ES2935920T3 - Procesos de elaboración de productos de fermentación - Google Patents

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Jeremy Saunders
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Zhengfang Kang
Joyce Craig
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Abstract

La invención se refiere a procesos para producir un producto de fermentación, que comprende licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa; pre-sacarificación y/o sacarificación y fermentación usando un organismo de fermentación en presencia de una fuente de carbohidratos que genera una enzima y una composición celulolítica. La invención también se refiere a métodos para deshidratar vinazas enteras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procesos de elaboración de productos de fermentación
REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS
[0001] Esta patente contiene una lista de secuencias.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención se refiere a procesos para crear productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón utilizando un organismo fermentador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] Un gran número de productos comerciales que son difíciles de producir sintéticamente se producen hoy en día mediante la fermentación de organismos. Dichos productos incluyen alcoholes (por ejemplo, butanol, etanol, metanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, gluconato, ácido glucónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2), y compuestos más complejos, incluidos, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas. La fermentación también se usa comúnmente en el alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), los lácteos (por ejemplo, en la producción de yogur y queso) y las industrias del cuero y del tabaco. Se conocen en la técnica un gran número de procesos para producir productos de fermentación, tales como etanol, mediante la fermentación de azúcares proporcionados por la degradación de materiales que contienen almidón. Sin embargo, la producción de productos de fermentación, como etanol, a partir de dicho material que contiene almidón sigue siendo demasiado costosa. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar procesos que puedan aumentar el rendimiento del producto de fermentación y, por tanto, reducir los costes de producción. Es un objeto de la presente invención proporcionar procesos mejorados para producir productos de fermentación.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0004] En el primer aspecto, la invención se refiere a procesos de elaboración de productos de fermentación, que comprenden
(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa; opcionalmente presacarificar el material licuado antes del paso (b);
(b) sacarificar el material licuado;
(c) fermentar usando un organismo fermentador;
en donde una enzima generadora de fuentes de carbohidratos y una composición celulolítica están presentes o se añaden durante el paso de fermentación (c) o la sacarificación y fermentación simultáneas, en donde la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 6 y comprende una o varias sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G91L, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y.
[0005] La composición celulolítica puede derivarse de Trichoderma reesei, Humicola insolens o Chrysosporium lucknowense. La composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa.
[0006] La composición celulolítica puede comprender algo de hemicelulasa, como, por ejemplo, xilanasa y/o betaxilosidasa. La hemicelulasa puede provenir del organismo productor de la composición celulolítica o de otras fuentes, por ejemplo, la hemicelulasa puede ser ajena al organismo productor de la composición celulolítica, como, por ejemplo, Trichoderma reesei. En una realización preferida, el contenido de hemicelulasa en la composición celulolítica constituye menos del 10 % en peso, tal como menos del 5 % en peso de la composición celulolítica.
[0007] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, y la composición celulolítica se agregan durante un paso de presacarificación antes de la sacarificación y la fermentación simultáneas o secuenciales.
[0008] La enzima generadora de fuentes de carbohidratos, por ejemplo, una glucoamilasa, es preferiblemente una glucoamilasa que comprende una actividad secundaria de alfa-amilasa, por ejemplo, una variante termoestable de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión al almidón (SBD) (SEQ ID N.°: 11 en el presente documento). Específicamente, las glucoamilasas y alfa-amilasas contempladas se describen en las secciones "Enzimas" más adelante y en los ejemplos.
[0009] En una realización preferida, la composición celulolítica comprende una variante de beta-glucosidasa de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus mostrada en la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento, que comprende cualquiera de las siguientes sustituciones:
• F100D S283G N456E F512Y;
• L89M G91L 1186V 1140V;
• 1186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y (usando la SEQ ID N.°: 6 para la numeración).
[0010] En una realización preferida, la composición celulolítica se obtiene de Trichoderma reesei y comprende además una o varias de:
(i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus, preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento;
(ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus, preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento;
(iii) una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de las mismas con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando la s Eq ID N.°: 6 en el presente documento para la numeración).
[0011] En una realización adicional de un proceso de la invención, hay una trehalasa presente o se añade durante la presacarificación, la sacarificación simultánea o secuencial y la fermentación. Como se muestra en el ejemplo 5, la combinación de una glucoamilasa, una composición celulolítica y una trehalasa aumenta el rendimiento de etanol.
[0012] La trehalasa puede estar presente o añadirse en una cantidad de 5-1000 micro g/g MS, por ejemplo 7-500 micro g/g MS, por ejemplo 10-250 micro g/g MS.
Definiciones
Enzimas:
[0013] Enzima celulolítica, composición celulolítica o celulasa: El término "enzima celulolítica", "composición celulolítica" o "celulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Dichas enzimas incluyen endoglucanasa(s), celobiohidrolasa(s), beta-glucosidasa(s) o combinaciones de las mismas. Los dos enfoques básicos para medir la actividad celulolítica incluyen: (1) medir la actividad celulolítica total y (2) medir las actividades celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas) tal como se ha revisado en Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad celulolítica total generalmente se mide usando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro Whatman n.° 1, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo con papel de filtro que utiliza papel de filtro Whatman n.° 1 como sustrato. El ensayo fue establecido por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).
