MXPA06013130A - Proceso para producir un producto de fermentacion. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion, tal como etanol, a partir de material que contiene almidon, que incluye i) someter el material que contiene almidon a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y/o una enzima generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador, tal como levadura. Alternativamente, la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion a partir del material que contiene almidon, preferentemente almidon granular, cuyo proceso comprende: a) someter el material que contiene almidon a una alfa-glucosidasa y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y b) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR UN PRODUCTO DE FERMENTACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación, tal como etanol, a partir del material que contiene almidón. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un gran número de productos comerciales que son difíciles de producir sintéticamente pueden ser producidos mediante fermentación. Tales productos que incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1 , 3-propanodiol) ; ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2, 5-diceto-D-glucónico) ; cetonas (por ejemplo, acetona) ; aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico) ; gases (por ejemplo H2 y C02) y compuestos más complejos, incluyendo por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B?2, beta-caroteno); y hormonas. La fermentación es también comúnmente utilizada en el alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino) , productos lácteos (por ejemplo, en la producción de yogurt y queso) , en las industrias del cuero y del tabaco. El etanol tiene una aplicación difundida como un producto químico industrial, aditivo para gasolinas o REF:177377 combustible líquido directo. Como un combustible o aditivo para combustible, el etanol reduce dramáticamente las emisiones de aire, mientras que mejora el funcionamiento del motor. Como un combustible renovable, el etanol reduce la dependencia nacional sobre las fuentes de combustibles fósiles finitas y extranjeras, al tiempo que disminuye la acumulación neta de dióxido de carbono en la atmósfera. Los procesos de fermentación son utilizados para la producción de etanol. Existen un gran número de descripciones concernientes a la producción de alcohol mediante fermentación, entre las cuales están, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5,231,017, Canadiense 1,143,677 y Europea 138428. Existe una necesidad para el mejoramiento adicional del producto de fermentación, tales como los procesos de fabricación de etanol . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los procesos para producir productos de fermentación, tales como etanol, a partir del material que contiene almidón, preferentemente basado en el grano entero, el proceso comprende: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y opcionalmente en una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y iii) la fermentación del material en presencia de un organismo de fermentación. En una modalidad preferida, la alfa-glucosidasa es derivada de una planta, preferentemente arroz, especialmente arroz ( Oryzae sativa) . La presente invención también se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, cuyo proceso comprende: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y a una enzima generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador. El producto de fermentación, especialmente tal como etanol puede ser opcionalmente recuperado después de la fermentación, preferentemente mediante destilación. Cualquier enzima que tenga las actividades enzimáticas anteriormente mencionadas puede ser utilizado de acuerdo a la invención. Las enzimas adecuadas son listadas en la sección "actividades enzimáticas" más adelante. No obstante, en una modalidad preferida, la alfa-amilasa es preferentemente la alfa-amilasa bacteriana, utilizada en el paso i) , que es derivada del género Bacillus , especialmente una cepa de Bacillus stearothermophilus o una variante de la misma. En una modalidad, preferida, la enzima generadora de maltosa utilizada en el paso ii) es una amilasa maltogénica, especialmente derivada del género Bacillus, especialmente una cepa de Bacillus stearothermophilus o una variante de la misma. En' una modalidad preferida, la alfa-glucosidasa utilizada en el paso ii) es de planta, tal como especialmente de origen de arroz, de origen microbiano. En el caso en que la alfa-glucosidasa sea de origen bacteriano, ésta puede ser derivada preferentemente de una cepa del género Bacillus, especialmente una cepa de Bacillus stearothermophilus o una variante de la misma. En una modalidad preferida, el organismo de fermentación utilizado en el paso de fermentación iii) es levadura, preferentemente de origen Saccharomyces, preferentemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae . La invención también se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación, tal como etanol a partir de material que contiene almidón, cuyo proceso comprende: a) someter el material que contiene almidón a una alfa-glucosidasa, y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa; y b) la fermentación en presencia de un organismo fermentador . En una modalidad preferida, el producto de fermentación es etanol. En una modalidad preferida, la alfa-glucosidasa es de origen de arroz. En una modalidad preferida, el material que contiene almidón es almidón granular. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra un diagrama de flujo de proceso para preparar etanol de acuerdo con una modalidad de la invención. La figura 2 muestra los perfiles de azúcar, glicerol y etanol para el curso completo de SSF para la corrida de referencia. La figura 3 muestra los perfiles de azúcar, glicerol y etanol para el curso completo de SSF para la corrida de prueba . La figura 4 muestra los perfiles de glucosa, DP2 y etanol, para el curso completo de SSF para el corrida de prueba y de referencia trazada gráficamente en la misma gráfica para más fácil comparación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un proceso para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, cuyo proceso incluye un paso de licuefacción y separada o simultáneamente se realizan los pasos de sacarificación y de fermentación. Los inventores han encontrado que al llevar a cabo la sacarificación y la fermentación (especialmente SSF) en presencia de una cantidad efectiva de un alfa-glucosidasa y opcionalmente glucosa y/o una o varias enzimas generadoras de maltosa, es ventajoso. Sin estar limitados a ninguna teoría, se cree que un proceso de la presente invención es más eficiente, debido a la maltosa generada - la cual no es preferida por la levadura en presencia de glucosa - es convertida en glucosa, la cual es luego consumida por la levadura, y convertida a etanol. Esto puede conducir a una más alta velocidad de fermentación y/o a un uso más eficiente del material del almidón. Además, la cantidad de azúcares residuales después de la fermentación es reducida. Además, se cree que un proceso de la invención da potencialmente el beneficio de que no es producido o al menos es producido menos glicerol, (el cual no puede ser utilizado por la levadura) . Materias Primas El material inicial que contiene almidón puede, de acuerdo a la invención, ser derivado de cualquier material vegetal. Los materiales iniciales preferidos son seleccionados del grupo que consiste de: tubérculos, raíces, granos enteros; y cualesquiera combinaciones de los anteriores. En una modalidad, el material que contiene almidón es obtenido de cereales. El material que contiene almidón puede ser, por ejemplo, seleccionado de los grupos que consisten de maíz, mazorca de maíz, trigo, cebada, mandioca, sorgo, centeno, sorgo milo y papa, o cualquier combinación de los anteriores. El trigo y el maíz son las materias primas preferidas. En un proceso de la invención, el material inicial que contiene almidón es preferentemente grano entero o al menos principalmente grano entero. Una amplia variedad de cosechas de grano entero que contienen almidón, pueden ser utilizadas como materia prima, incluyendo: maíz, sorgo milo, papa, mandioca, sorgo, trigo y cebada. De este modo, en una modalidad, el material que contiene almidón es grano seleccionado del grupo que consiste de maíz, milo, papa, mandioca, sorgo, trigo y cebada; o cualesquiera combinaciones de los mismos . En una modalidad preferida, el material que contiene almidón es grano entero seleccionado del grupo que consiste de maíz, trigo y cebada, o cualesquiera combinaciones de los mismos . En una modalidad, el material que contiene almidón es almidón granular. El término "almidón granular" es entendido como el almidón crudo no cocido, por ejemplo, el almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón es formado en las plantas como granulos delgados insolubles en agua. Estos granulos son preservados en almidones a temperaturas por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se colocan en agua fría, los granos pueden absorber una pequeña cantidad de líquido. Hasta 50aC a 70aC el hinchamiento es reversible, el grado de reversibilidad es dependiente del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización.

