CN103608460B

CN103608460B - 用于产生发酵产物的工艺

Info

Publication number: CN103608460B
Application number: CN201180068324.3A
Authority: CN
Inventors: R.德因哈默; S.克拉克; M.奎罗斯; J.马修斯; A.G.朱尔曼德; C-L.宋; 松井知子; 高木忍
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: US20210017546A1; US20240102056A1; US11499170B2; EP2654567A2; US20210040510A1; CA2822637A1; US20230265462A1; EP2654567B1; US11840718B2; US11566266B2; US10941422B2; US9816112B2; CA2822637C; US10947567B2; ES2673940T3; WO2012088303A2; US20190271011A1; US20140017749A1; CN103608460A; WO2012088303A3

Abstract

本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其中在液化过程中存在和/或添加热稳定性α‑淀粉酶和任选的热稳定性蛋白酶。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。

Description

用于产生发酵产物的工艺

技术领域

本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。

涉及序列表

本发明包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

发明背景

从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇在本领域是公知的。在产业上，目前使用两种不同种类的工艺。最常用的工艺，通常称作“常规工艺”，包括通常使用细菌α-淀粉酶在高温液化糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同步糖化和发酵(SSF)。另一种公知的工艺，通常称作“生淀粉水解”工艺(RSH工艺)，包括在起始糊化温度以下，通常在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下，同时糖化和发酵粒状淀粉。

虽然在过去十年中发酵产物产生工艺显著改善，但显著量的剩余淀粉物质并未转化为所需的发酵产物如乙醇。至少一些未转化的剩余淀粉物质例如糖和糊精为不可发酵的Maillard产物的形式。

因此，仍然存在对提供下述用于从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺的需要，所述工艺可与常规工艺相比提供更高的发酵产物产率。

发明内容

本发明涉及使用发酵生物从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。

在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺，其包括下述步骤：

i)在80至90℃范围的温度在4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)；

-任选地，蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的；

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

在一个实施方案中，在步骤i)的液化过程中存在和/或添加糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或普鲁兰酶(pullulanase)。

在一个第二个方面，本发明涉及组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中

i)所述α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)；和

ii)所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定的超过20%的热稳定性值。

在一个实施方案中，所述组合物进一步包含糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或普鲁兰酶。

在一个实施方案中，在液化步骤i)过程中存在和/或添加第二α-淀粉酶。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含：

i)α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)；

ii)蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的，且该蛋白酶来源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和/或橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)；和任选的

iii)葡糖淀粉酶，其来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)

在一个实施方案中，所述组合物包含第二α-淀粉酶。

附图说明

图1显示用α-淀粉酶1407、并且用或不用蛋白酶Pfu或葡糖淀粉酶PE001，在pH4.8制备的用于液化(85℃)的54小时的乙醇的比较。

图2显示对于实施例10中的实验在32%DS的峰值和断裂粘度(break viscosity)，其比较了

-α-淀粉酶A(1.4微克)(pH5.8)；

-α-淀粉酶1407(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8)；

-α-淀粉酶A(0.35微克)+α-淀粉酶1407(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8)；

-α-淀粉酶A(0.7微克)+α-淀粉酶1407(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8)；

图3显示了对于实施例10中的实验在32℃在32%DS的最终粘度，其比较了：

-α-淀粉酶A(1.4微克)(pH5.8)；

-α-淀粉酶A(0.7微克)+α-淀粉酶1407(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8).

图4显示了对于实施例10中的实验在32%DS的峰值和断裂粘度，其比较了α-淀粉酶A(1.4微克)(pH5.8)和α-淀粉酶A(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8)。

图5显示了对于实施例10中的实验在32℃在32%DS的最终粘度，比较了α-淀粉酶A(1.4微克)(pH5.8)和α-淀粉酶A(1.4微克)+葡糖淀粉酶PE001(10微克)+蛋白酶196(1微克)(pH4.8).

发明详述

本发明人显示了本发明的工艺具有多种优点。如实施例中所示，本发明的工艺导致较高的乙醇产率。其它益处包括对使用H₂SO₄调整pH的需求减少。这导致DDGS中的下游的硫更少，前端沾污(front end fouling)更少，啤酒石(beerstone)更少，且植酸沉淀更少。

本发明的工艺亦导致糖和糊精损失为Maillard产物的减少。DDGS的颜色得到改善，且热交换器寿命(较少的固体)得到延长。此外，由于所用的酶的较高热稳定性，可减少酶剂量。本发明的工艺仅需对现存工艺和工艺设备进行有限的变化，因此仅需有限的资金投入。

由于在液化中存在如本文中定义的热稳定性α-淀粉酶和第二α-淀粉酶，(进一步)减少了例如浆料罐(slurry tank)中的峰值粘度。这导致混合消耗的能量减少。而且，具有较低的平均粘度可改善浆料罐中醪/淀粉的混合，及其在整个液化工艺中的抽运(pumping)。

在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

i)在80℃至90℃范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述酶来液化含淀粉材料：

-任选的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的；

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

在一个优选实施方案中，步骤ii)和iii)顺序或同时进行。在液化步骤i)之前和/或之中可添加热稳定性α-淀粉酶，和任选的热稳定性蛋白酶，以及任选的糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的普鲁兰酶。热稳定性α-淀粉酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶”部分。热稳定性蛋白酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的蛋白酶”部分。本发明的组合物可合适地在本发明的工艺中使用。然而亦可分别添加酶组分。

在一个优选实施方案中，在液化过程中的pH为4.5至4.8。

在一个实施方案中，在液化过程中亦存在糖源生成酶。在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶。在一个实施方案中，所述糖源生成酶不同于在步骤ii)中的糖化和/或步骤iii)中的发酵过程中使用的糖源生成酶。

“糖源生成酶”的实例，包括特别是葡糖淀粉酶，可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。热稳定性葡糖淀粉酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分。

在一个实施方案中，本发明的工艺进一步在步骤i)之前包括下述步骤：

a)降低含淀粉材料的粒度，优选通过干磨；

b)形成包含含淀粉材料和水的浆料。

所述含淀粉材料如全谷粒可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。通常存在两种方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨提供胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的地方。干磨和湿磨在淀粉加工领域是已知的。根据本发明，优选干磨。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更加优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛目(screen)，优选0.1到0.5mm筛目的筛。在另一个实施方案中，至少50%，优选至少70%，更优选至少80%，特别是至少90%的含淀粉材料可穿过具有#6筛目的筛。

水性浆料可含有10-55w/w%干固形物(DS)，优选25-45w/w%干固形物(DS)，更优选30-40w/w%干固形物(DS)的含淀粉材料。将浆料加热到糊化温度以上，优选80至90℃，pH4.5至4.8，进行约15至60分钟。

可将热稳定性α-淀粉酶，任选的热稳定性蛋白酶和任选的糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的普鲁兰酶添加至所述水性浆料以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中，仅将一部分酶共混物(本发明的组合物)添加至所述水性浆料，而将剩余的酶在液化步骤i)过程中添加。液化步骤i)通常在80至90℃，pH4.5至4.8进行1至3小时。

在一个实施方案中，在进行步骤(a)中的液化之前，所述水性浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使浆料糊化。所述喷射蒸煮可在110至145℃，优选120至140℃，如125至135℃，优选约130℃的温度进行约1至15分钟，优选约3至10分钟，特别是约5分钟左右。

糖化和发酵

在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在和/或添加一种或多种糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶可优选为葡糖淀粉酶，但亦可为选自下组的酶：β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶。

糖源生成酶包括葡糖淀粉酶的实例，可见于下文“在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。

当进行顺序糖化和发酵时，糖化步骤ii)可使用本领域中公知的条件进行。举例而言，糖化步骤ii)可持续约24至约72小时，然而经常仅在30至65℃，通常约60℃的温度进行通常40至90分钟的预糖化，接着在同步糖化和发酵(“SSF”)中在发酵过程中进行糖化。糖化通常在20至75℃，优选40至70℃，通常60℃左右的温度，和在4至5的pH，正常约pH4.5进行。

同步糖化和发酵(“SSF”)广泛用于产业规模的发酵产物产生工艺，特别是乙醇产生工艺。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。对于糖化无保持阶段，意指发酵生物如酵母和酶可一同添加。SSF根据本发明通常在25℃至40℃，约28℃至35℃，如30℃至34℃，优选大约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施方案中，pH为3.5至5，特别是3.8至4.3。

发酵培养基

发酵培养基(″Fermentation media″或″fermentation medium″)指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。发酵培养基可包含对于发酵生物的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质，或其组合。

发酵生物

术语“发酵生物”指任何适用于发酵工艺并能够产生所需发酵产物的生物，包括细菌生物和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将糖，如葡萄糖或麦芽糖，直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物，如乙醇。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)的菌株。

在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰的范围内，特别是约5x10⁷。

商业上可获得的酵母包括，例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从GertStrand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。起始材料通常基于所需的发酵产物而选择。适用于本发明的工艺的含淀粉材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆类(peas)、豆类(beans)或甘薯，或其任意混合物，或从其来源的淀粉，或谷类。亦涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指由包括使用发酵生物的发酵步骤的工艺产生的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇)；有机酸(例如柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B₁₂，β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。所用的优选发酵工艺包括醇类发酵工艺。根据本发明获得的发酵产物如乙醇，可优选地用作燃料，其通常与汽油混合。然而，在乙醇的情况下，其亦可用作可饮用的乙醇。

