln Asn Ala
340 345 350
Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro
355 360 365
Ser Thr Asn Thr Gly Asp Pro Leu Gln Asp Ala Phe Val Trp Ile Lys
370 375 380
Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser Thr Ser Pro Arg Tyr
385 390 395 400
Asp Ala His Cys Gly Tyr Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala
405 410 415
Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn
420 425 430
Pro Ser Phe
435
<210> 19
<211> 547
<212> PRT
<213> 大型亚灰树花菌
<400> 19
Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg Glu Asp Leu
1 5 10 15
Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu
20 25 30
Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Asn Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp
35 40 45
Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn His
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser
65 70 75 80
Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Asp Ala His
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser
100 105 110
Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp
115 120 125
Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala
130 135 140
Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro
145 150 155 160
Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg
165 170 175
Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr
180 185 190
Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr
195 200 205
Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala
210 215 220
Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile
225 230 235 240
Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn
245 250 255
Asp Gln Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ile Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln
260 265 270
Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val
275 280 285
Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asn Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile
290 295 300
Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Asn Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu
325 330 335
Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe
340 345 350
Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala His Cys Ser
355 360 365
Asn Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val
370 375 380
Gly Ala Thr Gln Gly Val Ser Pro Glu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser
385 390 395 400
Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala
405 410 415
Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe
420 425 430
Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly Val Asp
435 440 445
Phe Gln Ile Val Ser Gly Gly Gln Thr Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser
450 455 460
Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Val Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg
465 470 475 480
Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Ala Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser
500 505 510
Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp
515 520 525
Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala
530 535 540
Val Gly Leu
545
<210> 20
<211> 3164
<212> DNA
<213> 绳状篮状菌
<400> 20
atgtatagtg caacgctact tcaggccctg tgccttctgc ccttggccgc aggactcccg 60
ttcaacgagc gagtagatca agtcctccgc tcatatgagg tgacctcaaa actcgactcc 120
cgcagcacca aaccttcaaa acatggccac acctaccaga ctcaattcct cggcgtaacc 180
tgggaccaac gcaactggcg cctccaaagc accgtcctcg atcagggaca ttatgagtct 240
cgtggatcca ttgccaacgg ctacattggc ctaaacgtcg ccggtgctgg ccccttgttt 300
gagctggatt cccccgtcga tggcgatgta atcaatggct ggcctctgtt ttcgcgtcga 360
cagacgtttg ctgggttagc gggattttac gatttacagc ctagaactaa tggtacgaat 420
tttccgtggt tgtctcagta tggcgatgat agcgcaatta gcggtgtgcc gcattggggt 480
gggatggtct tagatttggg tgacggagag tatctcgatg cgacggtgga caattccacc 540
atatcggatt atacgactac ttatgattat aaagcgggtg ttttgtcgtg ggattacaaa 600
tggaccccga aaaatgccaa tgggtcgttt ggaataagct acaagatctt tgcgaacaag 660
cttgatgtta atcaggctgt ggtgcaattg agcattactc cgtcgacgaa tgggtcagcg 720
