CN101432433A - 生产发酵产品的方法 - Google Patents

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CN101432433A CNA2005800237849A CN200580023784A CN101432433A CN 101432433 A CN101432433 A CN 101432433A CN A2005800237849 A CNA2005800237849 A CN A2005800237849A CN 200580023784 A CN200580023784 A CN 200580023784A CN 101432433 A CN101432433 A CN 101432433A
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Abstract

本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法，包括i)使含淀粉的材料接受α－淀粉酶作用，ii)使步骤i)中获得的材料接受α－葡糖苷酶和/或麦芽糖生成酶作用，和iii)在发酵生物，如酵母存在时发酵所述材料。或者本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，优选粒状淀粉，所述方法包括：a)含淀粉的材料接受α葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶作用，和b)在发酵生物存在时发酵所述材料。

Description

生产发酵产品的方法
参考序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法。
发明背景
大量难以合成生产的商业产品可以通过发酵来生产。这些产品包括醇(例如，乙醇，甲醇，丁醇，1，3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐或酯、乳酸、琥珀酸，2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素，B12，β-胡萝卜素)；和激素。发酵也常用于食用酒精(consumablealcohol)(例如，啤酒和葡萄酒(wine))，乳制品(例如，在酸奶酪和干酪的生产中)，皮革，和烟草工业中。
乙醇作为工业化学制品，汽油添加剂或直接的液体燃料而具有广泛的应用。作为燃料或燃料添加剂，乙醇在很大程度上减少了气体排放同时提高了发动机性能。作为可再生的燃料，乙醇减少了对于有限的和在很大程度上外国化石燃料来源的国家依赖性，同时减少二氧化碳在大气中的净聚积。发酵方法被用于生产乙醇。关于通过发酵生产乙醇有大量的公开，其中它们为，例如，US 5,231,017，CA 1,143,677，和EP 138428。
需要发酵产品的进一步改进，如乙醇生产方法。
发明概述
本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法，优选基于整谷物或整谷粒(whole grain)，所述方法包括：
i)使含淀粉的材料接受α-淀粉酶的作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶作用，和
iii)在发酵生物存在下发酵所述材料。
在优选的实施方案中所述α-葡糖苷酶来自植物，优选稻，特别是稻(Oryzae sativa)。
本发明还涉及由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
i)使含淀粉的材料接受α淀粉酶的作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和麦芽糖生成酶的作用，和
iii)在发酵生物存在下发酵所述材料。
发酵产品，如特别是乙醇可以任选地在发酵后回收，优选通过蒸馏。任何具有上述酶活性的酶都可以根据本发明进行使用。适合的酶列于下面的“酶活性”一节中。不过，在优选的实施方案中步骤i)中所用的α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶，来自芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的菌株或其变体。在优选的实施方案中步骤ii)中所用的麦芽糖生成酶是产麦芽糖(maltogenic)淀粉酶，特别是来自芽孢杆菌属，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株或其变体。在优选的实施方案中步骤ii)所用的α-葡糖苷酶是植物，如特别是稻来源的，或微生物来源的。对于α-葡糖苷酶是细菌来源的情况来说，它可以优选来自芽孢杆菌属的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株或其变体。在优选的实施方案中在发酵步骤iii)中所用的发酵生物是酵母，优选酵母属(Saccharomyces)来源的，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。
本发明还涉及由含淀粉的材料生产发酵产品，如乙醇的方法，所述方法包括：
a)使含淀粉的材料接受α-葡糖苷酶和任选地葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶的作用，和
b)在发酵生物存在时发酵。
在优选的实施方案中发酵产品是乙醇。在优选的实施方案中所述α-葡糖苷酶来源于稻。在优选的实施方案中所述含淀粉的材料是粒状淀粉(granular starch)。
附图简述
图1显示了根据本发明的一个实施方案制备乙醇的流程图。
图2显示了参照运行(reference run)的SSF完整过程的糖、甘油和乙醇特征谱(profile)。
图3显示了试验运行(test run)的SSF完整过程的糖、甘油和乙醇特征谱。
图4显示了试验运行和参照运行的SSF完整过程的葡萄糖、DP2和乙醇特征谱，其绘于同一图中以更易于比较。
发明详述
本发明提供了由包含淀粉的材料生产发酵产品，特别是乙醇的方法，该方法包括液化步骤以及分别或同时进行的糖化和发酵步骤。
本发明人已发现在有效量的α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖和/或麦芽糖生成酶存在时进行糖化和发酵(特别是SSF)是有利的。不限于任何理论，据信本发明的方法更加有效，因为生成的麦芽糖在葡萄糖存在时并不为酵母所偏好，该麦芽糖被转化成葡萄糖，其随后被酵母所消耗并转化成乙醇。这可以带来更高的发酵速率和/或淀粉材料的更有效使用。另外，减少了发酵后残余糖量。另外据信本发明的方法可能给予这样的益处，即不产生或至少产生较少的甘油(其不能被酵母所利用)。
原材料
根据本发明包含淀粉的起始材料可以来自任何植物材料。优选的起始材料选自：块茎、根、整谷物或谷粒，和前述材料的任意组合。在一个实施方案中，所述包含淀粉的材料获自谷类(cereals)。包含淀粉的材料可以，例如，选自玉米、玉米芯(cob)、小麦、大麦、木薯(cassava)、高粱(sorghum)、黑麦、买罗高粱(milo)和马铃薯；或前述的任意组合。
在本发明的方法中，包含淀粉的材料优选为整谷物或谷粒或至少主要为整谷物或谷粒。可以将大量包含淀粉的整谷物或谷粒作物用作原材料，包括：玉米(corn)(玉蜀黍(maize))、买罗高粱、马铃薯、木薯、高粱、小麦，和大麦。
因而，在一个实施方案中，所述包含淀粉的材料是选自玉米(玉蜀黍)、买罗高粱、马铃薯、木薯、高粱、小麦，和大麦的整谷物或谷粒；或其任意组合。在优选的实施方案中，所述包含淀粉的材料是选自玉米、小麦和大麦或其任意组合的整谷物或谷粒。
在一个实施方案中所述包含淀粉的材料是粒状淀粉。术语“粒状淀粉”被理解为天然未烹煮过(uncooked)的淀粉，即，尚未进行糊化(gelatinization)的淀粉。淀粉在植物中形成为不溶于水的微小颗粒。在低于起始糊化温度的温度下这些颗粒保存在淀粉中。当放于冷水中时，谷粒可以吸收小量的液体。直到50℃到70℃膨胀是可逆的，可逆程度根据特定淀粉而定。在更高的温度下开始一种不可逆的膨胀，称作糊化。
术语“起始糊化温度”被理解为淀粉的糊化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃到75℃之间开始糊化；糊化的确切温度依赖于具体的淀粉并且可以由技术人员容易地确定。因而，起始糊化温度可以根据植物物种，根据植物物种的特定品种以及生长条件而变化。在本发明的上下文中给定淀粉的起始糊化温度是利用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/St