回收

在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提或其它本领域公知的方法来回收。

在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，在液化过程中存在和/或添加热稳定性α-淀粉酶，热稳定性α-淀粉酶任选地与热稳定性蛋白酶，和任选地与糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选地与普鲁兰酶一同存在和/或添加。根据本发明，α-淀粉酶在pH4.5至5.0的液化中对淀粉溶解具有高活性，且在pH4.5至5.0和80℃至90℃，优选pH4.5至4.8，85℃左右具有高热稳定性。

更具体而言，用于本发明的工艺的α-淀粉酶，如实施例1中所述确定，在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)。

在一个优选实施方案中，在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂的T 1/2(min)为至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70，如15-70，如20-70，如25-70，如30-70，如40-70，如50-70，如60-70。

在一个实施方案中所述热稳定性α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。

在本发明的一个实施方案中所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如作为SEQ ID NO:3公开于WO 99/019467或本文中的SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有双重缺失I181+G182和取代N193F，进一步包括下述突变:

-V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;
	-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N;
	-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L;
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K;
	-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F;
-V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
	-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
	-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K;
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F;

-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N;
	-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V;
	-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;
	-A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
-E129V+K177L+R179E;
	-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M;
	-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T;
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376+I377;
	-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T;
	-E129V+K177L+R179E+S242Q;
-E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S;
	-K220P+N224L+S242Q+Q254S;
-M284V.

所述热稳定性α-淀粉酶可为截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，优选具有大约491个氨基酸。

在液化过程中存在和/或添加的第二α-淀粉酶

当在液化步骤i)过程中存在和/或添加第二α-淀粉酶时，获得了积极的粘度减少作用。如从实施例10可见，热稳定性α-淀粉酶(例如α-淀粉酶BE1407)在热稳定性蛋白酶(例如蛋白酶196)和热稳定性葡糖淀粉酶(例如葡糖淀粉酶PO)和其他的第二α-淀粉酶(例如α-淀粉酶A)存在或不存在下的组合导致减少的峰值粘度和最终粘度。

因此，在本发明的该方面，在液化步骤i)过程中添加第二α-淀粉酶。所述第二α-淀粉酶与根据本发明在液化过程中添加和/或存在的本文中定义的热稳定性α-淀粉酶相比，在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂，或大约pH4.8可能热稳定性较低，和/或效率较低。

在一个实施方案中所述第二α-淀粉酶是细菌来源的。

在一个实施方案中所述第二α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属的菌株，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的变体。所述第二α-淀粉酶可为截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，优选具有大约491个氨基酸。

在一个实施方案中第二α-淀粉酶与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性。

在一个实施方案中，如实施例1中所述的方式确定，所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有低于10的T 1/2(min)。

在一个实施方案中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有低于8，如低于7，如低于6，如低于5的T 1/2(min)。

在一个实施方案中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有2至10，如3至8，如高于4至10，如高于4至8的T 1/2(min)。

在一个实施方案中所述第二α-淀粉酶可来源于嗜热脂肪芽孢杆菌并且可具有下述突变：I181*+G182*或I181*+G182*+N193F(使用SEQ ID NO:1来编号)。

在一个实施方案中，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

i)在80至90℃范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)和进一步的第二α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有少于10的T 1/2(min)；

-蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的；

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

在液化过程中存在和/或添加的蛋白酶

根据本发明热稳定性蛋白酶可在液化过程中与热稳定性α-淀粉酶，和任选地糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选地普鲁兰酶一同存在和/或添加。

用于本发明的工艺的蛋白酶具有：

i)作为80℃/70℃的相对活性确定的超过20%的热稳定性值；和/或

ii)作为85℃/70℃的相对活性确定的超过10%的热稳定性值。

在一个实施方案中所述蛋白酶具有下述热稳定性值：

-作为80℃/70℃的相对活性确定的热稳定性值超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%；和/或

-作为85℃/70℃的相对活性确定的热稳定性值超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%，超过25%；和/或

-作为80℃的剩余活性确定的热稳定性值超过20%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%；和/或

-作为84℃的剩余活性确定的热稳定性值超过20%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%和/或。

如使用实施例3中公开的玉米醇溶蛋白-BCA测定法确定的，纯化的变体在85℃具有高于90，高于100的热稳定性。

“相对活性”和“剩余活性”的确定如实施例2中所述确定。

蛋白酶基于其催化机理归类为下述组：丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)，和未知的，即尚未归类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(编)，Academic Press(1998)，特别是序言(general introduction)部分。

在一个优选实施方案中用于本发明的工艺的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)，优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。

为了确定给定蛋白酶是否金属蛋白酶，参见上述“Handbook of ProteolyticEnzymes”和其中指示的原理。此种确定可对于所有类型的蛋白酶进行，无论其为天然存在的或野生型蛋白酶，或遗传工程的或合成的蛋白酶。

蛋白酶活性可使用任何合适的测定法来测量，其中使用含有与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键的底物。同样可对于所讨论的蛋白酶适用测定pH(assay-pH)和测定温度(assay-temperature)。测定pH值的实例为pH6，7，8，9，10，或11。测定温度的实例为0，35，37，40，45，50，55，60，65，70或80℃。

蛋白酶底物的实例是玉米醇溶蛋白，如天青精交联的玉米醇溶蛋白(AZCL-酪蛋白)。两种蛋白酶测定法描述于下文“材料和方法”部分，其中所谓“AZCL-酪蛋白测定法”(AZCL-酪蛋白测定法)是优选的测定法。

在一个实施方案中，通过所述AZCL-酪蛋白测定法测定，所述蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的活性的至少20%，如至少30%，如至少40%，如至少50%，如至少60%，如至少70%，如至少80%，如至少90%，如至少100%。

对于本文中的工艺中使用的蛋白酶的来源并无限制，只要其满足上文定义的热稳定性质。所述蛋白酶可为例如野生型蛋白酶的变体，只要所述蛋白酶具有上文定义的热稳定性质。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶是如上文定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施方案中用于本发明的工艺的蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选橙橘嗜热子囊菌的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(归类为EC3.4.24.39)的菌株的真菌金属蛋白酶。

在一个实施方案中所述蛋白酶变体与公开于WO 2003/048353的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文中的SEQ ID NO:3具有至少75%同一性，优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。

在一个实施方案中所述蛋白酶是显示于公开于WO 2003/048353的SEQ ID NO:2的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分和本文中显示为SEQ ID NO:3的变体，具有下述突变：

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。

在一个实施方案中在液化步骤i)过程中存在和/或添加的热稳定性蛋白酶来源于火球菌属(Pyrococcus)的菌株，如激烈火球菌的菌株。在一个实施方案中所述蛋白酶是美国专利号6,358,726-B1(Takara Shuzo Company)中显示为SEQ ID NO:1的蛋白酶。在另一个实施方案中，所述蛋白酶是公开于本文中的SEQ ID NO:13的蛋白酶，或与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13具有至少80%同一性，如至少85%，如至少90%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%的同一性的蛋白酶。所述激烈火球菌蛋白酶可购自Takara Shuzo Co.Ltd，Japan。

激烈火球菌蛋白酶是热稳定性蛋白酶。发现商品激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)如本文中实施例2中所述确定在pH4.5具有110%(80℃/70℃)和103%(90℃/70℃)的热稳定性。

在液化过程中存在和/或添加的糖源生成酶

根据本发明糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，在液化过程中与热稳定性α-淀粉酶和任选地热稳定性蛋白酶一同存在和/或添加。如上所讨论，普鲁兰酶亦可在液化步骤i)过程中存在和/或添加。

术语“糖源生成酶”包括任何生成可发酵的糖的酶。糖源生成酶能够产生可以被所讨论的发酵生物用作能量源(例如当用于本发明产生发酵产物如乙醇的过程中时)的糖。可将生成的糖直接或间接地转化为所需的发酵产物，优选乙醇。根据本发明可使用糖源生成酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(其生成葡萄糖)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其生成麦芽糖)。

在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，可以与所述热稳定性α-淀粉酶和任选的所述热稳定性蛋白酶一同或分别添加。

在一个实施方案中所述糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，在85℃具有至少20%，至少30%，优选至少35%的相对活性热稳定性。在一个实施方案中所述糖生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%的相对活性。

在一个具体和优选的实施方案中所述糖源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌来源，如来自青霉属(Penicillium)的菌株，特别是作为WO 2011/127802(其通过提述并入本文)公开的PCT/CN10/071753中作为SEQ ID NO:2公开并在本文中示于SEQ ID NO:9或14的草酸青霉的菌株。

在一个优选实施方案中所述糖源生成酶是作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中作为SEQ ID NO:2公开并示于本文中的SEQ ID NO:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，其具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。所述K79V葡糖淀粉酶变体相对于在共同待决的美国申请号61/531,189(其通过提述并入本文)中公开的亲本，对蛋白酶降解的敏感度降低。

在一个具体实施方案中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来源于青霉素的菌株，特别是作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中公开的草酸青霉的菌株。所述葡糖淀粉酶亦可为葡糖淀粉酶，其与作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中的SEQID NO:2中显示并在本文中显示为SEQ ID NO:9和14的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。

