ES2673940T3

ES2673940T3 - Proceso para producir productos de fermentación a partir de materiales que contienen almidón

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Publication number: ES2673940T3
Application number: ES11808099.3T
Authority: ES
Inventors: Randy Deinhammer; Suzanne Clark; Mauricio QUIROS; John Matthews; Anne Glud Hjulmand; Chee-Leong Soong; Tomoko Matsui; Shinobu Takagi
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: US20210017546A1; CA2822637A1; US10947567B2; US20190271011A1; US10941422B2; US20230265462A1; US9816112B2; WO2012088303A3; DK2654567T3; CN103608460A; US20240102056A1; US20210040510A1; US20180023099A1; US11566266B2; WO2012088303A2; US11840718B2; US11499170B2; CA2822637C; EP2654567B1; US20140017749A1

Abstract

Proceso para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye las etapas de: i) licuefacción del material que contiene almidón a un pH en el rango de 4,5-5,0 a una temperatura en el rango de 80-90 °C usando: - una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.º: 1 con una deleción doble en I181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de: - V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+S242Q; - E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - K220P+N224L+S242Q+Q254S; y - M284V; variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.º: 1 y tiene un T ½ (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2) de al menos 10; y - una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.º: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o - una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.º: 13 de este documento y que tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; ii) sacarificación utilizando una enzima generadora de fuente de carbohidratos; iii) fermentación utilizando un organismo fermentador.

Description

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Proceso para producir productos de fermentación a partir de materiales que contienen almidón Campo de la invención

[0001] Se describen procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón y composiciones adecuadas para el uso en un proceso de la invención.

Referencia a un listado de secuencias

[0002] Esta patente contiene un listado de secuencias.

Antecedentes de la invención

[0003] La producción de productos de fermentación, tal como etanol, a partir de material que contiene almidón es muy conocida en la técnica. Industrialmente se usan dos tipos diferentes de procesos hoy en día. El proceso usado más frecuentemente, a menudo referido como un "proceso convencional", incluye la licuefacción de almidón gelatinizado a alta temperatura usando típicamente una alfa-amilasa bacteriana, seguido de sacarificación y fermentación simultánea realizada en presencia de una glucoamilasa y un organismo de fermentación. Otro proceso muy conocido, frecuentemente referido como un proceso de "hidrólisis de almidón crudo" (proceso RSH) incluye la sacarificación y la fermentación simultánea de almidón granulado por debajo de la temperatura de gelatinización inicial típicamente en presencia de una alfa-amilasa fúngica ácida y una glucoamilasa.

[0004] A pesar de la mejora significativa de los procesos de producción de productos de fermentación en la última década, una cantidad significativa de material de almidón residual no se convierte en el producto de fermentación deseado, tal como etanol. Al menos parte del material de almidón residual no convertido, por ejemplo, azúcares y dextrinas, tienen la forma de productos de Maillard no fermentables.

[0005] Por lo tanto, sigue habiendo un deseo y una necesidad de proporcionar procesos para producir productos de fermentación, tal como etanol, a partir de material que contiene almidón que puedan proporcionar una mayor producción de producto de fermentación en comparación con un proceso convencional.

Resumen de la invención

[0006] Se describen procesos de producción de productos de fermentación, tal como etanol a partir de material que contiene almidón, que utilizan un organismo fermentador y composiciones adecuadas para el uso en un proceso de la invención.

[0007] En el primer aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación, tal como etanol, a partir de material que contiene almidón, que incluyen las etapas de:

i) licuefacción del material que contiene almidón a un pH en el rango de 4,5-5,0 a una temperatura en el rango de 80-90 °C usando:

- una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en 1181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

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- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 y tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de al menos 10; y

- una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o

- una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C;

ii) sacarificación utilizando una enzima generadora de fuente de carbohidratos;

iii) fermentación utilizando un organismo fermentador.

[0008] En una forma de realización, una enzima generadora de fuente de carbohidratos, en particular una glucoamilasa termoestable, y/o una pululanasa está(n) presente(s) y/o se adiciona(n) durante en la etapa de licuefacción i).

[0009] En un segundo aspecto, la invención se refiere a composiciones que incluyen una alfa-amilasa y una proteasa, donde la

i) alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en 1181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

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- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

ii) una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o

- una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.

[0010] En una forma de realización, la composición comprende además una enzima generadora de fuente de carbohidratos, en particular una glucoamilasa termoestable, y/o una pululanasa.

[0011] En una forma de realización, una segunda alfa-amilasa está presente y/o se adiciona durante la etapa de licuefacción i).

[0012] En una forma de realización, la composición comprende una segunda alfa-amilasa.

Breve descripción de las figuras

[0013]

La fig. 1 muestra una comparación de etanol después de 54 horas para licuefacciones (85 °C) preparadas con alfa-amilasa 1407 con y sin proteasa Pfu o glucoamilasa PE001 a pH 4,8.

La fig. 2 muestra la viscosidad máxima y de rotura a 32 % de DS para el experimento en el ejemplo 10 comparando

- Alfa-amilasa A (1,4 micro g) (pH 5,8);

- Alfa-amilasa 1407 (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8);

- Alfa-amilasa A (0,35 micro g) + alfa-amilasa 1407 (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8);

- Alfa-amilasa A (0,7 micro g) + alfa-amilasa 1407 (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8);

La fig. 3 muestra la viscosidad final a 32 % de DS a 32 °C para el experimento en el ejemplo 10 comparando

- Alfa-amilasa A (1,4 micro g) (pH 5,8);

- Alfa-amilasa A (0,7 micro g) + alfa-amilasa 1407 (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8).

La fig. 4 muestra el valor máximo y la viscosidad de rotura a 32 % de DS para el experimento en el ejemplo 10 comparando alfa-amilasa A (1,4 micro g) (pH 5,8) y alfa-amilasa A (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8).

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La fig. 5 muestra la viscosidad final a 32 % de DS, a 32 °C para el experimento en el ejemplo 10 comparando alfa-amilasa A (1,4 micro g) (pH 5,8) y alfa-amilasa A (1,4 micro g) + glucoamilasa PE001 (10 micro g) + proteasa 196 (1 micro g) (pH 4,8).

Descripción detallada de la invención

[0014] Se describen procesos de producción de productos de fermentación, tal como etanol, a partir de material que contiene almidón que utilizan un organismo fermentador y composiciones adecuadas para el uso en un proceso de la invención.

[0015] Los inventores han mostrado que un proceso de la invención tiene una serie de ventajas. Como se muestra en los ejemplos, un proceso de la invención da como resultado una producción de etanol más elevada. Otros beneficios incluyen una necesidad reducida de usar H2SO4 para el ajuste del pH. Esto da como resultado menos azufre aguas abajo en los DDGS, menos contaminación en la parte delantera, menos beerstone y menos precipitación de fitato.

[0016] Un proceso de la invención también da como resultado la pérdida reducida de azúcares y dextrinas para productos de Maillard. El color de los DDGS se mejora y la vida del intercambiador térmico (menos sólidos) se amplía.

Además, debido a la mayor termoestabilidad de las enzimas usadas, la dosis enzimática se puede reducir. Un proceso de la invención requiere cambios limitados para los procesos y equipos de los procesos existentes y, por lo tanto, inversión de capital limitada.

[0017] Al tener una alfa-amilasa termoestable y una segunda alfa-amilasa tal y como se define en este documento en la licuefacción, el valor máximo de la viscosidad, por ejemplo, en el tanque de la suspensión, se reduce (adicionalmente). Esto da como resultado menos energía consumida en la mezcla. También el tener una viscosidad de promedio inferior mejora la mezcla del triturado/almidón en el tanque de la suspensión y su bombeo a través del proceso de licuefacción.

[0018] En el primer aspecto, la invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón, que incluyen las etapas de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

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- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

iii) fermentación utilizando un organismo fermentador.

[0019] En una forma de realización preferida, las etapas ii) y iii) se realizan o bien consecutivamente o bien simultáneamente. La alfa-amilasa termoestable y la proteasa termoestable definidas anteriormente y opcionalmente la enzima generadora de fuente de carbohidratos, preferiblemente la glucoamilasa termoestable, y/u opcionalmente una pululanasa, se pueden adicionar antes y/o durante la etapa de licuefacción i). Ejemplos de alfa-amilasas termoestables se pueden encontrar en el apartado "Alfa-amilasa presente y/o adicionada durante la licuefacción" más adelante. Ejemplos de proteasas termoestables se pueden encontrar en el apartado "Proteasa presente y/o adicionada durante la licuefacción" más adelante. Una composición de la invención se puede usar adecuadamente en un proceso de la invención. Sin embargo, los componentes enzimáticos también se pueden adicionar de forma separada.

[0020] En una forma de realización preferida, el pH durante la licuefacción es de entre 4,5-4,8.

[0021] En una forma de realización, una enzima generadora de fuente de carbohidratos también está presente durante la licuefacción. En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa termoestable. En una forma de realización, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es diferente de la usada durante la sacarificación en la etapa ii) y/o la fermentación en la etapa iii).

[0022] Ejemplos de "enzimas generadoras de fuente de carbohidratos", entre las que se incluyen en particular las glucoamilasas, pueden encontrarse en el apartado "Enzima generadora de fuente de carbohidratos presente y/o adicionada durante la licuefacción" más adelante.

[0023] En una forma de realización, el proceso de la invención comprende, además, antes de la etapa i), las etapas de:

a) reducir el tamaño de las partículas del material que contiene almidón, preferiblemente por molienda en seco;

b) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.

[0024] El material de partida que contiene almidón, tal como granos enteros, se puede reducir en tamaño de partículas, por ejemplo, mediante molienda, para abrir la estructura y permitir un mayor procesamiento. Generalmente hay dos tipos de procesos: molienda en seco y húmeda. En la molienda en seco, se muelen y se usan semillas enteras. La molienda en húmedo da una buena separación del germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica frecuentemente en ubicaciones donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción de, por ejemplo, jarabes. Tanto la molienda en seco como la húmeda son muy conocidas en la técnica del procesamiento de almidón. Según la invención, se prefiere la molienda en seco. En una forma de realización, el tamaño de partículas se reduce a entre 0,05 y 3,0 mm, preferiblemente 0,1-0,5 mm, o de modo que al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, aún más preferiblemente al menos el 90 % del material que contiene almidón pase a través de un tamiz con un filtro de 0,05 a 3,0 mm, preferiblemente un filtro de 0,1-0,5 mm. En otra forma de realización, al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el

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80 %, especialmente al menos el 90 % del material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con un filtro del # 6.

[0025] La suspensión acuosa puede contener 10-55 % p/p de sólidos secos (DS), preferiblemente 25-45 % p/p de sólidos secos (DS), más preferiblemente 30-40 % p/p de sólidos secos (DS) de material que contiene almidón. La suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización, preferiblemente a entre 80-90 °C, pH 4,5-4,8 durante aproximadamente 15-60 minutos.

[0026] La alfa-amilasa termoestable, la proteasa termoestable y la enzima generadora de fuente de carbohidratos opcional, en particular glucoamilasa termoestable, y/o la pululanasa opcional se pueden adicionar a la suspensión acuosa para iniciar la licuefacción (dilución). En una forma de realización, solo una parte de la mezcla enzimática (composición de la invención) se adiciona a la suspensión acuosa, mientras que el resto de la enzima se adiciona durante la etapa de licuefacción i). La etapa de licuefacción i) se realiza típicamente a 80-90 °C, pH 4,5-4,8 durante 1-3 horas.

[0027] La suspensión acuosa, en una forma de realización, se puede cocer por chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de ser sometida a la licuefacción de la etapa i). La cocción por chorro se puede realizar a una temperatura de entre 110-145 °C, preferiblemente 120-140 °C, tal como 125-135 °C, preferiblemente de aproximadamente 130 °C durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 310 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos.

Sacarificación y fermentación

[0028] Una o más enzimas generadoras de fuente de carbohidratos, en particular glucoamilasas, están presentes y/o se adicionan durante la etapa de sacarificación ii) y/o la etapa de fermentación iii). La enzima generadora de fuente de carbohidratos puede ser preferiblemente una glucoamilasa, pero también puede ser una enzima seleccionada del grupo que consiste en: beta-amilasa, amilasa maltogénica y alfa-glucosidasa.

[0029] Ejemplos de enzima generadora de fuente de carbohidratos, entre los que se incluyen las glucoamilasas, se pueden encontrar en el apartado "Enzima generadora de fuente de carbohidratos presente y/o adicionada durante la sacarificación y/o la fermentación" más adelante.

[0030] Al hacer la sacarificación y la fermentación secuenciales, la etapa de sacarificación ii) se puede realizar utilizando condiciones muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, la etapa de sacarificación ii) puede durar hasta de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, resulta común hacer solo una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura de entre 30-65 °C, típicamente de aproximadamente 60 °C, seguido de sacarificación durante la fermentación en la sacarificación y la fermentación simultánea ("SSF"). La sacarificación se realiza típicamente a temperaturas de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH de entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente pH 4,5.

[0031] La sacarificación y la fermentación simultánea ("SSF") se usa ampliamente en procesos de producción de productos de fermentación a escala industrial, especialmente procesos de producción de etanol. A hacer la SSF, la etapa de sacarificación ii) y la etapa de fermentación iii) se realizan simultáneamente. No hay fase de retención para la sacarificación, lo que significa que se puede adicionar un organismo fermentador, tal como levadura, y enzima(s). La SSF se realiza según la invención típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32 °C. En una de forma de realización, la fermentación está en curso durante de 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas. En una forma de realización, el pH es de entre 3,5-5, en particular de entre 3,8 y 4,3.

Medio de fermentación

[0032] "Medios de fermentación" o "medio de fermentación" se refiere al ambiente donde se realiza la fermentación y que incluye el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de carbohidratos que se metaboliza por el organismo fermentador. El medio de fermentación puede comprender nutrientes y estimulador(es) de crecimiento para el organismo (los organismos) de fermentación. El nutriente y los estimuladores de crecimiento se usan ampliamente en la técnica de fermentación e incluyen fuentes de nitrógeno, tales como amoníaco; urea, vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.

Organismos fermentadores

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[0033] El término "organismo termentador" se refiere a cualquier organismo, incluidos organismos bacterianos y fúngicos, adecuado para el uso en un proceso de fermentación y capaz de producir el producto de fermentación deseado. Los organismos fermentadores especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, tal como etanol. Ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces spp., en particular, de Saccharomyces cerevisiae.

[0034] En una forma de realización, el organismo fermentador se adiciona al medio de fermentación de modo que el organismo fermentador viable, tal como levadura, contado por mL de medio de fermentación esté en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente de aproximadamente 5x107.

[0035] La levadura disponible comercialmente incluye, por ejemplo, levadura RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponibles de Fermentis/Lesaffre, EE.UU.), FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, EE.UU.), levadura fresca SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponibles de Ethanol Technology, WI, EE.UU.), BIOFERM AFT y XR (disponibles de NaBC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), GERT StRaND (disponible de Gert Strand, AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM Specialties).

Materiales que contienen almidón

[0036] Cualquier material adecuado que contenga almidón se puede utilizar según la presente invención. El material de partida se selecciona generalmente basándose en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de materiales adecuados que contienen almidón para el uso en un proceso de la invención incluyen granos enteros, maíz, trigo, cebada, centeno, mijo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, alubias, o patatas dulces, o mezclas de los mismos o almidones derivados de ellos, o cereales. Se contemplan también tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.

Productos de fermentación

[0037] El término "producto de fermentación" significa un producto producido por un proceso que incluye una etapa de fermentación que utiliza un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); y hormonas. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol de consumo (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, stouts, lagers, bitters, licores de malta, happoushu, cerveza de alto contenido de alcohol, cerveza de bajo contenido de alcohol, cerveza de bajo contenido de calorías o cerveza light. Los procesos de fermentación preferidos usados incluyen procesos de fermentación alcohólica. El producto de fermentación, tal como etanol, obtenido según la invención, se puede usar preferiblemente como combustible que se mezcla típicamente con gasolina. Sin embargo, en el caso del etanol también se puede usar como etanol potable.

Recuperación

[0038] Después de la fermentación, el producto de fermentación se puede separar del medio de fermentación. La suspensión se puede destilar para extraer el producto de fermentación deseado. Alternativamente, el producto de fermentación deseado se puede ser extraer del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o filtración con membrana. El producto de fermentación también se puede recuperar por desorción u otro método conocido en la técnica.

Alfa-amilasa presente y/o adicionada durante la licuefacción

[0039] Según la invención, la alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en 1181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

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- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 y tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de al menos 10. Según la invención, la alfa-amilasa tiene alta actividad con respecto a la solubilización de almidón en la licuefacción a pH de 4,5 a 5,0 y alta termoestabilidad a pH de 4,5-5,0 y 80-90 °C, preferiblemente 4,5-4,8, a alrededor de 85 °C.

[0040] Más específicamente la alfa-amilasa usada en un proceso de la invención tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2 de al menos 10 determinado como se describe en el ejemplo 1.

[0041] En una forma de realización preferida, el T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2, es al menos 15, tal como al menos 20, tal como al menos 25, tal como al menos 30, tal como al menos 40, tal como al menos 50, tal como al menos 60, tal como entre 10-70, tal como entre 15-70, tal como entre 20-70, tal como entre 25-70, tal como entre 30-70, tal como entre 40-70, tal como entre 50-70, tal como entre 60-70.

[0042] En una forma de realización, la alfa-amilasa termoestable es una variante de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus que tiene al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 de este documento.

[0043] La alfa-amilasa termoestable puede ser una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada, preferiblemente para tener alrededor de 491 aminoácidos.

Segunda alfa-amilasa presente y/o adicionada durante la licuefacción

[0044] Cuando una segunda alfa-amilasa está presente y/o se adiciona durante la etapa de licuefacción i), se obtiene un efecto de reducción de la viscosidad positivo. Como se puede observar en el ejemplo 10, la combinación de una alfa-amilasa termoestable (por ejemplo, alfa-amilasa BE1407) con o sin la presencia de una proteasa termoestable (por ejemplo, proteasa 196) y glucoamilasa termoestable (por ejemplo, glucoamilasa PO) y además una segunda alfa-amilasa (por ejemplo, alfa-amilasa A) da como resultado un valor máximo de viscosidad y una viscosidad final disminuidos.

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[0045] Por lo tanto, en este aspecto de la invención, una segunda alfa-amilasa se adiciona durante la etapa de licuefacción i). La segunda alfa-amilasa puede ser menos termoestable y/o menos eficaz a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2, o a alrededor de pH 4,8, que una alfa-amilasa termoestable definida en este documento adicionada y/o presente durante la licuefacción según la invención.

[0046] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa es de origen bacteriano.

[0047] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa se deriva de una cepa del género Bacillus, tal como una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular una variante de una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como la mostrada en la SEQ ID N.°: 3 en WO 99/019467 o la SEQ ID N.°: 1 de este documento. La segunda alfa- amilasa puede ser una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada, preferiblemente para tener alrededor de 491 aminoácidos.

[0048] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa tiene al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o al menos el 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 descrita en WO 99/019467 o la SEQ ID N.°: 1 de este documento.

[0049] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) por debajo de 10 determinado como se describe en el ejemplo 1.

[0050] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) por debajo de 8, tal como por debajo de 7, tal como por debajo de 6, tal como por debajo de 5.