Figure A200580023784D0009114753QIETU
rke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所述的方法5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。
含淀粉的材料也可以包含或由来自淀粉加工的支流(side stream)，例如可能不适于生产糖浆的含C6糖的工艺物料流(process streams)组成。在其它实施方案中，起始材料并非包含或由来自淀粉加工的支流组成。
减小含淀粉材料的粒度
在优选的实施方案中，可以在液化前减小含淀粉的起始材料的粒度(particle size)。在优选的实施方案中粉碎(mill)所述材料。磨碎(grinding)也被理解为粉碎。通常使用两种粉碎：湿磨(wet milling)和干磨(drymilling)。术语“干磨”表示使用，例如，锤式粉碎机(hammer mill)或辊轧式粉碎机(roller mill)。在使用整谷物或谷粒碾磨的情况下，粉碎整粒(whole kernel)并且用于该方法的剩余部分中。湿磨使得胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好的分离，其经常应用在有平行的糖浆生产的地方。还可以利用其它的大小减小(size reducing)技术如乳化技术和旋转脉动(rotary pulsation)。
本发明的方法
本发明的方法可以一般性地分成下列主要过程阶段：粉碎(milling)，以便打开含淀粉材料的结构并允许进一步的加工；液化，其中将经粉碎的含淀粉的材料水解(裂解)成麦芽糖糊精(糊精)；分别的或同时的糖化以及发酵，以从麦芽糖糊精产生低分子发酵性糖(fermentable sugar)，这些发酵性糖可被所述发酵生物如酵母代谢并转化成所需的发酵产品，如乙醇；和任选的回收，例如通过蒸馏来纯化所需的发酵产品。
发酵产品生产，如乙醇生产的单个工艺步骤可以分批或者作为连续流程来进行。对于所有工艺步骤都成批次进行的方法，或所有加工步骤都作为连续流程来进行的方法，或一个或多个工艺步骤成批次进行而一个或多个工艺步骤作为连续流程来进行的方法，都同等地加以考虑。
级联方法(cascade process)是一个或多个工艺步骤作为连续流程并且如本发明所考虑地那样来进行的方法的例子。对于级联方法进一步的信息和其它特别是乙醇工艺，参考The Alcohol Textbook.Ethanol production byfermentation and distillation.T.P.Lyons，D.R.Kesall和J.E.Murtagh编Nottingham University Press 1995。
在本发明的第一方面提供由经粉碎的含淀粉的材料生产发酵产品，特别是乙醇的方法，优选基于整谷物或谷粒，包括下列步骤：
i)使含淀粉的材料接受α-淀粉酶的作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶的作用，和
iii)在发酵生物存在时发酵所述材料。
在优选的实施方案中所述α-葡糖苷酶来自植物，优选稻，特别是稻(Oryzae sativa)。
本发明还涉及由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
i)使含淀粉的材料接受α-淀粉酶作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和麦芽糖生成酶作用，和
iii)在发酵生物存在时发酵所述材料。
在液化步骤i)之前，减小如上面在“原材料”一节中所定义的含淀粉的材料的粒度。在优选的实施方案中粉碎所述含淀粉的材料。在特定的实施方案中，本发明的方法在步骤i)之前，进一步包含下列步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成含有所述含淀粉材料和水的浆液。
含水浆液(aqueous slurry)可以包含10-40wt-％，优选25-35wt-％含淀粉的材料。在本发明的一个实施方案中，将所述浆液加热到糊化温度之上，如60-95℃之间，优选80-85℃，并且可以加入细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化作用(稀化(thinning))。不过，这并非必需的。
在一个实施方案中，在本发明的步骤i)中接受α-淀粉酶作用之前，可以将含淀粉材料的浆液在90-120℃，优选在105℃左右蒸汽加压蒸煮(jet-cooked)1-15分钟，优选3-10分钟，特别是5分钟左右，以进一步糊化该淀粉。在优选的实施方案中，步骤i)中的液化作用是通过(a)用例如细菌α-淀粉酶于70-90℃左右的温度下处理所述含淀粉材料15-120分钟而进行的。步骤(a)后可以进行步骤(b)，用α-淀粉酶在50-80℃的温度下处理步骤(a)中获得的材料30-90分钟。所述α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶，包括在下面“α-淀粉酶”一节中提及的淀粉酶。优选的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。液化作用是在大约pH 4-7的范围，优选pH大约4.5-6.5下进行的。是否调节浆液中的pH根据所用酶的特性而定。因而，在一个实施方案中调节pH，例如，通过加入NH3而将pH上调例如大约1个单位。当加入α-淀粉酶时调节pH是有利的。在优选的实施方案中，不调节pH，并且α-淀粉酶具有相应的合适pH-活性特征谱，如在大约pH 4下是具有活性的。液化的整谷物或谷粒也称作醪液(mash)。
在本发明的方法的步骤ii)中，将包含麦芽糖糊精的经液化的材料水解成可被发酵生物如酵母代谢的低分子发酵性糖。这一步骤被称为“糖化”。根据本发明，该步骤通过使经液化的包含麦芽糖糊精的材料接受α-葡糖苷酶和麦芽糖生成酶的作用而进行。所述麦芽糖生成酶将麦芽糖糊精降解成麦芽糖，并且所述麦芽糖最终被α-葡糖苷酶降解成葡萄糖，其被发酵生物例如酵母所消耗并转化成发酵产品，例如乙醇。
完整的糖化步骤可以持续长达72小时。但是，在优选的实施方案中可以结合所述糖化和发酵(SSF)，而且在本发明的一个实施方案中可以包括1-4小时的预糖化(pre-saccharification)。预糖化可以在任何合适的加工条件下进行。在优选的实施方案中，预糖化在30-65℃，如约60℃下，和在例如pH4-5，特别是约pH 4.5下进行。
因而，在本发明的方法的一个实施方案中可以进一步包括如本文所述的糖化步骤，其在步骤i)的液化之后和在步骤ii)之前进行。
在优选的实施方案中采用同时的糖化和发酵(SSF)过程，其中没有糖化的保持阶段(holding stage)，意味着酵母和糖化酶(saccharificationenzymes)是基本上一起加入的。
本发明还涉及由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
a)使含淀粉的材料接受α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶的作用，和
b)在发酵生物存在时发酵。
在优选的实施方案中，在发酵后回收发酵产品，如特别是乙醇，优选通过蒸馏。在优选的实施方案中，步骤a)之前可以在糊化温度(gelatinizationtemperature)以下的温度进行预处理。根据本发明的这方面，所述包含的淀粉优选是生(raw)粒状淀粉。如在“原材料”一节中所公开的，所述淀粉可以是任何植物来源的。所述α-葡糖苷酶，葡萄糖生成酶(glucose generatingenzyme)和麦芽糖生成酶(maltose generating enzyme)可以是在下面“酶活性”一节中公开的任何酶。在一个实施方案中所述含淀粉的材料可以在步骤(a)和/或(b)中和/或在步骤a)之前进一步接受α-淀粉酶的作用。所述α-淀粉酶可以是在下面“α-淀粉酶”一节中公开的任何α-淀粉酶。优选的是酸性α-淀粉酶，特别是真菌来源的α-淀粉酶。