在液化过程中存在和/或添加的普鲁兰酶

任选地，可在液化步骤i)过程中与热稳定性α-淀粉酶和任选地热稳定性蛋白酶一同存在和/或添加普鲁兰酶。如上文所提及的，糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，亦可在液化步骤i)过程中存在和/或添加。

所述普鲁兰酶可在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同步糖化和发酵过程中存在和/或添加。

普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖水解酶)是以水解α-1,6-糖苷键，例如支链淀粉(amylopectin)和普鲁兰(pullulan)中的α-1,6-糖苷键的能力为特征的脱支酶。

根据本发明涵盖的普鲁兰酶包括公开于美国专利号4,560,651(通过提述并入本文)的来自Bacillus amyloderamificans的普鲁兰酶，在WO 01/151620(通过提述并入本文)中作为SEQ ID NO:2公开的普鲁兰酶，在WO 01/151620(通过提述并入本文)中作为SEQID NO:4公开的Bacillus deramificans，和在WO 01/151620(通过提述并入本文)中作为SEQ ID NO:6公开且亦描述于FEMS Mic.Let.115:97-106(1994)的来自Bacillusacidopullulyticus的普鲁兰酶。

根据本发明涵盖的其它普鲁兰酶包括来自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)，特别是来自公开于WO 92/02614的沃氏火球菌DSM No.3773的普鲁兰酶，和本文中作为SEQ IDNO:6公开的成熟蛋白序列。

在一个实施方案中所述普鲁兰酶是家族GH57普鲁兰酶。在一个实施方案中所述普鲁兰酶包含在作为2011/087836(其通过提述并入本文)公开的US61/289,040中公开的X47域。更具体而言，所述普鲁兰酶可来源于热球菌属(Thermococcus)，包括Thermococcuslitoralis和Thermococcus hydrothermalis 的菌株，如在SEQ ID NO:11中所示的Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶，其在X47域(即本文中SEQ ID NO:11和12中的氨基酸1至782)之后紧接着的位点X4处被截短。所述普鲁兰酶亦可为Thermococcuslitoralis和Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶的杂合体，或具有截短位点X4的T.hydrothermalis/T.litoralis杂合酶，其公开于作为WO 2011/087836(其通过提述并入本文)公开的US 61/289,040并公开于SEQ ID NO:12。

所述普鲁兰酶可根据本发明以有效量添加，其包括约0.0001-10mg酶蛋白每克DS，优选0.0001-0.10mg酶蛋白每克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白每克DS的优选量。普鲁兰酶活性可作为NPUN确定。用于确定NPUN的测定法描述于下文“材料和方法”部分。

合适的商业上可获得的普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D，PROMOZYME^TMD2(Novozymes A/S，Denmark)，OPTIMAX L-300(Genencor Int.，USA)，和AMANO8(Amano，Japan)。

在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的糖源生成酶

根据本发明糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加。

在一个优选实施方案中所述糖源生成酶是真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属(Aspergillus)，优选黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)的菌株；或木霉属(Trichoderma)，优选里氏木霉(T.reesei)的菌株；或踝节菌属(Talaromyces)，优选埃默森踝节菌(T.emersonii)的菌株。

葡糖淀粉酶

根据本发明在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶可来源于任何合适来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如公开于WO 92/00381，WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO 84/02921的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.55(4):941-949(1991))，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8:575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301:275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry35:8698-8704；和在位置A435和S436导入Pro残基(Li等，1997，Protein Eng.10:1199-1204。

其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等，1998,“Purificationand properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticiumrolfsii，Appl.Microbiol.Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。在一个优选实施方案中，在糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中公开的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)，均在WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，或PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。根据本发明亦涵盖了杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO 2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。

在一个实施方案中所述葡糖淀粉酶来源于密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别是如作为WO 2011/066576公开的US 61/264,977中所述的密孔菌属菌株(SEQ ID NO:2，4或6)，或来自Gloephyllum属的菌株，特别是作为WO 2011/068803公开的US 61/406,741中所述的Gloephyllum的菌株(SEQ ID NO:2，4，6，8，10，12，14或16)，或黑层孔菌属(Nigrofomes)的菌株，特别是公开于US 61/411,044或PCT/US10/058375的黑层孔菌属菌种(Nigrofomes sp.)的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过提述并入本文)。亦涵盖这样的葡糖淀粉酶，其与任何上述提及的葡糖淀粉酶呈现高同一性，即与任何一个上述提及的酶序列的成熟部分至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。

亦涵盖这样的葡糖淀粉酶，其与任何上述提及的葡糖淀粉酶呈现高同一性，即与上述提及的成熟酶序列至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。

在一个实施方案中，葡糖淀粉酶可以以0.0001-20 AGU/g DS，优选0.001-10AGU/gDS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS的量添加。

包含葡糖淀粉酶的商业上可获得的组合物包括AMG200L；AMG300L；SAN^TMSUPER，SAN^TMEXTRA L，SPIRIZYME^TMPLUS，SPIRIZYME^TM FUEL，SPIRIZYME^TMB4U，SPIRIZYME^TMULTRA，SPIRIZYME^TMECXEL 和AMG^TME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM300，GC480，GC417(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900，G-ZYME^TM和G990ZR(来自Genencor Int.)。

产麦芽糖淀粉酶

在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的糖源生成酶亦可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解为α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可从Novozymes A/S获得。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述产麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

包含α-淀粉酶和蛋白酶的组合物

本发明的组合物包含热稳定性α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶。所述组合物亦可任选地包含热稳定性糖源生成酶，还可任选地包含普鲁兰酶。

因此，在该方面本发明涉及这样的组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中

i)α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有至少10的T 1/2(min)；

ii)蛋白酶，其其具有作为80℃/70℃的相对活性确定的超过20%的热稳定性值。

所述组合物任选地还包含糖源生成酶。所述糖源生成酶可为热稳定性葡糖淀粉酶，其在85℃具有至少20%，至少30%，优选至少35%的相对活性热稳定性。

所述热稳定性α-淀粉酶优选为细菌α-淀粉酶，特别是芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ IDNO:3或本文中的SEQ ID NO:1所示的变体。α-淀粉酶变体在上文“在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶”部分进一步描述。所述α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)可具有至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70，如15-70，如20-70，如25-70，如30-70，如40-70，如50-70，如60-70的T 1/2(min)。

在一个实施方案中所述α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，特别是截短的为491个氨基酸长，具有选自下组的突变的变体：

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；和

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文中的SEQ ID NO:1进行编号)。

应理解的是这些α-淀粉酶仅为具体实例。任何上文中在“在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶”部分公开的α-淀粉酶可用作本发明的组合物中的α-淀粉酶组分。

所述蛋白酶具有下述的热稳定性：

i)作为80℃/70℃的相对活性确定的热稳定性为超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%；或

ii)作为在85℃/70℃的相对活性确定的热稳定性为超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%，超过25%。

在一个实施方案中所述蛋白酶是SEQ ID NO:3中所示的金属蛋白酶的变体，其来源于橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。

在一个具体的优选实施方案中，所述蛋白酶是作为公开于WO 2003/048353的SEQID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文中的SEQ IDNO:3公开的、来源于橙橘嗜热子囊菌的金属蛋白酶的变体，其具有选自下组的突变：

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；和

-D79L+S87P+D142L。

在另一个优选实施方案中，所述蛋白酶来源于激烈火球菌的菌株，如美国专利号6,258,726中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶。

在另一个方面，所述蛋白酶是公开于本文中的SEQ ID NO:1的蛋白酶，或蛋白酶，其与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13具有至少80%同一性，如至少85%，如至少90%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%的同一性。所述激烈火球菌蛋白酶可购自Takara Shuzo Co.Ltd，Japan。

所述激烈火球菌蛋白酶是热稳定性蛋白酶。发现商品激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)如本文中实施例2中所述确定在pH4.5具有110%(80℃/70℃)和103%(90℃/70℃)的热稳定性。

应理解的是，这些蛋白酶仅为实例。任何上文中在“在液化过程中存在和/或添加的蛋白酶”部分公开的蛋白酶可用作本发明的组合物中的蛋白酶组分。

本发明的组合物可任选地进一步包含糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，其在85℃，pH5.3具有至少30%，优选至少35%的热稳定性。

在一个优选实施方案中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%的相对活性。

在一个优选实施方案中糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%的pH稳定性。

热稳定性和pH稳定性的确定描述于实施例4。

在一个具体实施方案中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来源于青霉属的菌株，特别是草酸青霉的菌株，其公开于作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753。所述葡糖淀粉酶亦可为葡糖淀粉酶，其与作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中的SEQID NO:2中所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。

在一个优选实施方案中所述糖源生成酶是草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，其在作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中作为SEQ ID NO:2公开，并示于本文中的SEQ IDNO:9和14，具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。所述K79V葡糖淀粉酶变体相对于公开于共同待决的美国申请号61/531,189(其通过提述并入本文)的亲本对蛋白酶降解具有减少的敏感度。

本发明的组合物可进一步包含普鲁兰酶。在一个优选实施方案中，所述普鲁兰酶包含如公开于作为WO 2011/087836(其通过提述并入本文)公开的US 61/289,040的X47域。