[0051] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de entre 2 y 10, tal como de entre 3 y 8, tal como de por encima de 4 a 10, tal como de por encima de 4 a 8.

[0052] En una forma de realización, la segunda alfa-amilasa se puede derivar de Bacillus stearothermophilus y puede tener las mutaciones siguientes: I181*+G182* o I181*+G182*+N193F (usando la SEQ ID N.°: 1 para la numeración).

Proteasa presente y/o adicionada durante la licuefacción

[0053] Según la invención, la proteasa termoestable es una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o una proteasa de Pyrococcus furiosus que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.

[0054] En una forma de realización, la proteasa tiene un valor de termoestabilidad:

- de más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.

[0055] Las variantes purificadas pueden tener una termoestabilidad de por encima de 90, por encima de 100 a 85 °C determinada utilizando el ensayo de zeína-BCA descrito en el ejemplo 3.

[0056] La determinación de la "Actividad relativa" y "Actividad restante" se determina como se describe en el ejemplo 2.

[0057] Las proteasas se clasifican basándose en su mecanismo catalítico en los grupos siguientes: serina proteasas (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y proteasas desconocidas, o aún sin clasificar (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds.), Academic Press (1998), en particular la parte de la introducción general.

[0058] En una forma de realización preferida, la proteasa termoestable usada en un proceso de la invención es una "metaloproteasa" definida como una proteasa que pertenece a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas).

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[0059] Para determinar si una proteasa determinada es una metaloproteasa o no, se hace referencia al anterior "Handbook of Proteolytic Enzymes" y a los principios indicados en el mismo. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas modificadas genéticamente o sintéticas.

[0060] La actividad de las proteasas se puede medir utilizando cualquier ensayo adecuado, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces de péptido relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo se deben adaptar igualmente a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Ejemplos de temperatura de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 u 80 °C.

[0061] Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, tal como caseína reticulada con azurina (AZCL-caseína). Dos ensayos de proteasa se describen más adelante en el apartado "Materiales y métodos", de los cuales el denominado "ensayo de AZCL-caseína" es el ensayo preferido.

[0062] En una forma de realización, la proteasa usada en un proceso de la invención es una metaloproteasa fúngica derivada a partir de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n° 0670 (clasificado como EC 3.4.24.39).

[0063] En una forma de realización, la variante de proteasa tiene al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento.

[0064] En una forma de realización, la proteasa es una variante de la parte madura de la metaloproteasa mostrada en la SEQ ID N.°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEQ ID N.°: 1 en WO 2010/008841 y mostrada como la SEQ ID N.°: 3 de este documento con las mutaciones siguientes:

- S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S5*+D79L+S87P+A112P+D142L;

- N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L;

- S36P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- A37P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L;

- T46R+D79L+S87P+T116V+D142L;

- S49P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S50P+D79L+S87P+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L;

- S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- D79L+P81R+S87P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L;

- D79L+S87P+D104P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+T124V+D142L;

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- D79L+S87P+A112P+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0065] En una forma de realización, la proteasa termoestable presente y/o adicionada durante la etapa de licuefacción i) se deriva de una cepa de Pyrococcus furiosus que tiene al menos el 80 % de identidad, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento. La proteasa de Pyrococcus furiosus se puede comprar de Takara Shuzo Co. Ltd, Japón.

[0066] La proteasa de Pyrococcus furiosus es una proteasa termoestable. Se descubrió que la proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu S) del producto comercial tiene una termoestabilidad del 110 % (80 °C/70 °C) y 103 % (90 °C/70 °C) a pH 4,5 determinada como se describe en el ejemplo 2 de este documento.

Enzima generadora de fuente de carbohidratos presente y/o adicionada durante la licuefacción.

[0067] Según la invención, una enzima generadora de fuente de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, puede estar presente y/o se puede adicionar durante la licuefacción junto con la alfa-amilasa termoestable definida en la reivindicación 1 y la proteasa termoestable definida en la reivindicación 1. Como se ha mencionado anteriormente, una pululanasa también puede estar presente y/o adicionarse durante la etapa de licuefacción i).

[0068] El término "enzima generadora de fuente de carbohidratos" incluye cualquier enzima generadora de azúcares fermentables. Una enzima generadora de fuente de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que se puede usar como una fuente de energía por el organismo (los organismos) de fermentación en cuestión, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invención para producir un producto de fermentación, tal como etanol. Los carbohidratos generados se pueden convertir directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, preferiblemente etanol. Según la invención, se puede utilizar una mezcla de enzimas generadoras de fuente de carbohidratos. Ejemplos específicos incluyen glucoamilasa (que son generadores de glucosa), beta-amilasa y amilasa maltogénica (que son generadores de maltosa).

[0069] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa termoestable. La enzima generadora de fuente de carbohidratos, en particular glucoamilasa termoestable, se puede adicionar junto con o por separado de la alfa-amilasa termoestable y la proteasa termoestable.

[0070] En una forma de realización, la enzima generadora de fuente de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, tiene una estabilidad térmica de actividad relativa a 85 °C de al menos el 20 %, al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 35 %. En una forma de realización, la enzima generadora de carbohidratos es una glucoamilasa con una actividad relativa a pH 4,5 de al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 85 %, preferiblemente al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %.

[0071] En una forma de realización específica y preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa termoestable, preferiblemente de origen fúngico, preferiblemente unos hongos filamentosos, tal como de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita como la SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802 y mostrada en las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento.

[0072] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802 y mostrada en las SEQ ID N.°: 9 y 14 de este documento, con una sustitución K79V (utilizando la secuencia madura mostrada en la SEQ ID N.°: 14 para la numeración). La variante de glucoamilasa K79V tiene sensibilidad reducida a la degradación de proteasas con respecto a la progenitora como se describe en la solicitud copendiente de EE.UU. N.° 61/531,189.

[0073] En una forma de realización específica, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa, preferiblemente derivada a partir de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802. La glucoamilasa también puede ser glucoamilasa con al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad

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con el polipéptido maduro mostrado en la SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802 y mostrada como las SEQ ID N.°: 9 y 14 de este documento.

Pululanasa presente y/o adicionada durante la licuefacción

[0074] Opcionalmente una pululanasa puede estar presente y/o se puede adicionar durante la etapa de licuefacción i) junto con la alfa-amilasa termoestable definida en la reivindicación 1 y la proteasa termoestable definida en la reivindicación 1. Como se ha mencionado anteriormente, una enzima generadora de fuente de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, también puede estar presente y/o adicionarse durante la etapa de licuefacción i).

[0075] La pululanasa puede estar presente y/o se puede adicionar durante la etapa de licuefacción i) y/o la etapa de sacarificación ii) o la sacarificación y la fermentación simultánea.

[0076] Las pululanasas (E.C. 3.2.1.41, pululano 6-glucano-hidrolasa), son enzimas desramificantes caracterizadas por su capacidad para hidrolizar los enlaces alfa-1,6-glicosídicos en, por ejemplo, amilopectina y pululano.

[0077] Las pululanasas contempladas según la presente invención incluyen las pululanasas de Bacillus amyloderamificans descritas en la patente de EE.UU. n.° 4,560,651, la pululanasa descrita como la SEQ ID N.°: 2 en wO 01/151620, los desramificantes de Bacillus descritos como la SEQ ID N.°: 4 en WO 01/151620, y la pululanasa de Bacillus acidopullulyticus descrita como la SEQ ID N.°: 6 en WO 01/151620 y también descrita en FEMS Mic. Let. 115: 97-106 (1994).

[0078] Las pululanasas adicionales contempladas según la presente invención incluían las pululanasas de Pyrococcus woesei, específicamente de Pyrococcus woesei DSM n.° 3773 descrita en WO 92/02614, y la secuencia de proteína madura descrita como la SEQ ID N.°: 6 de este documento.

[0079] En una forma de realización, la pululanasa es una pululanasa de la familia GH57. En una forma de realización, la pululanasa incluye un dominio X47 como se describe en US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836. Más específicamente, la pululanasa se puede derivar a partir de una cepa del género Thermococcus, que incluye Thermococcus litoralis y Thermococcus hydrothermalis, tal como la pululanasa de Thermococcus hydrothermalis mostrada en la SEQ ID N.°: 11 truncada en el sitio X4 justo después del dominio X47 (es decir, aminoácidos 1-782 en las SEQ ID N.°: 11 y 12 de este documento). La pululanasa también puede ser un híbrido de las pululanasas de Thermococcus litoralis y de Thermococcus hydrothermalis o una enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis con sitio de truncamiento X4 descrita en US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836 y descrita en la SEQ ID N.°: 12.

[0080] La pululanasa se puede adicionar, según la invención, en una cantidad eficaz que incluye la cantidad preferida de aproximadamente 0,0001-10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, preferiblemente 0,0001-0,10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, más preferiblemente 0,0001-0,010 mg de proteína enzimática por gramo de DS. La actividad de la pululanasa se puede determinar como NPUN. Un ensayo para la determinación de NPUN se describe en el apartado de "Materiales y métodos" más adelante.

[0081] Productos de pululanasa disponibles comercialmente adecuados incluyen PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EE.UU.), y AMANO 8, (Amano, Japón).

Enzima generadora de fuente de carbohidratos presente y/o adicionada durante la sacarificación y/o la fermentación

[0082] Según la invención, una enzima generadora de fuente de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, está presente y/o se adiciona durante la sacarificación y/o la fermentación.

[0083] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa, de origen fúngico, preferiblemente a partir de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. niger, A. awamori, o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente T. emersonii.

Glucoamilasa

[0084] Según la invención, la glucoamilasa presente y/o adicionada durante la sacarificación y/o la fermentación se puede derivar de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, se puede derivar a partir de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en

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glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa de Aspergillus niger G1 o G2 (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), o variantes de las mismas, tal como las descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori descrita en WO 84/02921, glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949 (1991)), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con estabilidad térmica mejorada: G137A y G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; e introducción de residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.

[0085] Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasa de Athelia rolfsii (previamente denominada Corticium rolfsii) (véase patente de EE.UU. N.° 4,727,026 y (Nagasaka et al., 1998, "Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamilases from Corticium rolfsii, Appl. Microbiol. Biotecnol. 50:323-330), glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente de EE.uU. N.° de ref. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente de EE.UU. N.° 4,587,215). En una forma de realización preferida, la glucoamilasa usada durante la sacarificación y/o la fermentación es la glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448.

[0086] Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138), y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) y Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea; y Leucopaxillus giganteus todas descritas en WO 2006/069289; o Peniophora rufomarginata descrita en WO 2007/124285; o una mezcla de las mismas. También se contemplan las glucoamilasas híbridas según la invención. Ejemplos de las glucoamilasas híbridas se describen en WO 2005/045018. Ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida descrita en las tablas 1 y 4 del ejemplo 1.

[0087] En una forma de realización, la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Pycnoporus, en particular una cepa de Pycnoporus como se describe en US 61/264,977 publicada como WO 2011/066576 (SEQ ID N.°: 2, 4 o 6), o a partir de una cepa del género Gloephyllum, en particular una cepa de Gloephyllum como se describe en US 61/406,741 publicada como WO 2011/068803 (SEQ ID N.°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16) o una cepa del género Nigrofomes, en particular una cepa de Nigrofomes sp. descrita en US 61/411,044 o PCT/US10/058375 (SEQ ID

N. °: 2). Se contemplan también las glucoamilasas que muestran una alta identidad con cualquiera de las glucoamilasas anteriormente mencionadas, es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad con cualquiera de las partes maduras de las secuencias enzimáticas mencionadas anteriormente.

[0088] Se contemplan también las glucoamilasas que muestran una alta identidad con cualquiera de las glucoamilasas anteriormente mencionadas, es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad con las secuencias de enzimas maduras anteriormente mencionadas.

[0089] Las glucoamilasas se pueden adicionar, en una forma de realización, en una cantidad de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferiblemente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[0090] Las composiciones disponibles comercialmente que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, FUEL SPIRIZYME™, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ ECXEL y AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300; GC480; GC417 (de Genencor Int.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int.).

Amilasa maltogénica

[0091] La enzima generadora de fuente de carbohidratos presente y/o adicionada durante la sacarificación y/o la fermentación también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa- maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Una amilasa maltogénica de cepa de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponible de Novozymes A/S. Las alfa-amilasas maltogénicas se describen en las patentes de EE.UU. N.°. 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628. La amilasa maltogénica se puede adicionar, en una forma de realización preferida, en una cantidad de

O, 05-5 mg de proteína total/gramo de dS o 0,05-5 MANU/g de DS.

Una composición que comprende alfa-amilasa y proteasa

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[0092] En este aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende una alfa-amilasa y una proteasa, donde la

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

[0093] La composición comprende además opcionalmente una enzima generadora de fuente de carbohidratos. Dicha enzima generadora de fuente de carbohidratos puede ser una glucoamilasa termoestable con una estabilidad térmica de actividad relativa a 85 °C de al menos el 20 %, al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 35 %.

[0094] Las variantes de alfa-amilasa se describen adicionalmente en el apartado anterior "Alfa-amilasa presente y/o adicionada durante la licuefacción". La alfa-amilasa puede tener un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de al menos 15, tal como al menos 20, tal como al menos 25, tal como al menos 30, tal como al menos 40, tal como al menos 50, tal como al menos 60, tal como entre 10-70, tal como entre 15-70, tal como entre 20-70, tal como entre 25-70, tal como entre 30-70, tal como entre 40-70, tal como entre 50-70, tal como entre 60-70.

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[0095] En una forma de realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearomthermfilus, en particular truncada para tener 491 aminoácidos de longitud, con mutaciones seleccionadas del grupo de:

- I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S;

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID N.°: 1 de este documento para la numeración).

[0096] La proteasa tiene una termoestabilidad de:

i) más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % determinada como actividad relativa a 80 °C/70 °C.

[0097] En una forma de realización preferida específica, la proteasa es una variante de la metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus descrita como la parte madura de la SEQ ID N.°: 3 de este documento con mutaciones seleccionadas del grupo de:

- A27K+D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+S87P+A112P+D142L; y

- D79L+S87P+D142L.

[0098] En otra forma de realización preferida, la proteasa se deriva de una cepa de Pyrococcus furiosus mostrada en la SEQ ID N.°: 13 de este documento con un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.

[0099] En otra forma de realización, la proteasa es una descrita en la SEQ ID N.°: 13 de este documento o una proteasa con al menos el 80 % de identidad, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento. La proteasa de Pyroccus furiosus se puede comprar de Takara Shuzo Co. Ltd, Japón.

[0100] La proteasa de Pyrococcus furiosus es una proteasa termoestable. Se descubrió que la proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu S) del producto comercial tiene una termoestabilidad del 110 % (80 °C/70 °C) y 103 % (90 °C/70 °C) a pH 4,5 determinada como se describe en el ejemplo 2 de este documento.

[0101] Se debe entender que estas proteasas son solo ejemplos. Cualquier proteasa descrita anteriormente en el apartado anterior "Proteasa presente y/o adicionada durante la licuefacción" se puede utilizar como el componente de proteasa en una composición de la invención.

[0102] Una composición de la invención puede comprender adicionalmente de manera opcional una enzima generadora de fuente de carbohidratos, en particular una glucoamilasa, que tiene una estabilidad térmica a 85 °C, pH 5,3, de al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 35 %.

[0103] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa con una actividad relativa de al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 85 %, preferiblemente al menos el 90 % a pH 4,5.

[0104] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa con una estabilidad de pH a pH 4,5 de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %.

[0105] La determinación de la estabilidad térmica y la estabilidad de pH se describe en el ejemplo 4.

[0106] En una forma de realización específica, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa, preferiblemente derivada a partir de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802. La glucoamilasa también puede ser glucoamilasa con al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %,

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tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con el polipéptido maduro mostrado en la SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802.

[0107] En una forma de realización preferida, la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802 y mostrada en las SEQ ID N.°: 9 y 14 de este documento, con una sustitución K79V (utilizando la secuencia madura mostrada en la SEQ ID N.°: 14 para la numeración). La variante de glucoamilasa K79V tiene sensibilidad reducida a la degradación de proteasas con respecto a la progenitora como se describe en la solicitud copendiente de EE.UU. N.° 61/531,189.

[0108] Una composición de la invención puede comprender además una pululanasa. En una forma de realización preferida, la pululanasa incluye un dominio X47 como se describe en US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836.

[0109] Específicamente, la pululanasa se puede derivar a partir de una cepa del género Thermococcus, que incluye Thermococcus litoralis y Thermococcus hydrothermalis o un híbrido de los mismos.

[0110] La pululanasa puede ser pululanasa de Thermococcus hydrothermalis truncada en el sitio X4 o una enzima híbrida de Thermococcus hydrothermalis/T. litoralis con sitio de truncamiento X4 como se describe en US 61/289,040 publicada como WO 2011/087836 o mostrada en la SEQ ID N.°: 12 de este documento.

[0111] En una forma de realización, la proporción de proteína enzimática (función del peso) entre los componentes en una composición de la invención puede ser:

Alfa-amilasa: glucoamilasa: proteasa: 0,1-10: 0,5-50: 0,1-7, tal como 0,5-3: 1-30: 0,5-2, tal como 1-2: 5-20: 0,5-2.

Materiales y métodos Materiales:

[0112]

Alfa-amilasa A: alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones I181*+G182*+N193F truncada a 491 aminoácidos (SEQ ID N.°: 1)

Alfa-amilasa 1093: alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E truncada a 491 aminoácidos (SEQ ID N.°: 1)

Alfa-amilasa 1407: alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S truncada a 491 aminoácidos (SEQ ID N.°: 1)

Alfa-amilasa 1236: alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S truncada a 491 aminoácidos (SEQ ID N.°: 1)

Proteasa 136: metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus CGMCC n° 0670 descrita como aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 3 de este documento y aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 2 en WO 2003/048353 con las mutaciones siguientes:

D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L

Proteasa 196: metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus CGMCC n° 0670 descrita como aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 3 de este documento y aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 2 en WO 2003/048353 con las mutaciones siguientes:

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

Proteasa 077: metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus CGMCC n° 0670 descrita como aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 3 de este documento y aminoácidos 1-177 en la SEQ ID N.°: 2 en WO 2003/048353 con las mutaciones siguientes: A27K+D79L+S87P+A112P+D142L.

Proteasa Pfu: proteasa derivada de Pyrococcus furiosus comprada de Takara Bio Inc. (Japón) como proteasa Pfu S (actividad 10,5 mg/mL) y también mostrada en la SEQ ID N.°: 13 de este documento.

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Glucoamilasa PO: parte madura de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEQ ID N.°: 2 en PCT/CN10/071753 publicada como WO 2011/127802 y mostrada en las SEQ ID N.°: 9 y 14 de este documento.

Glucoamilasa PE001: variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum con una sustitución K79V utilizando la secuencia madura mostrada en SEQ ID N.°: 14 para la numeración.

Glucoamilasa BL: mezcla de glucoamilasa de Tamaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 como la SEQ ID N.°: 7 y glucoamilasa de Trametes cingulata descrita en WO 06/069289 en una proporción de aproximadamente 9:1.