优选的，将优选来自稻(Oryzae sativa)的α-葡糖苷酶应用在工艺过程，如乙醇工艺过程中，来对糊化的或粒状淀粉进行糖化，所述工艺过程包括同时进行的糖化和发酵(SSF)和任选的发酵产品的回收。SSF之前可以为糊化步骤，例如通过蒸汽加压蒸煮(jet-cooking)，或者在SSF之前可以在低于糊化温度的温度下对为生粒状淀粉进行预处理，以实现淀粉颗粒的膨胀。在一个实施方案中，步骤(a)在低于“原材料”一节中所定义的起始糊化温度下进行。步骤(a)和(b)可以顺序地或同时地进行。在特定实施方案中，本发明的方法在步骤a)之前，进一步包含下列步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成含有所述含淀粉材料和水的浆液。
含水浆液可以包含10-40wt-％，优选25-35wt-％的含淀粉的材料。所述浆液可以包括水和工艺用水，如釜馏物(stillage)(逆流水(backset))，气体洗涤水(scrubber water)，蒸发器冷凝物或馏出物，来自蒸馏的侧线汽提塔水(side stripper water)，或其它发酵产品工厂的工艺用水。由于该过程是在糊化温度之下进行的，故而没有发生显著的粘性升高，因此如果需要的话，可以使用高水平的釜馏物。在实施方案中所述含水浆液包含大约1到大约70vol.-％的釜馏物，优选15-60％ vol.-％的釜馏物，特别是大约30到50vol.-％的釜馏物。
所述α-葡糖苷酶可以单独或与别的淀粉分解酶(amylolytic enzyme)组合施加，所述别的淀粉分解酶选自：葡糖淀粉酶，淀粉酶，包括细菌α-淀粉酶，酸性真菌α-淀粉酶，β-淀粉酶，和支链淀粉酶。在优选的实施方案中，将α-葡糖苷酶施加于生淀粉的水解过程中，如在丹麦专利申请号PA 200300812，WO 2004/106533或WO 2004/081193中所公开的，特此将其全部并入作为参考。在另一个优选的实施方案中将α-葡糖苷酶施加于啤酒生产的醪液糖化过程中，所述啤酒醪液包含选自谷物(grain)，稻，玉米，小麦，大麦，麦芽，未发芽的大麦，辅料，非谷物辅料和非大麦辅料的淀粉质(starchy)原料。
发酵
术语“发酵生物”指适用于所需发酵过程的任何生物。根据本发明适合的发酵生物能够发酵，即，直接或间接转化，优选DP1-3糖，如特别是葡萄糖和麦芽糖，成所需的发酵产品，如乙醇。一般将发酵生物加入醪液中。
发酵生物的例子包括真菌生物，如酵母或丝状真菌.优选的酵母包括酵母属的菌株(Saccharomyces spp.)，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。商业上现有的酵母包括，例如，RED 
Figure A200580023784D00131
/Lesaffre EthanolRed(可获自Red Star/Lesaffre，USA)，FALI(可获自Fleischmann’s酵母，USA)SUPERSTART(可获自Alltech)，GERT STRAND(可获自Gert Strand AB，Sweden)和FERMIOL(可获自DSM Specialties)。
一直进行发酵直到生产出所需量的发酵产品，如乙醇。这一般意味着进行发酵24-96小时，如35-60小时。在发酵过程中的温度和pH是适用所述发酵生物的温度和pH。对于酵母来说，例如，温度和pH为大约26-34℃，优选大约32℃，而pH为例如大约pH 3-6，例如大约pH 4-5。
优选的乙醇生产酵母包括，例如，毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces)。根据本发明优选的酵母是酵母属物种，特别是酿酒酵母或面包酵母(bakers yeast)。
回收
本发明的方法可以任选地包括回收发酵产品，如乙醇；因此发酵产品例如乙醇可以从发酵材料中被分离并纯化。在发酵后，可以蒸馏醪液来提取例如乙醇。由本发明的方法可以获得具有高达例如大约96vol.％乙醇纯度的乙醇。
因而，在一个实施方案中，步骤iii)中的发酵和蒸馏步骤可以同时和/或分别地/顺序地进行；任选地后续一个或多个工艺步骤来进一步精制发酵产品，例如乙醇。
酶活性
α-淀粉酶
本发明的方法可以在优选例如细菌和/或真菌α-淀粉酶的存在下进行。合适的α-淀粉酶的例子包括下面提及的。
细菌α-淀粉酶
例如，本发明的步骤i)或步骤(a)中所用的优选的细菌α-淀粉酶，可以来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的菌株。还优选的是具有这样的氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列与在本文SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中给出的序列具有至少50％同源性，优选至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％或至少99％，如100％的同源性。
其它细菌α-淀粉酶包括来自芽孢杆菌属菌种NCIB 12289，NCIB12512，NCIB 12513或DSM 9375菌株的α-淀粉酶，所有这些都在WO 95/26397中进行了详细描述，和Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31所述的α-淀粉酶。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873，WO 96/23874，WO 97/41213，WO 99/19467，WO 00/60059，和WO 02/10355任一篇中所述的α-淀粉酶(特此将所有文件并入作为参考)。具体考虑的α-淀粉酶变体公开在美国专利6,093,562、6,297,038、或美国专利6,187,576中(在此引入作为参考)，其包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，所述变体与WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3(或本文的SEQ ID NO：2)所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，在位点R179到G182缺失了一到二个氨基酸，优选如WO 1996/023873所公开的双重缺失(double deletion)-见例如第20页第1-10行(在此引入作为参考)，优选对应于Δ(181-182)，或缺失了用WO99/19467(该参考文件在此引入作为参考)(或本文的SEQ ID NO：2)中的SEQ IDNO：3编号的位点R179和G180氨基酸。更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，该酶与WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3(或本文的SEQ ID NO：2)所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有对应于Δ(181-182)的双重缺失，此外还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
具体考虑的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(如WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示)，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(如WO 99/19467中SEQ ID NO：5所示)，其具有如下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(用WO 99/19467中SEQ ID NO：4的编号)，如本文SEQ IDNO：4所示。还优选来自解淀粉芽孢杆菌并且与SEQ ID NO：4中给出的序列具有至少50％同源性，如至少60％，至少70％，至少80％，或甚至90％同源性的α-淀粉酶变体。特别优选具有突变H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S中的一个或多个，并且/或者在位置176和179之间的两个残基缺失，优选E178和G179的缺失的变体(利用WO 99/19467的SEQ ID NO：5中的编号)。
其它考虑要求的细菌α-淀粉酶为公开于EP 1,022,334中并保藏为FERMBP 6945的KSM-K36α-淀粉酶，和公开于EP 1,022,334中并保藏为FERMBP-6946的KSM-K38α-淀粉酶。所以还考虑要求保护变体，特别是在WO02/31124中公开的变体(来自Novozymes A/S).