具体而言，所述普鲁兰酶可来源于热球菌属，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的菌株，或其杂合体。

所述普鲁兰酶可为Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶，其在位点X4截短，或其可为Thermococcus hydrothermalis/T.litoralis杂合酶，其具有截短位点X4，如公开于作为WO 2011/087836公开的US 61/289,040或示于本文中的SEQ ID NO:12。

在一个实施方案中本发明涉及组合物，其包含：

i)α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有至少10的T 1/2(min)，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌；

ii)蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的，来源于激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌；和任选地

iii)葡糖淀粉酶，其来源于草酸青霉。

所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌蛋白酶和/或草酸青霉葡糖淀粉酶可为任何上述提及的实施方案。

在一个实施方案中所述组合物包含第二α-淀粉酶，其在pH 4.5，85℃，0.12 mMCaCl₂)具有小于10的T 1/2(min)，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。

在一个实施方案中本发明的植物中组分之间的酶蛋白的比例可为：

α-淀粉酶:葡糖淀粉酶:蛋白酶:0.1-10:0.5-50:0.1-7，如0.5-3:1-30:0.5-2，如1-2:5-20:0.5-2。

本发明的组合物的用途

在最后一个方面，本发明涉及本发明的植物在液化工艺中的用途。在一个实施方案中液化是本发明的工艺的步骤。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。

本文中引用了多个参考文献，其公开通过全文提述并入本文。

材料和方法

材料：

α-淀粉酶A：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F，截短至491个氨基酸(SEQ ID NO: 1)

α-淀粉酶1093：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E，截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1)

α-淀粉酶1407：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S，截短至491个氨基酸(SEQ IDNO:1)

α-淀粉酶1236：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S，截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1)

蛋白酶136：金属蛋白酶，其来源于橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670，作为本文中的SEQ ID NO:3中的氨基酸1-177和在WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2中的氨基酸1-177公开，具有下述突变：D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L

蛋白酶196：金属蛋白酶，其来源于橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670，作为本文中的SEQ ID NO:3中的氨基酸1-177和在WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2中的氨基酸1-177公开，具有下述突变：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

蛋白酶077：金属蛋白酶，其来源于橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670作为本文中的SEQ ID NO:3中的氨基酸1-177和在WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2中的氨基酸1-177公开，具有下述突变：A27K+D79L+S87P+A112P+D142L。

蛋白酶Pfu：蛋白酶，其来源于激烈火球菌，其作为Pfu蛋白酶S(活性10.5mg/mL)购自Takara Bio Inc.(日本)，并亦显示于本文中的SEQ ID NO:13。

葡糖淀粉酶PO：草酸青霉葡糖淀粉酶的成熟部分，其作为在作为WO 2011/127802公开的PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2公开，并显示于本文中的SEQ ID NO:9和14。

葡糖淀粉酶PE001：草酸青霉葡糖淀粉酶具有K79V取代的变体，其使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号。

葡糖淀粉酶BL：埃默森踝节菌葡糖淀粉酶(作为SEQ ID NO:7公开于WO 99/28448)和瓣环栓菌葡糖淀粉酶(公开于WO 06/069289)约9:1比例的共混物。

葡糖淀粉酶BL2：共混物，其包含埃默森踝节菌葡糖淀粉酶(公开于WO 99/28448)，瓣环栓菌葡糖淀粉酶(公开于WO 06/69289)和作为副活性(side activity)的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶(其具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD，在WO 2006/069290中的表5中作为V039公开)，比例为约65:15:1。

实施例9中的底物：来自Corn LP，Iowa，USA(84.19%DS)和回糟(backset)(6.27%DS)的磨碎的玉米。

普鲁兰酶TH：普鲁兰酶，其来自Thermococcus hydrothermalis，示于本文中的SEQID NO:11。

酵母：RED STAR ETHANOL RED^TM，其可从Red Star/Lesaffre，USA获得。

方法

同一性：两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的关系通过参数“同一性”描述。

就本发明而言，两种氨基酸序列之间的同一性程度以及两种核苷酸序列之间的同一性程度可通过程序“比对(align)”来确定，其为Needleman-Wunsch比对(即全局比对)。该程序用于比对多肽以及核苷酸序列。对于多肽比对使用缺省的评分矩阵BLOSUM50，而对于核苷酸比对使用缺省的同一性矩阵。对于间隔的第一残基的罚分对于多肽是-12，而对于核苷酸是-16。对于间隔的其它残基的罚分对于多肽是-2，而对于核苷酸是-4。

“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见Pearson和Lipman，1988，″ImprovedTools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85:2444-2448，和Pearson，1990，″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP和FASTA,″Methods inEnzymology183:63-98)。FASTA蛋白比对使用Smith-Waterman算法，对间隔大小无限制(参见″Smith-Waterman algorithm″，Smith和Waterman，1981，J.Mol.Biol.147:195-197)。

蛋白质测定法

AZCL-酪蛋白测定法

将0.2%蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液搅拌悬于硼砂/NaH₂PO₄缓冲液pH9中。一边搅拌一边将所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器中在45℃和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100℃煮沸20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4℃以3000rpm离心5分钟来将有色溶液与固体分开。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测量在595nm的吸光度。

pNA测定法

将50μL蛋白酶样品添加至微滴定板，并通过添加100μL 1mM pNA底物(5mg溶于100μL DMSO，并进一步用硼砂/NaH₂PO₄缓冲液pH9.0稀释至10mL)来起始所述测定。监测OD₄₀₅在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)量度。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M;0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可应要求由Novozymes A/S,Denmark得到，该文件夹通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性(KNU)

淀粉分解活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glass standard)进行比较。

一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；以及pH5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质Merck Amylum Solubile所需的酶量。

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可应对Novozymes A/S,Denmark要求而获得，该文件夹通过提述并入本文。

普鲁兰酶活性(NPUN)的确定

以NPUN表示的内切-普鲁兰酶活性相对于Novozymes普鲁兰酶标准测量。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7%红色普鲁兰(Megazyme)，pH5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶的量。该活性使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量。

将1mL稀释的样品或标样在40℃温育2分钟。添加0.5mL2%红色普鲁兰，0.5M KCl，50mM柠檬酸pH5，并混合。将试管在40℃温育20分钟，并通过添加2.5ml80%乙醇来终止。将试管静置于室温10至60分钟，接着以4000rpm离心10分钟。然后在510nm测量上清的OD，并使用标准曲线计算活性。

本发明在下述实施例中以更多细节描述，提供所述实施例以说明本发明，但不意欲以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。所有本文中引用的参考文献就其中描述的部分具体地通过提述并入本文。

实施例

实施例1

α-淀粉酶变体的稳定性

如下确定参照α-淀粉酶(嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F，截短至491个氨基酸(SEQ ID NO:1))及其α-淀粉酶变体的稳定性：将参照α-淀粉酶和变体在pH4.5和5.5、及75℃和85℃的温度与0.12mM CaCl₂温育，接着使用EnzChek底物(EnzChekUltra淀粉酶测定试剂盒E33651，Molecular Probes)确定剩余活性。

将纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸，0.01%Triton X100，0.12mM CaCl₂，pH5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并将180微升稳定缓冲液(150mM乙酸，150mM MES，0.01%Triton X100，0.12mMCaCl₂，pH4.5或5.5)添加至每个孔并混合。测定使用两个浓度的酶进行一式两次。在75℃或85℃温育之前，移取20微升并储藏于冰上作为对照样品。温育在PCR机器中在75℃和85℃进行。在温育之后，将样品在剩余活性缓冲液(100mM乙酸，0.01%Triton X100，0.12mM CaCl₂，pH5.5)中稀释至15ng/mL，并将25微升稀释的酶转移至黑色384-MTP。使用EnzChek底物测定剩余活性，将25微升底物溶液(100微克/ml)添加至每个孔。使用485-P nm的激发滤镜和555nm的发射滤镜每分钟测定荧光，持续15分钟(荧光读数器为Polarstar，BMG)。对于每个设定，将剩余活性针对对照样品归一化。

使用下述方程计算假定的对数衰减半寿期时间(assuming logarithmic decayhalf life time)：T 1/2(min)=T(min)*LN(0.5)/LN(%RA/100)，其中T是以分钟计的测定温育时间，而%RA是测定中确定的%剩余活性。

使用该测定设定，对于参照α-淀粉酶和变体确定了半寿期时间，其如表1所示。

表1

ND：未确定

结果说明α-淀粉酶变体与参照α-淀粉酶相比具有显著更高的半衰期和稳定性。

实施例2

蛋白酶变体的制备和热稳定性测试

使用的化学品为至少试剂级的商品。

菌株和质粒：

将大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。pJTP000是在TPI启动子调控下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，其从WO 01/92502中所述的pJC039构建，其中插入了橙橘嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03/048353)。

酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his4-539用于蛋白酶变体表达。其描述于J.Biol.Chem.272(15),pp9720-9727,1997中。

培养基和底物

10X基础溶液：不含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/L，琥珀酸100g/l，NaOH60g/l。

SC-葡萄糖：20%葡萄糖(即2%的最终浓度=2g/100mL))100mL/L，5%苏氨酸4mL/L，1%色氨酸10ml/l，20%酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。将溶液使用0.20微米孔径的过滤器灭菌。琼脂(2%)和H₂O(大约761mL)一同高压灭菌，并将分别灭菌的SC-葡萄糖溶液添加至琼脂溶液。