tctgtggtga atgtgattga tggatatgcc gctgttcgga cggactttgt ctcatcgggg 780
aatgagagtg acgttgtcta caccgctgtc aaacctaatg gcgtgaccaa tgttaccgca 840
tggatctata ctgcgttgga tggagatgat gcttttgaca tttcttcggc ggctcttgtg 900
aacgataagc catacgtgca tcaaaatgac tcttcgattg cgcagtctgt caatgttaca 960
ttcactgccg gtactaccat cacgatcaac aaatttgtcg gcgctgcatc taccgatgca 1020
ttcccggacc ctcaaagcac cgccagagaa gctgccttgt ctgctcgtcg cagaggcttt 1080
gacgacctct tccgctctca catctccgaa tgggctcaag tcatgcccga cgactccgtc 1140
gacgatttca cactcgcaaa cggcactcta cccaatgaca cgttcatcat cgaatctgct 1200
gtaatggccg ttgtaaatcc ttactaccta ctacagaata cggttgggcc aaatgctctt 1260
cgtcgagtaa acaatgcccc ggtcaatgac tggagtatac ccgtcggcgg tctgacgtcg 1320
gattcttacg ctggacaaat cttctgggat gccgatgtct ggatgcagcc tggcctggtc 1380
gcagcattcc ctgaatctgc taagcgtatc actaattacc gagcagccaa atattcccaa 1440
gccctggaaa atgcaaagac ggcatacact agttcccaga accagacgtg gttctcgccc 1500
gatgctgcaa tttactcatg gactagtgga agagtcggca actgtactgc cacaggtcca 1560
tgctgggatt atgaatatca cttgaacggc gacatcggaa tttcgcttgt caacgagtgg 1620
gttgtcagcg gtgataacga gactttcaag aacaagcatt tcccaattta caactccatt 1680
gcgacgttgt atggagactt gttgaaaaag aatggtagtt attacacact cactaacatg 1740
actgatcctg atgaatatgc aaacaatgtt gatgctggtg gatatacgat gacgctgatt 1800
tcgcagacgt tgtcgaatgc caacgcattc cggaaacagt ttggcatgaa cgagaacaca 1860
acctggacag agatggcaga caacattctc ttgattcgcg agaatgatgt aaccctcgag 1920
tatacaacta tgaacaacag tgtggccgtc aaacaggccg atgtgattct gtccaccttc 1980
ccattggact ataccaaaaa ctacaccacc agcgctgctc tcaatgatct agattacgta 2040
tgttctccct atccagtcat tcaataacct gctaacattc acagtacgcg ctgaaacaat 2100
ctcctgacgg tcccggcatg acatacgcca tcttctccat cgttgccaac gacgtttccc 2160
catctggctg ctcagcatac acctatgccc aatattccta cgacccgtac atccgcggac 2220
catttttcca attctccgaa caactactag atgactatac tatcaatggc ggcacgcatc 2280
ccgccttccc ctttttgact ggtcacggag gcgcaaacca ggtcgttctg tacgggtatc 2340
tgggtctgag gctgctaccg gacgatatgt tgcatatcga tcccaaccta ccgcctcaaa 2400
ttcccagcat taaatatcgc actttctact ggcgcggatg gcccatccaa gcagcctcaa 2460
attacacaca cactaccatt caacgcgcaa caacagtcgc gccattatca accgccgacc 2520
caacctacgc taataagagc atacatgtct cggtcggcca caacaccgtc aactccacaa 2580
cctattccct gtctgcgaac gggtctgcgc tcgttgtgcc taacagacaa atcggctcca 2640
tcaacactgt tgctggcaac gtggtgcagt gcaaatccgt tttgtcgaca gacgcatacc 2700
aaaaggggca ataccccatc tcggcggttg atggtgcagc gtcgacgaag tggcagcctg 2760
agtttgcggc gaacattagc tctttgacag tggatctgac cggtagcaat gttagtagtg 2820
tgtctgggtt ctattttgat tgggctcagg caccgcctac caatatcact gtactcctac 2880
acaactcgtc atctgcagca ctcgcttctt ctggcgacaa acctggaagc tcggcagtga 2940
cattgaatat aacaatctca aacccctaca acgcatcaac ctacaacgcg aatatcatcg 3000
cattaccttc tagtaattcg acaaactata cgttcccggc accggtacca aagccgaggt 3060
atgcaacctt gtttgtgcag gggaatcagg cgctggatga gacagataca aaatctggga 3120
atggtaccgg agcgacggtt gcggagtggg cgatattgag ttga 3164
<210> 21
<211> 1038
<212> PRT
<213> 绳状篮状菌
<400> 21
Met Tyr Ser Ala Thr Leu Leu Gln Ala Leu Cys Leu Leu Pro Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Leu Pro Phe Asn Glu Arg Val Asp Gln Val Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Glu Val Thr Ser Lys Leu Asp Ser Arg Ser Thr Lys Pro Ser Lys His
35 40 45
Gly His Thr Tyr Gln Thr Gln Phe Leu Gly Val Thr Trp Asp Gln Arg
50 55 60
Asn Trp Arg Leu Gln Ser Thr Val Leu Asp Gln Gly His Tyr Glu Ser
65 70 75 80
Arg Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ile Gly Leu Asn Val Ala Gly Ala
85 90 95
Gly Pro Leu Phe Glu Leu Asp Ser Pro Val Asp Gly Asp Val Ile Asn
100 105 110
Gly Trp Pro Leu Phe Ser Arg Arg Gln Thr Phe Ala Gly Leu Ala Gly
115 120 125
Phe Tyr Asp Leu Gln Pro Arg Thr Asn Gly Thr Asn Phe Pro Trp Leu
130 135 140
Ser Gln Tyr Gly Asp Asp Ser Ala Ile Ser Gly Val Pro His Trp Gly
145 150 155 160
Gly Met Val Leu Asp Leu Gly Asp Gly Glu Tyr Leu Asp Ala Thr Val
165 170 175
Asp Asn Ser Thr Ile Ser Asp Tyr Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Lys Ala
180 185 190
Gly Val Leu Ser Trp Asp Tyr Lys Trp Thr Pro Lys Asn Ala Asn Gly
195 200 205
Ser Phe Gly Ile Ser Tyr Lys Ile Phe Ala Asn Lys Leu Asp Val Asn