可商购的细菌α-淀粉酶产品和包含α-淀粉酶的产品包括TERMAMYLTMSC和LIQUOZYMETM SC，BAN(Novozymes A/S，丹麦)和DEX-LOTM，SPEZYMETM AA，和SPEZYMETM DELTA AA(来自Genencor Int.)。
真菌α-淀粉酶
优选的真菌α-淀粉酶来自曲霉属(Aspergillus)的菌株，包括米曲酶(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)，或A.kawashii。具体考虑要求的是米曲酶TAKAα-淀粉酶(EP 238 023)；在EP 383,779 B2([0037]节(还参见实施例1中黑曲霉基因的克隆)公开的黑曲霉α-淀粉酶；在EP140,410的实施例1中公开的黑曲霉α-淀粉酶。在优选的实施方案中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。在更加优选的实施方案中所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。更加优选地，所述酸性α-淀粉酶是来自曲霉属的真菌α-淀粉酶。这种可商购的酸性真菌淀粉酶是SP288(可获自Novozymes A/S，丹麦)。
术语“酸性α-淀粉酶”意指这样的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其以有效量添加时，在pH3.0-7.0，优选从3.5到6.0，或更加优选4.0-5.0时具有最佳活性。
优选地酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl样α-淀粉酶。在本公开中，术语＂Fungamyl样α-淀粉酶＂指这样的α-淀粉酶，其与在WO 96/23874中的SEQ IDNO：10中所示的氨基酸序列显示高度同一性，即大于50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％90％，95％或甚至大于99％的同一性。
优选所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选来自曲霉属，优选是黑曲霉物种的α-淀粉酶。在优选的实施方案中所述真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其在Swiss-prot/TeEMBL数据库中公开为“AMYA_ASPNG”，主登录号(primary accession no.)为P56271。还考虑要求所述酸性真菌淀粉酶的变体，其与所述酸性真菌淀粉酶具有70％的同一性，如至少80％或甚至至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一个实施方案中所述酸性真菌α-淀粉酶是在本文SEQ ID NO：1中公开的α-淀粉酶，或与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，优选至少75％，至少80％，至少85％或至少90％，例如，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。
商业性真菌α-淀粉酶
Figure A200580023784D00161
(Novozymes A/S)；和CLARASETM(来自Genencor Int.，USA)，后者都来自曲霉属。
麦芽糖生成酶
在本发明的方法中所用的麦芽糖生成酶可以是产麦芽糖淀粉酶，β-淀粉酶或真菌α-淀粉酶。
产麦芽糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶)能够水解直链淀粉和支链淀粉成为α构型的麦芽糖。另外，产麦芽糖淀粉酶能够水解麦芽三糖以及环糊精。具体考虑要求的产麦芽糖淀粉酶可以来自芽孢杆菌属物种，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌，最优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌C599，如在EP120.693中所公开的产麦芽糖淀粉酶。这种特定的产麦芽淀粉酶具有显示为US6162628中的SEQ ID NO：1的氨基酸1-686的氨基酸序列。优选的产麦芽糖淀粉酶具有这样的氨基酸序列，其与US6162628中的SEQ ID NO：1的氨基酸1-686具有至少70％的同一性，优选至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或特别是至少99％。最优选的产麦芽糖淀粉酶变体包括在WO99/43794中所公开的变体。
产麦芽淀粉酶可以0.01-40.0MANU/gDS的量添加，优选0.02-10MANU/g DS，优选0.05-5.0MANU/g DS。
另一种在本发明的方法中使用的麦芽糖生成酶可以是β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)。β-淀粉酶是传统上给予外切作用(exo-acting)的产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。
β-淀粉酶已经从各种植物和微生物中分离出来(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征是具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7.0的最适pH。优选所述β-淀粉酶来自丝状真菌，如来自微小根毛霉(Rhizomucor pusilis)的β-淀粉酶。考虑要求的β-淀粉酶包括来自大麦SPEZYME BBA 1500，SPEZYME DBA的β-淀粉酶和来自Genencor Int.的OPTIMALTTM ME，OPTIMALTTM BBA以及来自Novozymes A/S的NOVOZYMTM WBA。
另一种可以用在本发明的方法中的麦芽糖生成酶是真菌α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，如fungamyl样α-淀粉酶。在本说明书中，术语“fungamyl样α-淀粉酶”表示这样的α-淀粉酶，其与WO 96/23874中SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有高度同源性，即大于50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或甚至99％的同源性(同一性)。
当用作麦芽糖生成酶时真菌α-淀粉酶可以有效量添加，优选0.001-1.0AFAU/g DS，优选0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS或优选0.01-10mg蛋白质/g DS的产麦芽糖淀粉酶，β-淀粉酶，Fungamyl样α-淀粉酶，或其混合物。
α-葡糖苷酶
本发明的方法中所用的α-葡糖苷酶或麦芽糖酶(EC 3.2.1.48)可以来自微生物或植物。优选的是真菌来源的α-葡糖苷酶，如来自酵母或来自丝状真菌，和细菌来源的α-葡糖苷酶。优选的真菌α-葡糖苷酶是来自假丝酵母属(Candida)菌种，如C.edax的菌株，优选菌株CBS 6461的真菌α-葡糖苷酶。还优选可来自毕赤酵母属(Pichia)菌种的菌株，如P.amylophilia，P.missisippiensis，P.wicherhamii和罗丹毕赤酵母(P.rhodanensis)的α-葡糖苷酶。还考虑要求的α-葡糖苷酶来自曲霉属菌种，如构巢曲霉(A.nidulans)(Kato等人2002，Appl Environ Microbiol.68：1250-1256)，来自Rhizobium属物种(Berthelot等人1999，Appl Environ Microbiol.65：2907-2911)。