Glucoamilasa BL2: mezcla que comprende glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448, glucoamilasa de Trametes cingulata descrita en WO 06/69289, y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD descrito como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 como actividades secundarias (proporción de aproximadamente 65:15:1)

Sustrato en el ejemplo 9: maíz molido de Corn LP, Iowa, EE.UU. (84,19 % de DS) y agua de proceso (6,27 % de DS).

Pululanasa TH: pululanasa de Thermococcus hydrothermalis mostrada en la SEQ ID N.°: 11 de este documento.

Levadura: RED STAR ETHANOL RED™ disponible de Red Star/Lesaffre, EE.UU.

Métodos

[0113] Identidad: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad".

[0114] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se puede determinar mediante el programa "align", que es un alineamiento de Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento global). El programa se usa para el alineamiento de secuencias de polipéptidos, al igual que secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 se usa para alineamientos de polipéptidos, y la matriz de identidad predeterminada se usa para alineamientos de nucleótidos. La penalización para el primer residuo de un espacio es -12 para polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para otros residuos de un espacio son -2 para polipéptidos, y -4 para nucleótidos.

[0115] "Align" forma parte de la versión del paquete FASTA versión v20u6 (véase Pearson y Lipman, 1988, "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, y Pearson, 1990, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de proteínas de FASTA usan el algoritmo de Smith-Waterman sin limitación en cuanto al tamaño de espacio (véase, "Smith-Waterman algorithm" Smith y Waterman, 1981, J. Mol. Biol. 147:195-197).

Ensayos de proteasa

Ensayo de AZCL-caseína

[0116] Una solución de 0,2 % del sustrato azul de AZCL-caseína se suspende en tampón Borax/NaH2PO4 de pH 9 al tiempo que se agita. La solución se distribuye al tiempo que se agita a placas de microtitulación (100 microL a cada pocillo), se adicionan 30 microL de muestra enzimática y las placas se incuban en un termomezclador de Eppendorf durante 30 minutos a 45 °C y 600 r.p.m. La muestra de enzima desnaturalizada (ebullición a 100 °C durante 20 min) se usa como un blanco. Tras la incubación, la reacción se detiene transfiriendo la placa de microtitulación a hielo y la solución coloreada se separa del sólido mediante centrifugación a 3000 r.p.m. durante 5 minutos a 4 °C. 60 microL de sobrenadante se transfieren a una placa de microtitulación y la absorbancia a 595 nm se mide utilizando un lector de microplacas BioRad.

Ensayo de pNA

[0117] 50 microL de muestra que contiene proteasa se adicionan a una placa de microtitulación y se comienza el ensayo adicionando 100 microL 1mM de sustrato pNA (5 mg disueltos en 100 microL de DMSO y diluido adicionalmente a 10 mL con tampón Borax/NaH2PO4 de pH 9,0). El aumento en OD405 a temperatura ambiente se monitorea como una medida de la actividad de proteasa.

Actividad de glucoamilasa (AGU)

[0118] La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades de glucoamilasa (AGU).

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[0119] La unidad Novo de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar de 37 °C, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

[0120] Un sistema autoanalizador se puede utilizar. Se adiciona mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se vuelva beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.

Incubación de AMG:

Sustrato:: maltosa 23,2 mM

Tampón:: acetato 0,1 M

pH:: 4,30 ± 0,05

Temperatura de incubación:: 37 °C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Rango de trabajo de la enzima:: 0,5-4,0 AGU/mL

Reacción de color:

GlucDH:: 430 U/L

Mutarotasa:: 9 U/L

NAD:: 0,21 mM

Tampón:: fosfato 0,12 M; 0,15 M de NaCl

pH:: 7,60 ± 0,05

Temperatura de incubación:: 37 °C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Longitud de onda:: 340 nm

[0121] Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, carpeta que se incluye en el presente documento por referencia.

Actividad de alfa-amilasa (KNU)

[0122] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar utilizando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición del almidón de patata modificado por la enzima, y a la reacción le sigue la mezcla de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el color azul se hace más débil y se vuelve gradualmente un marrón rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.

[0123] Una Unidad Kilo Novo (KNU) de alfa-amilasa se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándar (es decir, a 37 °C +/- 0,05, 0,0003 M de Ca2+; y pH 5,6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.

[0124] Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, carpeta que se incluye en el presente documento por referencia.

Determinación de actividad de pululanasa (NPUN)

[0125] La actividad de endopululanasa en NPUN se mide con respecto a un estándar de pululanasa de Novozymes. Una unidad de pululanasa (NPUN) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micro mol de glucosa por minuto bajo las condiciones estándar (0,7 % de pululano rojo, (Megazyme) pH 5, 40 °C, 20 minutos). La actividad se mide en NPUN/ml utilizando pululano rojo.

[0126] 1 mL de muestra o estándar diluido se incuba a 40 °C durante 2 minutos. 0,5 ML 2 % de pululano rojo, 0,5 M de KCI, 50 mM de ácido cítrico, pH 5 se adicionan y se mezclan. Los tubos se incuban a 40 °C durante 20 minutos y se detienen adicionando 2,5 ml 80 % de etanol. Los tubos se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 10-60 minutos seguido de centrifugación 10 minutos a 4000 r.p.m. OD de los sobrenadantes se mide entones a 510 nm y la actividad se calcula utilizando una curva estándar.

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Ejemplos Ejemplo 1

Estabilidad de variantes de alfa-amilasa

[0127] La estabilidad de una alfa-amilasa de referencia (alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones I181*+G182*+N193F truncada a 491 aminoácidos (SEQ ID N.°: 1)) y variantes de alfa-amilasa de la misma se determinó incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a pH 4,5 y 5,5 y temperaturas de 75 °C y 85 °C con 0,12 mM de CaCl2 seguido de determinación de actividad residual utilizando el sustrato de EnzChek® (equipo de ensayo de amilasa EnzChek® Ultra, E33651, Molecular Probes).

[0128] Las muestras de enzima purificadas se diluyeron a concentraciones de trabajo de 0,5 y 1 o 5 y 10 ppm (microgramos/ml) en tampón de dilución enzimática (10 mM de acetato, 0,01 % de Triton X100, 0,12 mM de CaCl2, pH 5,0). Veinte microlitros de muestra enzimática se transfirieron a una MTP de PCR de 48 pocillos y 180 microlitros de tampón de estabilidad (150 mM de acetato, 150 mM de MES, 0,01 % de triton X100, 0,12 mM de CaCl2, pH 4,5 o 5,5) se adicionaron a cada pocillo y se mezclaron. El ensayo se realizó utilizando dos concentraciones enzimáticas en duplicados. Antes de la incubación a 75 °C u 85 °C, 20 microlitros se retiraron y se almacenaron en hielo como muestras de control. La incubación se realizó en una máquina PCR a 75 °C y 85 °C. Después de la incubación, las muestras se diluyeron a 15 ng/mL en el tampón de actividad residual (100 mM de acetato, 0,01 % de Triton X100, 0,12 mM de CaCl2, pH 5,5) y 25 microlitros de enzima diluida se transfirieron a negro 384-MTP. La actividad residual se determinó utilizando el sustrato EnzChek adicionando 25 microlitros de solución de sustrato (100 microgramos/ml) a cada pocillo. La fluorescencia se determinó cada minuto durante 15 minutos usando filtro de excitación a 485-P nm y filtro de emisión a 555 nm (el lector de fluorescencia es Polarstar, BMG). La actividad residual se normalizó a las muestras de control para cada configuración.

[0129] Asumiendo una desintegración logarítmica, el tiempo de vida media (T A (min)) se calculó utilizando la ecuación: T A (min) = T(min)*LN(0,5)/LN(%RA/100), donde T es tiempo de incubación de ensayo en minutos, y %RA es % de actividad residual determinado en el ensayo.

[0130] Usando esta configuración de ensayo, el tiempo de vida media se determinó para la alfa-amilasa de referencia y la variante de la misma como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Mutaciones: T 1% (min) (pH 4,5, 75 °C, 0,12 mM de CaCl2) T % (min) (pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2) T % (min) (pH 5,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2)

Alfa-amilasa A de referencia: 21 4 111

Alfa-amilasa A de referencia con la sustitución V59A: 32 6 301

Alfa-amilasa A de referencia con la sustitución V59E: 28 5 230

Alfa-amilasa A de referencia con la sustitución V59I: 28 5 210

Alfa-amilasa A de referencia con la sustitución V59Q: 30 6 250

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+ K220P+N224L+Q254S: 149 22 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+ K220P+N224L+Q254S: >180 28 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+Q254S+D269E+D281N: 112 16 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+Q254S+I270L: 168 21 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+Q254S+H274K: >180 24 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones: 91 15 ND

V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+Q254S+Y276F

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+ N224L+S242Q+Q254S: 141 41 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+ N224L+S242Q+Q254S: >180 62 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S: >180 49 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S+H274K: >180 53 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S+Y276F: >180 57 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S+D281N: >180 37 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S+M284T: >180 51 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ S242Q+Q254S+G416V: >180 45 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+ K177L+R179E+K220P+N224L+ Q254S: 143 21 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+ Q254S+M284T: >180 22 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+S242Q+Q254S: >180 38 ND

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+ R179E: 57 11 402

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S: 174 44 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+ Q254S+Y276F+L427M: >180 49 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T: >180 49 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+ Q254S+N376*+I377*: 177 36 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+ R179E+K220P+N224L+Q254S: 94 13 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T: 129 24 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179E+S242Q: 148 30 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+ R179V: 78 9 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S: 178 31 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones K220P+N224L+S242Q+Q254S: 66 17 >480

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones K220P+N224L+Q254S: 30 6 159

Alfa-amilasa A de referencia con la sustitución M284T: 35 7 278

Alfa-amilasa A de referencia con las sustituciones M284V: 59 13 ND

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ND no determinado_____________________________________________________________________________|

[0131] Los resultados demuestran que las variantes de alfa-amilasa tienen una vida media y una estabilidad significativamente superiores que la alfa-amilasa de referencia.

Ejemplo 2

Preparación de variantes de proteasa y prueba de termoestabilidad

[0132] Los productos químicos usados eran productos comerciales de al menos calidad reactiva.

Cepas y plásmidos:

[0133] E. coli DH12S (disponible de Gibco BRL) se usó para el rescate de plásmidos de levadura. pJTP000 es un vector transportador de S. cerevisiae y E. coli bajo el control del promotor TPI, construido a partir de pJC039 descrito en WO 01/92502, donde se ha insertado el gen de proteasa de Thermoascus aurantiacus M35 (WO 03/048353).

[0134] Células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, leu2-D2, his 4-539 se usó para expresión de variantes de proteasa. Se describe en J. Biol. Chem. 272(15): 9720-9727 (1997).

Medios y sustratos

[0135]

10X Solución basal: base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO) 66,8 g/L, succinato 100 g/l, NaOH 60 g/l.

SC-glucosa: 20 % de glucosa de (es decir, una concentración final de 2 % = 2 g/100 mL)) 100 mL/L, 5 % de treonina 4 mL/L, 1 % de triptófano 10 ml/l, 20 % de ácidos de casamino 25 ml/l, 10 X solución basal 100 ml/l. La solución se esteriliza utilizando un filtro de un tamaño de poros de 0,20 micrómetros. Agar (2 %) y H2O (aprox. 761 ML) se someten juntos a autoclave, y la solución de SC-glucosa esterilizada separadamente se adiciona a la solución de agar.

YPD: bacto-peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/L, 20 % de glucosa 100 mL/L.

YPD+Zn: YPD+0,25 mM ZnSO4.

Solución PEG/LiAc: 40 % PEG4000 50 ml, 5 M acetato de litio 1 mL.

Placa de microtitulación de zeína de 96 pocillos:

[0136] Cada pocillo contiene 200 microL de 0,05-0,1 % de zeína (Sigma), 0,25 mM de ZnSO4 y 1 % de agar en 20 mM de tampón de acetato sódico, pH 4,5.

Manipulaciones de ADN

[0137] A menos que se indique de otro modo, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. Et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley e hijos, 1995; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (Eds.).

Transformación de levadura

[0138] La transformación de levadura se realizó utilizando el método de acetato de litio. 0,5 microL de vector (digerido por endonucleasas de restricción) y 1 microL de fragmentos de PCR se mezclan. La mezcla de ADN, 100 microL de células competentes YNG318 y 10 microL de ADN portador YEAST MAKER (Clontech) se adicionan a un tubo de polipropileno de 12 mL (Falcon 2059). Adicionar 0,6 mL de solución PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 min a 30 °C, y 200 r.p.m. seguido de 30 min a 42 °C (choque térmico). Transferir a un tubo de Eppendorf y centrifugar durante 5 s. Eliminar el sobrenadante y resolver en 3 mL de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45 min a 200 r.p.m. a 30 °C. Verter la suspensión a las placas de SC-glucosa e incubar 30 °C durante 3 días para cultivar colonias. ADN total de levadura se extraen mediante el equipo Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (ZYMO research).

Secuenciación del ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0139] La transformación de E. coli para secuenciación del ADN se efectuó por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser).

Plásmidos de ADN se prepararon por el método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el equipo Qiagen® Plasmid. Los fragmentos de ADN se recuperaron a partir del gel de agarosa mediante el equipo de extracción de gel de Qiagen. Se realizó PCR utilizando un motor de ADN PTC-200. El analizador genético ABI PRISMTM 310 se usó para la determinación de todas las secuencias de ADN.

Construcción de vector de expresión de proteasa

[0140] El gen de proteasa M35 de Thermoascus se amplificó con el par de cebadores Prot F (SEQ ID N.°: 4) y Prot R (SEQ ID N.°: 5). Los fragmentos de PCR resultantes se introdujeron en S. cerevisiae YNG318 junto con el vector pJC039 (descrito en WO 2001/92502) digeridos con enzimas de restricción para eliminar el gen de cutinasa de Humicola insolens.

[0141] El plásmido en los clones de levadura en las placas de SC-glucosa se recuperó para confirmar la secuencia interna y se denominó como pJTP001.

Construcción de biblioteca de levadura y variantes dirigidas al sitio

[0142] La biblioteca de levadura y las variantes dirigidas al sitio se construyeron con el método de PCR de SOE (empalme por superposición de extensión, véase "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido de recombinación in vivo de levadura.

Cebadores generales para amplificación y secuenciación

[0143] Los cebadores AM34 (SEQ ID N.°: 6) y AM35 (SEQ ID N.°:7) se usaron para hacer fragmentos de ADN que contienen cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 + cebador inverso y AM35 + cebador directo) o solo para amplificar un gen de proteasa entero (AM34 + AM35).

Sistema de reacción por PCR:: Condiciones:

48,5 microL de H2O: 1 94 °C 2 min

2 esferas de PCR listas para el uso de puRe Taq (Amersham Biosciences): 2 94 °C 30 s

0,5 microL X 2 100 pmol/microL de cebadores: 3 55 °C 30 s

0,5 microL de modelo de ADN: 4 72 °C 90 s

: 2-4 25 ciclos

: 5 72 °C 10 min

[0144] Se recuperaron fragmentos de ADN de gel de agarosa mediante el equipo de extracción de gel de Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes se mezclaron con la digestión del vector. La solución mezclada se introdujo en Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas o variantes dirigidas al sitio por recombinación in vivo.

Ensayo de actividad relativa

[0145] Se inocularon clones de levadura en SC-glucosa en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con medio YPD+Zn y se cultivaron a 28 °C durante 3 días. Los sobrenadantes del cultivo se aplicaron a una placa de microtitulación de 96 pocillos de zeína y se incubaron a al menos 2 temperaturas (ex., 70 °C y 80 °C) durante más de 4 horas o durante toda la noche. La turbidez de la zeína en la placa se midió como A630 y la actividad relativa (temperaturas superiores/inferiores) se determinó como un indicador de mejora de la termoactividad. Los clones con actividad relativa más alta que la variante progenitora se seleccionaron y la secuencia se determinó.

Ensayo de actividad restante

[0146] Los clones de levadura en SC-glucosa se inocularon a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron a 28 °C durante 3 días. La actividad de proteasa se midió a 65 °C usando azocaseína (Megazyme) después de la incubación del sobrenadante del cultivo en 20 mM de tampón de acetato sódico, pH 4,5, durante 10 min a una temperatura determinada (80 °C u 84 °C con 4 °C como una referencia) para determinar la actividad restante. Los clones con actividad restante más alta que la variante progenitora se seleccionaron y la secuencia se determinó.

Ensayo de azocaseína

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0147] 20 microL de muestras se mezclaron con 150 microL de solución de sustrato (4 mL de 12,5 % de azocaseína en etanol en 96 mL de 20 mM de acetato sódico, pH 4,5, que contiene 0,01 % de triton-100 y 0,25 mM de ZnSO4) y se incubaron durante 4 horas o más.

[0148] Después de adicionar 20 microL/pocillo de solución de ácido tricloroacético (ATC) 100 %, la placa se centrifugó y 100 microL de sobrenadantes se sacaron con pipeta para medir A440.

Expresión de variantes de proteasa en Aspergillus oryzae

[0149] Los constructos que comprenden los genes de la variante de proteasa se usaron para construir vectores de expresión para Aspergillus. Los vectores de expresión de Aspergillus consisten en un casete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutra de Aspergillus niger fusionado a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg). También estaba presente en el plásmido el marcador selectivo de Aspergillus amdS de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento en la acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión para las variantes de proteasa se transformaron en Aspergillus tal y como se describe en Lassen et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 4701-4707.

Para cada uno de los constructos, 10-20 cepas se aislaron, purificaron y cultivaron en matraces de agitación. Purificación de variantes expresadas

[0150]

1. Ajustar el pH de los 0,22 pm de muestra de fermentación filtrada a 4,0.

2. Poner la muestra en un baño de hielo con agitación magnética. Adicionar (NH4)2SO4 en pequeñas partes alícuotas (correspondientes a aprox. 2,0-2,2 M de (NH4)2SO4 sin tomar en cuenta el aumento de volumen al adicionar el compuesto).

3. Después de la adición final de (NH4)2SO4, incubar la muestra en el baño de hielo con agitación magnética suave durante 45 min.

4. Centrifugación: centrifugador refrigerado de alta velocidad Hitachi himac CR20G equipado con cabeza de rotor R20A2, 5 °C, 20.000 r.p.m., 30 min.

5. Disolver el precipitado formado en 200 mL de 50 mM Na-acetato pH 4,0.

6. Filtrar la muestra por succión de vacío utilizando una membrana de 0,22 micro m PES PLUS (IWAKI).

7. Desalar/cambiar el tampón de la muestra a 50 mM de Na-acetato pH 4,0 usando ultrafiltración (Vivacell 250v de Vivascience equipada con membrana de 5 kDa PES MWCO) durante toda la noche en una cámara fría. Diluir la muestra de retenido a 200 ml utilizando 50 mM de Na-acetato pH 4,0.

La conductividad de la muestra es preferiblemente menos de 5 mS/cm.

8. Cargar la muestra sobre una columna de intercambio de cationes equilibrada con 50 mM de Na-acetato pH 4,0. Lavar la muestra no unida fuera de la columna utilizando 3 volúmenes de columna de tampón de unión (50 mM de Na-acetato pH 4,0), y eluir la muestra utilizando un gradiente lineal, 0-100 % de tampón de elución (50 mM de Na-acetato + 1 M de NaCl pH 4,0) en 10 volúmenes de columna.