210 215 220
Gln Ala Val Val Gln Leu Ser Ile Thr Pro Ser Thr Asn Gly Ser Ala
225 230 235 240
Ser Val Val Asn Val Ile Asp Gly Tyr Ala Ala Val Arg Thr Asp Phe
245 250 255
Val Ser Ser Gly Asn Glu Ser Asp Val Val Tyr Thr Ala Val Lys Pro
260 265 270
Asn Gly Val Thr Asn Val Thr Ala Trp Ile Tyr Thr Ala Leu Asp Gly
275 280 285
Asp Asp Ala Phe Asp Ile Ser Ser Ala Ala Leu Val Asn Asp Lys Pro
290 295 300
Tyr Val His Gln Asn Asp Ser Ser Ile Ala Gln Ser Val Asn Val Thr
305 310 315 320
Phe Thr Ala Gly Thr Thr Ile Thr Ile Asn Lys Phe Val Gly Ala Ala
325 330 335
Ser Thr Asp Ala Phe Pro Asp Pro Gln Ser Thr Ala Arg Glu Ala Ala
340 345 350
Leu Ser Ala Arg Arg Arg Gly Phe Asp Asp Leu Phe Arg Ser His Ile
355 360 365
Ser Glu Trp Ala Gln Val Met Pro Asp Asp Ser Val Asp Asp Phe Thr
370 375 380
Leu Ala Asn Gly Thr Leu Pro Asn Asp Thr Phe Ile Ile Glu Ser Ala
385 390 395 400
Val Met Ala Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr Val Gly
405 410 415
Pro Asn Ala Leu Arg Arg Val Asn Asn Ala Pro Val Asn Asp Trp Ser
420 425 430
Ile Pro Val Gly Gly Leu Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Gly Gln Ile Phe
435 440 445
Trp Asp Ala Asp Val Trp Met Gln Pro Gly Leu Val Ala Ala Phe Pro
450 455 460
Glu Ser Ala Lys Arg Ile Thr Asn Tyr Arg Ala Ala Lys Tyr Ser Gln
465 470 475 480
Ala Leu Glu Asn Ala Lys Thr Ala Tyr Thr Ser Ser Gln Asn Gln Thr
485 490 495
Trp Phe Ser Pro Asp Ala Ala Ile Tyr Ser Trp Thr Ser Gly Arg Val
500 505 510
Gly Asn Cys Thr Ala Thr Gly Pro Cys Trp Asp Tyr Glu Tyr His Leu
515 520 525
Asn Gly Asp Ile Gly Ile Ser Leu Val Asn Glu Trp Val Val Ser Gly
530 535 540
Asp Asn Glu Thr Phe Lys Asn Lys His Phe Pro Ile Tyr Asn Ser Ile
545 550 555 560
Ala Thr Leu Tyr Gly Asp Leu Leu Lys Lys Asn Gly Ser Tyr Tyr Thr
565 570 575
Leu Thr Asn Met Thr Asp Pro Asp Glu Tyr Ala Asn Asn Val Asp Ala
580 585 590
Gly Gly Tyr Thr Met Thr Leu Ile Ser Gln Thr Leu Ser Asn Ala Asn
595 600 605
Ala Phe Arg Lys Gln Phe Gly Met Asn Glu Asn Thr Thr Trp Thr Glu
610 615 620
Met Ala Asp Asn Ile Leu Leu Ile Arg Glu Asn Asp Val Thr Leu Glu
625 630 635 640
Tyr Thr Thr Met Asn Asn Ser Val Ala Val Lys Gln Ala Asp Val Ile
645 650 655
Leu Ser Thr Phe Pro Leu Asp Tyr Thr Lys Asn Tyr Thr Thr Ser Ala
660 665 670
Ala Leu Asn Asp Leu Asp Tyr Tyr Ala Leu Lys Gln Ser Pro Asp Gly
675 680 685
Pro Gly Met Thr Tyr Ala Ile Phe Ser Ile Val Ala Asn Asp Val Ser
690 695 700
Pro Ser Gly Cys Ser Ala Tyr Thr Tyr Ala Gln Tyr Ser Tyr Asp Pro
705 710 715 720
Tyr Ile Arg Gly Pro Phe Phe Gln Phe Ser Glu Gln Leu Leu Asp Asp
725 730 735
Tyr Thr Ile Asn Gly Gly Thr His Pro Ala Phe Pro Phe Leu Thr Gly
740 745 750
His Gly Gly Ala Asn Gln Val Val Leu Tyr Gly Tyr Leu Gly Leu Arg
755 760 765
Leu Leu Pro Asp Asp Met Leu His Ile Asp Pro Asn Leu Pro Pro Gln
770 775 780
Ile Pro Ser Ile Lys Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp Pro Ile
785 790 795 800
Gln Ala Ala Ser Asn Tyr Thr His Thr Thr Ile Gln Arg Ala Thr Thr
805 810 815
Val Ala Pro Leu Ser Thr Ala Asp Pro Thr Tyr Ala Asn Lys Ser Ile
820 825 830
His Val Ser Val Gly His Asn Thr Val Asn Ser Thr Thr Tyr Ser Leu
835 840 845
Ser Ala Asn Gly Ser Ala Leu Val Val Pro Asn Arg Gln Ile Gly Ser
850 855 860
Ile Asn Thr Val Ala Gly Asn Val Val Gln Cys Lys Ser Val Leu Ser
865 870 875 880
Thr Asp Ala Tyr Gln Lys Gly Gln Tyr Pro Ile Ser Ala Val Asp Gly
885 890 895
Ala Ala Ser Thr Lys Trp Gln Pro Glu Phe Ala Ala Asn Ile Ser Ser
900 905 910
Leu Thr Val Asp Leu Thr Gly Ser Asn Val Ser Ser Val Ser Gly Phe
915 920 925
Tyr Phe Asp Trp Ala Gln Ala Pro Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Leu
930 935 940
His Asn Ser Ser Ser Ala Ala Leu Ala Ser Ser Gly Asp Lys Pro Gly
945 950 955 960
Ser Ser Ala Val Thr Leu Asn Ile Thr Ile Ser Asn Pro Tyr Asn Ala
965 970 975
Ser Thr Tyr Asn Ala Asn Ile Ile Ala Leu Pro Ser Ser Asn Ser Thr
980 985 990
Asn Tyr Thr Phe Pro Ala Pro Val Pro Lys Pro Arg Tyr Ala Thr Leu
995 1000 1005
Phe Val Gln Gly Asn Gln Ala Leu Asp Glu Thr Asp Thr Lys Ser
1010 1015 1020
Gly Asn Gly Thr Gly Ala Thr Val Ala Glu Trp Ala Ile Leu Ser
1025 1030 1035
<210> 22