YPD：Bacto蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/L，20%葡萄糖100mL/L。

YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO₄。

PEG/LiAc溶液：40%PEG400050ml，5M乙酸锂1mL。

96孔玉米醇溶蛋白微滴定板：

每个孔含有200微升的20mM乙酸钠缓冲液pH4.5，其中含0.05-0.1%的玉米醇溶蛋白(Sigma)，0.25mM ZnSO₄和1%的琼脂。

DNA操作

除非另行声明，DNA操作和转化使用如Sambrook等(1989)Molecular cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等(编)″Current protocols in Molecular Biology″,John Wiley and Sons,1995；30Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编)中所述的分子生物学的标准方法进行。

酵母转化

酵母转化使用乙酸锂方法进行：将0.5微升的载体(通过限制性内切核酸酶消化)和1微升的PCR片段混合。将DNA混合物，100微升的YNG318感受态细胞，和10微升的YEASTMAKER载体DNA(Clontech)添加至12mL聚丙烯管(Falcon2059)。添加0.6mL PEG/LiAc溶液并轻柔地混合。在30℃和200rpm温育30分钟，接着在42℃温育30分钟(热激)。将其转移至eppendorf管并离心5秒。移除上清，并溶解于3mL的YPD。将细胞悬液在30℃在200rpm温育45分钟。将悬液倾至SC葡萄糖平板，并在30℃温育3日以生长菌落。通过Zymoprep酵母质粒小提试剂盒(ZYMO Research)提取酵母总DNA。

DNA测序

用于DNA测序的大肠杆菌转化通过电穿孔进行(BIO-RAD Gene Pulser)。DNA质粒通过碱法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或用Qiagen质粒试剂盒制备。从琼脂糖凝胶通过Qiagen凝胶提取试剂盒回收DNA片段。PCR使用PTC-200DNA Engine进行。用ABI PRISMTM310Genetic Analyzer确定所有的DNA序列。

蛋白酶表达载体的构建

用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得的PCR片段与pJC039载体一同导入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502)，用限制性酶消化该载体以去除特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶基因。

将SC-葡萄糖平板上的酵母克隆中的质粒回收以确认内部序列，并将其命名为pJTP001。

酵母文库和定位变体的构建

酵母中的文库和定位变体通过SOE PCR方法(通过重叠延伸的剪接，参见“PCR:Apractical approach”,p.207-209,Oxford University press,编者McPherson,Quirke,Taylor)，接着进行酵母体内重组来构建。

用于扩增和测序的通用引物

使用引物AM34(SEQ ID NO:6)和AM35(SEQ ID NO:7)与简并引物一同通过SOE方法(AM34+反向引物和AM35+正向引物)制备含有任何突变的片段的DNA片段，或仅扩增全蛋白酶基因(AM34+AM35)。

通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化物混合。将混合的溶液导入酿酒酵母以构建文库或通过体内重组构建定位变体。

相对活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至含有YPD+Zn培养基的96孔微滴定板的孔，并在28℃培养3日。将培养上清施于96孔玉米醇溶蛋白微滴定板，并在至少两个温度(例如70℃和80℃)温育超过4个小时或过夜。在平板中玉米醇溶蛋白的浊度作为A630测量，而相对活性(较高温度/较低温度)作为热活性改善的指标确定。选择具有与亲本变体相比更高相对活性的克隆并确定其序列。

残余活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至96孔微滴定板的孔中，并在28℃培养3日。在将培养上清在一定温度(80℃或84℃，以4℃作为参照)在20mM乙酸钠缓冲液pH4.5中温育10分钟之后，在65℃使用Azo-酪蛋白(Megazyme)进行测量蛋白酶活性，以确定残余活性。选择与亲本变体相比具有较高残余活性的克隆，并确定序列。

Azo-酪蛋白测定

将20微升的样品与150微升的底物溶液(4mL含12.5%azo酪蛋白的乙醇，加入96mL含0.01%Triton-100和0.25mM ZnSO₄的20mM乙酸钠pH4.5)混合，并温育4小时或更长时间。

在添加20微升/孔的100%三氯乙酸(TCA)溶液之后，离心平板，并移取100微升的上清以测量A440。

蛋白酶变体在米曲霉中的表达

将包含蛋白酶变体基因的构建体用于构建供曲霉用的表达载体。曲霉表达载体由基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子融合于构巢曲霉丙糖磷酸异构酶未翻译前导序列的表达盒(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)组成。在质粒上还存在来自构巢曲霉曲霉属选择性标志物amdS，其提供以乙酰胺作为唯一氮源生长的能力。将用于蛋白酶变体的表达质粒如Lassen等(2001),Appl.Environ.Microbiol.67,4701-4707中所述转化入曲霉。对于每个构建体，分离了10至20个菌株，将其纯化并培养于摇瓶。

表达的变体的纯化

1.将0.22μm过滤的发酵样品的pH调整为4.0。

2.将样品置于具有磁力搅拌的冰浴上。添加小量等份的(NH₄)₂SO₄(对应于大约2.0至2.2M(NH₄)₂SO₄，不考虑添加化合物时的体积增加)。

3.在(NH₄)₂SO₄最后一次添加之后，将样品在冰浴上以轻柔的磁力搅拌温育最少45分钟。

4.离心：配有R20A2转头的Hitachi himac CR20G高速冷冻离心机，5℃，20000rpm，30分钟。

5.将形成的沉淀物溶解于200mL50mM乙酸钠pH4.0。

6.通过使用0.22微米PES PLUS膜(IWAKI)的真空吸引器过滤样品。

7.使用在冷室中超滤(来自Vivascience的Vivacell250，配置有5kDaMWCO PES膜)过夜将样品脱盐/缓冲液交换至50mM乙酸钠pH4.0。使用50mM乙酸钠pH4.0将渗余物样品稀释至200ml。样品的电导率优选低于5mS/cm。

8.将样品加载于用50mM乙酸钠pH4.0平衡的阳离子交换柱。使用3个柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH4.0)将未结合的样品从柱洗出，并使用线性梯度0-100%洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH4.0)以10个柱体积将样品洗脱。

9.将收集的级分通过内切蛋白酶测定法(参见下文)测定接着对选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切蛋白酶测定法和SDS-PAGE汇集级分。

内切蛋白酶测定法

1.将Protazyme OL片/5ml250mM乙酸钠pH5.0通过磁力搅拌溶解(底物：来自Megazyme的内切蛋白酶Protazyme AK片–cat.#PRAK11/08)。

2.在搅拌下，将250微升的底物溶液转移至1.5mL Eppendorf管。

3.将25微升的样品添加至每个管(空白为样品缓冲液)。

4.将管在Thermomixer上在50℃振荡(1000rpm)温育15分钟。

5.将250微升的1M NaOH添加至每个管，接着进行涡旋。

6.在16,000x G和25℃离心3分钟。

7.将200微升的上清转移至MTP，并记录在590nm的吸光度。

实施例3

使用纯化的酶得到的选择的蛋白酶变体的温度概貌

纯化显示良好热稳定性的选择的蛋白酶变体，并将所述纯化的酶用于如下所述的玉米醇溶蛋白-BCA测定。在所示的高温下将酶温育60分钟之后在60℃确定残余的蛋白酶活性。

玉米醇溶蛋白-BCA测定：

进行玉米醇溶蛋白-BCA测定以检测在不同温度由变体蛋白酶从玉米醇溶蛋白释放的可溶性蛋白定量。

规程：

1)将10微升的10微克/mL酶溶液和100微升的0.025%玉米醇溶蛋白溶液在微滴定板(MTP)中混合。

2)在不同温度温育60分钟。

3)添加10微升的100%三氯乙酸(TCA)溶液。

4)将MTP在3500rpm离心5分钟。

5)取出15微升至新的含有100微升BCA测定溶液的MTP(Pierce批号23225,BCA蛋白质测定试剂盒)。

6)在60℃温育30分钟。

7)测量A562。

结果示于表5。所有测试的蛋白酶变体与野生型(WT)蛋白酶相比显示改善的热稳定性。

表5：玉米醇溶蛋白-BCA测定

实施例4

草酸青霉葡糖淀粉酶的表征

草酸青霉葡糖淀粉酶公开于WO 2011/127802和本文中的SEQ ID NO:9。

底物。底物：去离子水中的1%可溶性淀粉(Sigma S-9765)

反应缓冲液：0.1M乙酸缓冲液，pH5.3

葡萄糖浓度测定试剂盒：Wako葡萄糖测定试剂盒(LabAssay glucose,WAKO,Cat#298-65701)。

反应条件：将20微升可溶性淀粉和50微升乙酸缓冲液(pH5.3)混合，添加30微升酶溶液(50微克酶蛋白/ml)至100微升的终体积，接着在37℃温育15分钟。

葡萄糖浓度通过Wako试剂盒确定。

所有工作平行进行。

最适温度：为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的最适温度，将如上所述的“反应条件”测定在20，30，40，50，60，70，80，85，90和95℃进行，结果示于表6。

表6：最适温度

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下的最适温度是50至70℃，且葡糖淀粉酶在95℃保持超过80%活性。

热稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件测定进行修改，其中将酶溶液和乙酸缓冲液在20，30，40，50，60，70，75，80，85，90和95℃预温育15分钟。在温育之后，将20微升的淀粉添加至溶液，并如上所述进行测定。

结果示于表7。

表7：热稳定性

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育15分钟之后在高至70℃时仍稳定，因为其保持超过80%活性。

最适pH。为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的最适pH，将如上所述的反应条件测定在2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0和11.0进行。使用下述缓冲液：100mM琥珀酸，HEPES，CHES，CAPSO，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100，pH用HCl或NaOH调整至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。

结果示于表8。

表8：最适pH

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下在pH5.0具有最高活性。所述草酸青霉葡糖淀粉酶在宽阔的pH范围内具有活性，体现在它在pH2至7保持超过50%活性。

pH稳定性。为了评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件测定修改为将酶溶液(50微克/mL)在使用在最适pH部分描述的缓冲液在具有pH2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.07.0，8.0，9.0，10.0和11.0的缓冲液中预温育20小时。在预温育之后，将20微升可溶性淀粉添加至溶液中至100微升的最终体积，并如上所述进行测定。

结果示于表9。

表9：pH稳定性

根据结果可见，草酸青霉葡糖淀粉酶在预温育20小时之后，在pH3至pH7稳定，且其在pH8减少活性。

实施例5

改进的乙醇产生工艺

醪制备：玉米醪通过在85℃水浴液化2小时来制备。干固体(DS)含量为约30至33%，且回糟比(backset ratio)为约30%。

醪制备：通过称取一定量的磨碎的玉米、回糟和自来水放入Nalgene瓶来制备用于液化的玉米浆料。使用50%w/w NaOH将浆料pH调整至5.80(对照)或使用40%v/v H₂SO₄调整pH至4.50(研究A，B)或4.80(研究C，D，E，F)。使用α-淀粉酶A的对照醪制备为pH5.8。添加等份的酶储液。将瓶盖紧并置入水浴中。在最初30分钟将浆料每5分钟剧烈振荡一次，在此之后每30分钟进行一次，进行总共2小时。将醪在冰浴中立即冷却。然后将尿素和青霉素添加至每个醪以分别达到500和3ppm的浓度。

发酵设定：将醪使用40%H₂SO₄或50%NaOH调整至pH5.0。将大约5g的每种醪转移至预称重的15mL塑料Falcon离心管以供发酵。通常，对于每个处理准备五个重复的发酵。在每个试管盖上钻出小孔以允许发酵过程中的CO₂释放。在醪转移之后，将所有试管重新称重以获得其起始样品重量。然后向每个试管添加100微升的复水的RED STAR ETHANOL RED酵母(通过将5.5g的干酵母称入150mL Erlenmeyer瓶，添加100mL的自来水，并在32℃水浴中搅拌30分钟来复水)，达到0.50AGU/g DS的起始浓度所需的一份稀释的葡糖淀粉酶BL(稀释于去离子水)。将去离子水添加至每个试管，使得添加至每个试管的液体的总体积相对于样品重量是相同的。然后将所有试管重新称重，并置于设为32℃的水浴中。通常允许发酵进行54小时(若无其他说明)。在大约7小时之后，将试管剧烈涡旋，然后在剩余发酵时间中每日涡旋和重新称重两次。在每个试管中每克干固体产生的乙醇的克数从根据下式的重量损失数据来计算：

通常，对于每个处理在54小时的发酵之后取出四个重复的试管以供HPLC分析。将取出的样品用50微升的40%H₂SO₄处理以中止发酵，并彻底涡旋。然后将样品在1460x g下离心10分钟，然后通过0.45微米注射器式滤器过滤入HPLC小瓶。最终对样品进行HPLC分析以对乙醇的量进行定量。

结果

结果的总结提供于表10

表10：每一个酶的剂量均列于括号中，并表示为微克EP/g DS

^*除非另行指明，在54小时时测量

实施例6

使用草酸青霉AMG变体(PE001)的全玉米液化和SSF工艺

将显示对蛋白酶降解减少的敏感度的草酸青霉葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶PO)变体，葡糖淀粉酶PE001，在全玉米液化和淀粉糖化(示于下一节)中测试。对于全玉米液化，将葡糖淀粉酶PE001酶以不同剂量与低pH淀粉酶变体α-淀粉酶1407一同添加。在一些液化中，将葡糖淀粉酶PE001变体与低pH淀粉酶α-淀粉酶1407和热稳定性蛋白酶蛋白酶196一同测试。在所有实验中，液化均使用称为“Lab-O-Mat”的自动化系统来进行。该装置控制温度并提供恒定的混合。其它实验条件为：pH为4.8(对于含有α-淀粉酶1407低pH淀粉酶的液化物(liquefact))或5.8(对于α-淀粉酶A对照)，32%干固体，85℃，总共2小时的时间。酶给料方案示于表11。将液化的醪使用葡糖淀粉酶BL2糖化和发酵(以0.5AGU/克干固体的剂量在32℃进行54小时)。

表11：对于使用葡糖淀粉酶PO蛋白酶切口稳定(nicking stable)变体(即葡糖淀粉酶PE001)进行的三个全玉米液化实验的酶剂量方案。

HPLC定量的乙醇滴度(以克每升计)示于表12。

表12：平均乙醇滴度和相关的标准偏差，以克每升计。蛋白酶196是WO 2011/072191中所述的温度稳定蛋白酶，而α-淀粉酶1407是WO 2011/082425中所述的低pH淀粉酶。

实施例7

蛋白酶Pfu的热稳定性

购自Takara Bio，(日本)的激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性使用如实施例2中相同的方法测试。发现热稳定性(相对活性)在pH4.5为110%(80℃/70℃)和103%(90℃/70℃)

实施例8

使用α-淀粉酶1407和Pfu蛋白酶进行液化所得的乙醇产生

该实验的目的是评估来源于激烈火球菌的蛋白酶Pfu在pH4.8在85℃，2小时的液化过程中的应用性能(application performance)。

液化(Labomat)

每个液化包括磨碎的玉米(84.19%DS)，回糟(6.27%DS)，和自来水，得到100g的总重量，32.50%的干固体(DS)。将回糟以30%w/w总浆料重量混合。起始浆料pH大约为5.2，并在液化之前用40%v/v硫酸调整至pH4.8。所有酶根据下表13中列出的实验设计添加。液化在Labomat中使用下述条件进行：5℃/分钟跃变，跃变17分钟；103分钟保持时间；对于整个运行40rpm；200mL不锈钢罐(canister)。在液化之后，将所有罐在冰浴中冷却，并准备进行基于下文SSF中列出的实验方案的发酵。

同步糖化和发酵(SSF)

将每份醪用50%w/w氢氧化钠或40%硫酸调整至5.0。将青霉素施于每份醪至3ppm的总浓度。准备试管的醪，即向每个15mL预先钻孔的试管(以允许CO₂释放)中加入大约4.5g等份的醪。将试管置于4℃过夜直至翌日早晨。

将所有醪的试管从冷藏处移出，并在恒温培养室中温热至32℃。温热后，马上将葡糖淀粉酶BL2以0.50AGU/g DS加入每个试管的醪，添加水使得所有试管容纳120μL的液体且每个醪样品包含100μL的复水的酵母。复水的酵母通过将5.5g的Fermentis RED STAR混入100mL的32℃自来水至少15分钟来制备。

当随时间监测CO₂重量损失时，将每个单位的生成和损失的CO₂通过下式换算为每克干物质产生的乙醇的克数(g EtOH/gDS)：

HPLC分析

发酵取样在发酵54小时之后通过每次处理取3个试管来进行。每个样品用50μL的40%v/v H₂SO₄灭活，涡旋，在1460×g离心10分钟，并通过0.45μm Whatman PP过滤器过滤。54小时样品不作进一步稀释，用HPLC进行分析。在HPLC分析之前和之中，样品储藏在4℃。

该方法使用对于乙醇的校正标样来对分析物进行定量(%w/v)。使用包括原点的四点校正来进行定量。

当适用时，数据使用JMP软件(Cary，NC)以使用Tukey-Kramer HSD或Dunnett’s进行配对的单因素方差分析(Oneway ANOVA of pairs)来进行分析。代表95%置信水平的误差棒通过将单因素方差分析的标准误差乘以1.96来确立。

表13：试验计划

下文的表14和图1显示结果：

实施例9

使用α-淀粉酶1407和Pfu蛋白酶进行液化所得的乙醇产生

液化(Labomat)

每次液化包括磨碎的玉米(84.19%DS)，回糟(6.27%DS)，和自来水，得到100g的总重量，32.50%的干固体(DS)。将回糟以30%w/w总浆料重量混合。起始浆料pH大约为5.2，并在液化之前用40%v/v硫酸调整至pH4.8。所有酶根据下表13中列出的实验设计添加。液化在Labomat中使用下述条件进行：5℃/分钟跃变，跃变17分钟；103分钟保持时间；对于整个运行40rpm；200mL不锈钢罐(canister)。在液化之后，将所有罐在冰浴中冷却，并准备进行基于下文SSF中列出的实验方案的发酵。

同步糖化和发酵(SSF)