El término "temperatura de gelatinización inicial" es entendido como la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua comienza a gelatinizarse entre 50SC y 75aC; la temperatura exacta de la gelatinización depende del almidón específico y puede ser fácilmente determinada por el experto en la técnica. De este modo, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo a la especie vegetal, a la variedad particular de la especie vegetal, así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual se pierde la birrefringencia es 5% de los granulos de almidón utilizando el método descrito en Gorinstein, S. y Lii, C, Starch/Stárke, Vol. 44(2) pp.461-466 (1992). El material que contiene almidón puede también consistir de, o comprender una corriente colateral del procesamiento de almidón, por ejemplo, las corrientes de proceso que contienen carbohidratos de 6 átomos de carbono que no pueden ser adecuadas para la producción de jarabes. En otras modalidades, el material inicial no consiste de o comprende una corriente colateral del procesamiento del almidón. Reducción del tamaño de partícula del material que contiene almidón El material inicial que contiene almidón puede ser reducido, en una modalidad preferida, el tamaño de partícula antes de la licuefacción. En una modalidad preferida, el material es molido. La trituración es también entendida como molienda. Dos tipos de molienda son normalmente utilizados: la molienda húmeda y seca. El término "molienda seca" denota la molienda del material que contiene almidón, utilizando, por ejemplo, un molino de martillos o de rodillos. En el caso del uso de la molienda de grano entero el grano entero es molido y utilizado en la parte remanente del proceso. La molienda húmeda da una buena separación del germen y de la harina (granulo de almidón y de proteína) y es frecuentemente aplicado en sitios donde existe una producción paralela de jarabes. Otras tecnologías reductoras de tamaño tales como la tecnología de emulsificación, la pulsación rotatoria, pueden ser utilizadas. Proceso de la invención El proceso de la presente invención puede ser en general dividido en las siguientes etapas de proceso principales: molienda, con el fin de abrir la estructura del material que contiene almidón y permitir el procesamiento adicional; licuefacción, donde el material que contiene almidón molido es hidrolizado (desintegrado) a maltodextrinas (dextrinas) ; la sacarificación y fermentación separadas o simultáneas, para producir azúcares fermentables de bajo peso molecular a partir de las maltodextrinas que pueden ser metabolizadas por el organismo fermentador en cuestión, tales como levaduras, y convertido al producto de fermentación deseado, tal como etanol; y opcionalmente la recuperación, por ejemplo, mediante destilación para purificar el producto de fermentación deseado. Los pasos de proceso individuales de la producción del producto de fermentación, tales como la producción de etanol pueden ser realizados por lotes o como un proceso de flujo continuo. Para los procesos donde todos los pasos de proceso son realizados por lotes, o los procesos donde todos los pasos de proceso son realizados como un flujo continuo, o los procesos donde uno o más pasos de procesos son realizados por lotes y uno o más pasos de proceso son realizados como un flujo continuo son igualmente contemplados. El proceso en cascada es un ejemplo de un proceso donde uno o más pasos del proceso son realizados como un flujo continuo, y como tales contemplados para la invención. Para información adicional sobre el proceso en cascada y otros procesos de etanol especialmente, consultar The Alcohol Texbook. Ethanol production by fermentation and destilation. Eds. T.P. Lyons, D.R. Kesall y J.E. Murtagh, Nottingha University Press 1995. En el primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir del material que contiene almidón, molido, preferentemente basado en grano entero, que comprende los pasos de: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador . En una modalidad preferida, la alfa-glucosidasa es derivada de una planta, preferentemente de arroz, especialmente arroz ( Oryzae sativa) . La presente invención también se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón, cuyo proceso comprende: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y una enzima generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador. El material que contiene almidón es definido anteriormente en la sesión "Materias primas" y es reducido en el tamaño de partícula antes del paso de licuefacción i) . En una modalidad preferida, el material que contiene almidón es molido. En una modalidad particular, los procesos de la invención comprenden además, antes del paso i) , los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua. La suspensión acuosa puede contener de 10-40% en peso, preferentemente de 25-35% en peso del material que contiene almidón. En una modalidad de la invención, la suspensión es calentada por arriba de la temperatura de gelatinización, tal como entre 60-95eC, preferentemente 80-85aC, y puede ser agregada la alfa-amilasa bacteriana y/o fúngica acida para iniciar la licuefacción (adelgazamiento) . No obstante, esto no es indispensable. La suspensión del material que contiene almidón puede ser, en una modalidad, cocida por chorro para gelatinizar adicionalmente el almidón a 90-120 C, preferentemente alrededor de 105SC, por 1-15 minutos, preferentemente de 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos, antes de ser sometida a una alfa-amilasa en el paso i) de la invención. En una modalidad preferida, el paso de licuefacción i) es llevada a cabo mediante (a) el tratamiento del material que contiene almidón, con por ejemplo, una alfa-amilasa bacteriana con una temperatura de alrededor de 70-90aC por 15-120 minutos. El paso (a) puede ser seguido por el paso (b) de tratamiento obtenido en el paso (a) con una alfa-amilasa a una temperatura entre 50-80aC por 30-90 minutos. La alfa-amilasa puede ser cualquier alfa-amilasa incluyendo aquellas mencionadas en la sección "Alfa-amilasa" más adelante. Las alfa-amilasas preferidas son alfa-amilasas acidas. La licuefacción es realizada a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4-7, preferentemente pH aproximadamente 4.5-6.5. Si el pH en la suspensión es ajustado o no, esto depende de las propiedades de la o las enzimas utilizadas. De este modo, en una modalidad del pH es ajustado, por ejemplo, aproximadamente a 1 unidad por arriba, por ejemplo, mediante la adición de NH3. El ajuste del pH es ventajosamente realizado al tiempo cuando es agregada la alfa-amilasa. En una modalidad preferida, el pH no íes ajustado y la alfa-amilasa tiene un perfil de actividad de pH adecuado, correspondiente, tal como el que es activo a un pH por arriba de 4. El grano entero licuado es también conocido como mosto. En el paso ii) del proceso de la invención, el material licuado que comprende maltodextrinas, es hidrolizado en azúcares fermentables de bajo peso molecular que pueden ser metabolizados mediante un organismo fermentador, tal como una levadura. Este paso es denominado como "sacarificación". De acuerdo a la presente invención este paso es llevado a cabo al someter la maltodextrina licuada que contiene material, a una alfa-glucosidasa y una enzima generadora de maltosa. La enzima generadora de maltosa degrada las maltodextrinas en maltosa, y la maltosa es finalmente degradada por la alfa-gluocosidasa en glucosa, la cual es consumida y convertida al producto de fermentación, por ejemplo, etanol, por el organismo fermentador, por ejemplo, la levadura. Un paso de sacarificación completo puede durar hasta 72 horas. No obstante, la sacarificación y la fermentación (SSF) pueden, en una modalidad preferida, ser combinadas, y en una modalidad de la invención puede ser incluido un paso de pre-sacarificación de 1-4 horas. La pre-sacarificación puede ser llevada a cabo a cualesquiera condiciones adecuadas de proceso. En una modalidad preferida, la pre-sacarificación es llevada a cabo a temperaturas de 30-65aC, tal como alrededor de 60 aC, y a un pH, por ejemplo, en el intervalo de 4 a 5, especialmente alrededor de pH 4.5. De este modo, en una modalidad el método de la invención puede comprender además un paso de pre-sacarificación, como se describe en la presente, el cual es realizado después de la licuefacción en el paso i, y antes del paso ii) . En una modalidad preferida, es empleada una sacarificación y una fermentación simultáneas (SSF, donde no existe etapa de retención para la sacarificación, lo que significa que la levadura y las enzimas de sacarificación son agregadas esencialmente de manera conjunta. La invención también se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, cuyo proceso comprende: a) someter el material que contiene almidón a una alfa-glucosidasa y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y b) la fermentación en presencia de un organismo fermentador . En una modalidad preferida, el producto de fermentación, especialmente tal como el etanol, es recuperado después de la fermentación, preferentemente mediante destilación. En una modalidad preferida, el paso a) , puede ser precedido por el pre-tratamiento a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización. De acuerdo a este aspecto de la invención, el material que contiene almidón es preferentemente almidón granular crudo. El almidón puede ser de cualquier origen vegetal como se describe más adelante en la sección "Materias primas". La enzima generadora de glucosa, la alfa-glucosidasa y la enzima generadora de maltosa, pueden ser cualquiera de las enzimas descritas en la sección "Actividades enzimáticas" más adelante. En una modalidad, el material que contiene almidón, puede ser además sometido a una alfa-amilasa en el paso (a) y/o (b) y/o antes del paso a) . La alfa-amilasa puede ser cualquiera de las alfa-amilasas descritas en la sección "Alfa-amilasa" más adelante. Son preferidas las alfa-amilasas acidas, especialmente de origen fúngico.