<211> 3608
<212> DNA
<213> 嗜热篮状菌
<400> 22
atgcagtcaa agctcctggc tctgctgccg cttctgctgc aactccctgc agtaagcggc 60
acgtctgcca acgcgcgcat caacagatgc gtcaagaaac acgcaggtgg gaaaacccca 120
agtggcccat ccaacaacac ctatcaaacc agattccccg gagtcacctg ggaccaggac 180
aactggtgcc tctccacgac caccctggac cagggtcact acgaatcgcg cggctccgtc 240
gccaatgggt acttgggtat taatgttgcc agcgttggcc cgttcttcga atttgacaca 300
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accatcagtg gcttctggga ccagcagccc acgacgaatg gatccaactt cccctggctg 420
tatcagtacg gtggtgagag cgtcatcagc ggtgtgcctc actggagcgg cctgattctc 480
gatctgggcg acaacaccta cttggacgcg acggtggaca gccgcaccat ttcgggcttc 540
agcacgacgt atgacttcaa gtcgggtgtt ctgtcctggt cctatcagtg gactcccgcc 600
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caggccgtcg tggacatgga ggttgtctcc tcgacggaag caaaggccac cgtcgtgaac 720
gtgattgatg gtgcctcggc tgtccgcacg gattttgtgg aatccggcca ggatgacggt 780
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aacatcacgg gctccgacaa cgtggacatg cgctctcgcg cgctggttac gaacaagccg 900
tacgtcaacg gcaatgcctc gtccatcacg caagccgtca acgttcactt cactcctgga 960
aagagcgttc gcatcaccaa gtttgtcggc ggtgcctcgt cggatgcgtt ttccaaccct 1020
cagcagatcg ccaagcaggc ttgttcgacc gcccaggcca acggatatgt gaagtcgctg 1080
cgttcccacg ttgccgagtg ggccagcgtc atgccggatg actctgtcga tgactttacc 1140
ttccccagca atggcactct gcccgcagat gagtacatca tcgaatcgca aatcatctcc 1200
gtggcgaata cgtactatct cttgcagaac acggtcggca agaacgccat caatgcatcc 1260
tcgagcaccg agctgaacaa ggactccatc gccgtcggtg gtctgacttc ggaatcgtac 1320
gccggtatga tcttctggga cgccgacgtc tggatgcaac cgggtcttgt cgcgtcccat 1380
cccgaggcgg cccagcgcat caccaactat cgagtggcca aatatcccca ggccaaagcg 1440
aacgttgcga ctgcctatca gagctctaag aaccagacaa acttctcccc ggacgcagct 1500
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tacgagtatc atttgaacgg cgatattgga ctgtccatca tcaatcagta tgtggccagc 1620
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tactcgaata ttgttcagaa gaatggctcg tcgtggactt tgactaacat gactgatcct 1740
gtatgtctct ccccttgtct cttgtctctt gttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980
tttttttttt tttttttggt ttgtgtgctt ggctgacgtg tctaggatga atatgcaaac 2040
caggtcgatg ccggtggtta caccatgccc ctgattgctc agacgctgtt gtacgccaac 2100
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tcagccgagc ctggaacgtc tcgtccctcg acagcgccga ccccaaattc gccaacgcct 2820
ccatccccgt ccacgtcggc ctcgaatcga acgtgaccgt ctaccgtctc cccgtcaacg 2880
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tgcagtgccg tcccgtccaa tccatggacg gctatcaacc cggccaattc cccatctccg 3000
tcgtcgacgg tgcctcctcc acgaaatggc aacctctcta ctctgcgaac gtctcctccg 3060
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ccgcgagata cgccacgctc ttcatccagg gtaaccaggc gaacagtccc gcggaggtgg 3420
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tcgattag 3608
<210> 23
<211> 1089
<212> PRT
<213> 嗜热篮状菌
<400> 23
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Ala Val Ser Gly Thr Ser Ala Asn Ala Arg Ile Asn Arg Cys Val Lys
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Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Ile Asn Val Ala Ser Val Gly Pro Phe Phe
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Glu Phe Asp Thr Pro Val Asp Gly Asp Val Ile Asn Gly Trp Pro Leu
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Phe Asp Arg Arg Met Ser Phe Ala Thr Ile Ser Gly Phe Trp Asp Gln
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Gln Pro Thr Thr Asn Gly Ser Asn Phe Pro Trp Leu Tyr Gln Tyr Gly
130 135 140
Gly Glu Ser Val Ile Ser Gly Val Pro His Trp Ser Gly Leu Ile Leu
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Asp Leu Gly Asp Asn Thr Tyr Leu Asp Ala Thr Val Asp Ser Arg Thr
165 170 175
Ile Ser Gly Phe Ser Thr Thr Tyr Asp Phe Lys Ser Gly Val Leu Ser
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Trp Ser Tyr Gln Trp Thr Pro Ala Gly Asn Met Gly Ser Tyr Asn Ile
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Thr Tyr Arg Leu Phe Ala His Lys Leu Tyr Val Asn Gln Ala Val Val
210 215 220
Asp Met Glu Val Val Ser Ser Thr Glu Ala Lys Ala Thr Val Val Asn