9. Las fracciones recogidas se ensayan mediante un ensayo de endoproteasa (cf. más adelante) seguido de SDS-PAGE estándar (condiciones de reducción) en fracciones seleccionadas. Las fracciones se agrupan basándose en el ensayo de endoproteasa y SDS-PAGE.

Ensayo de endoproteasa

[0151]

1. Pastilla de Protazyme OL/5 ml de 250 mM de Na-acetato pH 5,0 se disuelve por agitación magnética (sustrato: pastilla de Protazyme Ak de endoproteasa de Megazyme - cat. # PRAK 11/08).

2. Con agitación, 250 microL de solución de sustrato se transfieren a un tubo de Eppendorf de 1,5 mL.

3. 25 microL de muestra se adicionan a cada tubo (el blanco es tampón de muestra).

4. Los tubos se incuban en un termomezclador con agitación (1000 r.p.m.) a 50 °C durante 15 minutos.

5. 250 microL de 1 M de NaOH se adicionan a cada tubo, seguido de agitación en vórtex.

6. Centrifugación durante 3 min. a 16,100 * G y 25 °C.

7. 200 microL del sobrenadante se transfieren a una MTP, y la absorbancia a 590 nm se registra.

Tabla 2. Actividad relativa de variantes de proteasa. La numeración de la sustitución (las sustituciones) comienza

a partir del N-terminal del péptido maduro en los aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID N.°: 3.__________________

Variante | Sustitución (sustituciones) y/o deleción | Actividad restante

: (deleciones) 00 o o O 00 o O

JTP082: AS5/D79L/S87P/A112P/D142L 53 %

JTP091: D79L/S87P/A112P/T124V/D142L 43 %

JTP092: AS5/N26R/D79L/S87P/A112P/D142L 60 %

JTP095: N26R/T46R/D79L/S87P/A112P/D142L 62 %

JTP096: T46R/D79L/S87P/T116V/D142L 67 %

JTP099: D79L/P81 R/S87P/A112P/D142L 80 %

JTP101: A27K/D79L/S87P/A112P/T124V/D142L 81 %

JTP116: D79L/Y82F/S87P/A112P/T124V/D142L 59 %

JTP117: D79L/Y82F/S87P/A112P/T124V/D142L 94 %

JTP127: D79L/S87P/A112P/T124V/A126V/D142L 53 %

Tabla 3 Actividad relativa de variantes de proteasa. La numeración de la sustitución (las sustituciones) comienza a partir del N-terminal del péptido maduro en los aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID N.°: 3.

Variante: Sustituciones Actividad relativa

80 °C/70 °C: 85 °C/70 °C

JTP050: D79L S87P A112P D142L 23 % 9 %

JTP134: D79LY82F S87P A112P D142L 40 %

JTP135: S38T D79LS87P A112P A126V D142L 62 %

JTP136: D79LY82F S87P A112P A126V D142L 59 %

JTP137: A27K D79L S87P A112P A126V D142L 54 %

JTP145: S49P D79L S87P A112P D142L 59 %

JTP146: S50P D79L S87P A112P D142L 63 %

JTP148: D79L S87P D104P A112P D142L 64 %

JTP161: D79L Y82F S87G A112P D142L 30 % 12 %

JTP180: S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L 52 %

JTP181: D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L 45 %

JTP187: S70V D79L Y82F S87G A112P D142L 45 %

JTP188: D79L Y82F S87G D104P A112P D142L 43 %

JTP189: D79L Y82F S87G A112P A126V D142L 46 %

JTP193: Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L 15 %

JTP194: Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L 22 %

JTP196: A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L 18 %

Tabla 4 Actividad relativa de variantes de proteasa. La numeración de la sustitución (las sustituciones) comienza a partir del N-terminal del péptido maduro en los aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID N.°: 3.

Variante: Sustituciones Actividad relativa

80 °C/70 °C

JTP196: A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L 55 %

JTP210: A27K Y82F S87G D104P A112P A126V D142L 36 %

JTP211: A27K D79L Y82F D104P A112P A126V D142L 44 %

JTP213: A27K Y82F D104P A112P A126V D142L 37 %

Ejemplo 3

5

Perfil de temperatura de variantes de proteasa seleccionadas utilizando enzimas purificadas

[0152] Las variantes de proteasa seleccionadas con una buena termoestabilidad se purificaron y las enzimas purificadas se usaron en un ensayo de zeína-BCA como se describe a continuación. La actividad de proteasa 10 restante se determinó a 60 °C tras la incubación de la enzima a temperaturas elevadas como se indica durante 60 min.

Ensayo de zeína-BCA:

15 [0153] El ensayo de zeína-BCA se realizó para detectar cuantificación de proteínas solubles liberadas de zeína por

proteasas variantes a varias temperaturas.

Protocolo:

5

10

15

20

25

30

35

40

1) Mezclar 10 microL de 10 micro g/mL de soluciones enzimáticas y 100 microL de 0,025 % de solución de zeína en una placa de microtitulación (MTP).

2) Incubar a varias temperaturas durante 60 min.

3) Adicionar 10 microL de solución de ácido tricloroacético (ATC) 100 %.

4) Centrifugar la MTP a 3500 r.p.m. durante 5 min.

5) Eliminar 15 microL a una nueva MTP que contiene 100 microL de solución de ensayo BCA (Cat. #:23225 de Pierce, equipo de ensayo de proteína BCA).

6) Incubar durante 30 min. a 60 °C.

7) Medir A562.

[0155] Los resultados se muestran en la tabla 5. Todas las variantes de proteasa evaluadas mostraron una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa de tipo salvaje (WT).

Tabla 5 Ensayo de zeína-BCA

WT/Variante: Muestra incubada 60 min a temperaturas indicadas (°C) (micro g/mL péptido equivalente de albúmina de suero bovino liberado)

60 °C: “v] O o o “v] en o O 00 o o O 00 en o O co o o O CO en o O

WT: 94 103 107 93 58 38

JTP050 (D79L+S87P+A112P+D142L): 86 101 107 107 104 63 36

JTP077 (A27K+D79L+S87P+A112P+D142L): 82 94 104 105 99 56 31

JTP188 (D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+ D142L): 71 83 86 93 100 75 53

JTP196 (A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+ A112P+A126V+D142L): 87 99 103 106 117 90 38

Ejemplo 4

Caracterización de glucoamilasa de Penicillium oxalicum

[0156] La glucoamilasa de Penicillium oxalicum se describe en WO 2011/127802 y en la SEQ ID N.°: 9 de este documento.

[0157] Sustrato. Sustrato: 1 % de almidón soluble (Sigma S-9765) en el tampón de reacción de agua desionizada: 0,1 M de tampón acetato a pH 5,3

[0158] Equipo de determinación de concentración de glucosa: equipo de ensayo de glucosa Wako (LabAssay Glucose, WAKO, Cat. # 298-65701).

[0159] Condición de reacción. 20 microL de almidón soluble y 50 microL de tampón acetato a pH 5,3 se mezclaron. 30 microL de solución enzimática (50 micro g de proteína enzimática/ml) se adicionaron a un volumen final de 100 microL seguido de incubación a 37 °C durante 15 min.

[0160] La concentración de glucosa se determinó mediante equipos Wako.

[0161] Todo el trabajo se realizó en paralelo.

[0162] Temperatura óptima. Para valorar la temperatura óptima de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo de "condición de reacción" anteriormente descrito se realizó a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 y 95 °C. Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6. Temperatura óptima

Temperatura (°C): 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95

Actividad relativa (%): 63,6 71,7 86,4 99,4 94,6 100,0 92,9 92,5 82,7 82,8

[0163] A partir de los resultados, se puede observar que la temperatura óptima para la glucoamilasa de Penicillium oxalicum en las condiciones dadas es de entre 50 °C y 70 °C y la glucoamilasa mantiene más del 80 % de la actividad a 95 °C.

5 [0164] Estabilidad térmica. Para valorar la estabilidad térmica de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo

de condición de reacción se modificó en que la solución enzimática y el tampón acetato se preincubaron durante 15 min a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 y 95 °C. Después de la incubación, 20 microL de almidón se adicionaron a la solución y el ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente.

10 [0165] Los resultados se muestran en la tabla 7.

Tabla 7 Estabilidad térmica

Temperatura (°C): 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95

Actividad relativa (%): 91,0 92,9 88,1 100,0 96,9 86,0 34,8 36,0 34,2 34,8

[0166] A partir de los resultados se puede observar que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum es estable hasta

15 70 °C después de la preincubación durante 15 min en que mantiene más del 80 % de actividad.

[0167] pH óptimo. Para valorar el pH óptimo de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo de condición de reacción anteriormente descrito se realizó a pH 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0. En vez de usar el tampón acetato descrito en el ensayo de condición de reacción del tampón, se usó el siguiente tampón 100

20 mM de ácido succínico, HEPES, CHES, CAPSO, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCI, 0,01 % de Triton X-100, pH ajustado a 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 u 11,0 con HCI o NaOH.

[0168] Los resultados se muestran en la tabla 8.

25 ___________________________________ Tabla 8 pH óptimo ______________________________

pH: 2,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

actividad relativa ______: 71,4 78,6 77,0 91,2 84,2 100,0 55,5 66,7 30,9 17,8 15,9 16,1

[0169] A partir de los resultados se puede observar que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum en las condiciones dadas tiene la mayor actividad a pH 5,0. La glucoamilasa de Penicillium oxalicum es activa en un amplio rango de pH en el que mantiene más del 50 % de actividad de pH 2 a 7.

30

[0170] Estabilidad de pH. Para valorar la estabilidad térmica de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo de condición de reacción se modificó en que la solución enzimática (50 micro g/mL) se preincubó durante 20 horas en tampones con pH 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0 utilizando los tampones descritos en pH óptimo. Después de la preincubación, 20 microL de almidón soluble a un volumen final de 100 microL se adicionaron

35 a la solución y el ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente.

[0171] Los resultados se muestran en la tabla 9.

Tabla 9 Estabilidad de pH

pH: 2,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

actividad relativa (%): 17,4 98,0 98,0 103,2 100,0 93,4 71,2 90,7 58,7 17,4 17,0 17,2

40

[0172] A partir de los resultados se puede observar que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, es estable de pH 3 a pH 7 después de la preincubación durante 20 horas y reduce su actividad a pH 8.

Ejemplo 5

45

Proceso de producción de etanol mejorado

[0173] Preparación de triturado: triturados de maíz se prepararon mediante licuefacción en un baño de agua a 85 °C durante 2 horas. El contenido de sólidos secos (DS) fue de alrededor del 30-33 % y la proporción de agua de proceso

50 alrededor del 30 %. Preparación de triturado: suspensiones de maíz se prepararon para licuefacción pesando las cantidades específicas de maíz molido, agua de proceso, y agua del grifo en botellas de Nalgene. Las suspensiones se ajustaron a o bien pH 5,80 (Control) utilizando 50 % p/p de NaOH o bien 4,50 (estudio A, B) o bien 4,80 (Estudio

5

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C, D, E, F) utilizando 40 % v/v de H2SO4. Los triturados de control usando alfa-amilasa A se hicieron a pH 5,8. Se adicionaron partes alícuotas de soluciones madre enzimáticas. Las botellas se taparon apretadamente y se colocaron en el baño de agua. Las suspensiones se agitaron enérgicamente una vez cada 5 minutos durante los primeros 30 minutos y luego una vez cada 30 minutos a partir de entonces durante un total de 2 horas. Los triturados se enfriaron inmediatamente en un baño de hielo. Urea y penicilina se adicionaron entonces a cada triturado para alcanzar concentraciones de 500 y 3 ppm, respectivamente.

[0174] Configuración de fermentación: los triturados se ajustaron a pH 5,0 utilizando 40 % de H2SO4 o 50 % de NaOH. Aproximadamente 5 g de cada triturado se transfirieron a tubos centrifugadores Falcon de plástico de 15 mL prepesados para la fermentación. Típicamente, se prepararon cinco fermentaciones repetidas para cada tratamiento. Un pequeño agujero se perforó en la tapa de cada tubo para permitir la liberación de CO2 durante la fermentación. Después de la transferencia del triturado, todos los tubos se volvieron a pesar para obtener sus pesos de muestra inicial. En cada tubo se adicionaron entonces 100 microL de levadura RED STAR ETHANOL RED rehidratada (rehidratada pesando 5,5 g de levadura seca en un matraz de Erlenmeyer de 150 mL, adicionando 100 mL de agua del grifo y agitando en un baño de agua a 32 °C durante 30 minutos), una parte alícuota de glucoamilasa BL diluida (diluida en agua desionizada) se necesita para alcanzar concentraciones de inicio de 0,50 AGU/g de DS. Agua desionizada se adicionó a cada tubo de manera que el volumen total de líquido añadido a cada tubo con respecto al peso de la muestra fuera el mismo. Todos los tubos se volvieron a pesar entonces y luego se colocaron en un conjunto de baño de agua a 32 °C. Se permitió típicamente que la fermentación progresara durante 54 horas (si no se declara otra cosa). Los tubos se agitaron enérgicamente en vórtex después de aproximadamente 7 horas y luego se agitaron en vórtex y se volvieron a pesar dos veces al día durante el tiempo de fermentación restante. Los gramos de etanol producidos por gramo de sólidos secos en cada tubo se calcularon a partir de los datos de pérdida de peso según la ecuación siguiente:

g etanol /g DS

, ... , 1 mol C07 1 mol etanol

g C02 perdida de peso x 44,0Q98 g x 1 mQ, ^ x

g maíz en tubo x % DS de maíz

46,094 g etanol 1 mol etanol

[0175] Típicamente, 4 tubos repetidos para cada tratamiento se sacaron después de 54 horas de fermentación para análisis de HPLC. Las muestras sacadas se trataron con 50 microL de 40 % de H2SO4 para parar la fermentación y se agitaron en vórtex minuciosamente. Las muestras se centrifugaron luego a 1460xg durante 10 minutos y luego se filtraron en los viales de HPLC a través de filtros de jeringa de 0,45 micro m. El análisis de HPLC se condujo finalmente en las muestras para cuantificar las cantidades de etanol.

Resultados

[0176] Una visión de conjunto de los resultados se proporciona en la tabla 10.

Tabla 10: Las dosis enzimáticas se enumeran en paréntesis para cada una y se expresan como micro g EP/g de DS.

Estudio: pH Enzimas en la etapa de licuefacción i). Glucoamilasa en SSF HPLC EtOH vs alfa- amilasa A de referencia (Control)

A: 4,5 Alfa-amilasa 1093 (1,4) Proteasa 077 (2) Pululanasa TH (2) Glucoamilasa BL 3,0 %

B: 4,5 Alfa-amilasa 1093 (2,75) Proteasa 077 (5) Pululanasa TH (2) Glucoamilasa BL 1,6 %

C: 4,8 Alfa-amilasa 1236 (2) Proteasa 136 (2) Glucoamilasa PO (15) Glucoamilasa BL 4,7 %

D: 4,8 Alfa-amilasa 1093 (2) Proteasa 180 (2,1) Glucoamilasa PO (10) Glucoamilasa BL 4,2 % (48 h)

E: 4,8 Alfa-amilasa 1236 (2) Proteasa 188 (2) Glucoamilasa PO (15) Glucoamilasa BL 7,1 %

F: 4,8 Alfa-amilasa 1407 (1) Glucoamilasa BL 4,8 % (a 72 h)


: Proteasa 196 (2) Glucoamilasa pO (2)

*medido a 54 horas a menos que se indique de otro modo.

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Ejemplo 6

Licuefacción de maíz entero y proceso de SSF que utiliza la variante de AMG de P. oxalicum (PE001)

[0177] La variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum (Glucoamilasa PO), Glucoamilasa PE001, que muestra sensibilidad reducida a la degradación de proteasa, se evaluó tanto en la licuefacción de maíz entero como en la sacarificación de almidón (mostrada en el apartado siguiente). Para las licuefacciones de maíz entero, la enzima de glucoamilasa PE001 se adicionó en dosis diferentes con una variante de amilasa de pH bajo, alfa-amilasa 1407. En algunas licuefacciones, la variante de glucoamilasa PE001 se evaluó tanto con la amilasa alfa-amilasa 1407 de pH bajo como con la proteasa termoestable proteasa 196. En todos los experimentos, las licuefacciones se hicieron utilizando el sistema automatizado llamado "Lab-O-Mat". Este instrumento controla la temperatura y proporciona mezcla constante. Las otras condiciones experimentales fueron: el pH era 4,8 (para las licuefacciones que contienen la amilasa de bajo pH alfa-amilasa 1407) o 5,8 (para el control de alfa-amilasa A), 32 % de sólidos secos, 85 °C, 2 horas de tiempo total. Los esquemas de dosificación enzimática se muestran en la tabla 11. Los triturados licuados se sacarificaron y se fermentaron usando glucoamilasa BL2 (a una dosis de 0,5 AGU/gramo de sólidos secos durante 54 horas a 32 °C).

Tabla 11. Esquema de dosificación enzimática para los tres experimentos de licuefacción de maíz entero hechos usando variante estable de corte de proteasa de glucoamilasa PO, es decir, glucoamilasa PE001.

Alfa-amilasa (dosis): Proteasa (dosis) Glucoamilasa (dosis)

Alfa-amilasa A (0,02 % p/p de maíz): Ninguna Ninguna

Alfa-amilasa 1407 (1,4 ug EP/g de DS): Ninguna Ninguna

Alfa-amilasa 1407 (1,4 ug EP/g de DS): Ninguna Glucoamilasa PO (P3HK) (10 ug EP/g de DS)

Alfa-amilasa 1407 (1,4 ug EP/g de DS): Ninguna Glucoamilasa PE001 (10 ug EP/g de DS)

Alfa-amilasa 1407 (1,4 ug EP/g de DS): Proteasa 196 (1 ug EP/g de DS) Glucoamilasa PO (P3HK) (10 ug EP/g de DS)

Alfa-amilasa 1407 (1,4 ug EP/g de DS): Proteasa 196 (1 ug EP/g de DS) Glucoamilasa PE001 (10 ug EP/g de DS)

[0178] Los títulos de etanol cuantificados por HPLC (en gramos por litro) se muestran en la tabla 12.

Tabla 12. Media de títulos de etanol y desviaciones estándar asociadas, en gramos por litro. La proteasa 196 es una proteasa de temperatura estable descrita en WO 2011/072191 y la alfa-amilasa 1407 es una amilasa de pH bajo

descrita en WO 2011/082425.

Tratamiento: Etanol (media ± desviación estándar; gramos/litro)

Control de alfa-amilasa A: 126,4 ± 0,3

Control de alfa-amilasa 1407 (variante de alfa-amilasa de pH ba¡o): 126,7 ± 0,3

Glucoamilasa PO (tipo salvaje) P3HK (10 ug EP/g de DS): 127,2 ± 0,4

Variante de glucoamilasa PE001 (10 ug EP/g de DS): 127,1 ± 0,5

Glucoamilasa PO (tipo salvaje) P3HK (10 ug EP/g de DS) + proteasa 196 (1 ug EP/g de DS): 127,6 ± 0,4

Variante de glucoamilasa PE001 (10 ug EP/g de DS) + proteasa 196 (1 ug EP/g de DS): 127,7 ± 0,2

Ejemplo 7

Termoestabilidad de proteasa Pfu

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[0179] La termoestabilidad de la proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu S) adquirida de Takara Bio, (Japón) se evaluó usando los mismos métodos que en el ejemplo 2. Se observó que la termoestabilidad (actividad relativa) fue del 110 % a (80 °C/70 °C) y 103 % (90 °C/70 °C) a pH 4,5.