将每份醪用50%w/w氢氧化钠或40%硫酸调整至pH5.0。每份醪中加入青霉素至3ppm的总浓度。准备试管的醪，即向每个15mL预先钻孔的试管(以允许CO₂释放)中加入大约4.5g等份的醪。将试管置于4℃过夜直至翌日早晨。

将所有醪的试管从冷藏处移出，并在恒温培养室中温热至32℃。温热后，马上将葡糖淀粉酶BL2以0.50AGU/g DS加入至每个试管的醪中，添加水使得所有试管容纳120μL的液体和每个醪样品包含100μL的复水的酵母。复水的酵母通过将5.5g的Fermentis RED STAR混入100mL的32℃自来水至少15分钟来制备。

在随时间监测CO₂重量损失中，将每个单位的生成和损失的CO₂通过下式换算为每克干物质产生的乙醇的克数(g EtOH/gDS)：

HPLC分析

当适用时，数据使用JMP软件(Cary，NC)以使用Tukey-Kramer HSD或Dunnett’s进行配对的单因素方差分析来进行分析。代表95%置信水平的误差棒通过将单因素方差分析的标准误差乘以1.96来确立。

表15：试验计划

下表16显示结果：

实施例10

在乙醇产生工艺中改善的较低粘度

玉米粉制备：将来自Corn LP，Iowa，USA的玉米粉过筛，并确定了其粒度分布(PSD)。使用了根据ASTM E-11规格为12，16，20，30，40，和60号的美国标准测试(U.S.Standard Test)筛。收到的粉的干固体(DS)含量为大约87.4%。准备每个实验运行具有相同的PDS。

Rapid Visco Analyzer中的粘度概貌设定和确定：使用Perten RVA-4单元在液化过程中测量粘度概貌。准备用于液化的玉米浆料，即将特定量的经筛过的玉米粉称入Perten金属杯，其重现了收到的粉的PSD。将40克浆料通过添加自来水制备为32%DS，并使用50%w/w NaOH将其pH调整至5.80(对照)或使用40%v/v H₂SO₄调整至4.80。在Perten RVA-4中的每次运行之前添加等份的酶储液，其亦考虑了用于取得所需固体的量。对照浆料使用pH5.8的α-淀粉酶A。将Perten RVA-4编程为在25℃混合浆料1分钟，以6分钟将浆料温度从25℃增加至85℃，将温度在85℃维持恒定2小时，将液化的醪温度以7分钟从85℃冷却至32℃，并将液化的醪温度在32℃维持5分钟。在每次运行过程中，将混合维持恒定在210rpm。

结果

结果概述提供于表17并示于图2-5。

表17：对于每个酶剂量列于括号中并表示为微克EP/g DS.

本发明在下述编号段落中进一步描述：

[1].一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

i)在80至90℃范围的温度、在4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料：

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

[2].段[1]的工艺，其进一步在液化步骤i)之前包括下述步骤：

a)降低含淀粉材料的粒度，优选通过干磨；

b)形成包含含淀粉材料和水的浆料。

[3].段[1]或[2]的工艺，其中至少50%，优选至少70%，更优选至少80%，特别是至少90%的含淀粉材料可通过具有#6筛目(screen)的筛。

[4].段[1]-[3]中任一段的工艺，其中液化过程中的pH为4.5至4.8。

[5].段[1]-[4]中任一段的工艺，其中液化过程中的温度为82至88℃的范围，优选大约85℃。

[6].段[1]-[5]中任一段的工艺，其中在步骤i)的液化之后进行喷射蒸煮步骤。

[7].段[6]的工艺，其中所述喷射蒸煮在110至145℃，优选120至140℃，如125至135℃，优选约130℃的温度进行约1至15分钟，优选约3至10分钟，特别是约5分钟左右。

[8].段[1]-[7]中任一段的工艺，其中糖化和发酵顺序或同时进行。

[9].段[1]-[8]中任一段的工艺，其中糖化在20至75℃，优选40至70℃，如60℃左右的温度，以及4至5的pH，例如约pH4.5或约4.8进行。

[10].段[1]-[9]中任一段的工艺，其中发酵或同步糖化和发酵(SSF)在25℃至40℃，约28℃至35℃，例如30℃至34℃，优选大约32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。

[11].段[1]-[10]中任一段的工艺，其中发酵产物在发酵之后回收，例如通过蒸馏回收。

[12].段[1]-[11]中任一段的工艺，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇；饮用乙醇，和/或工业乙醇。

[13].段[1]-[12]中任一段的工艺，其中所述含淀粉材料是全谷粒。

[14].段[1]-[13]中任一段的工艺，其中所述含淀粉材料来源于玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。

[15].段[1]-[14]中任一段的工艺，其中所述发酵生物是酵母，优选酵母属的菌株，特别是酿酒酵母的菌株。

[16].段[1]-[15]中任一段的工艺，其中所述α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mMCaCl₂具有至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70的T 1/2(min)。

[17].段[1]-[16]中任一段的工艺，其中所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。

[18].段[17]的工艺，其中所述细菌α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的变体，特别是所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是截短的，优选截短为具有大约491个氨基酸。

[19].段[1]-[18]中任一段的工艺，其中所述α-淀粉酶变体与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。

[20].段[1]-[19]中任一段的工艺，其中所述α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短为具有大约491个氨基酸，具有选自下组的突变：

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；和

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。

[21].段[1]-[20]中任一段的工艺，其中在液化步骤i)过程中添加第二α-淀粉酶。

[22].段[21]的工艺，其中所述第二α-淀粉酶是细菌来源的。

[23].段的工艺[21]或[22]，其中所述第二α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属的菌株，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别是其中所述第二α-淀粉酶是截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，优选截短为具有大约491个氨基酸。

[24].段[1]-[23]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性。

[25].段[21]-[24]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有低于10的T 1/2(min)。

[26].段[21]-[25]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有低于8，例如低于7，例如低于6，例如低于5的T 1/2(min)。

[27].段[21]-[26]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有2至10，例如3至8，例如4以上至10，例如4以上至8的T 1/2(min)。

[28].段[21]-[27]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌并具有下述突变：I181*+G182*或I181*+G182*+N193F(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

[29].段[1]-[28]中任一段的工艺，其包括下述步骤：

-α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)，特别是段16-20中任一段所述的α-淀粉酶；和额外的第二α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有少于10的T 1/2(min)，特别是段21-28中任一段所述的α-淀粉酶；

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

[30].段[1]-[29]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定为超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%超过100%，例如超过105%，例如超过110%，例如超过115%，例如超过120%的热稳定性。

[31].段[1]-[30]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定为50至115%，例如50至70%，例如50至60%，例如100至120%，例如105至115%的热稳定性。

[32].段[1]-[31]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶具有作为85℃/70℃的相对活性确定为超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%，超过25%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%，超过100%，超过110%的热稳定性。

[33].段[1]-[32]中任一段的工艺，其蛋白酶变体具有作为85℃/70℃的相对活性确定为10至50%，如10至30%，如10至25%的热稳定性。

[34].段[1]-[33]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶的热稳定性作为85℃/70℃的相对活性确定为50至100%，如70至110%，如90至110%。

[35].段[1]-[34]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是真菌生物。

[36].段[1]-[35]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选橙橘嗜热子囊菌的菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670的菌株的金属蛋白酶的变体。

[37].段[1]-[36]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是下述金属蛋白酶的变体：作为WO 2003/048353的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文中显示为SEQ ID NO:3的成熟部分公开的金属蛋白酶。

[38].段[1]-[37]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶变体与公开于WO 2003/048353的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75%同一性，优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。

[39].段[1]-[38]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是SEQ ID NO:3中所示的橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的变体，其具有选自下组的突变：

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；和

[40].段[1]-[39]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是细菌来源的。

[41].段[1]-[40]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶来源于火球菌属的菌株，优选激烈火球菌的菌株。

[42].段[1]-[41]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是美国专利号6,258,726中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶。

[43].段[1]-[42]中任一段的工艺，其中所述蛋白酶是与美国专利号6,258,726中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性的蛋白酶。

[44].段[1]-[43]中任一段的工艺，进一步地，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加糖源生成酶。

[45].段[44]的工艺，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加的糖源生成酶是葡糖淀粉酶。

[46].段[44]或[45]的工艺，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在85℃，pH5.3具有至少30%，优选至少35%的热稳定性。

[47].段[44]-[46]中任一段的工艺，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%的相对活性。

[48].段[44]-[47]中任一段的工艺，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%的pH稳定性。

[49].段[44]-[48]中任一段的工艺，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来源于青霉属的菌株，特别是草酸青霉的菌株，其作为公布为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2，或本文中的SEQ ID NO:9或14公开。

[50].段[44]-[49]中任一段的工艺，其中所述葡糖淀粉酶与作为公布为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2，或本文中的SEQ ID NO:9或14中所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性，或其中所述糖源生成酶是所述来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶变体，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。

[51].段[1]-[50]中任一段的工艺，进一步地，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶。

[52].段[1]-[51]中任一段的工艺，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属(Aspergillus)，优选黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)的菌株；或木霉属(Trichoderma)，优选里氏木霉(T.reesei)的菌株；或踝节菌属(Talaromyces)，优选埃默森踝节菌(T.emersonii)的菌株，或密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，或Gloephyllum的菌株。