225 230 235 240
Val Ile Asp Gly Ala Ser Ala Val Arg Thr Asp Phe Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gln Asp Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Ala Val Arg Pro Trp Gly Ile Ala
260 265 270
Asn Val Thr Ala Tyr Ile Tyr Ala Asn Ile Thr Gly Ser Asp Asn Val
275 280 285
Asp Met Arg Ser Arg Ala Leu Val Thr Asn Lys Pro Tyr Val Asn Gly
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Asn Ala Ser Ser Ile Thr Gln Ala Val Asn Val His Phe Thr Pro Gly
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Val Ala Asn Thr Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr Val Gly Lys Asn Ala
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435 440 445
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450 455 460
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Asn Val Ala Thr Ala Tyr Gln Ser Ser Lys Asn Gln Thr Asn Phe Ser
485 490 495
Pro Asp Ala Ala Val Tyr Ser Trp Thr Ser Ala Arg Tyr Gly Asn Cys
500 505 510
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515 520 525
Ile Gly Leu Ser Ile Ile Asn Gln Tyr Val Ala Ser Gly Asp Thr Gln
530 535 540
Thr Phe Lys Glu Lys Leu Phe Pro Val Phe Asp Ser Val Ala Thr Leu
545 550 555 560
Tyr Ser Asn Ile Val Gln Lys Asn Gly Ser Ser Trp Thr Leu Thr Asn
565 570 575
Met Thr Asp Pro Asp Glu Tyr Ala Asn Gln Val Asp Ala Gly Gly Tyr
580 585 590
Thr Met Pro Leu Ile Ala Gln Thr Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Phe Arg
595 600 605
Gln Gln Phe Gly Leu Glu Thr Asn Asp Thr Trp Asn Glu Ile Ala Gln
610 615 620
Asp Val Leu Val Ile Arg Glu Asn Gly Val Thr Leu Glu Phe Thr Thr
625 630 635 640
Met Asn Gly Ser Ala Val Val Lys Gln Ala Asp Val Val Leu Asp Thr
645 650 655
Tyr Pro Leu Gly Tyr Thr His Asn Tyr Gly Pro Thr Asp Ala Leu Asn
660 665 670
Asp Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Arg Gln Ser Pro Asp Gly Pro Ala Met
675 680 685
Thr Trp Ala Ile Phe Ser Val Val Ala Asn Gln Ile Ser Pro Ser Gly
690 695 700
Cys Ser Ala Tyr Thr Tyr Ala Gln Tyr Ala Phe Ser Pro Tyr Ala Arg
705 710 715 720
Ala Pro Phe Tyr Gln Leu Ser Glu Gln Leu Ile Asp Asp Ala Ser Leu
725 730 735
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Ala Leu Gln Val Asn Leu Phe Gly Tyr Leu Gly Phe Arg Tyr Leu Pro
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Asp Asn Val Ile His Ile Asp Pro Asn Leu Pro Pro Gln Ile Pro His
770 775 780
Ile Thr Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp Pro Ile Thr Ala Ala
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Ser Thr Tyr Thr His Thr Thr Leu Ser Arg Ala Trp Asn Val Ser Ser
805 810 815
Leu Asp Ser Ala Asp Pro Lys Phe Ala Asn Ala Ser Ile Pro Val His
820 825 830
Val Gly Leu Glu Ser Asn Val Thr Val Tyr Arg Leu Pro Val Asn Gly
835 840 845
Thr Leu Thr Val Pro Asn Arg Met Val Gly Ser Lys Asn Thr Leu Ala
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Gly Asn Met Val Gln Cys Arg Pro Val Gln Ser Met Asp Gly Tyr Gln
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Pro Gly Gln Phe Pro Ile Ser Val Val Asp Gly Ala Ser Ser Thr Lys
885 890 895
Trp Gln Pro Leu Tyr Ser Ala Asn Val Ser Ser Val Thr Val Thr Leu
900 905 910
Ser Ser Ser Ala Val Gly Lys Ser Val Asn Gly Phe Tyr Phe Asp Trp
915 920 925
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Phe Ala Gln Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Phe Asp Asn Pro Ser Ala
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Ser Gly Asn Leu Tyr Ser Val Val Ser Val Leu Lys Asp Ile Gln Leu
965 970 975
Ser Asp Pro Tyr Asp Pro Ala Thr Thr Asp Leu Asp Val Ile Ala Ile
980 985 990
Pro Lys Gly Asn Thr Thr Asn Val Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Ala
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Ala Arg Tyr Ala Thr Leu Phe Ile Gln Gly Asn Gln Ala Asn Ser
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Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Asn Gly Thr Gly Ala Thr Val Ala
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<210> 24
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<212> DNA
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<223> PCR引物