Ejemplo 8

Producción de etanol usando alfa-amilasa 1407 y proteasa Pfu para la licuefacción

[0180] El fin de este experimento era evaluar el rendimiento de aplicación de la proteasa Pfu derivada de Pyrococcus furiosus a pH 4,8 durante la licuefacción a 85 °C durante 2 horas.

Licuefacción (Labomat)

[0181] Cada licuefacción recibió maíz molido (84,19 % de DS), agua de proceso (6,27 % de DS), y agua del grifo con el objetivo de un peso total de 100 g a 32,50 % de sólidos secos (DS). El agua de proceso se mezcló a 30 % p/p del peso de la suspensión total. El pH de la suspensión inicial era aproximadamente de 5,2 y se ajustó a pH 4,8 con 40 % v/v de ácido sulfúrico antes de la licuefacción. Todas las enzimas se adicionaron según el diseño experimental enumerado en la tabla 13 a continuación. La licuefacción se produjo en un Labomat utilizando las condiciones siguientes: 5 °C/min. rampa, rampa de 17 minutos, tiempo de retención de 103 minutos, 40 r.p.m. durante toda la ejecución, recipientes de acero inoxidable de 200 mL. Después de la licuefacción, todos los recipientes se enfriaron en un baño de hielo y se prepararon para fermentación basándose en el protocolo enumerado en SSF.

Sacarificación y fermentación simultánea (SSF)

[0182] Cada triturado se ajustó a pH 5,0 con 50 % p/p de hidróxido sódico o 40 % v/v de ácido sulfúrico. Se aplicó penicilina a cada triturado a una concentración total de 3 ppm. Los tubos se prepararon con triturado con partes alícuotas de aproximadamente 4,5 g de triturado por 15 mL de tubos de ensayo preperforados para permitir la liberación de CO2. Los tubos de ensayo permanecieron, durante toda la noche, a 4 °C hasta la mañana siguiente.

[0183] Todos los tubos de ensayo de triturado se extrajeron del almacenamiento en frío y se calentaron a 32 °C en la cámara de incubación de entrada. Una vez calentada, la glucoamilasa BL2 se dosificó a cada tubo de triturado a 0,50 AGU/g de DS, se adicionó agua de modo que todos los tubos recibieran 120 pL de líquido y cada muestra de triturado recibió 100 pL de levadura rehidratada. La levadura rehidratada se preparó mezclando 5,5 g de RED STAR de Fermentis en 100 mL de agua del grifo a 32 °C durante al menos 15 minutos.

[0184] En la supervisión de la pérdida de peso de CO2 a lo largo del tiempo, cada unidad de CO2 generada y perdida se convierte en gramo de etanol producido por gramo de sólidos secos (g EtOH/g de DS) mediante la siguiente:

g etanol /g DS

, ... , 1 mol C07 1 mol etanol 46,094 a etanol

g C02 perdida de peso x 44,0098 g x mQ, ^ ^ molyetanol

g triturado en tubo % DS de triturado

Análisis de HPLC

[0185] El muestreo de fermentación se produjo después de 54 horas de fermentación tomando 3 tubos por tratamiento. Cada muestra se desactivó con 50 pL de 40 % v/v de H2SO4, agitando en vórtex, centrifugando a 1460*g durante 10 minutos, y filtrando a través de un filtro de Whatman PP de 0,45 pm. Muestras después de 54 horas se analizaron bajo HPLC sin dilución adicional. Las muestras se almacenaron a 4°C antes de y durante el análisis de HPLC.

Sistema de HPLC: Desgasificador serie 1100/1200 de Agilent con software Chem Station, bomba cuaternaria, automuestreador, compartimento de columna con calentador, detector de índice de refracción (RI)

Columna: Columna de exclusión de iones Bio-Rad HPX-87H 300 mm x 7,8 mm pieza# 125-0140 Catión H de cartucho de seguridad Bio-Rad pieza# 125-0129, soporte pieza# 125-0131

Método: 0,005 M de H2SO4 fase móvil Caudal: 0,6 ml/min Temperatura de columna: 65 °C Temperatura del detector RI: 55 °C

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[0186] El método cuantificó analito(s) usando un estándar de calibración para etanol (% p/v). Una calibración de cuatro puntos que incluye el origen se usa para la cuantificación.

[0187] Donde fue aplicable, los datos se analizaron utilizando software JMP (Cary, NC) con Oneway de ANOVA de pares usando Tukey-Kramer HSD o Dunnett's. Las barras de error que indican el nivel de confianza del 95 % se establecieron multiplicando el error estándar del análisis Oneway de Anova por 1,96.

Tabla 13. Plano experimental.

Licuefacción a 85 °C (pH 4,8)

Alfa-amilasa: Dosis pg/g de DS Proteasa Dosis pg/g de DS Glucoamilasa Dosis pg/g de DS

1407: 1,4 - - - -

1407: 1,4 Pfu 2 - -

1407: 1,4 Pfu 2 PE001 10

La tabla 14 y la fig. 1 más adelante muestran los resultados:

Tratamiento: pH EtOH (% p/v) EtOH (% A) Error Std JMP 95 % CI

Control: 4,8 9,2 100 % 0,022 0,042

Pfu: 4,8 11,0 120 % 0,022 0,042

Pfu+PE001: 4,8 11,0 120 % 0,022 0,042

Ejemplo 9

[0188] El fin de este experimento era evaluar el rendimiento de aplicación de proteasa Pfu derivada de Pyrococcus furiosus a pH 4,8 durante la licuefacción a 85 °C durante 2 horas.

Licuefacción (Labomat)

[0189] Cada licuefacción recibió maíz molido (84,19 % de DS), agua de proceso (6,27 % de DS), y agua del grifo con el objetivo de un peso total de 100 g a 32,50 % de sólidos secos (DS). El agua de proceso se mezcló a 30 % p/p de peso de la suspensión de total. El pH de la suspensión inicial era aproximadamente de 5,2 y se ajustó a pH 4,8 con 40 % v/v de ácido sulfúrico antes de la licuefacción. Todas las enzimas se adicionaron según el diseño de experimentos enumerado en la tabla 13 más adelante. La licuefacción se produjo en un Labomat utilizando las condiciones siguientes: 5 °C/min., rampa, rampa de 17 minutos, tiempo de retención de 103 minutos, 40 r.p.m. durante toda la ejecución, recipientes de acero inoxidable de 200 mL. Después de la licuefacción, todos los recipientes se enfriaron en un baño de hielo y se prepararon para la fermentación basándose en el protocolo enumerado en SSF.

Sacarificación y fermentación simultánea (SSF)

[0190] Cada triturado se ajustó a pH 5,0 con 50 % p/p de hidróxido sódico o 40 % v/v de ácido sulfúrico. Se aplicó penicilina a cada triturado a una concentración total de 3 ppm. Los tubos se prepararon con triturado con partes alícuotas de aproximadamente 4,5 g de triturado por 15 mL de tubos de ensayo preperforados para permitir la liberación de CO2. Los tubos de ensayo permanecieron, durante toda la noche, a 4 °C hasta la mañana siguiente.

[0191] Todos los tubos de ensayo de triturado se extrajeron del almacenamiento en frío y se calentaron a 32 °C en la cámara de incubación de entrada. Una vez calentada, la glucoamilasa BL2 se dosificó a cada tubo de triturado a 0,50 AGU/g de DS, se adicionó agua de modo que todos los tubos recibieron 120 pL de líquido y cada muestra de triturado recibió 100 pL de levadura rehidratada. La levadura rehidratada se preparó mezclando 5,5 g de RED STAR de Fermentis en 100 mL de agua del grifo a 32 °C durante al menos 15 minutos.

[0192] En la supervisión de la pérdida de peso de CO2 a lo largo del tiempo, cada unidad de CO2 generada y perdida se convierte en gramo de etanol producido por gramo de sólidos secos (g EtOH/g de DS) por la siguiente:

g etanol /g DS

, ... , 1 mol C07 1 mol etanol 46,094 a etanol

g C02 perdida de peso x 44,0098 g x mQ, ^ ^ molyetanol

g triturado en tubo % DS de triturado

Análisis de HPLC

5

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25

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40

[0193] El muestreo de fermentación se produjo después de 54 horas de fermentación tomando 3 tubos por tratamiento.

Cada muestra se desactivó con 50 pL de 40 % v/v de H2SO4, agitando en vórtex, centrifugando a 1460*g durante 10 minutos, y filtrando a través de un filtro Whatman PP de 0,45 pm. Muestras después de 54 horas se analizaron bajo HPLC sin dilución adicional. Las muestras se almacenaron a 4 °C antes de y durante el análisis de HPLC.

Sistema de HPLC: Desgasificador de Agilent serie 1100/1200 con software Chem station, bomba cuaternaria, automuestreador, compartimento de columna con calentador Detector de índice de refracción (RI)

Columna: Columna de exclusión de iones Bio-Rad HPX-87H 300 mm x 7,8 mm pieza# 125-0140 Catión H de cartucho de seguridad de Bio-Rad pieza# 125-0129, soporte pieza# 125-0131

[0194] El método cuantificó analito(s) usando el estándar de calibración para etanol (% p/v). Una calibración de cuatro puntos que incluye el origen se usa para la cuantificación.

[0195] Donde fue aplicable, se analizaron los datos utilizando software JMP (Cary, NC) con Oneway de ANOVA de pares usando Tukey-Kramer HSD o Dunnett's. Las barras de error que indican el nivel de confianza del 95 % se establecieron multiplicando el error estándar del análisis Oneway de Anova por 1,96.

Tabla 15. Plano experimental.

Licuefacción a 85 °C (pH 4,8)

1407: 1,4 - - - -

1407: 1,4 Pfu 2 - -

1407: 1,4 Pfu 2 PE001 10

La tabla 16 a continuación muestra los resultados:

Tratamiento: pH EtOH (% p/v) EtOH (% A) Error Std JMP 95 % Cl+I

Control: 4,8 9,2 100 % 0,022 0,042

Pfu: 4,8 11,0 120 % 0,022 0,042

Pfu + PE001: 4,8 11,0 120 % 0,022 0,042

Ejemplo 10

Viscosidad inferior mejorada en el proceso de producción de etanol

[0196] Preparación de harina de maíz: harina de maíz de Corn LP, Iowa, EE.UU., se tamizó y se definió su distribución de tamaño de partículas (PSD). Se usaron tamices de prueba de estándar de EE.UU. con especificaciones ASTM E-11 para los tamices del número 12, 16, 20, 30, 40 y 60. El contenido de sólidos secos (DS) de la harina recibida fue de alrededor del 87,4 %. Cada ejecución experimental se preparó para tener la misma PSD.

[0197] Configuración del perfil de viscosidad y determinación con Rapid Visco Analyzer: se usó una unidad RVA-4 de Perten para medir el perfil de viscosidad durante la licuefacción. Las suspensiones de maíz se prepararon para la licuefacción pesando cantidades específicas de harina de maíz tamizada en un recipiente de metal de Perten que repetía la PSD de la harina recibida. Una suspensión de 40 gramos se hizo a 32 % de DS adicionando agua del grifo y el pH se ajustó a o bien 5,80 (Control) utilizando 50 % p/p de NaOH o bien 4,80 utilizando 40 % v/v de H2SO4. Se adicionaron partes alícuotas de soluciones madre enzimáticas antes de cada ejecución en el RVA-4 de Perten y las cantidades también se consideraron para obtener los sólidos deseados. La suspensión de control usó alfa-amilasa A a pH 5,8. El RVA-4 de Perten se programó para mezclar la suspensión durante 1 minuto a 25 °C, aumentar la temperatura de suspensión de 25 °C a 85 °C en 6 minutos, mantener la temperatura a 85 °C constante durante 2 horas, refrescar la temperatura del triturado licuado de 85 °C hasta 32 °C en 7 minutos, y mantener la temperatura del triturado licuado a 32 °C durante 5 minutos. Durante cada ejecución, la mezcla se mantuvo constante a 210 r.p.m.

Resultados

[0198] Una visión de conjunto de los resultados se proporciona en la tabla 17 y se muestra en las figuras 2-5.

Tabla 17: Las dosis enzimáticas se enumeran en paréntesis para cada ^ una y se expresan como micro g EP/g de DS.

N.° de experimento: Descripción de la enzima Viscosidad máxima Viscosidad media máxima a final Viscosidad final % de reducción de viscosidad máxima vs. experimento 2 % de reducción de viscosidad media y máxima a final vs. experimento 2 % de reducción de viscosidad final vs. experimento 2

1: Alfa-amilasa A (1,4) a pH=5,8 12769 535 1078

2: Alfa-amilasa 1407 (1,4) + Glucoamila- sa PE001 (10) + Proteasa 196 (1) a pH=4,8 15050 659 816

3: Alfa-amilasa A (1,4) + Glucoamila- sa PE001 (10) + Proteasa 196 (1) a pH=4,8 11848 728 1831

4: Alfa-amilasa A (0,35) + Alfa-amilasa 1407 (1,4) + Glucoamila- sa PE001 (10) + Proteasa 196 (1) a pH=4,8 12927 527 689 14 % 20 % 16 %

5: Alfa-amilasa A (0,7) + Alfa-amilasa 1407 (1,4) + Glucoamila- sa PE001 (10) + Proteasa 196 (1) a pH=4,8 11454 423 682 24 % 36 % 16 %

5 Listado de secuencias

[0199]

<110> Novozymes A/S 10 Deinhammer, Randy

Clark, Suzanne Quiros, Mauricio

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Matthews, John Hjulmand, Anne Glud Soong, Chee-Leong Matsui, Tomoko Takagi, Shinobu

<120> Proceso para producir productos de fermentación <130> 12098-WO-PCT

<160> 14

<170> Versión de PatentIn 3.5

<210> 1 <211> 515

<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus

<220>

<221> mat_peptide <222> (1)7.(515)

<400> 1

Ala
Ala: Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1: 5 10 15

Pro: Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn



: 20 25 30

Leu: Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys


: 35 40 45

Gly: Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

: 50 55 60

Leu: Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65: 70 75 80

Lys: Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met




: 85 90 95

Gln: Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly



: 100 105 110

5

10

15

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25

30

35

40

45

50

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205

Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn 210 215 220

Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240

Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly 245 250 255

Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys 260 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 275 280 285

Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala 290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 305 310 315 320

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln 325 330 335

Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile 370 375 380

Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val 405 410 415

Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430

Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val 435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser 450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480

Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr 485 490 495

Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val 500 505 510

Ala Trp Pro 515

<210> 2 <211> 1068 <212> ADN

5 <213> Thermoascus aurantiacus

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(1065)

<220>

<221> misc_signal <222> (1).T(57)

15

<220>

<221> misc_feature <222> (58)7.(534)

20 <220>

<221> mat_peptide <222> (535)..(1068)

<400> 2

25: atg cgg ctc gtt gct tcc cta acg gcc ttg gtg gcc ttg tcc gta

: Met Arg Leu Val Ala Ser Leu Thr Ala Leu Val Ala Leu Ser Val




: -175 -170 -165

: cct gtc ttt ccc gct gct gtc aac gtg aag cgt gct tcg tcc tac

30: Pro Val Phe Pro Ala Ala Val Asn Val Lys Arg Ala Ser Ser Tyr




: -160 -155 -150

: ctg gag atc act ctg agc cag gtc agc aac act ctg atc aag gcc

: Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gln Val Ser Asn Thr Leu Ile Lys Ala

35: -145 -140 -135

: gtg gtc cag aac act ggt agc gac gag ttg tcc ttc gtt cac ctg

: Val Val Gln Asn Thr Gly Ser Asp Glu Leu Ser Phe Val His Leu




: -130 -125 -120

40

: aac ttc ttc aag gac ccc gct cct gtc aaa aag gta tcg gtc tat

: Asn Phe Phe Lys Asp Pro Ala Pro Val Lys Lys Val Ser Val Tyr




: -115 -110 -105

45: cgc gat ggg tct gaa gtg cag ttc gag ggc att ttg agc cgc tac aaa

: Arg Asp Gly Ser Glu Val Gln Phe Glu Gly Ile Leu Ser Arg Tyr Lys




: -100 -95 -90

: tcg act ggc ctc tct cgt gac gcc ttt act tat ctg gct ccc gga gag

50: Ser Thr Gly Leu Ser Arg Asp Ala Phe Thr Tyr Leu Ala Pro Gly ' Glu



: -85 -80 - 75

: tcc gtc gag gac gtt ttt gat att gct tcg act tac gat ctg acc agc

45

90

135

180

225

273

321

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

417

465

513

561

609

657

705

753

801

849

897

945

993

Ser

ggc

Gly

-55

gct

Ala

ttg

Leu

atc

Ile

aga

Arg

10

aac

Asn

gag

Glu

cgt

Arg

acc

Thr

ctg

Leu

90

ttc

Phe

caa

Gln

agc

Ser

Val: Glu Asp Val Phe Asp Ile Ala Ser Thr Tyr Asp Leu Thr Ser

-70: -65 -60

ggc: cct gta act atc cgt act gag gga gtt gtt ccc tac gcc acg

Gly: Pro Val Thr Ile Arg Thr Glu Gly Val Val Pro Tyr Ala Thr




: -50 -45 -40

aac: agc act gat att gcc ggc tac atc tca tac tcg tct aat gtg

Asn: Ser Thr Asp Ile Ala Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Asn Val



: -35 -30 -25

acc: att gat gtc gat ggc gcc gct gct gcc act gtc tcc aag gca

Thr: Ile Asp Val Asp Gly Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Lys Ala


: -20 -15 -10

act: cct ttg gac cgc cgc act agg atc agt tcc tgc tcc ggc agc

Thr: Pro Leu Asp Arg Arg Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser

: -5 -1 1 5

cag: agc gct ctt act acg gct ctc aga aac gct gct tct ctt gcc

Gln: Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala




: 15 20 25

gca: gct gcc gac gcg gct cag tct gga tca gct tca aag ttc agc

Ala
Ala
Ala: Asp Ala Ala Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser



: 30 35 40

tac: ttc aag act act tct agc tct acc cgc cag acc gtg gct gcg

Tyr: Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala


: 45 50 55

ctt: cgg gct gtt gcg cgg gag gca tct tcg tct tct tcg gga gcc

Leu: Arg Ala Val Ala Arg Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala

: 60 65 70

acg: tac tac tgc gac gat ccc tac ggc tac tgt tcc tcc aac gtc

Thr: Tyr Tyr Cys Asp Asp Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val

75: 80 85

gct: tac acc ctg cct tca tac aac ata atc gcc aac tgt gac att

Ala: Tyr Thr Leu Pro Ser Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile




: 95 100 105

tat: act tac ctg ccg gct ctg acc agt acc tgt cac gct cag gat

Tyr: Thr Tyr Leu Pro Ala Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Asp



: 110 115 120

gcg: acc act gcc ctt cac gag ttc acc cat gcg cct ggc gtc tac

Ala: Thr Thr Ala Leu His Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Val Tyr


: 125 130 135

cct: ggc acg gac gac ctg gcg tat ggc tac cag gct gcg atg ggt

Pro: Gly Thr Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


: 140 145 150

ctc: agc agc agc cag gct gtc atg aac gct gac acc tac gct ctc tat

Leu: Ser Ser Ser Gln Ala Val Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr

: 155 160 165

gcg: aat gcc ata tac ctt ggt tgc taa

Ala: Asn Ala Ile Tyr Leu Gly Cys

170: 175

<210> 3

<211> 355

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus <400> 3

Met Arg Leu Val Ala Ser Leu Thr Ala Leu Val Ala Leu Ser Val -175 -170 -165

Pro Val Phe Pro Ala Ala Val Asn Val Lys Arg Ala Ser Ser Tyr -160 -155 -150

Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gln Val Ser Asn Thr Leu Ile Lys Ala -145 -140 -135

Val Val Gln Asn Thr Gly Ser Asp Glu Leu Ser Phe Val His Leu -130 -125 -120

Asn Phe Phe Lys Asp Pro Ala Pro Val Lys Lys Val Ser Val Tyr -115 -110 -105

Arg Asp Gly Ser Glu Val Gln Phe Glu Gly Ile Leu Ser Arg Tyr Lys -100 -95 -90

Ser Thr Gly Leu Ser Arg Asp Ala Phe Thr Tyr Leu Ala Pro Gly Glu -85 -80 -75

Ser Val Glu Asp Val Phe Asp Ile Ala Ser Thr Tyr Asp Leu Thr Ser -70 -65 -60

Gly Gly Pro Val Thr Ile Arg Thr Glu Gly Val Val Pro Tyr Ala Thr -55 -50 -45 -40

1068

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ala Asn Ser Thr Asp Ile Ala Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Asn Val -35 -30 -25

Leu Thr Ile Asp Val Asp Gly Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Lys Ala -20 -15 -10

Ile Thr Pro Leu Asp Arg Arg Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser -5 -1 1 5

Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala 10 15 20 25

Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser 30 35 40

Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala 45 50 55

Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala 60 65 70

Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val 75 80 85

Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile 90 95 100 105

Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Asp 110 115 120

Gln Ala Thr Thr Ala Leu His Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Val Tyr 125 130 135

Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly 140 145 150

Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr 155 160 165

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly Cys 170 175

<210> 4

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Constructo sintético <400> 4

aacgacggta cccggggatc ggatccatgc ggctcgttgc ttccctaac

<210>: 5

<211>: 48

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Constructo artificia

<400>: 5

ctaattacat gatgcggccc ttaattaatt agcaaccaag gtatatgg

<210> 6 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Constructo artificial <400> 6

taggagttta gtgaacttgc

<210> 7

<211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Constructo artificial <400> 7

ttcgagcgtc ccaaaacc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

48

96

144

192

240

288

336

384

432

480

528

<210> 8 <211> 1851

<212> ADN

<213> Penicillium oxalicum

<220>

<221>: CDS

<222>: (1).. .(1851)

<400>: 8

atg: cgt ctc act cta tta tca ggt

Met: Arg Leu Thr Leu Leu Ser Gly

1: 5

cag: ctg acg gcg gcg cgt cct gat

Gln: Leu Thr Ala Ala Arg Pro Asp



: 20

ttc: atc cac aaa gag ggc gag cgg

Phe: Ile His Lys Glu Gly Glu Arg


: 35 40

ctc: ggt ggg cga ggt aag aaa aca

Leu: Gly Gly Arg Gly Lys Lys Thr

: 50 55

att: gcc agt cca aac aca gag aat

Ile: Ala Ser Pro Asn Thr Glu Asn

65: 70

cgt: gac tca gct ttg act gcc aag

Arg: Asp Ser Ala Leu Thr Ala Lys




: 85

tct: cgg gca aag ttt cca att gac

Ser: Arg Ala Lys Phe Pro Ile Asp



: 100

cgg: gac tac gtg tcg tcc caa gca

Arg: Asp Tyr Val Ser Ser Gln Ala


: 115 120

tct: gga acc ctg aag gat ggc
tct

Ser: Gly Thr Leu Lys Asp Gly
Ser

: 130 135

att: gac ctg aat ccc ttt tcg ggt

Ile: Asp Leu Asn Pro Phe Ser Gly

145: 150

ggc: cca gcg ctg cga gcg acc gct

gta: gcc ggc gtt ctc tgc gca gga

Val: Ala Gly Val Leu Cys Ala Gly

: 10 15

ccc: aag ggt ggg aat ctg acg ccg

Pro: Lys Gly Gly Asn Leu Thr
Pro

25: 30

tcg: ctc caa ggc atc ttg gac aat

Ser: Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn




: 45

ccc: ggc act gcc gca ggg ttg ttt

Pro: Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe



: 60

cca: aac tat tat tat aca tgg act

Pro: Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr


: 75 80

tgc: ttg atc gac ctg ttc gaa gac

Cys: Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp

: 90 95

cgc: aaa tac ttg gaa aca gga att

Arg: Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile

105: 110

atc: ctc cag agt gtg tct aat cct

Ile: Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro




: 125

ggt: ctg ggt gaa ccc aag ttt gag

Gly: Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu



: 140

gcc: tgg ggt cgg cct cag cgg gat

Ala: Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp


: 155 160

atg: atc acc tac gcc aac tac ctg

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

Gly: Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu




: 165 170 175

ata: tcc cat ggt cag aaa tcg gat gtg tca cag gtc atg tgg ccg att

Ile: Ser His Gly Gln Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro
Ile



: 180 185 190

att: gcc aat gat cta gca tat gtt ggt caa tac tgg aat aat acc gga

Ile: Ala Asn Asp Leu Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly


: 195 200 205

ttt: gac ctg tgg gaa gag gtg gat ggg tca agc ttt ttc acg att gcg

Phe: Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala

: 210 215 220

gtc: cag cac cga gcc ctt gtt gaa ggc tcg caa ctg gcg aaa aag ctc

Val: Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu

225: 230 235 240

ggc: aag tcc tgc gat gcc tgt gat tct cag cct ccc cag ata ttg tgt

Gly: Lys Ser Cys Asp Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys




: 245 250 255

ttc: ctg cag agt ttc tgg aac gga aag tac atc acc tcc aac atc aac

Phe: Leu Gln Ser Phe Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn



: 260 265 270

acg: caa gca agc cgc tct ggt atc gac ctg gac tct gtc ctg gga agc

Thr: Gln Ala Ser Arg Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser


: 275 280 285

att: cat acc ttt gat ccc gaa gca gcc tgt gac gat gca act ttc cag

Ile: His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln

: 290 295 300

cct: tgt tct gcc cgc gct ctg gcg aac cac aag gtc tat gtg gat tcc

Pro: Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser

305: 310 315 320

ttc: cgc tct atc tac aag att aat gcg ggt ctt gca gag gga tcg gct

Phe: Arg Ser Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala




: 325 330 335

gcc: aac gtt ggc cgc tac ccc gag gat gtt tac caa gga ggc aat cca

Ala: Asn Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro



: 340 345 350

tgg: tat ctc gcc acc cta ggc gca tct gaa ttg ctt tac gac gcc ttg

Trp: Tyr Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu


: 355 360 365

tac: cag tgg gac aga ctt ggc aaa ctt gaa gtc tcg gag acc tcg ttg

Tyr: Gln Trp Asp Arg Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1200

1248

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

tca: ttc ttc aaa gac ttt gac gcg acc gtg aaa att ggc tcg tac tcg

Ser: Phe Phe Lys Asp Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr
Ser

385: 390 395 400

agg: aac agc aag acc tac aag aaa ttg acc cag tcc atc aag tcg tac

Arg: Asn Ser Lys Thr Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr




: 405 410 415

gcg: gac ggg ttc atc cag tta gtg cag cag tac act cct tct aat gga

Ala: Asp Gly Phe Ile Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly



: 420 425 430

tct: ctg gcc gag caa tac gat cgc aat acg gct gct cct ctc tct gca

Ser: Leu Ala Glu Gln Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala


: 435 440 445

aac: gat ctg act tgg tca ttt gcc tct ttc ttg acg gct acg caa cgc

Asn: Asp Leu Thr Trp Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg

: 450 455 460

cgc: gat gcc gtg gtt cct ccc tcc tgg ggc gca aag tcg gca aac aaa

Arg: Asp Ala Val Val Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys

465: 470 475 480

gtc: cca acc act tgt tca gcc tcc cct gtt gtg ggt act tat aag gcg

Val: Pro Thr Thr Cys Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala




: 485 490 495

ccc: acg gca act ttc tca tcc aag act aag tgc gtc ccc gct aaa gat

Pro: Thr Ala Thr Phe Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp



: 500 505 510

att: gtg cct atc acg ttc tac ctg att gag aac act tac tat gga gag

Ile: Val Pro Ile Thr Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu


: 515 520 525

aac: gtc ttc atg agt ggc aac att act gcg ctg ggt aac tgg gac gcc

Asn: Val Phe Met Ser Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala

: 530 535 540

aag: aaa ggc ttc cca ctc acc gca aac ctc tac acg caa gat caa aac

Lys
Lys: Gly Phe Pro Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn

545: 550 555 560

ttg: tgg ttc gcc agt gtc gag ttc atc cca gca ggc aca ccc ttt gag

Leu: Trp Phe Ala Ser Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu




: 565 570 575

tac: aag tac tac aag gtc gag ccc aat ggc gat att act tgg gag aag

Tyr: Lys Tyr Tyr Lys Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys



: 580 585 590

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1824

ggt: ccc aac cgg gtg ttc gtc gct ccc acg gga tgc cca gtt cag cct

Gly: Pro Asn Arg Val Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro


: 595 600 605

cac: tcc aac gac gtg tgg cag ttt tga

His: Ser Asn Asp Val Trp Gln Phe

610 615

<210> 9

<211> 616 <212> PRT

<213> Penicillium oxalicum

<400>: 9

Met: Arg Leu Thr Leu Leu Ser Gly Val Ala Gly Val Leu Cys Ala Gly

1: 5 10 15

Gln: Leu Thr Ala Ala Arg Pro Asp Pro Lys Gly Gly Asn Leu Thr Pro



: 20 25 30

Phe: Ile His Lys Glu Gly Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn


: 35 40 45

Leu: Gly Gly Arg Gly Lys Lys Thr Pro Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe

: 50 55 60

Ile: Ala Ser Pro Asn Thr Glu Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr

65: 70 75 80

Arg: Asp Ser Ala Leu Thr Ala Lys Cys Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp




: 85 90 95

Ser: Arg Ala Lys Phe Pro Ile Asp Arg Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile



: 100 105 110

Arg: Asp Tyr Val Ser Ser Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro


: 115 120 125

Ser: Gly Thr Leu Lys Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu

: 130 135 140

1851

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ile Asp Leu Asn Pro Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp 145 150 155 160

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu 165 170 175

Ile Ser His Gly Gln Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro Ile 180 185 190

Ile Ala Asn Asp Leu Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly 195 200 205

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala 210 215 220

Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu 225 230 235 240

Gly Lys Ser Cys Asp Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys 245 250 255

Phe Leu Gln Ser Phe Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn 260 265 270

Thr Gln Ala Ser Arg Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser 275 280 285

Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln 290 295 300

Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser 305 310 315 320

Phe Arg Ser Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala 325 330 335

Ala Asn Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro 340 345 350

Trp Tyr Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tyr Gln Trp Asp Arg Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu 370 375 380

Ser Phe Phe Lys Asp Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr Ser 385 390 395 400

Arg Asn Ser Lys Thr Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr 405 410 415

Ala Asp Gly Phe Ile Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly 420 425 430

Ser Leu Ala Glu Gln Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala 435 440 445

Asn Asp Leu Thr Trp Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg 450 455 460

Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys 465 470 475 480

Val Pro Thr Thr Cys Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala 485 490 495

Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp 500 505 510

Ile Val Pro Ile Thr Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu 515 520 525

Asn Val Phe Met Ser Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala 530 535 540

Lys Lys Gly Phe Pro Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn 545 550 555 560

Leu Trp Phe Ala Ser Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu 565 570 575

Tyr Lys Tyr Tyr Lys Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys 580 585 590

Gly Pro Asn Arg Val Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro 595 600 605

10

His Ser Asn Asp Val Trp Gln Phe 610 615

15

<210> 10 <211> 4014

<212> ADN

<213> Thermococcus hydrothermalis

20

<220>

<221> CDS <222> (1)..(4011)

25 <220>

<221> misc_signal <222> (1)..(81)

30

35

40

45

<220>

<221> mat peptide

<222>: (82) ..(4014)

<400>: 10

atg: agg cgg gtg gtt gcc ctc ttc att gca att ttg atg ctt gga agc

Met: Arg Arg Val Val Ala Leu Phe Ile Ala Ile Leu Met Leu Gly Ser


: -25 -20 -15

atc: gtt gga gcg aac gtt aag agc gtt ggc gcg gcg gag ccg aag ccg

Ile: Val Gly Ala Asn Val Lys Ser Val Gly Ala Ala Glu Pro Lys Pro

: -10 -5 -1 1 5

ctc: aac gtc ata ata gtc tgg cac cag cac cag ccc tac tac tac gac

Leu: Asn Val Ile Ile Val Trp His Gln His Gln Pro Tyr Tyr Tyr Asp




: 10 15 20

cct: gtc cag gac gtc tac acc agg ccc tgg gtc agg ctc cac gcg gcg

Pro: Val Gln Asp Val Tyr Thr Arg Pro Trp Val Arg Leu His Ala Ala



: 25 30 35

aac
aac: tac tgg aag atg gcc cac tac ctg agc cag tac ccg gag gtt

Asn
Asn: Tyr Trp Lys Met Ala His Tyr Leu Ser Gln Tyr Pro Glu Val


: 40 45 50

48

96

144

192

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

864

cac: gcc acc att gac ctc tcg ggt tcg ctg ata gcc cag ctt gcc gac

His: Ala Thr Ile Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ile Ala Gln Leu Ala Asp

: 55 60 65

tac: atg aac ggc aag aag gac acc tac cag ata atc acc gag aag ata

Tyr: Met Asn Gly Lys Lys Asp Thr Tyr Gln Ile Ile Thr Glu Lys Ile

70: 75 80 85

gcc: aac ggg gaa ccc ctc acc gtc gac gag aag tgg ttc atg ctc cag

Ala: Asn Gly Glu Pro Leu Thr Val Asp Glu Lys Trp Phe Met Leu Gln




: 90 95 100

gca: ccg gga ggg ttc ttc gac aac acc atc ccc tgg aac ggt gaa ccg

Ala: Pro Gly Gly Phe Phe Asp Asn Thr Ile Pro Trp Asn Gly Glu Pro



: 105 110 115

ata: acc gac ccc aac ggc aac ccg ata agg gac ttc tgg gac cgc tac

Ile: Thr Asp Pro Asn Gly Asn Pro Ile Arg Asp Phe Trp Asp Arg Tyr


: 120 125 130

acg: gag ctg aag aac aag atg ctc agc gca aag gcc aag tac gca aac

Thr: Glu Leu Lys Asn Lys Met Leu Ser Ala Lys Ala Lys Tyr Ala Asn

: 135 140 145

ttc: gtg act gag agc cag aag gtc gct gtg acg aac gag ttc aca gag

Phe: Val Thr Glu Ser Gln Lys Val Ala Val Thr Asn Glu Phe Thr Glu

150: 155 160 165

cag: gac tac ata gac cta gcg gtt ctc ttc aat ctc gct tgg att gac

Gln: Asp Tyr Ile Asp Leu Ala Val Leu Phe Asn Leu Ala Trp Ile Asp




: 170 175 180

tac: aat tac atc acg agc acg ccg gag ttc aag gcc ctc tac gac aag

Tyr: Asn Tyr Ile Thr Ser Thr Pro Glu Phe Lys Ala Leu Tyr Asp Lys



: 185 190 195

gtt: gac gag ggc ggc tat aca agg gcg gac gtc aaa acc gtt ctc gac

Val: Asp Glu Gly Gly Tyr Thr Arg Ala Asp Val Lys Thr Val Leu Asp


: 200 205 210

gcc: cag atc tgg ctt ctc aac cac acc ttc gag gag cac gag aag ata

Ala: Gln Ile Trp Leu Leu Asn His Thr Phe Glu Glu His Glu Lys Ile

: 215 220 225

aac: ctc ctc ctc gga aac ggc aac gtc gag gtc acg gtc gtt ccc tac

Asn: Leu Leu Leu Gly Asn Gly Asn Val Glu Val Thr Val Val Pro Tyr

230: 235 240 245

gcc: cac ccg ata ggc ccg ata ctc aac gac ttc ggc tgg gac agc gac

Ala: His Pro Ile Gly Pro Ile Leu Asn Asp Phe Gly Trp Asp Ser Asp




: 250 255 260

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440

1488

1536

ttc

Phe

ggc

Gly

ctc

Leu

gtc

Val

310

gtc

Val

ata

Ile

acc

Thr

gag

Glu

gtg

Val

390

ggg

Gly

gag

Glu

tac

Tyr

gac

Asp

ggc

aac: gac cag gtc aag aag gcc gac gaa ctg tac aag ccg tac ctc

Asn: Asp Gln Val Lys Lys Ala Asp Glu Leu Tyr Lys Pro Tyr Leu


: 265 270 275

ggc
ggc: acc gcg gtt cca aaa ggc gga tgg gcg gct gag agc gcc

Gly
Gly: Thr Ala Val Pro Lys Gly Gly Trp Ala Ala Glu Ser Ala

: 280 285 290

aac: gac aaa act ctg gag atc ctc gcc gag aac ggc tgg gag tgg

Asn: Asp Lys Thr Leu Glu Ile Leu Ala Glu Asn Gly Trp Glu Trp

295: 300 305

atg: acc gac cag atg gtt ctc gga aag ctc ggc att gag gga acc

Met: Thr Asp Gln Met Val Leu Gly Lys Leu Gly Ile Glu Gly Thr




: 315 320 325

gag: aac tac cac aag ccc tgg gtg gcc gag ttc aac gga aag aag

Glu: Asn Tyr His Lys Pro Trp Val Ala Glu Phe Asn Gly Lys Lys



: 330 335 340

tac: ctc ttc cca aga aat cac gat cta agt gac aga gtt ggc ttt

Tyr: Leu Phe Pro Arg Asn His Asp Leu Ser Asp Arg Val Gly Phe


: 345 350 355

tac: agc gga atg aac cag cag cag gcc gtt gag gac ttc gtc aac

Tyr: Ser Gly Met Asn Gln Gln Gln Ala Val Glu Asp Phe Val Asn

: 360 365 370

ctc
ctc: aag ctc cag aag cag aac tac gat ggc tcg ctg gtt tac

Leu
Leu: Lys Leu Gln Lys Gln Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Val Tyr

375: 380 385

gtc: acg ctc gac ggc gag aac ccc gtg gag aac tac ccc tac gac

Val: Thr Leu Asp Gly Glu Asn Pro Val Glu Asn Tyr Pro Tyr Asp




: 395 400 405

gag: ctc ttc ctc acc gaa ctc tac aag aag ctg acc gaa ctc cag

Glu: Leu Phe Leu Thr Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Thr Glu Leu Gln