Preferentemente, la alfa-glucosidasa, preferentemente derivada del arroz Orizae sativa , es aplicada en un proceso, tal como el proceso de etanol, para la sacarificación de un almidón gelatinizado o granular, comprendido dicho proceso la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) y opcionalmente la recuperación del producto de fermentación. La SSF puede ser precedida por un paso de gelatinización, por ejemplo, mediante cocción por chorro, o la SSF puede ser precedida por el pre-tratamiento del almidón granular crudo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización, con el fin de lograr un hinchamiento de los granulos de algodón. En una modalidad, el paso (a) es llevado a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización inicial como se define en la sección "Materias primas". Los pasos (a) y (b) pueden ser llevados a cabo secuencial o simultáneamente. En una modalidad particular, el proceso de la invención comprende además, antes del paso a), los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua. La suspensión acuosa puede contener de 10-40% en peso, preferentemente de 25-35% en peso del material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y aguas del proceso, tales como sedimentos (contracorriente) , agua de depurador, condensado o destilado del evaporador, agua depuradora colateral de la destilación u otra agua del proceso del producto vegetal de fermentación. Debido a que el proceso es llevado a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización y de este modo no tiene lugar ningún incremento significativo en la viscosidad, pueden ser utilizados si se desea altos niveles de sedimentos. En una modalidad, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% en volumen de sedimento, preferentemente 15-60% en volumen de sedimento, especialmente de aproximadamente 30 a 50% en volumen de sedimento. La alfa-glucosidasa puede ser aplicada sola o en combinación con otra enzima amilolítica seleccionada del grupo que comprende glucoamilasa, amilasas, incluyendo alfa-amilasa bacteriana, alfa-amilasa fúngica acida, beta-amilasa y pululanasa. En una modalidad preferida, la alfa-glucosidasa es aplicada en un proceso para la hidrólisis del almidón crudo como se describe en la solicitud de patente Danesa No. PA 2003 00812, WO 2004/106533 ó WO 2004/081193, las cuales son incorporadas por referencia en la presente. En otra modalidad preferida, la alfa-glucosidasa es aplicada en un proceso para la sacarificación de un mosto para la producción de cerveza, el mosto para la producción de cerveza que comprende el material almidonoso seleccionado del grupo que consiste de grano, arroz, maíz, trigo, cebada, malta, cebada no maltada, adjunto, adjunto no granular, y adjunto no de cebada. Fermentación El término "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo adecuado para el uso en un proceso de fermentación deseado. Los organismos fermentados adecuados son, de acuerdo a la invención capaces de fermentar, por ejemplo, de convertir, preferentemente azúcares DP?_3 especialmente tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente al producto de fermentación deseado, tal como etanol . El organismo fermentador es típicamente agregado a al mosto. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos, tales como levadura u hongos filamentosos, la levadura preferida incluye las cepas de Saccharomyces spp., y en particular Saccharomyces cerevisae. La levadura comercialmente disponible incluye por ejemplo, RED STAR®/Lesaffre Ethanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, EUA), FALI (disponible de Fleischmann's Yeast, EUA), SUPERSTART (disponible de Alltech) , GERT STRANC (disponible de Gert Strand AB, Suecia) , y FERMIOL (disponible de DSM Specialities) . La fermentación es continua hasta que se produce la cantidad deseada del producto de fermentación tal como etanol . Esto significa típicamente llevar a cabo la fermentación por 24-96 horas, tal como 35-60 horas. La temperatura y el pH durante la fermentación es una temperatura y pH adecuados para el organismo fermentador en cuestión. Para levadura, por ejemplo, la temperatura y el pH está en el intervalo de aproximadamente 26-34aC, preferentemente de aproximadamente 32 eC, y el pH, por ejemplo, está en el intervalo de aproximadamente pH 3-6, por ejemplo, aproximadamente pH 4-5. La levadura preferida para la producción de etanol incluye por ejemplo, Pichia y Saccharomyces . La levadura preferida de acuerdo a la invención es las especies de Saccharomyces , en particular, Saccharomyces cerevisae o la levadura de los panaderos . Recuperación El proceso de la invención puede comprender opcionalmente la recuperación del producto de fermentación tal como etanol; por lo tanto, el producto de fermentación, por ejemplo, el etanol, puede ser separado del material fermentado y purificado. Después de la fermentación, el mosto puede ser destilada para extraer, por ejemplo, etanol. El etanol con una pureza de hasta aproximadamente, por ejemplo 96% en volumen de etanol puede ser obtenido mediante el proceso de la invención. De este modo, en una modalidad, la fermentación en el paso iii) y un paso de destilación puede ser llevado a cabo simultáneamente y/o separadamente/secuencialmente; opcionalmente seguido por uno o más pasos del proceso para la refinación adicional del producto de fermentación, por ejemplo, el etanol. Actividades enzimáticas Alfa-amilasa Puede ser llevado a cabo un proceso de la invención en presencia de, preferentemente, por ejemplo, una alfa-amilasa bacteriana y/o fúngica. Los ejemplos de alfa-amilasas adecuadas incluyen las que se mencionan más adelante. Alfa-amilasas bacterianas Las alfa-amilasas bacterianas preferidas utilizadas, en el paso i) o en el paso a) de la invención, pueden ser derivadas de una cepa de B . licheniformis, B . amyloliquefaciens, B. stearothermophilus , o Bacillus subtillis . También preferidas son las alfa-amilasas que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de homología, preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 85%, o al menos 90%, por ejemplo, al menos 95%, 97%, 98%, o al menos 99%, tal como una homología del 100% a las secuencias descritas en la SEQ ID No. : 2 o en la SEQ ID No.: 3 de la presente. Otras alfa-amilasas bacterianas incluyen alfa-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales son descritas con detalle en W095/26397, y la alfa-amilasa descrita por Tsukamoto et al . , Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), p. 26-31.