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<212> DNA
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<400> 25
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<223> PCR引物
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<220>
<223> PCR引物
<400> 27
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<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 28
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<210> 29
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> PCR引物
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<220>
<223> PCR引物
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ctatatacac aactggggat ccaccatgta tagtgcaacg ctacttcagg ccctgtgcct 60
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<210> 32
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 32
tagagtcgac ccagccgcgc cggccactaa tcgaaccgcg gcaaaatcat ct 52
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PCR引物
<400> 33
tagagtcgac ccagccgcgc cggccatcaa ctcaatatcg cccactccgc 50
<210> 34
<211> 1034
<212> PRT
<213> 解纤维素篮状菌
<400> 34
Met His Ser Ala Ala Leu Leu Gln Ala Leu Cys Leu Leu Pro Leu Val
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Ser Pro Lys Asn Leu Glu Ser Arg Ser Thr Lys His Gly Asn Ser Tyr
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Gln Ser Thr Val Leu Asp Gln Gly His Tyr Glu Ser Arg Gly Ser Ile
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Ala Asn Gly Tyr Ile Gly Leu Asn Val Ala Gly Ala Gly Pro Phe Phe
85 90 95
Glu Leu Asp Thr Ala Val Asp Gly Asp Val Ile Asn Gly Trp Pro Leu
100 105 110
Phe Ser Arg Arg Gln Thr Phe Ala Gly Leu Ala Gly Phe Tyr Asp Leu
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Gln Pro Thr Thr Asn Gly Ser Asn Phe Pro Trp Leu Ser Gln Tyr Gly
130 135 140
Asp Asp Ser Ala Ile Ser Gly Val Pro His Trp Gly Gly Leu Ile Leu
145 150 155 160
Asp Leu Gly Asp Gly Glu Tyr Leu Asp Ala Thr Val Asp Asn Ser Thr
165 170 175
Ile Ser Asp Tyr Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Lys Ala Gly Val Leu Ser
180 185 190
Trp Asp Tyr Lys Trp Thr Pro Lys Asn Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ile
195 200 205
Asn Tyr Lys Ile Phe Ala Asn Lys Leu Asp Val Asn Gln Ala Val Val
210 215 220
Gln Leu Ser Ile Thr Pro Ser Ala Asn Gly Ser Gly Ser Val Val Asn
225 230 235 240
Val Ile Asp Gly Tyr Ser Ala Val Arg Thr Asp Phe Val Ser Ser Gly
245 250 255
Asn Glu Ser Asp Val Ile Tyr Thr Ala Val Lys Pro Val Gly Val Asn
260 265 270
Asn Val Thr Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Leu Asp Gly Asp Glu Ala Phe
275 280 285
Asp Phe Ser Ser Ala Glu Leu Val Asn Asp Lys Pro Tyr Val His Gln
290 295 300
Asn Asp Ser Ser Ile Ala Gln Ser Val Asn Val Thr Phe Thr Ala Gly
305 310 315 320
Thr Thr Ile Thr Ile Asn Lys Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr Asp Ala
325 330 335
Phe Pro Asp Pro Gln Ser Thr Ala Arg Glu Ala Ala Met Thr Ala Arg
340 345 350
Arg Arg Gly Phe Asp Asp Leu Phe Arg Ser His Val Ser Glu Trp Ala
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Arg Arg Val Asn Asn Ala Pro Val Asn Asp Trp Ser Ile Pro Val Gly
420 425 430
Gly Leu Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Gly Gln Ile Phe Trp Asp Ala Asp
435 440 445
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595 600 605
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645 650 655
Pro Leu Asp Tyr Thr Lys Asn Tyr Thr Thr Ser Ala Ala Leu Asn Asp
660 665 670
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755 760 765
Asp Met Leu His Ile Asp Pro Asn Leu Pro Pro Gln Ile Pro Ser Val
770 775 780
Lys Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp Pro Ile Gln Ala Ala Ser
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820 825 830
Gly Gln Asn Thr Ala Asn Ser Thr Thr Tyr Ser Leu Pro Val Asn Gly
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850 855 860
Thr Gly Asn Ile Ala Gln Cys Val Ser Val Leu Ser Thr Asp Ala Tyr
865 870 875 880
Gln Pro Gly Gln Tyr Pro Ile Ser Ala Val Asp Gly Ala Ala Ser Thr
885 890 895
Lys Trp Gln Pro Glu Phe Ala Ala Asn Val Ser Ser Leu Thr Val Asp
900 905 910