优选的细菌α-葡糖苷酶包括来自芽孢杆菌属，如来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的α-葡糖苷酶。优选具有这样的氨基酸序列的α-葡糖苷酶，所述氨基酸序列与本文SEQ ID NO：6中给出的成熟序列具有至少50％的同源性(同一性)，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少85％或至少90％，例如，至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％，如100％的同源性(同一性)。考虑可商购的α-葡糖苷酶是可购自SIGMA(Sigma目录号G3651)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶。植物来源的α-葡糖苷酶可以来自谷类，如来自小麦，黑麦，大麦，玉米或稻。考虑要求的其它α-葡糖苷酶包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)α-葡糖苷酶，特别是在美国专利号60/585,336中公开的α-葡糖苷酶或Fusarium venenatumα-葡糖苷酶，特别是在美国专利号60/586,103中公开的α-葡糖苷酶(特此将两个申请都并入作为参考)。
优选的植物α-葡糖苷酶来自稻，例如稻(Oryzae sativa)。优选α-葡糖苷酶具有N-末端氨基酸序列；GYNVASVAGS(SEQ ID NO：7)，更加优选α-葡糖苷酶具有N-末端氨基酸序列；GYNVASVAGS KNRRRARRELAAGGGGA(SEQ ID NO：8)，或α-葡糖苷酶具有这样的N-末端氨基酸序列，其包含对应于两种前述氨基酸序列的任一种的氨基酸序列，其中优选不超过一个，更加优选不超过两个，还要更加优选不超过三个，最优选不超过四个氨基酸残基被取代，插入和/或缺失。优选的稻α-葡糖苷酶可获自Sigma-Aldrich，目录号G9259。还优选在Iwata等人于Journal ofBioscienceand Bioengineering，Vol.95，No.1，106-108.2003中公开的稻α-葡糖苷酶。优选α-葡糖苷酶具有大约90kDa到100kDa的分子量(MW)，更加优选大约92kDa到99kDa，如从大约95kDa到98kDa。特别优选的α-葡糖苷酶具有大约97kDa的MW。
可以0.1-10000麦芽糖酶单位/kg DS，1-1000麦芽糖酶单位/kg DS，或更加优选10-100麦芽糖酶单位/kgDS，如或更加优选1-10麦芽糖酶单位/kgDS或优选从0.01到10mg蛋白质/gDS或0.001到100mg蛋白质/gDS，优选从0.01到10mg蛋白质/g DS的有效量添加α-葡糖苷酶。
葡萄糖生成酶
根据本发明可以使用任何葡萄糖生成酶。优选的葡萄糖生成酶是葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以是任何来源的，例如，来自微生物或植物。优选真菌或细菌来源的葡糖淀粉酶，其选自黑曲霉葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如在WO 92/00381和WO 00/04136中公开的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。
其它考虑要求的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；和Pro残基导入在位置A435和S436上(Li等人(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。另外，Clark Ford在Oct 17，1997，ENZYME ENGINEERING 14，北京/中国Oct 12-17，97，摘要号：Abstractbook p.0-61中给出了一篇论文。该摘要提出在泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶的位置G137A，N20C/A27C，和S30P上的突变提高了热稳定性。
其它葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来自Talaromyces emersonii(WO 99/28448)，Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32，153)，Talaromyces duponti，Talaromyces thermopiles(美国专利号4,587,215)。所考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135，138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
还具体考虑来自Athelia rolfsii(以往名为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii)的葡糖淀粉酶，包括具有已知氨基酸序列如SPTREMBL：Q12596的葡糖淀粉酶。还参见美国专利号4,727,026和(Nagasaka，Y.等人(1998)Purificationand properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticiumrolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)。
包含葡糖淀粉酶的可商购的产品包括SPIRIZYMETM FUELSPIRIZYME PLUS，SANTM SUPERTM和AMGTM E(来自Novozymes A/S)。
可以以有效量，优选0.02-20AGU/g DS，优选从0.005到5AGU/g DS，或0.1-10AGU/g DS，优选0.05到0.5AGU/g DS如0.1，0.3，0.5，1或2AGU/g DS左右，如0.1-0.5AGU/gDS之间的量来添加葡糖淀粉酶。
支链淀粉酶
支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)，是去分枝(de-branching)酶，特征是它们水解例如，支链淀粉(amylopectin)和茁霉多糖(pullulan)中的α-1，6-糖苷键的能力。
根据本发明具体考虑的支链淀粉酶包括在美国专利号4,560,651(特此并入作为参考)中公开的来自Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶，在WO01/151620(特此并入作为参考)中公开为SEQ ID NO：2的支链淀粉酶，在WO 01/151620中公开为SEQ ID NO：4的Bacillus deramificans以及在美国专利号：5,736,375(特此并入作为参考)中的SEQ ID NO：11，和在WO 01/151620(特此并入作为参考)中公开为SEQ ID NO：6并且描述于FEMS Mic.Let.(1994)115，97-106中的来自Bacillus acidopullulyticus的支链淀粉酶。
根据本发明可以以有效量，其包括1-100微克/g DS之间优选的范围，特别是10-60微克/g DS的量添加支链淀粉酶。可以将支链淀粉酶活性测定为NPUN。测定NPUN的测定法描述于下面“材料与方法”一节中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D，PROMOZYMETMD2(Novozymes A/S，丹麦)，OPTIMAX L-300(Genencor Int.，USA)，和AMANO8(Amano，日本)。
通过本发明的方法生产的产品的使用
可以将通过本发明的方法获得的乙醇用作，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即，适于饮用的精制酒精(neutral spirits)为，或工业乙醇，包括燃料添加剂。
本文描述和要求保护的发明并不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲作为本发明的几方面的说明。任何等同的实施方案都在本发明的范围之内。由前面的说明书，除了那些在本文显示和描述的以外本发明的各种改进对于本领域熟练技术人员来说将是显而易见的。这些改进也将落入随附权利要求书的范围之内。在抵触的情况下，以包括定义的说明书为准。本文引用的各种参考文献，将其全部内容并入作为参考。由下列实施例对本发明作进一步描述，其不应被视为限制本发明的范围。