La alfa-amilasa de Bacillus puede ser también una variante y/o híbrido, especialmente una descrita en cualquiera de los documentos WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos son incorporados por referencia en la presente) . Las variantes de alfa-amilasa específicamente contempladas son descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,093,562, 6,297,038 ó 6,187,576 (incorporadas por referencia en la presente) e incluyen las variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (alfa-amilasa de BSG) que tienen una supresión de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179 a G182, preferentemente una doble supresión descrita en WO 1996/023873 -ver por ejemplo página 20, líneas 1-10 (incorporada por referencia en la presente) , preferentemente correspondiente a delta (181-182) en comparación a la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa BSG de tipo silvestre descrita en la SEQ ID NO: 3 descrita en el documento WO 99/19467 (o SEQ ID NO: 2 en la presente) o la supresión de los aminoácidos R179 y G180 utilizando la SEQ ID NO: 3 en WO 99/19467 (o SEQ ID NO: 2 en la presente) para numeración (cuya referencia es incorporada por referencia en la presente) . Aún más preferidas son las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, que tienen una doble supresión correspondiente a delta (181-182) y comprenden además una sustitución N193F (también denotada 1181* + G182* + N193F) comparada a la secuencia de aminoácidos alfa-amilasa de BSG de • tipo silvestre descrita en la SEQ ID NO: 3, detallada en WO 99/19467 (o SEQ ID NO: 2 en la presente) . Una alfa-amilasa híbrida específicamente contemplada comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (mostrada en la SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada en la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467), con la siguiente sustitución: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración en la SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) mostrada en la presente como SEQ ID NO: 4. También preferidas son las variantes de alfa-amilasa derivadas de Bacillus amyloliquefaciens y que tienen al menos 50% de homología, tal como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o incluso 90% de homología a la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 4. Especialmente preferidas son las variantes que tienen una o más de las mutaciones H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la supresión de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferentemente la supresión de E178 y G179 (utilizando la numeración de la SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467) . Otras alfa-amilasas bacterianas contempladas son la alfa-amilasa KSM-K36 descrita en la Patente Europea EP-1,022,334 y depositada como FERM BP 6945 y la alfa-amilasa KSM-K38 descrita en la Patente Europea EP-1,022,334 y depositada como FERM BP 6946. Son contempladas también las variantes, en particular las variantes descritas en WO 02/31124 (de Novozymes A/S) . Los productos de alfa-amilasa bacterianos comercialmente disponibles y los productos que contienen alfa-amilasas incluyen TERMAMYL1® SC y LIQUOZYME^ SC, BAN (Novozymes A/S, Dinamarca) y DEX-LO", SPEZYME1111 AA, y SPEZYME^ DELTA AA (de Genencor Int.) . Alfa-amilasas fúngicas Las alfa-amilasas fúngicas son derivadas de una cepa de Aspergillus, incluyendo Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, o A . kawashii . Específicamente contempladas son la alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae (EP-288, 023 ) ; la alfa-amilasa de Aspergillus niger descrita en la Patente Europea EP-383,779 B2 (sección [0037] (ver también la clonación del gen de A . niger en el Ejemplo 1) ; la alfa-amilasa de Aspergillus niger descrita en el Ejemplo 1 de la Patente Europea EP-140,410. En una modalidad preferida la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida. En una modalidad más preferida, la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa fúngica acida o una alfa-amilasa bacteriana acida. Más preferentemente, la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa fúngica derivada del género Aspergillus . Tal amilasa acida fúngica comercialmente disponible es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) . El término "alfa-amilasa acida" significa una alfa-amilasa (E.C.3.2.1.1) que agregada en una cantidad efectiva tiene actividad óptima a un pH en el intervalo de 3.0 a 7.0, preferentemente de 3.5 a 6.0, o más preferentemente de 4.0 a 5.0. Una alfa-amilasa acida fúngica preferida es una alfa-amilasa similar a Fungamyl. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa similar a Fungamyl" indica una alfa-amilasa que muestra una alta identidad, por ejemplo, mayor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 o incluso mayor de 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 en WO 96/23874. Preferentemente, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida, preferentemente del género Aspergillus, preferentemente de la especie Aspergillus niger. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa acida fúngica es aquella de A . niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el No. de acceso primario P56271. También son contempladas las variantes de dicha amilasa fúngica acida que tienen al menos 70% de identidad, tal como al menos 80%, o incluso al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a éstas. En una modalidad, la alfa-amilasa fúngica acida es aquella descrita en la SEQ ID NO: 1 en la presente, o una secuencia que es al menos 70% idéntica, preferentemente al menos 75% idéntica, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90%, por ejemplo, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad a la SEQ ID NO: 1. Las alfa-amilasas fúngicas comerciales FUNGAMYL® (Novozymes A/S); y CLARASE*® (de Genencor Int., EUA), son ambas derivadas de Aspergillus . Enzimas generadoras de maltosa Las enzimas generadoras de maltosa utilizadas en un proceso de la invención puede ser una amilasa maltogénica, una beta-amilasa o una alfa-amilasa fúngica. Las amilasas maltogénicas (glucan-1, 4-alfa-maltohidrolasa) son capaces de hidrolizar la amilosa y la amilopectina a maltosa en la configuración alfa. Además, una amilasa maltogénica es capaz de hidrolizar la maltotriosa así como las ciclodextrinas. Las amilasas maltogénicas específicamente contempladas pueden ser derivadas de Bacillus sp., preferentemente de Bacillus stearothermophilus , lo más preferentemente de Bacillus stearothermophilus C599 tal como aquella descrita en la Patente Europea EP-120,693. Esta amilasa maltogénica particular tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1-686 de la SEQ ID NO: 1 en la Patente de los Estados Unidos No. 6,162,628. Una amilasa maltogénica preferida tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad a los aminoácidos 1-686 de la SEQ ID NO: 1 en la Patente de los Estados Unidos No. 6,162,628, preferentemente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o particularmente al menos 99%. Las variantes más preferidas de la amilasa maltogénica comprenden las variantes descritas en el documento W099/43794. Las amilasas maltogénicas pueden ser agregadas en cantidades de 0.01 a 40.0 MANU/g DS, preferentemente de 0.02-10 MANU/g DS, preferentemente de 0.05-5.0 MANU/g DS . Otra enzima generadora de maltosa que va a ser utilizada en el proceso de la invención puede ser una beta-amilasa (E.C.3.2.1.2) . La beta-amilasa es el nombre tradicionalmente dado a las amilasas maltogénicas de acción exo, que catalizan la hidrólisis de los enlaces 1, 4-alfa-glucosídicos en la amilosa, amilopectina y polímeros de glucosa relacionados. Las beta-amilasas han sido aisladas de diversas plantas y microorganismos (W.M. Fogarty y C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, Vol. 15, p. 112-115, 1979) . Estas beta-amilasas son caracterizadas por tener temperaturas óptimas en el intervalo de 40°C a 65°C y pH óptimo en el intervalo de 4.5 a 7.0. Preferentemente, la beta-amilasa es derivada de un hongo filamentoso, tal como una beta-amilasa derivada de Rhizomucor pusillis . La beta-amilasa contemplada incluye la beta-amilasa de cebada SPEZYME® BBA 1500, SPEZYME® DBA y OPTIMALT^ ME, OPTIMALT^ BBA de Genencor Int., así como NOVOZYM* WBA de Novozymes A/S. Otra enzima generadora de maltosa que puede ser utilizada en un proceso de la invención, es una alfa-amilasa fúngica (EC 3.2.1.1), tal como una alfa-amilasa similar a fungamil. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa similar a fungamyl" indica una alfa-amilasa que muestra una alta homología, por ejemplo más de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de homología (identidad) a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 en WO 96/23874. Cuando se utilizan como una enzima generadora de maltosa, las alfa-amilasas fúngicas pueden ser agregadas en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.001 a 1.0 AFAU/g DS, preferentemente de 0.002 a 0.5 AFAU/g DS, preferentemente de 0.02 a 0.1 AFAU/g DS o preferentemente de 0.01 a 10 mg proteína/DS de amilasa maltogénica, beta-amilasa, alfa-amilasa similar a Fungamyl, o mezclas de las mismas. Alfa-glucosidasas Una 'alfa-glucosidasa o maltasa (EC 3.2.1.48) utilizada en un proceso de la invención, puede ser derivada de un micro-organismo o una planta. Son preferidas las alfa-glucosidasas de origen fúngico, tal como una alfa-glucosidasa derivada de una levadura o de un hongo filamentoso, y de origen bacteriano. Una alfa-glucosidasa fúngica preferida es una derivada de una cepa de Candida sp., tal como una cepa de C. edax, preferentemente la cepa CBS 6461. También preferidas son las alfa-glucosidasas derivables de una cepa de Pichia sp., tal como una cepa de P. Amylophilla, P. Missisippiensis, P. Wicherhamil y P. Rhodanensis . Son contempladas también las alfa-glucosidasas derivadas de Aspergillus sp., tal como A . nidulans (Kato et al. 2002, Appl Environ Microbiol. 68: 1250-1256), de Rhizobium sp. (Berthelot et al. 1999, Appl Environ Microbiol. 65. 