Leu Thr Ser Ser Asn Ala Ser Ser Val Ser Gly Phe Tyr Phe Asp Trp
915 920 925
Ala Gln Ala Pro Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Leu His Asn Ser Ser
930 935 940
Ser Ala Ala Leu Thr Ser Ser Ser Thr His Gly Gly Ser Ser Ser Val
945 950 955 960
Ser Leu Asn Ile Thr Thr Ser Asn Pro Tyr Asp Ala Ser Ser Tyr Asp
965 970 975
Ala Asn Val Ile Ala Leu Ser Ser Ser Asn Thr Thr Asn Tyr Thr Phe
980 985 990
Pro Ala Pro Val Ala Lys Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Phe Val Gln Gly
995 1000 1005
Asn Gln Ala Leu Asp Glu Thr Asp Thr Lys Ala Gly Asn Gly Thr
1010 1015 1020
Gly Ala Thr Val Ala Glu Trp Ala Ile Leu Ser
1025 1030
<210> 35
<211> 1040
<212> PRT
<213> 具疣篮状菌
<400> 35
Met Tyr Ser Ala Thr Leu Leu Gln Ala Leu Cys Leu Leu Pro Leu Val
1 5 10 15
Ala Gly Leu Pro Phe Asn Glu Arg Val Asp Gln Ile Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Pro Lys Asn Leu Glu Ser Arg Ser Thr Lys His Gly Asn Asn Thr
35 40 45
Lys His Gly Asn Ser Tyr Gln Thr Gln Phe Ser Gly Val Thr Trp Asp
50 55 60
Gln Arg Asn Trp Arg Leu Gln Ser Thr Val Leu Asp Gln Gly His Tyr
65 70 75 80
Glu Ser Arg Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ile Gly Leu Asn Val Ala
85 90 95
Gly Ala Gly Pro Phe Phe Glu Leu Asp Thr Ala Val Asp Gly Asp Val
100 105 110
Ile Asn Gly Trp Pro Leu Phe Ser Arg Arg Gln Thr Phe Ala Gly Leu
115 120 125
Ala Gly Phe Tyr Asp Leu Gln Pro Thr Thr Asn Gly Ser Asn Phe Pro
130 135 140
Trp Leu Asp Gln Tyr Gly Asp Asp Ser Ala Ile Ser Gly Val Pro His
145 150 155 160
Trp Gly Gly Leu Ile Leu Asp Leu Gly Asp Gly Glu Tyr Leu Asp Ala
165 170 175
Thr Val Asp Asn Ser Thr Ile Ser Asp Tyr Arg Thr Thr Tyr Asp Tyr
180 185 190
Lys Ala Gly Val Leu Ser Trp Asp Tyr Lys Trp Thr Pro Lys Asn Ser
195 200 205
Lys Gly Ser Phe Gly Ile Asn Tyr Lys Ile Phe Ala Asn Lys Leu Asp
210 215 220
Val Asn Gln Ala Val Val Gln Leu Ser Ile Thr Pro Ser Ala Asn Gly
225 230 235 240
Ser Ala Ser Val Val Asn Val Ile Asp Gly Tyr Ser Ala Val Arg Thr
245 250 255
Asp Phe Val Ser Ser Gly Asn Glu Ser Asp Val Ile Tyr Thr Ala Val
260 265 270
Lys Pro Val Gly Val Asn Asn Val Thr Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Leu
275 280 285
Asp Gly Asp Glu Ala Phe Asp Phe Ser Ser Ala Glu Leu Val Asn Asp
290 295 300
Lys Pro Tyr Val His Gln Asn Asp Ser Ser Ile Ala Gln Ser Val Asn
305 310 315 320
Val Ser Phe Thr Ala Gly Thr Thr Val Thr Ile Asn Lys Phe Val Gly
325 330 335
Ala Ala Ser Thr Asp Ala Phe Pro Asp Pro Gln Ser Thr Ala Arg Glu
340 345 350
Ala Ala Leu Thr Ala Arg Arg Arg Gly Phe Asp Asp Leu Phe Arg Ser
355 360 365
His Ile Ser Glu Trp Ala Gln Val Met Pro Asp Asp Ser Val Asp Asp
370 375 380
Phe Thr Leu Ala Asn Gly Thr Leu Pro Asn Asp Arg Phe Ile Ile Glu
385 390 395 400
Ser Ala Val Met Ala Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Leu Gln Asn Thr
405 410 415
Val Gly Pro Asn Ala Leu Arg Arg Val Asn Asn Ala Pro Val Asn Asp
420 425 430
Trp Ser Ile Pro Val Gly Gly Leu Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Gly Gln
435 440 445
Ile Phe Trp Asp Ala Asp Val Trp Met Gln Pro Gly Leu Val Ala Ala
450 455 460
Phe Pro Glu Ser Ala Lys Arg Ile Thr Asn Tyr Arg Thr Ala Ile Tyr
465 470 475 480
Ser Gln Ala Leu Glu Asn Ala Lys Thr Ala Tyr Thr Ser Ser Gln Asn
485 490 495
Gln Thr Ser Phe Ser Ser Asp Ala Ala Ile Tyr Ser Trp Thr Ser Gly
500 505 510
Arg Tyr Gly Asn Cys Thr Ala Thr Gly Pro Cys Trp Asp Tyr Glu Tyr
515 520 525
His Leu Asn Gly Asp Ile Gly Ile Ser Leu Val Asn Gln Trp Val Val
530 535 540
Ser Gly Asp Asn Glu Thr Phe Lys Ser Thr His Phe Pro Ile Tyr Asn
545 550 555 560
Ser Ile Ala Thr Leu Tyr Gly Asp Leu Leu Lys Lys Asn Gly Ser Tyr
565 570 575
Tyr Thr Leu Thr Asn Met Thr Asp Pro Asp Glu Tyr Ala Asn Asn Val
580 585 590
Asp Ala Gly Gly Tyr Thr Met Thr Leu Ile Ser Gln Thr Leu Ser Asn
595 600 605
Ala Asn Ala Phe Arg Lys Gln Phe Gly Met Asp Glu Asn Thr Thr Trp
610 615 620
Thr Glu Met Ala Glu Asn Ile Leu Leu Ile Arg Glu Asn Asp Val Thr
625 630 635 640
Leu Glu Tyr Thr Thr Met Asn Asn Ser Val Ala Val Lys Gln Ala Asp
645 650 655
Val Ile Leu Ser Thr Phe Pro Leu Asp Tyr Thr Lys Asn Tyr Thr Thr
660 665 670
Ser Ala Ala Leu Asn Asp Leu Asp Tyr Tyr Ala Leu Lys Gln Ser Pro