材料和方法
酶：
细菌α-淀粉酶A(BAAA)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，具有突变：I181*+G182*+N193F，公开于美国专利号6,187,576中，并且可以从Novozymes A/S，丹麦索取。
真菌酸性α-淀粉酶B(FAAB)：在SEQ ID NO：1中公开的黑曲霉α-淀粉酶，可获自Novozymes A/S。
α-葡糖苷酶BS(AGBS)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶，可获自SIGMA(Sigma目录号G3651)。
麦芽糖生成酶：在EP120.693中描述的来自嗜热脂肪芽孢杆菌C599的产麦芽淀粉酶并且可获自Novozymes A/S。
α-葡糖苷酶OS：稻α-葡糖苷酶，可获自SIGMA(Sigma目录号G9259)。
葡糖淀粉酶TN：来自Talaromyces emersonii并且在WO 99/28448中被公开为SEQ ID NO：7的葡糖淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶和黑曲霉酸性α-淀粉酶的副活性(side activity)。
支链淀粉酶PD：来自Bacillus deramificans的支链淀粉酶，其具有在US5,736,375中显示为SEQ ID NO：11的氨基酸序列并在本文中公开为SEQ IDNO：9。
β-淀粉酶WG：由小麦谷粒中提取的植物β-淀粉酶(Novozym WBA，可获自Novozymes A/S)。
同源性(同一性)的测定
术语多肽“同源性”意指两个氨基酸序列之间的同一性。同源性可以通过本领域已知的计算机程序进行适当地测定，如在GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of MolecularBiology，48，443-453。使用下列设置用于多肽序列比较：GAP生成罚分(creation penalty)为3.0，而GAP延伸罚分(extention penalty)为0.1。
α-淀粉酶活性(KNU)的测定
利用KNU来测量具有高最适pH(pH optima)的细菌α-淀粉酶。
PHADEBAS TM 测定
通过采用PHADEBAS片剂作为底物的方法来测定α-淀粉酶活性。PHADEBAS片剂(Phadebas Amylase Test，Pharmacia Diagnostic提供)包含交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，其已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压制成片。
对于每个单次测量，将一个片剂混悬于包含5ml50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，用NaOH将pH值调节到目标值)的试管中。试验在目标温度下的水浴中进行。将待测α-淀粉酶稀释在x ml的50mM Britton-Robinson缓冲液中。将1ml这种α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。淀粉被α-淀粉酶水解，产生可溶性蓝色片段。在分光光度计上620nm处测量的得到的蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在10或15分钟温育后(测试时间)测得的620nm吸光度，在620nm处于0.2到2.0的吸光度范围内。在这种吸光度范围中活性和吸光度之间有线性关系(Lambert-Beer定律)。所以必须调节酶的稀释以适合这种标准。在特定的条件组下(温度，pH，反应时间，缓冲条件)1mg的给定α-淀粉酶将水解一定量的底物并且将产生蓝色。于620nm处测量颜色强度(color intensity)。在给定的条件设置下测量的吸光度与所述α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)正成比。
备选方法
通过采用PNP-G7底物的方法来测定α-淀粉酶活性。PNP-G7是p-硝基苯基-α，D-麦芽庚糖苷(maltoheptaoside)的缩写，它是嵌段的(blocked)寡糖，可以被内切淀粉酶所剪切。剪切后，包括在试剂盒中的α-葡糖苷酶消化底物以释放游离的PNP分子，该分子具有黄色，因而能够用可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)测量。包含PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim生产(目录号1054635)。
将1瓶底物(BM1442309)加入到5ml缓冲液中(BM1442309)来制备底物。将1瓶α-葡糖苷酶(BM1462309)加入到45ml缓冲液中(BM1442309)来制备α-葡糖苷酶。将5mlα-葡糖苷酶溶液与0.5ml底物混合制成工作溶液。
通过将20微升酶溶液转到96孔微量滴定板上并于25℃温育来进行测定。加入200微升25℃的工作溶液。将溶液混合并预温育1分钟，每15秒测量OD405nm的吸光度，持续3分钟。
在给定的条件设置下，随时间变化的吸光度曲线的斜率与所述α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。
FAU活性的测定
1个真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为基于下列标准条件每小时降解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，批号9947275)的酶的量：
底物          可溶性淀粉
温度          37℃
pH            4.7
反应时间      7-20分钟
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)的测定
酸性α-淀粉酶活性以AFAU(Acid Fungal Alpha-amylase Units，酸性真菌α-淀粉酶单位)进行测量，相对于酶标准对其进行测定。
所述的标准品是AMG 300L(来自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，也公开在Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)和WO 92/00381中)。在这种AMG中的中性α-淀粉酶在室温保存3周后从大约1FAU/mL下降到0.05FAU/mL以下。
根据下列描述测定这种AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5,260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉但不与其降解产物形成蓝色复合物。所以颜色的强度与淀粉的浓度成正比。淀粉酶活性利用反向比色法(reverse colorimetry)测定，以特定分析条件下淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。
          α-淀粉酶
淀粉+碘   →            糊精+寡糖
          40℃，pH 2.5
蓝色/紫罗兰 t＝23sec.   褪色
标准条件/反应条件：(每分钟)
底物：                淀粉，大约0.17g/L
缓冲液：              柠檬酸盐，大约0.03M
碘(I2)：              0.03g/L
CaCl2：               1.85mM
pH：                  2.50±0.05
温育温度：            40℃
反应时间：            23秒
波长：                λ＝590nm
酶浓度：              0.025AFAU/mL
酶工作范围：          0.01-0.04AFAU/mL
如果优选另外的细节可以见于EB-SM-0259.02/01，可以根据要求获自Novozymes A/S，并入作为参考。