[53].段[1]-[52]中任一段的工艺，进一步地，其中在液化和/或糖化过程中存在普鲁兰酶。

[54].段[53]的工艺，其中在液化步骤i)过程中存在或添加的普鲁兰酶是家族GH57普鲁兰酶，其中所述普鲁兰酶优选包含在作为WO 2011/087836公布的US 61/289,040中公开、或示于本文中的SEQ ID NO:12的X47域。

[55].段[53]或[54]的工艺，其中所述普鲁兰酶来源于来源于热球菌属，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的菌株，或其杂合体。

[56].段[53]-[55]中任一段的工艺，其中所述普鲁兰酶为Thermococcushydrothermalis普鲁兰酶，其在位点X4截短，或其为Thermococcus hydrothermalis/T.litoralis杂合酶，其具有截短位点X4，其公开于作为WO 2011/087836公布的US 61/289,040或示于本文中的SEQ ID NO:12。

[57].段[1]-[56]中任一段的工艺，其包括下述步骤：

-来源于激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

[58].一种组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中

i)所述α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有至少10的T 1/2(min)；

[59].段[58]的组合物，进一步包含糖源生成酶。

[60].段[58]或[59]的组合物，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在85℃具有至少20%，至少30%，优选至少35%的相对活性热稳定性。

[61].段[58]-[60]中任一段的组合物，其中所述α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，特别是芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别是所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是截短的，优选截短为具有大约491个氨基酸。

[62].段[58]-[61]中任一段的工艺，其中所述α-淀粉酶变体与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。

[63].段[58]-[62]中任一段的组合物，所述α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短为具有大约491个氨基酸，具有选自下组的突变：

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；和

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。

[64].段[58]-[63]中任一段的组合物，其中所述α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mMCaCl₂具有至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70的T 1/2(min)。

[65].段[58]-[64]中任一段的组合物，进一步地，其中所述组合物包含第二α-淀粉酶，特别是细菌来源的。

[66].段[65]的组合物，其中所述第二α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO 99/019467中的SEQ IDNO:3或本文中的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别是其中所述第二α-淀粉酶是截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，优选截短为具有大约491个氨基酸。

[67].段[58]-[66]中任一段的工艺，其中所述第二α-淀粉酶与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，以及甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性。

[68].段[65]-[67]中任一段的组合物，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有低于10的T 1/2(min)。

[69].段[65]-[68]中任一段的组合物，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有低于8，如低于7，如低于6，如低于5的T 1/2(min)。

[70].段[65]-[69]中任一段的组合物，其中所述第二α-淀粉酶在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂具有2至10，例如3至8，例如高于4至10，例如高于4至8的T 1/2(min)。

[71].段[64]-[70]的组合物，其中所述第二α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌且具有下述突变：突变I181*+G182*或I181*+G182*+N193F(使用SEQ ID NO:1进行编号)。

[72].段[58]-[71]中任一段的组合物，其包含：

-α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有至少10的T 1/2(min)；

-第二α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有少于10的T 1/2(min)；

-热稳定性葡糖淀粉酶。

[73].段[72]的组合物，其中所述热稳定性α-淀粉酶是段61-64中任一段中的。

[74].段[72]或[73]的组合物，其中所述第二α-淀粉酶是段65-71中任一段中的。

[75].段[58]-[74]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定为超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%，超过100%，例如超过105%，例如超过110%，例如超过115%，例如超过120%的热稳定性。

[76].段[58]-[75]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定为50至115%，例如50至70%，例如50至60%，例如100至120%，例如105至115%的热稳定性。

[77].段[58]-[76]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶具有作为85℃/70℃的相对活性确定为超过12%，超过14%，超过16%，超过18%，超过20%，超过25%，超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%，超过100%，超过110%的热稳定性。

[78].段[58]-[77]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶具有作为85℃/70℃的相对活性确定为10至50%，例如10至30%，例如10至25%的热稳定性。

[79].段[58]-[78]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶具有作为85℃/70℃的相对活性确定为50至100%，例如70至110%，例如90至110%的热稳定性。

[80].段[58]-[79]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶是本文中SEQ ID NO:3中所示的来源于橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。

[81].段[58]-[80]中任一段的组合物，其中所述橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体示于SEQ ID NO:3，具有选自下组的突变：

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L;

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L;

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；和

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。

[82].段[58]-[81]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶来源于火球菌属的菌株，优选激烈火球菌的菌株。

[83].段[58]-[82]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶是美国专利号6,258,726中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13中所示的蛋白酶。

[84].段[58]-[83]中任一段的组合物，其中所述蛋白酶是与美国专利号6,258,726中的SEQ ID NO:1或本文中的SEQ ID NO:13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性的蛋白酶。

[85].段[58]-[84]中任一段的组合物，进一步包含糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶，其在85℃，pH5.3具有至少30%，优选至少35%的热稳定性。

[86].段[85]的组合物，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%的相对活性。

[87].段[85]或[86]的组合物，其中糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其在pH4.5具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%的pH稳定性。

[88].段[85]-[87]中任一段的组合物，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来源于青霉属的菌株，特别是草酸青霉的菌株，其作为公布为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2，或本文中的SEQ ID NO:9或14公开。

[89].段[85]-[88]中任一段的组合物，其中所述糖源生成酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2公开的来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶的变体，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号)。

[90].段[85]-[89]中任一段的组合物，其中所述葡糖淀粉酶与示于公布为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中的SEQ ID NO:2的成熟多肽、或示于本文中的SEQ IDNO:9或14的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。

[91].段[58]-[90]的组合物，进一步包含普鲁兰酶。

[92].段[91]的组合物，其中所述普鲁兰酶是GH57普鲁兰酶，其优选包含在作为WO2011/087836公布的US 61/289,040中公开的X47域。

[93].段[91]或[92]的组合物，其中所述普鲁兰酶来源于来源于热球菌属，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis的菌株(本文中示于SEQ IDNO:10)，或其杂合体。

[94].段[93]的组合物，其中所述普鲁兰酶为Thermococcus hydrothermalis普鲁兰酶，其在位点X4截短；或为公开于作为WO 2011/087836公布的US 61/289,040或示于本文中的SEQ ID NO:12的Thermococcus hydrothermalis/T.litoralis杂合酶，其具有截短位点X4。

[95].段[58]-[94]中任一段的组合物，其包含：

i)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有至少10的T 1/2(min)，；

ii)来源于激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的，；和任选地

iii)葡糖淀粉酶，其来源于草酸青霉。

[96].段[95]的组合物，其中所述组合物进一步包含来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的第二α-淀粉酶，其在pH4.5，85℃，0.12mM CaCl₂)具有小于10的T 1/2(min)。

[97].段[58]-[96]中任一段的组合物在液化工艺中的用途。

[98].段97的用途，其中液化如段[1]-[57]中任一段定义进行。

Claims

1.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

-α-淀粉酶，其在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂具有至少10的T1/2min，是SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，与SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少99％、但少于100％的同一性，并具有如下突变：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-蛋白酶，其具有超过20％的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的，其中所述蛋白酶是来源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株的蛋白酶，所述蛋白酶是与SEQ ID NO:13具有至少99％的同一性的蛋白酶；

ii)使用糖源生成酶进行糖化；

iii)使用发酵生物进行发酵。

2.权利要求1的工艺，其中所述α-淀粉酶是是截短的，截短为具有491个氨基酸。

3.权利要求1的工艺，进一步地，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶，其中所述葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3具有至少30％的热稳定性。

4.权利要求3的工艺，其中所述葡糖淀粉酶是来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶的变体，使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号，其具有K79V取代，此外与SEQ ID NO:14中所示的成熟多肽具有至少99％的同一性。

5.权利要求1-4中任一项的工艺，进一步地，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶，其中所述葡糖淀粉酶是真菌来源的。

6.权利要求1-4中任一项的工艺，进一步地，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶，其中所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)的菌株；或里氏木霉(T.reesei)的菌株；或埃默森踝节菌(T.emersonii)的菌株。

7.权利要求1-4中任一项的工艺，进一步地，其中在液化和/或糖化过程中存在普鲁兰酶。

8.一种组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中

i)所述α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂具有至少10的T1/2min，是SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，与SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少99％、但少于100％的同一性，并具有如下突变：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

ii)所述蛋白酶具有超过20％的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80℃/70℃的相对活性确定的，其中所述蛋白酶是来源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株的蛋白酶，所述蛋白酶是与SEQ ID NO:13具有至少99％的同一性的蛋白酶。

9.权利要求8的组合物，其中所述α-淀粉酶是截短的，截短为具有491个氨基酸。

10.权利要求8的组合物，进一步地，其中所述组合物包含细菌来源的第二α-淀粉酶，其在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂具有少于10的T1/2min。

11.权利要求8的组合物，其中所述蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定为超过80％的热稳定性。

12.权利要求8的组合物，其进一步包含葡糖淀粉酶，其在85℃、pH5.3具有至少20％的相对活性热稳定性，是来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶变体，使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列进行编号，其在SEQ ID NO:14中具有K79V取代，与SEQ ID NO:14中所示的成熟多肽具有至少99％的同一性。

13.权利要求8的组合物，进一步包含普鲁兰酶。