2907-2911). Las alfa-glucosidasas bacterianas preferidas incluyen alfa-glucosidadas derivadas del género Bacillus, tal como de una cepa de Bacillus stearothermophilus . Son preferidas las alfa-glucosidasas que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de homología (identidad) , preferentemente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90%, por ejemplo al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%, tal como 100% de homología (identidad) a la secuencia madura descrita en la SEQ ID NO: 6 en la presente. Una alfa-glucosidasa comercialmente disponible contemplada en la alfa-glucosidasa de Bacillus stearothermophilus comercialmente disponible de SIGMA (Sigma Cat. No. g3651) . Las alfa-glucosidasas de origen vegetal pueden ser derivadas de un cereal, tal como de trigo, centeno, cebada, maíz o arroz. Otras alfa-glucosidasas contempladas incluyen alfa-glucosidasas de Aspergillus fumigatus, especialmente aquellas descritas en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/585,336 o alfa-glucosidasas de Fusarium venena tum, especialmente aquellas descritas en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/586,103 (ambas solicitudes son incorporadas por referencia en la presente) . Una alfa-glucosidasa vegetal preferida es derivada de arroz, por ejemplo Oryzae sativa . Preferentemente, la alfa-glucosidasa tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal; GYNVASVAGS (SEQ ID NO: 7), más preferentemente la alfa-glucosidasa tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal; GYNVASVAGS KNRRRARREL AAGGGGA (SEQ ID NO: 8), o la alfa-glucosidasa tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquiera de las dos secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas, en donde preferentemente no más de uno, más preferentemente no más de dos, aún más preferentemente no más de tres, y lo más preferentemente no más de cuatro residuos aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o suprimidos. Una alfa-glucosidasa de arroz, preferida es disponible de Sigma-Aldrich como Cat. No. G9259. También preferida es la alfa-glucosidasa de arroz descrita en Iwata et al. en Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 95, No. 1, 106-108, 2003. Preferentemente, la alfa-glucosidasa tiene un peso molecular de aproximadamente 90 kDa a 100 kDa, más preferentemente de aproximadamente 92 kDa a 99 kDa, tal como de aproximadamente 95 kDa a 98 kDa. Una alfa-glucosidasa particularmente preferida tiene un peso molecular de aproximadamente 97 kDa. La alfa-glucosidasa puede ser agregada en una cantidad efectiva de 0.1 a 10000 unidades de maltasa/kg DS, 1 a 1000 unidades de maltasa/kg DS, o más preferentemente 10 a 100 unidades de maltasa/kg DS, tal como o más preferentemente 1 a 10 unidades de maltasa/kg DS o preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g DS o 0.001 a 100 mg de proteína/g DS, preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g DS. Enzimas generadoras de glucosa Cualesquiera enzimas generadoras de glucosa pueden ser utilizadas de acuerdo a la invención. La enzima generadora de glucosa preferida es una glucoamilasa. La glucoamilasa puede ser de cualquier origen, por ejemplo, derivada de un microorganismo o una planta. Es preferida la glucoamilasa de origen fúngico o bacteriano seleccionada del grupo que consiste de la glucoamilasa de Aspergillus niger, en particular la glucoamilasa Gl o G2 de A . niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), o variantes de la misma, tal como se describe en WO 92/00381 y WO 00/4136; la glucoamilasa A . awamori (WO 84/02921), A . oryzae (Agrie. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas . Otras variantes contempladas de glucoamilasa de Aspergillus incluyen las variantes para aumentar la estabilidad térmica: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); enlaces disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; y la introducción de residuos de Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204) . Además, Clark Ford presentó un documento el 17 de octubre de 1997, ENZYME ENGINEERING 14, Beijing/China Octubre 12-17, 97, número de extracto: P. 0-61. El extracto sugiere mutaciones en las posiciones G137A, N20C/A27C y S30P en una glucoamilasa de Aspergillus awamori para mejorar la estabilidad térmica. Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 92/28448), Talaromyces leycettanus (Patente de los Estados Unidos No. Re. 32,153), Talaromyces duponti , Talaromyces thermopiles (Patente de los Estados Unidos No. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoajnylolyticum (EP-135,138) , y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). También, son específicamente contempladas las glucoamilasas derivadas de Athelia rolfsii (previamente denotada Cortici um rolfsii ) , incluyendo una que tiene la secuencia de aminoácidos disponible como SPTREMBL:Q12596. Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 4,727,026 y (Nagasaka, Y. Et al. (1998) Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticum rolfsii , Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330). Los productos comercialmente disponibles que comprenden una glucoamilasa incluyen SPIRIZYME1® FUEL, SPIRIZYME PLUS, SAN1® SUPER1® y AMG*® E (de Novozymes A/S) . Una glucoamilasa puede ser agregada en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.02 a 20 AGU/g DS, preferentemente de 0.005 a 5 AGU/g DS, o 0.1 a 10 AGU/g DS, preferentemente de 0.05 a 0.5 AGU/g DS tal como alrededor de 0.1, 0.3, 0.5 1 ó 2 AGU/g DS, tal como entre 0.1 a 0.5 AGU/g DS. Pululanasa Las pululanasas (E.C. 3.2.1.41, pululan-6-glucano-hidrolasa) , son enzimas de desramificación caracterizadas por su habilidad para hidrolizar los enlaces alfa-1, 6-glucosídicos por ejemplo en la amilopectina y el pululano. Las pululanasas específicamente contempladas de acuerdo a la presente invención incluyen las pululanasas de Bacillus amyloderamificans descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,560,651 (incorporada por referencia en la presente), la pululanasa descrita en la SEQ ID NO: 2 en WO 01/151620 (incorporada por referencia en la presente) , la pululanasa de Bacillus deramificans descrita en la SEQ ID NO: 4 en WO 01/151620 y SEQ ID NO: 11 en la Patente de los Estados Unidos No. 5,736,375 (incorporada por referencia en la presente) , y la pululanasa de Bacillus acidopullulyticus descrita en la SEQ ID NO: 6 en WO 01/151620 (incorporada por referencia en la presente) y también descrita en FEMS Mic. Let. (1994) 115, 97-106. La pululanasa de acuerdo a la invención puede ser agregada, en una cantidad efectiva que incluye el intervalo preferido de entre 1 a 100 microgramos por g de DS, especialmente de 10 a 60 microgramos por g de DS . La actividad de pululanasa puede ser determinada como NPUN. Un ensayo para la determinación de NPUN se describe en la sección "Materiales y Métodos" más adelante. Los productos de pululanasa comercialmente disponibles, adecuados incluyen PROMOZYME D, PROMOZYME1® D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EUA) , y AMANO 8 (Amano, Japón) . Uso de los productos producidos mediante procesos de la invención El etanol obtenido mediante el proceso de la invención puede ser utilizado como, por ejemplo, etanol para combustible; etanol para beber, por ejemplo, alcohol neutro potable o etanol industrial, incluyendo aditivo para combustible. La invención descrita y reclamada en la presente no está limitada en el alcance por las modalidades específicas descritas aquí, ya que estas modalidades están destinadas a ser ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualesquiera modalidades equivalentes están destinadas a estar dentro del alcance de esta invención. Por supuesto, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí, se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones están también destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . En el caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluyendo las definiciones. Son citadas aquí diversas referencias, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad. La presente invención es además descrita por los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes del alcance de la invención. MATERIALES Y MÉTODOS Enzimas : Alfa-Amilasa A Bacteriana (BAAA) : variante de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones: I181*+G182*+N193F descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 6,187,576 y disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca . Alfa-amilasa B acida fúngica (FAAB) : alfa-amilasa de Aspergillus niger descrita en la SEQ ID NO: 1 y disponible de Novozymes A/S. Alfa-glucosidasa BS (AGBS) : alfa-glucosidasa de Bacillus stearothermophilus disponible de SIGMA (Sigma Cat. No. G3651) . Enzima generadora de maltosa: amilasa maltogénica derivada de Bacillus stearothermophilus C599 descrita en la Patente Europea EP-120,693 y disponible de Novozymes A/S. Alfa-glucosidasa OS: alfa-glucosidasa de Orizae sa tiva disponible de SIGMA (Sigma Cat. No. G9259) . Glucoamilasa TN: glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii y descrita como SEQ ID NO: 7 en WO 99/28448 con actividad lateral de glucoamilasa de Aspergillus niger y alfa-amilasa acida de Aspergillus niger. Pululanasa PD: pululanasa derivada de Bacillus deramificans que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 en la Patente de los Estados Unidos No. 5,736,375 y descrita como SEQ ID NO: 9 en la presente. Beta-amilasa WG: una beta-amilasa vegetal extraída de grano de trigo (Novozym® WBA disponible de Novozymes A/S) . Determinación de Homología (Identidad) El término "homología" de polipéptido significa el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos. La homología puede ser adecuadamente determinada por programas de computadora conocidos en la técnica, tales como, GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Manual de Programa para Wisconsin Package, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Los siguientes ajustes para la comparación de la secuencia polipeptídica, son utilizados: penalidad por creación de espacio vacío GAP de 3.0, y penalidad por extensión de espacio vacío GAP de 0.1. Determinación de la Actividad de Alfa Amilasa (KNU) La KNU es utilizada para medir las alfa-amilasas bacterianas con alto pH óptimo. Ensayo PHADEBAS*® La actividad de alfa-amilasa es determinada mediante un método que emplea las tabletas PHADEBAS como sustrato. Las tabletas PHADEBAS (Prueba de Amilasa Phadebas® suministrada por Pharmacia Diagnostic) contiene un polímero de almidón de color azul, insoluble, reticulado, el cual ha sido mezclado con albúmina sérica bovina y una sustancia amortiguadora, y formada en tabletas . Para cada medición simple es suspendida una tableta en un tubo que contiene 5 ml de amortiguador Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, cloruro de calcio 0.1 mM, pH ajustado al valor de interés con hidróxido de sodio) . La prueba es realizada en un baño de agua a la temperatura de interés. La alfa-amilasa que va a ser probada es diluida en x ml de amortiguador Britton-Robinson 50 mM. 1 ml de esta solución de alfa-amilasa es agregado a 5 ml del amortiguador Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa, dando fragmentos azules solubles . La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de alfa-amilasa. Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 10 ó 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) está en el intervalo de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este intervalo de absorbancia existe linearidad entre la actividad y la absorbancia (ley de Lambert-Beer) . La dilución de la enzima debe ser por lo tanto ajustada para ajustar este criterio. Bajo un grupo específico de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones del amortiguador) 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad del sustrato y será producido un color azul .