α-葡糖苷酶活性(麦芽糖酶单位)
α-葡糖苷酶活性可以麦芽糖酶单位表示(g形成的葡萄糖/L麦芽糖酶制剂/小时)。将麦芽糖酶制剂于20％w/v麦芽糖，50mM柠檬酸盐，pH＝4.5的溶液中在60℃温育60分钟(1小时)。利用GOD-PERID测定，Boehringer Mannheim测量释放的葡萄糖量。
支链淀粉酶活性(NPUN)的测定
相对于Novozymes支链淀粉酶标准品测量以NPUN表示的内切-支链淀粉酶活性。将一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色茁霉多糖(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。利用红色茁霉多糖(red pullulan)以NPUN/ml测量所述活性。
将1ml稀释的样品或标准品于40℃温育2分钟。加入0.5ml2％红色茁霉多糖，0.5M KCl，50mM柠檬酸，pH5并进行混合。将试管于40℃温育20分钟并通过加入2.5ml 80％乙醇终止。将试管置于室温10-60分钟，接下来于4000rpm离心10分钟。随后于510nm测量上清液的OD并利用标准曲线计算活性。
实施例
实施例1
用细菌酸性α-淀粉酶进行液化
用50NU/g干固体(DS)的来自嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶对100mL粉碎过的玉米浆进行液化。玉米醪液具有大约30％的干物质(pH 5.4)。在85℃将所述醪液加热0.5小时。接着，将温度降到70℃，然后用具有SEQID NO：1中公开的氨基酸序列的来自黑曲霉的酸性真菌淀粉酶B对所述醪液进行处理。酶的加载量是0.05AFAU/g干固体。1.0小时后，取样品进行HPLC分析。将温度降低到32℃以进行同时糖化和发酵(SSF)。
用葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶和麦芽糖生成酶进行SSF
一旦液化作用结束，将pH调整到5.0。接着，用黑曲霉葡糖淀粉酶(0.1AGU/g DS)来处理所述醪液，所述黑曲霉葡糖淀粉酶包括黑曲霉酸性α-淀粉酶(AGU和AFAU之间的比率约为9:1)，α-葡糖苷酶BS(0.1AGU/g DS的等价葡糖淀粉酶蛋白剂量)和产麦芽糖淀粉酶(0.1AGU/g DS的等价葡糖淀粉酶蛋白剂量)的副活性。接着，用酵母(酿酒酵母)(4％ w/w)接种所述醪液并在整个发酵过程中以32℃温育。每隔一定的时间取样品进行HPLC以确定乙醇和糖特征谱。
实施例2
使用50NU/g DS的来自嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶A，以三步热浆法(hot slurry process)对33％的干固体(DS)的整玉米醪液(whole cornmash)进行液化作用。首先，将浆液加热到约82℃，并将三分之一(1/3)的α-淀粉酶加入以起始液化作用。接着，在大约112℃的温度对所述浆液进行蒸汽加压蒸煮，以完成所述浆液的糊化。接着，将所述浆液冷却到大约77℃，并将剩余的三分之二(2/3)的α-淀粉酶加入以完成水解作用。
将250mL的液化的整玉米醪液加到500mL的具有磁力搅拌器的蓝盖瓶中。将所述醪液的pH调整到大约5.5。将所述蓝盖瓶在大约32℃的水浴中温育40分钟，然后以0.2g/瓶，即相当于15mill个活细胞计数/mL的剂量加入干酵母(酿酒酵母)。使用充有浓H2SO4的酵母用气锁(yeast lock)来封闭该瓶。在32℃持续发酵大约91小时，并通过每隔一定的时间称重瓶子，来监测与乙醇产生成比例的CO2的损失。
Figure A200580023784D00261
实施例3
用室温(RT)自来水来制备粉碎的小麦颗粒的30％ D.S.的浆液。对于每个处理，将2 x 250g分在500mL的蓝盖发酵烧瓶中。将pH调节到6.0，并加入酶：来自嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶A(0.15KNU/g DS)，β-淀粉酶WG(0.0125mg EP/g DS)，和来自稻的α-葡糖苷酶(0.0125mg EP/gDS)。在振荡水浴中在大约55℃进行预处理60分钟。将所述烧瓶冷却到大约32℃，在每个烧瓶中加入0.25g的干面包酵母(对应于1000万活细胞/g醪液)，所述烧瓶配备气锁，并被称重。在预设为大约32℃的振荡水浴中将所述烧瓶进行温育，进行同时糖化和发酵(SSF)过程步骤96小时。每隔一定的时间称重所述烧瓶并对CO2重量损失(g)进行测量来监测发酵过程。所用的CO2损失的量和乙醇重量之间的关系式是CO2损失(g)×1.045＝EtOH(g)。将乙醇产率计算为：
Figure A200580023784D00271
实施例4
重复在实施例3中所述的过程；除了所述浆液是30％ DS的干磨的玉米浆液。
实施例5
在SSF过程中加入α-葡糖苷酶的作用
该实施例研究了α-葡糖苷酶和支链淀粉酶，酸性α-淀粉酶和低剂量的葡糖淀粉酶的组合在SSF的整个过程中对糖，甘油和乙醇特征谱的影响。
用两个相同的容器(每个5升的总容积)进行包括液化和SSF的完全的过程。使用约2.5kg的工作容积。使用单个反应器进行液化，以得到共同的液化材料。用磨碎的玉米来制备具有30wt.％干固体(DS)的液体浆液，用自来水将最终重量补足为约5.5Kg。用稀NaOH调节pH到5.8。调节了pH后，即将细菌α-淀粉酶A(BAAA)(玉米的0.04％ w/w)加入容器中。在将酶与玉米浆液混和后，通过将热水循环过套管来将温度升高到85℃。在温度达到85℃后，将其保持1.5小时，然后冷却到32℃。在实验余下的过程中，将温度保持在32℃。
完成了液化作用后，即将醪液等分在2个发酵罐中。在第一个反应器(发酵罐1)中，仅加入葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶TN)(0.5AGU/g DS)作为参照运行。在第二个反应器(发酵罐2，试验运行)中，将葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶TN)剂量减少到10％(与参照运行相比)，使其达到0.05AGU/gDS)，以及对于3种酶，使其酶蛋白为最初葡糖淀粉酶TN剂量的5wt.％(即，真菌酸性α-淀粉酶B(FAAAB)、支链淀粉酶PD和α-葡糖苷酶OS酶蛋白分别相当于0.025AGU/g DS的葡糖淀粉酶TN)。基于总醪液重量，将尿素(1000ppm)和青霉素(3mg/L)加入每个发酵罐中。最终，在所述反应器中接种0.04mL/g醪液的已培养20小时的酵母繁殖物。在每个容器中，搅拌维持在550rpm。每隔一定时间取样品，分析糖和乙醇特征谱，并且通过铺于3M的皿膜上来分析活酵母数。为了使在发酵过程中乙醇和水的蒸发最小化，将废气通过冷凝器，在所述冷凝器中，水在2℃循环。
结果
图2和3分别显示对于参照和试验运行的糖、甘油和乙醇特征谱。如图可见，具体地在最初的15个小时，在参照运行中的DP4+水解作用的速率相对更快，这是因为显著更高的葡糖淀粉酶TN活性。
对于麦芽三糖(DP3)观察到相似的结果。然而，对于麦芽糖，在开始的25个小时，在试验运行中发现相对浓度低得多。这可以由酶混合物中存在α-葡糖苷酶来解释。
缓慢的DP4+水解作用(低剂量的葡糖淀粉酶TN)连同酵母的指数生长导致实验反应中产生的葡萄糖的消耗得相对较快。然而，在参照运行中，更高剂量的葡糖淀粉酶TN导致了更高的葡萄糖释放(在图4中显示)。
另一个重要的发现是试验运行进行40小时后，麦芽糖浓度增加。一个原因可以是由于乙醇的存在，α-葡糖苷酶失活，从而导致麦芽糖积累，这显示了α-葡糖苷酶在糖利用模式中的重要性。
如在图4中显示，与试验运行相比，发现总乙醇产率在参照运行中更高。然而，在试验运行中只添加了25wt.％的总酶蛋白质。
关于甘油浓度，它们在实验和参照反应中分别终止于10.7g/L和12.0g/L。这可能是对酵母的应激(stress)的表现，显示协同性的糖特征谱可导致更好的酵母生长环境和更好的糖利用。
结论是获得了葡萄糖以及麦芽糖的更好的利用，因为没有观察到任何糖的积累。这显示了试验运行的酶之间的协同作用。此外，当添加具有α-葡糖苷酶的酶组合时，观察到更低的甘油生成。
序列表
<110>诺维信北美公司(NOVOZYMES NORTH AMERICA，INC.)