: 410 415 420

cag: ggt ctc ata aga acc ctc acc ccg agc gag tac atc cag ctc

Gln: Gly Leu Ile Arg Thr Leu Thr Pro Ser Glu Tyr Ile Gln Leu


: 425 430 435

ggc: gac aag gcc aac aag ctc aca cct cgg atg atg gag cgc ctt

Gly: Asp Lys Ala Asn Lys Leu Thr Pro Arg Met Met Glu Arg Leu

: 440 445 450

ctc: acc gga gac aac gtt aac gcc ctc ctc aag gcc cag agc
ctc

Leu: Thr Gly Asp Asn Val Asn Ala Leu Leu Lys Ala Gln Ser
Leu

455: 460 465

gaa: ctc tac gac atg acc ggc gtt aag gag gag atg cag tgg ccc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

Gly: Glu Leu Tyr Asp Met Thr Gly Val Lys Glu Glu Met Gln Trp Pro

470: 475 480 485

gag: agc agc tgg ata gac gga acc ctc tcc acg tgg ata ggc gag ccc

Glu: Ser Ser Trp Ile Asp Gly Thr Leu Ser Thr Trp Ile Gly Glu Pro




: 490 495 500

cag: gag aac tac ggc tgg tac tgg ctc tac atg gcc agg aag gcc ctt

Gln: Glu Asn Tyr Gly Trp Tyr Trp Leu Tyr Met Ala Arg Lys Ala Leu



: 505 510 515

atg: gag aac aag gat aaa atg agc cag gcg gac tgg gag aag gcc tac

Met: Glu Asn Lys Asp Lys Met Ser Gln Ala Asp Trp Glu Lys Ala Tyr


: 520 525 530

gag: tac ctg ctc cgc gcc gag gca agc gac tgg ttc tgg tgg tac gga

Glu: Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ser Asp Trp Phe Trp Trp Tyr Gly

: 535 540 545

agc: gac cag gac agc ggc cag gac tac acc ttc gac cgc tac ctg aag

Ser: Asp Gln Asp Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Lys

550: 555 560 565

acc: tac ctc tac gag atg tac aag ctg gca gga gtc gag ccg ccg agc

Thr: Tyr Leu Tyr Glu Met Tyr Lys Leu Ala Gly Val Glu Pro Pro Ser




: 570 575 580

tac: ctc ttc ggc aac tac ttc ccg gac gga gag ccc tac acc acg agg

Tyr: Leu Phe Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Arg



: 585 590 595

ggc: ctg gtc gga ctc aag gac ggc gag atg aag aac ttc tcc agc atg

Gly: Leu Val Gly Leu Lys Asp Gly Glu Met Lys Asn Phe Ser Ser Met


: 600 605 610

tcc: ccg ctg gca aag ggc gtg agc gtc tat ttc gac ggc gag ggg ata

Ser: Pro Leu Ala Lys Gly Val Ser Val Tyr Phe Asp Gly Glu Gly Ile

: 615 620 625

cac: ttc ata gtg aaa ggg aac ctg gac agg ttc gag gtg agc atc tgg

His: Phe Ile Val Lys Gly Asn Leu Asp Arg Phe Glu Val Ser Ile Trp

630: 635 640 645

gag: aag gat gag cgc gtt ggc aac acg ttc acc cgc ctc caa gag aag

Glu: Lys Asp Glu Arg Val Gly Asn Thr Phe Thr Arg Leu Gln Glu Lys




: 650 655 660

ccg: gac gag ttg agc tat ttc atg ttc cca ttc tca agg gac agc gtt

Pro: Asp Glu Leu Ser Tyr Phe Met Phe Pro Phe Ser Arg Asp Ser Val



: 665 670 675

ggt: ctc ctc ata acc aag cac gtc gtg tac gag aac gga aag gcc gag

Gly: Leu Leu Ile Thr Lys His Val Val Tyr Glu Asn Gly Lys Ala Glu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2208

2256

2304

2352

2400

2448

2496

2544

2592

2640

2688

2736

2784

ata: tac ggc gcc acc gac tac gag aag agc gag aag ctt ggg gaa gcc

Ile: Tyr Gly Ala Thr Asp Tyr Glu Lys Ser Glu Lys Leu Gly Glu Ala

: 695 700 705

acc: gtc aag aac acg agc gaa gga atc gaa gtc gtc ctt ccc ttt gac

Thr: Val Lys Asn Thr Ser Glu Gly Ile Glu Val Val Leu Pro Phe Asp

710: 715 720 725

tac: ata gaa aac ccc tcc gac ttc tac ttc gct gtc tcg acg gtc aaa

Tyr: Ile Glu Asn Pro Ser Asp Phe Tyr Phe Ala Val Ser Thr Val Lys




: 730 735 740

gat: gga gac ctt gag gtg ata agc act cct gtg gag ctc aag ctc ccg

Asp: Gly Asp Leu Glu Val Ile Ser Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Pro



: 745 750 755

acc: gag gtc aag gga gtc gtc ata gcc gat ata acc gac cca gaa ggc

Thr: Glu Val Lys Gly Val Val Ile Ala Asp Ile Thr Asp Pro Glu Gly


: 760 765 770

gac
gac: cat ggg ccc gga aac tac act tat ccc acg gac aag gtc ttc

Asp
Asp: His Gly Pro Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Thr Asp Lys Val Phe

: 775 780 785

aag: cca ggt gtt ttc gac ctc ctc cgc ttc agg atg ctc gaa cag acg

Lys: Pro Gly Val Phe Asp Leu Leu Arg Phe Arg Met Leu Glu Gln Thr

790: 795 800 805

gag: agc tac gtc atg gag ttc tac ttc aag gac cta ggt ggt aac ccg

Glu: Ser Tyr Val Met Glu Phe Tyr Phe Lys Asp Leu Gly Gly Asn Pro




: 810 815 820

tgg: aac gga ccc aac ggc ttc agc ctc cag ata atc gag gtc tac ctc

Trp: Asn Gly Pro Asn Gly Phe Ser Leu Gln Ile Ile Glu Val Tyr Leu



: 825 830 835

gac: ttc aag gac ggt gga aac agt tcg gcc att aag atg ttc ccc
gac

Asp: Phe Lys Asp Gly Gly Asn Ser Ser Ala Ile Lys Met Phe Pro
Asp


: 840 845 850

gga: ccg gga gcc aac gtc aac ctc gac ccc gag cat cca tgg gac gtt

Gly: Pro Gly Ala Asn Val Asn Leu Asp Pro Glu His Pro Trp Asp Val

: 855 860 865

gcc: ttc agg ata gcg ggc tgg gac tac gga aac ctc atc atc ctg ccg

Ala: Phe Arg Ile Ala Gly Trp Asp Tyr Gly Asn Leu Ile Ile Leu Pro

870: 875 880 885

aac: gga acg gcc atc cag ggc gag atg cag att tcc gca gat ccg gtt

Asn: Gly Thr Ala Ile Gln Gly Glu Met Gln Ile Ser Ala Asp Pro Val




: 890 895 900

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2832

2880

2928

2976

3024

3072

3117

3162

3207

3252

3297

3342

3387

aag

Lys

gag

Glu

tac

Tyr

aag

Lys

950

cgc

Arg

gag

Glu

aag

Lys

gag

Glu

aaa

Lys

acc

Thr

ctc

Leu

ata

Ile

gcc

Ala

aac: gcc ata ata gtc aag gtt cca aag aag tac atc gcc ata
aac

Asn: Ala Ile Ile Val Lys Val Pro Lys Lys Tyr Ile Ala Ile
Asn


: 905 910 915

gac: tac ggc ctc tgg gga gac gtc ctc gtc ggc tcg cag gac ggc

Asp: Tyr Gly Leu Trp Gly Asp Val Leu Val Gly Ser Gln Asp Gly

: 920 925 930

ggc: ccg gac aag tgg aga acg gcg gca gtg gat gcg gag cag tgg

Gly: Pro Asp Lys Trp Arg Thr Ala Ala Val Asp Ala Glu Gln Trp

935: 940 945

ctt: gga ggt gcg gac ccg cag gca gtc ata aac ggc gtg gcc ccg

Leu: Gly Gly Ala Asp Pro Gln Ala Val Ile Asn Gly Val Ala Pro




: 955 960 965

gtc: att gat gag ctg gtt ccg cag ggc ttt gaa ccg acc cag gag

Val: Ile Asp Glu Leu Val Pro Gln Gly Phe Glu Pro Thr Gln Glu



: 970 975 980

cag: ctg agc agc tac gat gca aac gac atg aag ctc gcc act gtc

Gln: Leu Ser Ser Tyr Asp Ala Asn Asp Met Lys Leu Ala Thr Val


: 985 990 995

gcg ctg cta ctc ctc aag cag ggc atc gtt gtg acc gac ccg

Ala Leu Leu Leu Leu Lys Gln Gly Ile Val Val Thr Asp Pro

1000 1005 1010

gga gac gac cac ggg ccg gga acg tac acc tat ccg acg gac

Gly Asp Asp His Gly Pro Gly Thr Tyr Thr Tyr Pro Thr Asp

1015 1020 1025

gtt ttc aag ccc ggt gtt ttc gac ctc ctc aag ttc aag gtg

Val Phe Lys Pro Gly Val Phe Asp Leu Leu Lys Phe Lys Val

1030 1035 1040

gag gga agc gac gac tgg acg ctg gag ttc cac ttc aaa gac Glu Gly Ser Asp Asp Trp Thr Leu Glu Phe His Phe Lys Asp 1045 1050 1055

ggt gga aac ccg tgg aac ggg ccg aac ggc ttc agc ctg cag Gly Gly Asn Pro Trp Asn Gly Pro Asn Gly Phe Ser Leu Gln 1060 1065 1070

atc gag gta tac ttc gac ttc aag gag ggc ggg aac gtc tcg Ile Glu Val Tyr Phe Asp Phe Lys Glu Gly Gly Asn Val Ser 1075 1080 1085

att aag atg ttc ccg gat ggg ccc gga agc aac gtc cgt ctt Ile Lys Met Phe Pro Asp Gly Pro Gly Ser Asn Val Arg Leu 1090 1095 1100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

3432

3477

3522

3567

3612

3657

3702

3747

3792

3837

3882

3927

3972

4014

gat: cca aat cac cca tgg gac ctg gcg ctt agg ata gcc ggc tgg

Asp: Pro Asn 1105 His Pro Trp Asp Leu 1110 Ala Leu Arg Ile Ala 1115 Gly Trp

gac: tac gga aac ctg ata att ctg ccc gac gga acc gcc tac caa

Asp: Tyr Gly 1120 Asn Leu Ile Ile Leu 1125 Pro Asp Gly Thr Ala 1130 Tyr Gln

ggc: gag atg cag att tcc gca gat ccg gtt aag aac gcc ata ata

Gly: Glu Met 1135 Gln Ile Ser Ala Asp 1140 Pro Val Lys Asn Ala 1145 Ile Ile

gtc: aag gtt cca aag aag tac ctg aac ata tcc gac tac gga ctc

Val: Lys Val 1150 Pro Lys Lys Tyr Leu 1155 Asn Ile Ser Asp Tyr 1160 Gly Leu

tac: acc gcc gtc atc gtg ggt tcc caa gac ggg tac ggc ccg gac

Tyr: Thr Ala 1165 Val Ile Val Gly Ser 1170 Gln Asp Gly Tyr Gly 1175 Pro Asp

aag: tgg agg ccc gtg gcc gct gag gcc gag cag tgg aag ctc gga

Lys: Trp Arg 1180 Pro Val Ala Ala Glu 1185 Ala Glu Gln Trp Lys 1190 Leu Gly

ggc: gca gac ccc cag gcg gtc ata gac aac ctc gta cca agg gtc

Gly: Ala Asp 1195 Pro Gln Ala Val Ile 1200 Asp Asn Leu Val Pro 1205 Arg Val

gtt: gat gaa ctc gtg ccg gag ggc ttc aag cca acg cag gag gag

Val: Asp Glu 1210 Leu Val Pro Glu Gly 1215 Phe Lys Pro Thr Gln 1220 Glu Glu

cag: ctg agc agc tac gac ctt gag aag aag acc ctg gcg acg gtg

Gln: Leu Ser 1225 Ser Tyr Asp Leu Glu 1230 Lys Lys Thr Leu Ala 1235 Thr Val

ctc: atg gta ccg ctc gtc aat ggg act ggc ggc gag gaa cca acg

Leu: Met Val 1240 Pro Leu Val Asn Gly 1245 Thr Gly Gly Glu Glu 1250 Pro Thr

ccg: acg gag agc cca acg gaa acg acg aca acc aca ccc agc gaa

Pro: Thr Glu 1255 Ser Pro Thr Glu Thr 1260 Thr Thr Thr Thr Pro 1265 Ser Glu

aca: acc acc aca act tca acg acc acc ggc cca agc tca acg acc

Thr
Thr: Thr 1270 Thr Thr Ser Thr Thr 1275 Thr Gly Pro Ser Ser 1280
Thr
Thr

acc: agc aca ccc ggc gga gga atc tgc ggc cca ggc att ata gcg

Thr: Ser Thr 1285 Pro Gly Gly Gly Ile 1290 Cys Gly Pro Gly Ile 1295 Ile Ala

ggc: ctg gcc ctg ata ccg ctc ctc ctc aag agg agg aac tga

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Gly Leu Ala Leu Ile Pro Leu Leu Leu Lys Arg Arg Asn 1300 1305 1310

<210> 11 <211> 1337

<212> PRT

<213> Thermococcus hydrothermalis <400> 11

Met Arg Arg Val Val Ala Leu Phe Ile Ala Ile Leu Met Leu Gly Ser -25 -20 -15

Ile Val Gly Ala Asn Val Lys Ser Val Gly Ala Ala Glu Pro Lys Pro -10 -5 -1 1 5

Leu Asn Val Ile Ile Val Trp His Gln His Gln Pro Tyr Tyr Tyr Asp 10 15 20

Pro Val Gln Asp Val Tyr Thr Arg Pro Trp Val Arg Leu His Ala Ala 25 30 35

Asn Asn Tyr Trp Lys Met Ala His Tyr Leu Ser Gln Tyr Pro Glu Val 40 45 50

His Ala Thr Ile Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ile Ala Gln Leu Ala Asp 55 60 65

Tyr Met Asn Gly Lys Lys Asp Thr Tyr Gln Ile Ile Thr Glu Lys Ile 70 75 80 85

Ala Asn Gly Glu Pro Leu Thr Val Asp Glu Lys Trp Phe Met Leu Gln 90 95 100

Ala Pro Gly Gly Phe Phe Asp Asn Thr Ile Pro Trp Asn Gly Glu Pro 105 110 115

Ile Thr Asp Pro Asn Gly Asn Pro Ile Arg Asp Phe Trp Asp Arg Tyr 120 125 130

Thr Glu Leu Lys Asn Lys Met Leu Ser Ala Lys Ala Lys Tyr Ala Asn 135 140 145

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Phe Val Thr Glu Ser Gln Lys Val Ala Val Thr Asn Glu Phe Thr Glu 150 155 160 165

Gln Asp Tyr Ile Asp Leu Ala Val Leu Phe Asn Leu Ala Trp Ile Asp 170 175 180

Tyr Asn Tyr Ile Thr Ser Thr Pro Glu Phe Lys Ala Leu Tyr Asp Lys 185 190 195

Val Asp Glu Gly Gly Tyr Thr Arg Ala Asp Val Lys Thr Val Leu Asp 200 205 210

Ala Gln Ile Trp Leu Leu Asn His Thr Phe Glu Glu His Glu Lys Ile 215 220 225

Asn Leu Leu Leu Gly Asn Gly Asn Val Glu Val Thr Val Val Pro Tyr 230 235 240 245

Ala His Pro Ile Gly Pro Ile Leu Asn Asp Phe Gly Trp Asp Ser Asp 250 255 260

Phe Asn Asp Gln Val Lys Lys Ala Asp Glu Leu Tyr Lys Pro Tyr Leu 265 270 275

Gly Gly Gly Thr Ala Val Pro Lys Gly Gly Trp Ala Ala Glu Ser Ala 280 285 290

Leu Asn Asp Lys Thr Leu Glu Ile Leu Ala Glu Asn Gly Trp Glu Trp 295 300 305

Val Met Thr Asp Gln Met Val Leu Gly Lys Leu Gly Ile Glu Gly Thr 310 315 320 325

Val Glu Asn Tyr His Lys Pro Trp Val Ala Glu Phe Asn Gly Lys Lys 330 335 340

Ile Tyr Leu Phe Pro Arg Asn His Asp Leu Ser Asp Arg Val Gly Phe 345 350 355

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Thr: Tyr Ser Gly Met Asn Gln Gln Gln Ala Val Glu Asp Phe Val Asn


: 360 365 370

Glu: Leu Leu Lys Leu Gln Lys Gln Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Val Tyr

: 375 380 385

Val
Val: Thr Leu Asp Gly Glu Asn Pro Val Glu Asn Tyr Pro Tyr Asp

390: 395 400 405

Gly: Glu Leu Phe Leu Thr Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Thr Glu Leu Gln




: 410 415 420

Glu: Gln Gly Leu Ile Arg Thr Leu Thr Pro Ser Glu Tyr Ile Gln Leu



: 425 430 435

Tyr: Gly Asp Lys Ala Asn Lys Leu Thr Pro Arg Met Met Glu Arg Leu


: 440 445 450

Asp: Leu Thr Gly Asp Asn Val Asn Ala Leu Leu Lys Ala Gln Ser Leu

: 455 460 465

Gly: Glu Leu Tyr Asp Met Thr Gly Val Lys Glu Glu Met Gln Trp Pro

470: 475 480 485

Glu: Ser Ser Trp Ile Asp Gly Thr Leu Ser Thr Trp Ile Gly Glu Pro




: 490 495 500

Gln: Glu Asn Tyr Gly Trp Tyr Trp Leu Tyr Met Ala Arg Lys Ala Leu



: 505 510 515

Met: Glu Asn Lys Asp Lys Met Ser Gln Ala Asp Trp Glu Lys Ala Tyr


: 520 525 530

Glu: Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ser Asp Trp Phe Trp Trp Tyr Gly

: 535 540 545

Ser: Asp Gln Asp Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Lys

550: 555 560 565

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Thr Tyr Leu Tyr Glu Met Tyr Lys Leu Ala Gly Val Glu Pro Pro Ser 570 575 580

Tyr Leu Phe Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Arg 585 590 595

Gly Leu Val Gly Leu Lys Asp Gly Glu Met Lys Asn Phe Ser Ser Met 600 605 610

Ser Pro Leu Ala Lys Gly Val Ser Val Tyr Phe Asp Gly Glu Gly Ile 615 620 625

His Phe Ile Val Lys Gly Asn Leu Asp Arg Phe Glu Val Ser Ile Trp 630 635 640 645

Glu Lys Asp Glu Arg Val Gly Asn Thr Phe Thr Arg Leu Gln Glu Lys

650 655 660

Pro Asp Glu Leu Ser Tyr Phe Met Phe Pro Phe Ser Arg Asp Ser Val 665 670 675

Gly Leu Leu Ile Thr Lys His Val Val Tyr Glu Asn Gly Lys Ala Glu

680 685 690

Ile Tyr Gly Ala Thr Asp Tyr Glu Lys Ser Glu Lys Leu Gly Glu Ala 695 700 705

Thr Val Lys Asn Thr Ser Glu Gly Ile Glu Val Val Leu Pro Phe Asp 710 715 720 725

Tyr Ile Glu Asn Pro Ser Asp Phe Tyr Phe Ala Val Ser Thr Val Lys 730 735 740

Asp Gly Asp Leu Glu Val Ile Ser Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Pro 745 750 755