675 680 685
Asp Gly Pro Gly Met Thr Tyr Ala Ile Phe Ser Ile Val Ala Asn Asp
690 695 700
Val Ser Pro Ser Gly Cys Ser Ala Tyr Thr Tyr Ala Gln Tyr Ser Tyr
705 710 715 720
Asp Pro Tyr Ile Arg Gly Pro Phe Phe Gln Phe Ser Glu Gln Leu Leu
725 730 735
Asp Asp Tyr Thr Ala Asn Gly Gly Thr His Pro Ala Phe Pro Phe Leu
740 745 750
Thr Gly His Gly Gly Ala Asn Gln Val Val Leu Tyr Gly Tyr Leu Gly
755 760 765
Leu Arg Leu Leu Pro Asp Asp Met Leu His Ile Asp Pro Asn Leu Pro
770 775 780
Pro Gln Ile Pro Ser Val Lys Tyr Arg Thr Phe Tyr Trp Arg Gly Trp
785 790 795 800
Pro Ile Gln Ala Ala Ser Asn Tyr Thr His Thr Thr Ile Gln Arg Ala
805 810 815
Thr Thr Val Ala Pro Leu Ser Thr Ala Asp Gln Ala Tyr Ala Asn Thr
820 825 830
Ser Ile Ser Val Ser Val Gly Gln Asn Thr Ala Asn Ser Thr Thr Tyr
835 840 845
Ser Leu Pro Val Asn Gly Ser Ala Ile Val Val Pro Asn Arg Gln Ile
850 855 860
Gly Ser Ile Asn Thr Val Ala Gly Asn Ile Ala Gln Cys Val Ser Val
865 870 875 880
Leu Ser Thr Asp Ala Tyr Gln Pro Gly Gln Tyr Pro Ile Ser Ala Val
885 890 895
Asp Gly Ala Ala Ser Thr Lys Trp Gln Pro Glu Phe Ala Ala Asn Val
900 905 910
Asn Ser Leu Thr Val Asp Leu Thr Ser Ser Asn Ala Ser Ser Val Ser
915 920 925
Gly Phe Tyr Phe Asp Trp Ala Gln Ala Pro Pro Thr Asn Ile Thr Val
930 935 940
Leu Leu His Asn Ser Ser Ser Val Ala Leu Thr Ser Ser Ser Thr His
945 950 955 960
Gly Gly Ser Ser Ser Val Ser Leu Asn Ile Thr Ile Ser Asn Pro Tyr
965 970 975
Asp Ala Leu Ser Tyr Asp Ala Asn Val Ile Ala Leu Ser Ser Ser Asn
980 985 990
Thr Thr Asn Tyr Thr Phe Pro Ala Pro Val Ala Lys Pro Arg Tyr Ala
995 1000 1005
Thr Leu Leu Val Gln Gly Asn Gln Ala Leu Asp Glu Thr Asp Thr
1010 1015 1020
Lys Ala Gly Asn Gly Thr Gly Ala Thr Val Ala Glu Trp Ala Ile
1025 1030 1035
Leu Ser
1040

Claims (15)

1.一种具有海藻糖酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)与SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少93％序列同一性或与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:20的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少95％序列同一性、或与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸编码的多肽；
(c)SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有海藻糖酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽具有通过TSA确定的至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少66℃、至少67℃，例如至少68℃的热变性温度Td。
3.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-2中任一项所述的多肽。
4.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如权利要求1-2中任一项所述的多肽。
5.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-2中任一项所述的多肽。
6.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求5所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个异源控制序列。
7.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求6所述的核酸构建体。
8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其中该细胞是酵母细胞，特别是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞，最特别是酿酒细胞。
9.一种产生具有海藻糖酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求7或8所述的宿主细胞。
10.一种生产发酵产物的方法，该方法包括
(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；
任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；
(b)使所液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物进行发酵；
其中
i)葡糖淀粉酶；
ii)如权利要求1-8中任一项所述的海藻糖酶；
iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；
在以下步骤的过程中存在和/或添加：
-糖化步骤(b)；
-发酵步骤(c)；
-同时的糖化和发酵；
-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中在以下步骤期间进一步存在和/或添加α-淀粉酶：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵；或步骤(b)之前任选的预糖化步骤。
12.如权利要求10-11中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶源自特别地具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，优选如本文的SEQ ID NO:7披露的，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N、优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:7用于编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％同一性，例如至少70％，更优选至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中该发酵生物源自酵母，如酿酒酵母的菌株。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中该酵母发酵生物表达如权利要求1-2所述的海藻糖酶。
15.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：如权利要求1-2中任一项所述的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。
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