La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el grupo de condiciones dadas. Método alternativo La actividad alfa-amilasa es determinada por un método que emplea el sustrato PNP-G7. PNP-G7 que es una abreviatura para p-nitrofenil-alfa, D-maltoheptaósido es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el equipo, digiere el sustrato para liberar una molécula de PNP libre, la cual tiene un color amarillo y de este modo puede ser medida mediante espectrometría visible a lambda=405 nm (400-420 nm) . Los equipos que contienen el sustrato PNP-G7 y alfa-glucosidasa, son fabricados por Boehringer-Mannheim (Cat. No. 1054635) . Para preparar el sustrato es agregada una botella del sustrato (BM 1442309) a 5 ml de amortiguador (BM1442309) . Para preparar la alfa-glucosidasa se agrega una botella de alfa-glucosidasa (BM 146309) a 45 ml de amortiguador (BM1442309) . La solución de trabajo es elaborada mediante el mezclado de 5 ml de solución de alfa-glucosidasa con 0.5 ml de sustrato . El ensayo es realizado mediante la transformación de microlitros de solución enzimática a una placa de microtitulación de 96 pozos, e incubando a 25°C. Una solución de trabajo de 20 microlitros a 25°C es agregada. La solución es mezclada y pre-incubada 1 minuto y la absorción es medida cada 15 segundos en 3 minutos a OD 405 nm. La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión, bajo el grupo dado de condiciones.

Determinación de la actividad de FAU Una Unidad Alfa-Amilasa Fúngica (FAU) es definida como la cantidad de enzima, la cual desintegra 5.26 g de almidón (Merck Amylum solubile Erg. B.6, Lote 9947275) por hora, con base en las siguientes condiciones estándares: Sustrato Almidón soluble Temperatura 37°C pH 4.7 tiempo de reacción 7-20 minutos Determinación de la actividad de alfa-amilasa acida (AFAU) La actividad de alfa-amilasa acida es medida en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Fúngica acida por su acepción en inglés) , que son determinadas con relación a un estándar de enzima . El estándar utilizado es AMG 300 L (de Novozymes A/S, glucoamilasa de Aspergillus niger Gl de tipo silvestre, también descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) y WO 92/00381) . La alfa-amilasa neutra en este AMG cae después del almacenamiento a temperatura ambiente por 3 semanas, de aproximadamente 1 FAU/ml hasta por debajo de 0.05 FAU/ml . La actividad de alfa-amilasa acida en este estándar de AMG es determinada de acuerdo con la siguiente descripción.

En este método, 1 AFAU es definida como la cantidad de enzima, que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora, bajo condiciones estándares . El yodo forma un complejo azul con el almidón, pero no con sus productos de degradación. La intensidad del color es por lo tanto directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa es determinada utilizando una colorimetría inversa como una reducción en la concentración del almidón bajo condiciones analíticas específicas . Alfa-amilasa Almidón + yodo -> dextrinas+oligosacáridos 40°C, pH 2.5 azul/violeta 5=23 segundos decoloración Condiciones estándares/condiciones de reacción: (por minuto) sustrato: almidón, aproximadamente 0.17 g/l amortiguador : citrato, aproximadamente 0.03 M yodo (I2) : 0.03 g/l CaCl2: 1.85 mM pH: 2.50 ± 0.05 temperatura de incubación: 40°C tiempo de reacción: 23 segundos longitud de onda: lambda=590 nm concentración de enzima: 0.025 AFAU/ml intervalo de trabajo de la enzima: 0.01-0.04 AFAU/ml Si son preferidos detalles adicionales, éstos pueden ser encontrados en EB-SM-0259.02/01 disponible a petición de Novozymes A/S, e incorporada por referencia. Actividad de alfa-glucosidasa (unidades de maltasa) La actividad de alfa-glucosidasa puede ser expresada en unidades de maltasa (g de glucosa formada/litro de preparación de maltasa/hora) . Una preparación de maltasa es incubada a 60°C en una solución de maltosa al 20% p/v, en citrato 50 mM a pH = 4.5 por 60 minutos (1 hora) . La cantidad de glucosa liberada es medida utilizando el ensayo GOD-PERID, Boehringer Mannheim. Determinación de la actividad de pululanasa (NPUN) La actividad de endo-pululanasa NPUN es medida con relación a un estándar de pululanasa de Novozymes. Una unidad de pululanasa (NPUN) es definida como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de glucosa por minuto, bajo condiciones estándares (0.7% de rojo pululano (Megazyme) , pH 5, 40°C, 20 minutos) . La actividad es medida en NPUN/ml utilizando pululano rojo. 1 ml de muestra diluida o estándar se incuba a 40°C por 2 minutos. Se agregan y se mezclan 0.5 ml de pululano rojo al 2%, cloruro de potasio 0.5 M, ácido cítrico 50 mM, pH 5. Los tubos son incubados a 40°C por 20 minutos y detenidos mediante la adición de 2.5 ml de etanol al 80%. Los tubos se dejan reposar a temperatura ambiente por 10 a 60 minutos, seguido por centrifugación 10 minutos a 4000 rpm. La densidad óptica (OD por sus siglas en ingles) de los sobrenadantes es luego medida a 510 nm y la actividad es calculada utilizando una curva estándar. EJEMPLOS Ejemplo 1 Licuefacción con alfa-amilasa acida bacteriana 100 ml de suspensión de maíz molido se licúa con 50 UN/g de sólidos secos (DS) de alfa-amilasa bacteriana A de Bacillus stearothermophilus . El mosto de maíz tiene aproximadamente 30% de sustancia seca (pH 5.4). El mosto es calentado a 85°C por 0.5 hora. La temperatura es luego disminuida a 70°C y el mosto es luego tratado con la alfa-amilasa B acida fúngica de Aspergillus niger, que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 1. La carga enzimática es de 0.05 AFAU/g de sólidos secos. Después de 1 hora las muestras son tomadas para el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en ingles) . La temperatura es llevada a 32°C para llevar a cabo la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) . SSF con glucoamilasa, alfa-glucoamilasa y enzima generadora de maltosa Una vez que se termina la licuefacción, el pH es ajustado a 5.0. El mosto es luego tratado con glucoamilasa de Aspergillus niger (0.1 de AGU/g de DS) incluyendo una actividad colateral de alfa-amilasa acida de Aspergillus niger (la proporción entre AGU y AFAU es de aproximadamente 9.1), alfa-glucosidasa BS (dosis de proteína glucoamilasa equivalente de 0.1 AGU/g de DS) y la amilasa maltogénica (dosis de proteína glucoamilasa equivalente de 0.1 AGU/g de DS) . El mosto es luego inoculado con levadura ( Saccharomyces cerevisiae) (4% p/p) e incubada a 32°C por el curso completo de la fermentación. Son tomadas muestras a intervalos regulares para realizar la HPLC para el etanol y el perfil de azúcares . Ejemplo 2 Un mosto de maíz entero, con 33% de sólidos secos (DS) fue licuado en un proceso de suspensión en caliente de tres pasos utilizando 50 UN /g de DS de alfa-amilasa bacteriana A de Bacillus sterarothermophilus . Primeramente, la suspensión se calentó aproximadamente a 82°C y un tercio (1/3) de la alfa-amilasa se agregó para iniciar la licuefacción. Luego la suspensión fue cocida por chorro a una temperatura de aproximadamente 112°C para completar la gelatinización de la suspensión. Luego la suspensión fue enfriada aproximadamente a 77°C y los dos tercios (2/3) remanentes de la alfa-amilasa fueron agregados para finalizar la hidrólisis. 250 ml de mosto de maíz entero, licuado se llenaron en botellas con tapa azul de 500 ml con agitadores magnéticos. El pH del mosto se ajustó aproximadamente a 5.5. Las botellas fueron incubadas en un baño de agua aproximadamente a 32°C por 40 minutos antes de que la levadura seca ( Saccharomyces cerevisiae) fuera agregada a una dosis de 0.2 g/botella equivalente a una cuenta de 15 millones de células viables por mililitro. Las botellas fueron cerradas utilizando un seguro de levadura llenado con ácido sulfúrico concentrado. La fermentación a 32°C fue continuada por aproximadamente 91 horas y mediante el pesaje de la botella a intervalos regulares se monitorizó la pérdida de C02, que es proporcional a la producción de etanol .