Thr Glu Val Lys Gly Val Val Ile Ala Asp Ile Thr Asp Pro Glu Gly 760 765 770

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Asp Asp His Gly Pro Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Thr Asp Lys Val Phe 775 780 785

Lys Pro Gly Val Phe Asp Leu Leu Arg Phe Arg Met Leu Glu Gln Thr 790 795 800 805

Glu Ser Tyr Val Met Glu Phe Tyr Phe Lys Asp Leu Gly Gly Asn Pro 810 815 820

Trp Asn Gly Pro Asn Gly Phe Ser Leu Gln Ile Ile Glu Val Tyr Leu 825 830 835

Asp Phe Lys Asp Gly Gly Asn Ser Ser Ala Ile Lys Met Phe Pro Asp 840 845 850

Gly Pro Gly Ala Asn Val Asn Leu Asp Pro Glu His Pro Trp Asp Val 855 860 865

Ala Phe Arg Ile Ala Gly Trp Asp Tyr Gly Asn Leu Ile Ile Leu Pro 870 875 880 885

Asn Gly Thr Ala Ile Gln Gly Glu Met Gln Ile Ser Ala Asp Pro Val 890 895 900

Lys Asn Ala Ile Ile Val Lys Val Pro Lys Lys Tyr Ile Ala Ile Asn 905 910 915

Glu Asp Tyr Gly Leu Trp Gly Asp Val Leu Val Gly Ser Gln Asp Gly 920 925 930

Tyr Gly Pro Asp Lys Trp Arg Thr Ala Ala Val Asp Ala Glu Gln Trp 935 940 945

Lys Leu Gly Gly Ala Asp Pro Gln Ala Val Ile Asn Gly Val Ala Pro 950 955 960 965

Arg Val Ile Asp Glu Leu Val Pro Gln Gly Phe Glu Pro Thr Gln Glu 970 975 980

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Glu Gln Leu Ser Ser Tyr Asp Ala Asn Asp Met Lys Leu Ala Thr Val 985 990 995

Lys Ala Leu Leu Leu Leu Lys Gln Gly Ile Val Val Thr Asp Pro 1000 1005 1010

Glu Gly Asp Asp His Gly Pro Gly Thr Tyr Thr Tyr Pro Thr Asp 1015 1020 1025

Lys Val Phe Lys Pro Gly Val Phe Asp Leu Leu Lys Phe Lys Val 1030 1035 1040

Thr Glu Gly Ser Asp Asp Trp Thr Leu Glu Phe His Phe Lys Asp 1045 1050 1055

Leu Gly Gly Asn Pro Trp Asn Gly Pro Asn Gly Phe Ser Leu Gln 1060 1065 1070

Ile Ile Glu Val Tyr Phe Asp Phe Lys Glu Gly Gly Asn Val Ser 1075 1080 1085

Ala Ile Lys Met Phe Pro Asp Gly Pro Gly Ser Asn Val Arg Leu 1090 1095 1100

Asp Pro Asn His Pro Trp Asp Leu Ala Leu Arg Ile Ala Gly Trp 1105 1110 1115

Asp Tyr Gly Asn Leu Ile Ile Leu Pro Asp Gly Thr Ala Tyr Gln 1120 1125 1130

Gly Glu Met Gln Ile Ser Ala Asp Pro Val Lys Asn Ala Ile Ile 1135 1140 1145

Val Lys Val Pro Lys Lys Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Tyr Gly Leu 1150 1155 1160

Tyr Thr Ala Val Ile Val Gly Ser Gln Asp Gly Tyr Gly Pro Asp 1165 1170 1175

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Lys Trp Arg Pro Val Ala Ala Glu Ala Glu Gln Trp Lys 1180 1185 1190

Gly Ala Asp Pro Gln Ala Val Ile Asp Asn Leu Val Pro 1195 1200 1205

Val Asp Glu Leu Val Pro Glu Gly Phe Lys Pro Thr Gln 1210 1215 1220

Gln Leu Ser Ser Tyr Asp Leu Glu Lys Lys Thr Leu Ala 1225 1230 1235

Leu Met Val Pro Leu Val Asn Gly Thr Gly Gly Glu Glu 1240 1245 1250

Pro Thr Glu Ser Pro Thr Glu Thr Thr Thr Thr Thr Pro 1255 1260 1265

Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Gly Pro Ser Ser 1270 1275 1280

Thr Ser Thr Pro Gly Gly Gly Ile Cys Gly Pro Gly Ile 1285 1290 1295

Gly Leu Ala Leu Ile Pro Leu Leu Leu Lys Arg Arg Asn 1300 1305 1310

<210> 12 <211> 809

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Pululanasa híbrida de Thermoccus hydrothermalis litoralis

<220>

<221> SEÑAL <222> (1)..(27)

<220>

<221> mat_peptide <222> (28)..(809)

Leu Gly

Arg Val

Glu Glu

Thr Val

Pro Thr

Ser Glu

Thr Thr

Ile Ala

y Thermococcus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<400> 12

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile -25 -20 -15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Glu Glu Pro Lys Pro -10 -5 -1 1 5

Leu Asn Val Ile Ile Val Trp His Gln His Gln Pro Tyr Tyr Tyr Asp 10 15 20

Pro Ile Gln Asp Ile Tyr Thr Arg Pro Trp Val Arg Leu His Ala Ala 25 30 35

Asn Asn Tyr Trp Lys Met Ala Asn Tyr Leu Ser Lys Tyr Pro Asp Val 40 45 50

His Val Ala Ile Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ile Ala Gln Leu Ala Asp 55 60 65

Tyr Met Asn Gly Lys Lys Asp Thr Tyr Gln Ile Val Thr Glu Lys Ile 70 75 80 85

Ala Asn Gly Glu Pro Leu Thr Leu Glu Asp Lys Trp Phe Met Leu Gln 90 95 100

Ala Pro Gly Gly Phe Phe Asp His Thr Ile Pro Trp Asn Gly Glu Pro 105 110 115

Val Ala Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Arg Glu Gln Trp Asp Arg Tyr 120 125 130

Ala Glu Leu Lys Asp Lys Arg Asn Asn Ala Phe Lys Lys Tyr Ala Asn 135 140 145

Leu Pro Leu Asn Glu Gln Lys Val Lys Ile Thr Ala Glu Phe Thr Glu 150 155 160 165

Gln Asp Tyr Ile Asp Leu Ala Val Leu Phe Asn Leu Ala Trp Ile Asp 170 175 180

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Val Asp Val Gly Gly Tyr Thr Lys Glu Asp Val Ala Thr Val Leu Lys 200 205 210

His Gln Met Trp Leu Leu Asn His Thr Phe Glu Glu His Glu Lys Ile 215 220 225

Asn Tyr Leu Leu Gly Asn Gly Asn Val Glu Val Thr Val Val Pro Tyr 230 235 240 245

Ala His Pro Ile Gly Pro Leu Leu Asn Asp Phe Gly Trp Tyr Glu Asp 250 255 260

Phe Asp Ala His Val Lys Lys Ala His Glu Leu Tyr Lys Lys Tyr Leu 265 270 275

Gly Asp Asn Arg Val Glu Pro Gln Gly Gly Trp Ala Ala Glu Ser Ala 280 285 290

Leu Asn Asp Lys Thr Leu Glu Ile Leu Thr Asn Asn Gly Trp Lys Trp 295 300 305

Val Met Thr Asp Gln Met Val Leu Asp Ile Leu Gly Ile Pro Asn Thr 310 315 320 325

Val Glu Asn Tyr Tyr Lys Pro Trp Val Ala Glu Phe Asn Gly Lys Lys 330 335 340

Ile Tyr Leu Phe Pro Arg Asn His Asp Leu Ser Asp Arg Val Gly Phe 345 350 355

Arg Tyr Ser Gly Met Asn Gln Tyr Gln Ala Val Glu Asp Phe Val Asn 360 365 370

Glu Leu Leu Lys Val Gln Lys Glu Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Val Tyr 375 380 385

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Val Val Thr Leu Asp Gly Glu Asn Pro Trp Glu His Tyr Pro Phe Asp 390 395 400 405

Gly Lys Ile Phe Leu Glu Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Thr Glu Leu Gln 410 415 420

Lys Gln Gly Leu Ile Arg Thr Val Thr Pro Ser Glu Tyr Ile Gln Met 425 430 435

Tyr Gly Asp Lys Ala Asn Lys Leu Thr Pro Arg Met Met Glu Arg Leu 440 445 450

Asp Leu Thr Gly Asp Asn Val Asn Ala Leu Leu Lys Ala Gln Ser Leu 455 460 465

Gly Glu Leu Tyr Asp Met Thr Gly Val Lys Glu Glu Met Gln Trp Pro 470 475 480 485

Glu Ser Ser Trp Ile Asp Gly Thr Leu Ser Thr Trp Ile Gly Glu Pro 490 495 500

Gln Glu Asn Tyr Gly Trp Tyr Trp Leu Tyr Met Ala Arg Lys Ala Leu 505 510 515

Met Glu Asn Lys Asp Lys Met Ser Gln Ala Asp Trp Glu Lys Ala Tyr 520 525 530

Glu Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ser Asp Trp Phe Trp Trp Tyr Gly 535 540 545

Ser Asp Gln Asp Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Lys 550 555 560 565

Thr Tyr Leu Tyr Glu Met Tyr Lys Leu Ala Gly Val Glu Pro Pro Ser 570 575 580

Tyr Leu Phe Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Arg 585 590 595

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Gly Leu Val Gly Leu Lys Asp Gly Glu Met Lys Asn Phe Ser Ser Met 600 605 610

Ser Pro Leu Ala Lys Gly Val Ser Val Tyr Phe Asp Gly Glu Gly Ile 615 620 625

His Phe Ile Val Lys Gly Asn Leu Asp Arg Phe Glu Val Ser Ile Trp 630 635 640 645

Glu Lys Asp Glu Arg Val Gly Asn Thr Phe Thr Arg Leu Gln Glu Lys

650 655 660

Pro Asp Glu Leu Ser Tyr Phe Met Phe Pro Phe Ser Arg Asp Ser Val 665 670 675

Gly Leu Leu Ile Thr Lys His Val Val Tyr Glu Asn Gly Lys Ala Glu 680 685 690

Ile Tyr Gly Ala Thr Asp Tyr Glu Lys Ser Glu Lys Leu Gly Glu Ala 695 700 705

Thr Val Lys Asn Thr Ser Glu Gly Ile Glu Val Val Leu Pro Phe Asp 710 715 720 725

Tyr Ile Glu Asn Pro Ser Asp Phe Tyr Phe Ala Val Ser Thr Val Lys 730 735 740

Asp Gly Asp Leu Glu Val Ile Ser Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Pro 745 750 755

Thr Glu Val Lys Gly Val Val Ile Ala Asp Ile Thr Asp Pro Glu Gly 760 765 770

Asp Asp His Gly Pro Gly Asn Tyr Thr 775 780

<210> 13

<211> 412

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<22 0>

<221> mat_peptide <222> (1)7.(412)

<223> Proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu)

<400> 13

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr 1 5 10 15

Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile 20 25 30

Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val 35 40 45

Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp 50 55 60

His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala 85 90 95

Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile 100 105 110

Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile 115 120 125

Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr 130 135 140

Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val 145 150 155 160

Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly 165 170 175

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly 195 200 205

Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala 210 215 220

Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr 225 230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala 245 250 255

Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys 260 265 270

Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala 275 280 285

Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn 290 295 300

Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys 305 310 315 320

Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr 325 330 335

Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu 340 345 350

Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr 355 360 365

Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr 370 375 380

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ile: Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val

385: 390 395 400

Val: Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser




: 405 410

<210> 14

<211> 595

<212> PRT

<213> Penicillium oxalicum

<220>

<221> mat_peptide

<222> (1)7.(595)

<223> Secuencia de glucoamilasa de Penicillium oxalicum madura <400> 14

Arg: Pro Asp Pro Lys Gly Gly Asn Leu Thr Pro Phe Ile His Lys Glu

1: 5 10 15

Gly: Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn Leu Gly Gly Arg
Gly



: 20 25 30

Lys
Lys: Thr Pro Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe Ile Ala Ser Pro Asn


: 35 40 45

Thr: Glu Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu

: 50 55 60

Thr: Ala Lys Cys Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp Ser Arg Ala Lys Phe

65: 70 75 80

Pro: Ile Asp Arg Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile Arg Asp Tyr Lys Ser




: 85 90 95

Ser: Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Lys



: 100 105 110

Asp: Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Ile Asp Leu Asn Pro


: 115 120 125

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg 130 135 140

Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Ser His Gly Gln 145 150 155 160

Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro Ile Ile Ala Asn Asp Leu 165 170 175

Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu 180 185 190

Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala 195 200 205

Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu Gln Ser Phe 225 230 235 240

Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn Thr Gln Ala Ser Arg 245 250 255

Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp 260 265 270

Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg 275 280 285

Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr 290 295 300

Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala Ala Asn Val Gly Arg 305 310 315 320

Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr 325 330 335

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Arg 340 345 350

Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu Ser Phe Phe Lys Asp 355 360 365

Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr Ser Arg Asn Ser Lys Thr 370 375 380

Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr Ala Asp Gly Phe Ile 385 390 395 400

Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ser Leu Ala Glu Gln 405 410 415

Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala Asn Asp Leu Thr Trp 420 425 430

Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg Arg Asp Ala Val Val 435 440 445

Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys Val Pro Thr Thr Cys 450 455 460

Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala Pro Thr Ala Thr Phe 465 470 475 480

Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp Ile Val Pro Ile Thr 485 490 495

Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Val Phe Met Ser 500 505 510

Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala Lys Lys Gly Phe Pro 515 520 525

Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn Leu Trp Phe Ala Ser 530 535 540

: Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu Tyr Lys Tyr Tyr Lys

: 545 550 555 560

5: Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Gly Pro Asn Arg Val





: 565 570 575

: Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro His Ser Asn Asp Val

10: 580 585 590

15

Trp Gln Phe 595

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

1. Proceso para producir productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que incluye las etapas de:

i) licuefacción del material que contiene almidón a un pH en el rango de 4,5-5,0 a una temperatura en el rango de 80-90 °C usando:

- una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en I181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 y tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCl2) de al menos 10; y

- una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o

- una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y que tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C;

ii) sacarificación utilizando una enzima generadora de fuente de carbohidratos;

iii) fermentación utilizando un organismo fermentador.
2. Proceso según la reivindicación 1, donde la variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 de este documento está truncada, preferiblemente para tener alrededor de 491 aminoácidos.
3. Proceso según la reivindicación 2, donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 de este documento.
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la alfa-amilasa se deriva de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada para tener alrededor de 491 aminoácidos con las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

- I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S;

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde una segunda alfa-amilasa se adiciona durante la etapa de licuefacción i).
6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la proteasa es una variante de la metaloproteasa descrita como la parte madura de la SEQ ID N.°: 3 de este documento, donde la variante de proteasa tiene al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la proteasa es una variante de la proteasa de Thermoascus aurantiacus mostrada en la SEQ ID N.°: 3 con las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; y

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la proteasa se deriva de una cepa de Pyrococcus furiosus que tiene al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 % de identidad con SEQ ID N.°: 13 de este documento.
9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde además una enzima generadora de fuente de carbohidratos está presente y/o se adiciona durante la etapa de licuefacción i), preferiblemente una glucoamilasa, en particular donde la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa con una estabilidad térmica a 85 °C, pH 5,3, de al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 35 %.
10. Proceso según la reivindicación 9, donde la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa, preferiblemente derivada a partir de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita como las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento, en particular donde la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una variante de la glucoamilasa derivada a partir de una cepa de Penicillium oxalicum con una sustitución K79V en las SEQ ID N.°: 9 o 14 (utilizando la secuencia madura mostrada en la SEQ ID N.°: 14 para la numeración), tal como donde la glucoamilasa tiene al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con el polipéptido maduro mostrado en las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento.
11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde además una glucoamilasa está presente y/o se adiciona durante la sacarificación y/o la fermentación, preferiblemente donde la glucoamilasa es de origen fúngico, preferiblemente derivada a partir de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. niger, A. awamori, o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente T. emersonii, o una cepa de Pycnoporus, o una cepa de Gloephyllum.
12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde además una pululanasa está presente durante la licuefacción y/o la sacarificación.

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13. Composición que incluye una alfa-amilasa y una proteasa, donde la

i) alfa-amilasa es una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en 1181 + G182 y sustitución N193F, y que además comprende mutaciones seleccionadas del grupo de:

- V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;

- V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

- E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;

- E129V+K177L+R179E+S242Q;

- E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;

- K220P+N224L+S242Q+Q254S; y

- M284V;

variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 y tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de al menos 10; y

ii) una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o

- una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.
14. Composición según la reivindicación 13, donde la variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 de este documento está truncada, preferiblemente para tener alrededor de 491 aminoácidos, en particular donde la variante de alfa-amilasa tiene al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 de este documento.
15. Composición según la reivindicación 13 o 14, donde la alfa-amilasa se deriva de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus truncada para tener alrededor de 491 aminoácidos con las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

- I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+ Q254S;

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; y

- I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S.

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16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, donde además la composición comprende una segunda alfa-amilasa derivada de Bacillus stearothermophilus.
17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, donde la proteasa tiene una termoestabilidad de más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % más del 100 %, tal como más del 105 %, tal como más del 110 %, tal como más del 115 %, tal como más del 120 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.
18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, donde la proteasa es una variante de la proteasa de Thermoascus aurantiacus mostrada en la SEQ ID N.°: 3 de este documento con las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

- A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

- D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L;

- Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-18, donde la proteasa de Pyrococcus furiosus es una que tiene al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento.
20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-19, que además comprende una enzima generadora de fuente de carbohidratos, en particular donde la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una glucoamilasa, preferiblemente con una estabilidad térmica de actividad relativa a 85 °C, pH 5,3, de al menos el 20 %, al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 35 %, en particular donde la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita como las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento, en particular donde la enzima generadora de fuente de carbohidratos es una variante de la glucoamilasa derivada a partir de una cepa de Penicillium oxalicum con una sustitución K79V en las SEQ ID N.°: 9 o 14 (utilizando la secuencia madura mostrada en la SEQ ID N.°: 14 para la numeración), en particular donde la glucoamilasa tiene al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, aún más preferiblemente al menos el 93 %, de la forma más preferible al menos el 94 %, e incluso de la forma más preferible al menos el 95 %, tal como incluso al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad con el polipéptido maduro mostrado en las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento.
21. Composición según las reivindicaciones 13-20, que comprende además una pululanasa.
22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-21 que comprende:

i) una variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEQ ID N.°: 1 con una deleción doble en I181 + G182 y sustitución N193F, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 1 y tiene un T A (min) a pH 4,5, 85 °C, 0,12 mM de CaCh) de al menos 10;

ii) una variante de una metaloproteasa, variante que tiene al menos el 80 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEQ ID N.°: 3 de este documento y que tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; o

- una Pyrococcus furiosus, proteasa que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID N.°: 13 de este documento y tiene un valor de termoestabilidad superior al 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C; y

iii) una glucoamilasa derivada de Penicillium oxalicum mostrada en las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento o una glucoamilasa con al menos el 80 % de identidad con el polipéptido maduro mostrado en las SEQ ID N.°: 9 o 14 de este documento.