Bhargava，Swapnil
Frisner，Henrik
Bisg
Figure A200580023784D0029132615QIETU
rd-Frantzen，Henrik
Tams，Jeppe
<120>生产发酵产品的方法
<130>10653.204-WO
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>484
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>1
Figure A200580023784D00291
Figure A200580023784D00301
<210>2
<211>514
<212>PRT
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400>2
Figure A200580023784D00311
Figure A200580023784D00321
<210>3
<211>483
<212>PRT
<213>地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)
<400>3
Figure A200580023784D00322
Figure A200580023784D00331
Figure A200580023784D00341
<210>4
<211>480
<212>PRT
<213>解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400>4
Figure A200580023784D00342
Figure A200580023784D00351
Figure A200580023784D00361
<210>5
<211>498
<212>PRT
<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400>5
Figure A200580023784D00362
Figure A200580023784D00371
<210>6
<211>555
<212>PRT
<213>嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)
<400>6
Figure A200580023784D00381
Figure A200580023784D00391
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>稻(Oryza sativa)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>N-末端
<400>7
Figure A200580023784D0040132755QIETU
<210>8
<211>27
<212>PRT
<213>稻(Oryza sativa)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(27)
<223>N-末端
<400>8
Figure A200580023784D00401
<210>9
<211>928
<212>PRT
<213>Bacillus dcamificans
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1)..(928)
<223>支链淀粉酶(Pullulanase)
<409>9
Figure A200580023784D00402
Figure A200580023784D00411
Figure A200580023784D00431

Claims (57)

1.由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
i)使含淀粉的材料接受α淀粉酶的作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶的作用，
iii)在发酵生物存在下发酵所述材料。
2.由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
i)使含淀粉的材料接受α淀粉酶的作用，
ii)使步骤i)中获得的材料接受α-葡糖苷酶和麦芽糖生成酶的作用，
iii)在发酵生物存在下发酵所述材料。
3.权利要求1或2的方法，其中所述发酵产品是乙醇。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中在发酵后回收所述发酵产品，优选通过蒸馏。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中在步骤ii)中的糖化和在步骤iii)中的发酵同时进行(SSF)。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤i)通过(a)在约70-90℃的温度下用α-淀粉酶处理含淀粉的材料15-120分钟而进行。
7.权利要求6的方法，其中在所述步骤i)(a)后进行
(b)用α-淀粉酶在50-80℃的温度下处理在步骤(a)中获得的材料30-90分钟。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中在步骤i)前，在90-120℃，优选约105℃下将所述含淀粉的材料进行蒸汽加压蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中在步骤i)中的α-淀粉酶是细菌来源的，优选为芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶或具有突变：I181*+G182*特别是I181*+G182*+N193F的变体。
10.权利要求7的方法，其中步骤(b)中的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选地是酸性真菌α-淀粉酶，优选来自曲霉属物种，优选黑曲霉或米曲霉。
11.权利要求10的方法，其中所述酸性α-淀粉酶是具有这样的氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO：1具有至少75％，至少80％，至少85％或至少90％，例如，至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％的同一性。
12.权利要求10的方法，其中所述酸性α-淀粉酶是具有在SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列的α-淀粉酶。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述麦芽糖生成酶是β-淀粉酶和/或产麦芽糖淀粉酶。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述麦芽糖生成酶以有效量，优选0.01-10mg蛋白质/g DS加入。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述α-葡糖苷酶以有效量，优选0.01-10mg蛋白质/g DS的量加入。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述α-葡糖苷酶来自植物，优选稻，特别是来自稻(Oryzae sativa)的α-葡糖苷酶。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述α-葡糖苷酶来自细菌，优选来自芽孢杆菌属，优选嗜热脂肪芽孢杆菌，特别是在SEQ ID NO：6中给出的嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述含淀粉的材料选自块茎，根和整谷物或谷粒；和这些的任意组合。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述含淀粉的材料获自谷类。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述含淀粉的材料选自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁和马铃薯；或这些的任意组合。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述含淀粉的材料是整谷物或谷粒，并且所述方法包括在步骤(a)前粉碎整谷物或谷粒的步骤。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述含淀粉的材料可通过包括粉碎整谷物或谷粒的方法获得。
23.权利要求1或2的方法，其在步骤i)之前还包含下列步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成含有所述材料和水的浆液。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中减小含淀粉的材料的粒度，优选通过粉碎。
25.权利要求24的方法，其中所述粉碎是干磨步骤。
26.权利要求24的方法，其中所述粉碎是湿磨步骤。
27.权利要求1-26任一项的方法，其中含淀粉的材料是来自淀粉加工的支流。
28.权利要求1-27任一项的方法，其中发酵生物是酵母，如酵母属，特别是酿酒酵母。
29.由含淀粉的材料生产发酵产品的方法，所述方法包括：
a)使含淀粉的材料接受α-葡糖苷酶和任选的葡萄糖生成酶和/或麦芽糖生成酶的作用，和
b)在发酵生物存在时发酵所述材料。
30.权利要求29的方法，其中在发酵后回收发酵产品，优选通过蒸馏。
31.权利要求29或30的方法，其中于步骤a)之前在低于糊化温度的温度下进行预处理。
32.权利要求29或30的方法，其中步骤a)在低于糊化温度的温度下进行。
33.权利要求29-32任一项的方法，其中含淀粉材料是生粒状淀粉。
34.权利要求29-33任一项的方法，其中在步骤(a)中和/或步骤a)之前使含淀粉的材料接受α-淀粉酶作用。
35.权利要求34的方法，其中α-淀粉酶是细菌来源的，优选芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶或具有突变：I181*+G182*特别是I181*+G182*+N193F的变体。
36.权利要求34的方法，其中α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶，优选来自曲霉属物种，优选黑曲霉或米曲霉。
37.权利要求35的方法，其中酸性α-淀粉酶是具有这样的氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO：1具有至少75％，至少80％，至少85％或至少90％，例如至少95％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性。
38.权利要求37的方法，其中酸性α-淀粉酶是具有在SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列的α-淀粉酶。
39.权利要求29-38任一项的方法，其中麦芽糖生成酶是β-淀粉酶和/或产麦芽糖淀粉酶。
40.权利要求29-39任一项的方法，其中以有效量，优选0.01-10mg蛋白/g DS添加麦芽糖生成酶。
41.权利要求29-40任一项的方法，其中葡萄糖生成酶是葡糖淀粉酶。
42.权利要求29-41任一项的方法，其中葡萄糖生成酶，优选葡糖淀粉酶，以有效量添加，优选以0.005-5AGU/g DS，优选0.05-0.5AGU/g DS来添加。
43.权利要求29-42任一项的方法，其中α-葡糖苷酶以有效量，优选0.01到10mg蛋白/g DS来添加。
44.权利要求29-43任一项的方法，其中α-葡糖苷酶来自植物，优选稻，特别是来自稻(Oryzae sativa)的α-葡糖苷酶。
45.权利要求29-44任一项的方法，其中α-葡糖苷酶来自细菌，优选来自芽孢杆菌属，优选嗜热脂肪芽孢杆菌，特别是在SEQ ID NO：6中给出的嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶。
46.权利要求29-45任一项的方法，其中含淀粉的材料选自块茎、根和整谷物或谷粒；以及这些的任意组合。
47.权利要求29-46任一项的方法，其中含淀粉的材料获自谷类。
48.权利要求29-47任一项的方法，其中含淀粉的材料选自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁和马铃薯；或这些的任意组合。
49.权利要求29-48任一项的方法，其中发酵产品是乙醇。
50.权利要求29-49任一项的方法，其中发酵生物是酵母，如酵母属，特别是酿酒酵母。
51.权利要求29-50任一项的方法，其中含淀粉的材料是整谷物或谷粒，并且所述方法在步骤(a)之前包含粉碎所述整谷物或谷粒的步骤。
52.权利要求29-51任一项的方法，其中含淀粉的材料可通过包括粉碎整谷物或谷粒的方法而获得。
53.权利要求29-52任一项的方法，在步骤a)之前进一步包含下列步骤：
x)减小含淀粉材料的粒度；
y)形成含有所述材料和水的浆液。
54.权利要求29-53任一项的方法，其中减小含淀粉的材料的粒度，优选通过粉碎。
55.权利要求54的方法，其中所述粉碎是干磨步骤。
56.权利要求54的方法，其中所述粉碎是湿磨步骤。
57.权利要求29-56任一项的方法，其中含淀粉的材料是来自淀粉加工的支流。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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