Ejemplo 3 Una suspensión de 30% de D.S. de grano de trigo molido se elabora con agua de la llave a temperatura ambiente (TA) . Para cada tratamiento se colocan 2 porciones de 250 g en matraces de fermentación de tapa azul de 500 ml . El pH se ajustó a 6.0 y las enzimas son agregadas: la alfa-amilasa bacteriana A de Bacilus stearothermophilus (0.15 KNU/g de DS) , beta-amilasa WG (0.0125 mg EP/g de DS) y alfa-glucosidasa de Oryzae sativa (0.0125 mg EP/g de DS) . Se lleva a cabo un pre-tratamiento por 60 minutos aproximadamente a 55°C en un baño de agua con agitación. Los matraces son enfriados aproximadamente a 32°C, se agregan 0.25 g de levadura de panadero seca (correspondiente a 10 millones de células viables/g de mosto) a cada matraz, los matraces son equipados con seguros de aire, y se pesan. Los matraces son incubados en un baño de agua con agitación preajustado aproximadamente a 32°C y se lleva a cabo un paso simultáneo del proceso de sacarificación y fermentación (SSF) por 96 horas. Los matraces son pesados a intervalos regulares y se mide la pérdida en peso de C02 (g) para monitorizar el progreso de la fermentación. La relación utilizada entre la cantidad de pérdida de C02 y el peso del etanol es: pérdida de CO? (g) x 1 . 045 - EtOH (g) . El rendimiento del etanol es calculado como: pérdida de peso (g) x 1.045 Litro de etanol/100 kg de materia seca de mosto = xlOO (g/ml)x250?20?¿ de materia seca Ejemplo 4 Se repite el proceso descrito en el Ejemplo 3; excepto que la suspensión es una suspensión de maíz molido seco al 30% de DS .

Ejemplo 5 Efecto de adición de la alfa-glucosidasa durante SSF Este Ejemplo investiga el impacto de la alfa-glucosidasa en combinación con la pululanasa, alfa-amilasa acida y una baja dosis de glucoamilasa sobre el azúcar, el glicerol y el perfil de etanol sobre el lapso completo de SSF. Dos recipientes idénticos (cada uno de 5 litros de volumen total) fueron utilizados para llevar a cabo el proceso completo, incluyendo la licuefacción y SSF. Se utilizó un volumen de trabajo de aproximadamente 2.5 kg. Para la licuefacción, se utilizó un reactor simple para tener un material licuado común. El maíz triturado fue utilizado para hacer una suspensión líquida con 30% en peso de sólidos secos (DS) utilizando agua de la llave constituyendo el peso final aproximadamente de 5.5 kg. El pH fue ajustado a 5.8 utilizando hidróxido de sodio diluido. Una vez que se ajustó el pH, la alfa-amilasa A bacteriana (BAAA) (0.04% p/p de maíz) fue agregada al recipiente. Después de mezclar la enzima con la suspensión de maíz, la temperatura fue elevada a 85°C al hacer circular agua caliente a través de la chaqueta. Después de que la temperatura ambiente alcanzó 85°C, ésta se mantuvo por 1.5 horas antes de enfriarla hasta 32°C. Por el resto del curso del experimento, la temperatura fue mantenida a 32°C. Una vez que se completó la licuefacción, el mosto fue dividido en dos fermentadores igualmente . En el primer reactor (fermentador 1), únicamente se agregó glucoamilasa (Glucoamylase TN) (0.5 AGU/g de DS) como una corrida de Referencia. En el segundo reactor (fermentador 2, corrida de Prueba) , la dosis de glucoamilasa (Glucoamylase TN) fue reducida al 10% (comparada a la corrida de Referencia) haciéndola hasta 0.05 de AGU/g de DS) junto con 5% en peso de enzima proteica de la dosis original de Glucoamylase TN para 3 enzimas (por ejemplo, alfa-amilasa fúngica acida B (FAAAB) , pululanasa PD y la enzima proteica alfa-glucosidasa OS, cada una equivalente a 0.025 AGU/g de DS de Glucoamylase TN) . Se agregaron urea (1000 ppm) y penicilina (3 mg/litro) a cada fermentador, con base en el peso total de mosto. Finalmente, los reactores fueron inoculados con 0.04 ml/g de mosto de levadura (RED STAR*®) que había sido desarrollada por 20 horas. La agitación fue mantenida a 550 rpm en cada recipiente. Fueron tomadas muestras con intervalos regulares y analizadas para los perfiles de azúcares y etanol y para la cuenta de levadura viable, mediante la siembra en placas sobre Petrifilm de 3M. Para reducir al mínimo la evaporación de etanol y agua durante la fermentación, el gas producido se hizo pasar a través de un condensador donde se circulaba agua a 2°C. Resultados Las Figuras 2 y 3 muestran los perfiles de azúcar, glicerol y etanol para las corridas de Referencia y de Prueba, respectivamente. Como se puede observar a partir de las curvas, la velocidad de hidrólisis DP4+ es relativamente más rápida en la corrida de Referencia, específicamente en las 15 horas iniciales, lo cual pudo ser atribuido a una actividad de Glucoamylase TN significativamente más alta. Se realizó una observación similar con la maltotriosa (DP3) . No obstante, en el caso de la maltosa, para las 25 horas iniciales, se encontró que las concentraciones relativas eran muchos más bajas en la corrida de Prueba. Esto puede ser explicado por la presencia de alfa-glucosidasa en la mezcla enzimática. Una hidrólisis DP4+ lenta (una dosis baja de Glucoamylase TN) aunado con el crecimiento exponencial de levadura, dio como resultado el consumo de la glucosa generada relativamente rápido en la corrida de Prueba. No obstante, una dosis más alta de Glucoamylase TN dio como resultado una liberación más alta de la glucosa en el caso de la corrida de Referencia (mostrada en la Figura 4) . Otro hallazgo importante fue el incremento en la concentración de maltosa después de 40 horas en la corrida de Prueba. Una razón pudo ser la desactivación de la alfa-glucosidasa debido a la presencia del etanol que dio como resultado la acumulación de maltosa, mostrando la importancia de la alfa-glucosidasa en el patrón de utilización del azúcar. Como se muestra en la Figura 4, el rendimiento total de etanol se encontró que era más alto en la corrida de Referencia que en la corrida de Prueba. No obstante, únicamente 25% en peso de la enzima proteica total se agregó en la corrida de Prueba. Cuando se observan las concentraciones de glicerol, éstas terminaron a 10.7 g/litro y 12.0 g/litro para la corrida de Prueba y de Referencia, respectivamente. Esto pudo ser una representación del estrés sobre la levadura, indicando que un perfil de azúcar sinérgico pudo dar como resultado un mejor ambiente de crecimiento para la levadura y mejor utilización de los azúcares. En conclusión, se obtuvo una mejor utilización de la glucosa así como de la maltosa, ya que no se observó ninguna acumulación de azúcar. Esto muestra una sinergia entre las enzimas de la corrida de Prueba. Además, la menor generación de glicerol fue observada con la adición de una combinación de enzima con alfa-glucosidasa. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (57)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón, caracterizado el proceso porque comprende: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador. 2. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón, caracterizado el proceso porque comprende: i) someter el material que contiene almidón a una alfa-amilasa, ii) someter el material obtenido en el paso i) a una alfa-glucosidasa y a una enzima generadora de maltosa, y iii) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador.
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el producto de fermentación es etanol .
4. 4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el producto de fermentación es recuperado después de la fermentación, preferentemente mediante destilación.
5. 5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sacarificación en los pasos ii) y la fermentación en el paso iii) se llevan a cabo simultáneamente (SSF) .
6. 6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el paso i) es llevado a cabo mediante (a) el tratamiento del material que contiene almidón con una alfa-amilasa a una temperatura alrededor de 70-90°C por 15 a 120 minutos.
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el paso i (a) es seguido por: (b) el tratamiento del material obtenido en el paso (a) con una alfa-amilasa a una temperatura de 50-80°C por 30 a 90 minutos.
8. 8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el material que contiene almidón es cocido por chorro a 90-120°C, preferentemente alrededor de 105°C, por 1 a 15 minutos, preferentemente por 3 a 10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos, antes del paso i) .
9. 9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la alfa-amilasa en el paso i) es de origen bacteriano, preferentemente una alfa-amilasa de Bacillus, especialmente derivada de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus o una variante con las mutaciones: I181*+G182* especialmente I181*+G182*+N193F.
10. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la alfa-amilasa en el paso (b) es una alfa-amilasa acida, preferentemente una alfa-amilasa fúngica acida, preferentemente derivada de Aspergillus spp., preferentemente Aspergillus niger o Aspergillus oryzae .
11. 11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad a la SEQ ID NO: 1, preferentemente al menos 75%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90%, por ejemplo, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad a la SEQ ID NO: 1.
12. 12. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO : 1.
13. 13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la enzima generadora de maltosa es una beta-amilasa y/o una amilasa maltogénica.
14. 14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la o las enzimas generadoras de maltosa son agregadas en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g de DS .
15. 15. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es agregada en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g de DS .
16. 16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es derivada de una planta, preferentemente arroz, especialmente una alfa-glucosidasa derivada de arroz ( Oryzae sativa) .
17. 17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es derivada de una bacteria, preferentemente derivada del género Bacillus, preferentemente Bacillus stearothermophilus, especialmente la alfa-glucosidasa de Bacillus stearothermophilus descrita en la SEQ ID NO: 6.
18. 18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste de: tubérculos, raíces y grano entero; y cualquier combinación de éstos.
19. 19. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el material que contiene almidón es obtenido de cereales .
20. 20. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, sorgo o milo y papas; o cualquier combinación de éstos .
21. 21. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el material que contiene almidón es de grano entero y el método comprende un paso de moler el grano entero antes del paso (a) .
22. 22. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el material que contiene almidón es obtenible mediante un proceso que comprende la molienda de grano entero.
23. 23. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende además antes del paso i) los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y) formar una suspensión que comprende el material y agua.
24. 24. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizado porque el material que contiene almidón es reducido en tamaño de partícula, preferentemente mediante molienda.
25. 25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la molienda es un paso de molienda en seco.
26. 26. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la molienda es un paso de molienda húmeda .
27. 27. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el material que contiene almidón es una corriente colateral del procesamiento de almidón.
28. 28. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque el organismo fermentador es levadura, tal como Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae.
29. 29. Un proceso para producir un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón, caracterizado el proceso porque comprende: a) someter el material que contiene almidón a una alfa-glucosidasa y opcionalmente a una enzima generadora de glucosa y/o generadora de maltosa, y b) fermentar el material en presencia de un organismo fermentador.
30. 30. El proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el producto de fermentación es recuperado después de la fermentación, preferentemente mediante destilación.
31. 31. El proceso de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque el paso a) es precedido por un pre-tratamiento a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización.
32. 32. El proceso de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque el paso a) es llevado a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización.
33. 33. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado porque el material que contiene almidón es almidón granular crudo .
34. 34. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, caracterizado porque el material que contiene almidón es sometido a una alfa-amilasa en el paso (a) y/o antes del paso a) .
35. 35. El proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la alfa-amilasa es de origen bacteriano, preferentemente una alfa-amilasa de Bacillus, especialmente derivada de la alfa-amilasa Bacillus stearothermophilus o una variante con las mutaciones: I181*+G182* especialmente I181*+G182*+N193F .
36. 36. El proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la alfa-amilasa es una alfa-amilasa acida, preferentemente una alfa-amilasa fúngica acida, preferentemente derivada de Aspergillus spp., preferentemente Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
37. 37. El proceso de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad a la SEQ ID NO: 1, preferentemente al menos 75%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90%, por ejemplo, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad a la SEQ ID NO: 1.
38. 38. El proceso de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la alfa-amilasa acida es una alfa-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 1.
39. 39. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-38, caracterizado porque la enzima generadora de maltosa es una beta-amilasa y/o una amilasa maltogénica.
40. 40. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-39, caracterizado porque la o las enzimas generadoras de maltosa son agregadas en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g de DS .
41. 41. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-40, caracterizado porque la enzima generadora de glucosa es una glucoamilasa.
42. 42. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-41, caracterizado porque la enzima generadora de glucosa, preferentemente glucoamilasa, es agregada en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.005 a 5 AGU/g de DS, preferentemente de 0.05 a 0.5 AGU/g de DS.
43. 43. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-42, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es agregada en una cantidad efectiva, preferentemente de 0.01 a 10 mg de proteína/g de DS .
44. 44. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-43, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es derivada de una planta, preferentemente arroz, especialmente una alfa-glucosidasa derivada de arroz ( Oryzae sativa) .
45. 45. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-44, caracterizado porque la alfa-glucosidasa es derivada de una bacteria, preferentemente derivada del género Bacillus, preferentemente Bacillus stearothermophilus, especialmente alfa-glucosidasa Bacillus stearothermophil us descrita en la SEQ ID NO: 6.
46. 46. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-45, caracterizado porque el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste de: tubérculos, raíces y grano entero; y cualquier combinación de éstos .
47. 47. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-46, caracterizado porque el material que contiene almidón es obtenido de cereales .
48. 48. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-47, caracterizado porque el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, sorgo o milo y papas; o cualquier combinación de éstos.
49. 49. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-48, caracterizado porque el producto de fermentación es etanol .
50. 50. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-49, caracterizado porque el organismo fermentador es una levadura, tal como Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae .
51. 51. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-50, caracterizado porque el material que contiene almidón es un grano entero, y el proceso comprende el paso de moler el grano entero antes del paso (a) .
52. 52. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-51, caracterizado porque el material que contiene almidón es obtenible mediante un proceso que comprende la molienda de grano entero.
53. 53. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-52, caracterizado porque comprende además, antes del paso a) los pasos de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y) formar una suspensión que comprende el material y agua.
54. 54. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-53, caracterizado porque el material que contiene almidón es reducido en el tamaño de partícula, preferentemente mediante molienda.
55. 55. El proceso de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la molienda es un paso de molienda en seco. '
56. 56. El proceso de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la molienda es un paso de molienda húmeda .
57. 57. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-56, caracterizado porque el material que contiene almidón es una corriente colateral del procesamiento de almidón.