[0014] La actividad de la enzima celulolítica se determina midiendo el aumento de la hidrólisis de un material celulósico por parte de la(s) enzima(s) celulolítica(s) en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulosa en rastrojos de maíz pretratados ("PCS") (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50 °C, 55 °C o 60 °C, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína enzimática celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 ml, PCS lavadas o sin lavar, sólidos insolubles al 5 %, acetato de sodio 50 mM, pH 5, MnSO41 mM, 50 °C, 55 °C o 60 °C, 72 horas, análisis de azúcar mediante columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.).
[0015] Glucosidasa familia 61: El término "glucosidasa familia 61" o "familia GH61" o "GH61" se refiere a un polipéptido que pertenece a la familia 61 de glucosidasa de acuerdo con Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat B. y Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas de esta familia se clasificaron originalmente como una familia de glucosidasas basándose en la medición de una actividad muy débil de endo-1,4-beta-D-glucanasa en un miembro de la familia. La estructura y el modo de acción de estas enzimas no son canónicos y no pueden considerarse como glucosidasas auténticas. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy sobre la base de su capacidad para mejorar la descomposición de la lignocelulosa cuando se usan junto con una celulasa o una mezcla de celulasas.
[0016] Polipéptido con actividad potenciadora celulolítica: El término "polipéptido con actividad potenciadora celulolítica" se refiere a un polipéptido GH61 que cataliza la potenciación de la hidrólisis de un material celulósico mediante enzimas que tienen actividad celulolítica. Para los fines de la presente invención, la actividad potenciadora celulolítica se determina midiendo el aumento de azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa a partir de la hidrólisis de un material celulósico mediante enzimas celulolíticas en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína total/g de celulosa en PCS, donde la proteína total está compuesta por un 50-99.5 % p/p de proteína enzimática celulolítica y un 0.5-50 % p/p de proteína de un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica durante 1-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50 °C, 55 °C o 60 °C, y pH, por ejemplo,, 5.0 o 5.5, en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1­ 50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS). En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST® 1.5 l (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) en presencia de un 2-3 % del peso total proteico de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según WO 02/095014) o un 2-3 % del peso total proteico de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae tal como se describe en WO 2002/095014) de la carga de proteína de celulasa se utiliza como fuente de la actividad celulolítica.
[0017] El polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica mejora la hidrólisis de un material celulósico catalizado mediante enzimas que tienen actividad celulolítica reduciendo la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferiblemente al menos 1.01 veces, por ejemplo, al menos 1.05 veces, al menos 1.10 veces, al menos 1.25 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 20 veces.
[0018] Beta-glucosidasa: El término "beta-glucosidasa" se refiere a una beta-D-glucósido glucohidrolasa (E.C.
3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de los residuos terminales no reductores de beta-D-glucosa con la liberación de beta-D-glucosa.
[0019] Para los fines de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina usando p-nitrofenilbeta-D-glucopiranósido como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 1.0 |_imol de anión de pnitrofenolato producido por minuto a 25 °C, pH 4.8 a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 50 mM que contiene TWEEN® 20 (monolaurato de sorbitán polioxietilenado) al 0.01 %.
[0020] Celobiohidrolasa: El término "celobiohidrolasa" se refiere a una 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C.
3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celooligosacáridos o cualquier polímero que contiene glucosa beta-1,4 enlazada, que libera celobiosa desde los extremos reductores o no reductores de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, TrenMS in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178).
[0021] La actividad de la celobiohidrolasa se determina de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. En la presente invención, el método de Tomme et al. se puede utilizar para determinar la actividad de la celobiohidrolasa.
[0022] Endoglucanasa: El término "endoglucanasa" se refiere a una endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, derivados de celulosa (como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mixtos como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereales, y otros materiales vegetales que contienen componentes celulósicos.
[0023] La actividad de endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción en la viscosidad del sustrato o el aumento en los extremos reductores determinados mediante un ensayo de azúcares reductores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). A efectos de la presente invención, la actividad de endoglucanasa se determina usando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40 °C.
[0024] Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: El término "enzima hemicelulolítica" o "hemicelulasa" se refiere a una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico. Véase, por ejemplo, Shallom, D. y Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6 (3): 219-228). Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa vegetal. Los ejemplos de hemicelulasas incluyen, entre otros, una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una ácido cumárico esterasa, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que se unen mediante enlaces de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular de la planta, entrecruzándolas en una red robusta. Las hemicelulosas también se unen covalentemente a la lignina, formando junto con la celulosa una estructura altamente compleja. La estructura y la organización variables de las hemicelulosas requiere la acción concertada de muchas enzimas para su completa degradación. Los módulos catalíticos de las hemicelulasas son las glucosidasas (GH) que hidrolizan enlaces glucosídicos o carbohidrato esterasas (CE), que hidrolizan enlaces éster de grupos laterales de acetato o ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, en función de la homología de su secuencia primaria, pueden asignarse a las familias GH y CE. Algunas familias, con un pliegue general similar, se pueden agrupar en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas de carbohidratos está disponible en la base de datos de enzimas activas de carbohidratos (Carbohydrate-Active Enzymes o CAZy). Las actividades de las enzimas hemicelulolíticas se pueden medir de acuerdo con Ghose y Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura, por ejemplo, 50 °C, 55 °C o 60 °C, y un pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5, adecuados.
[0025] Alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3.2.1.1) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacáridos y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
[0026] Glucoamilasas (glucano 1,4-alfa-glucosidasa, EC 3.2.1.3) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de los residuos de a-D-glucosa unidos al terminal (1^4) sucesivamente desde los extremos no reductores de las cadenas con liberación de beta-D-glucosa.
Otras definiciones:
[0027] Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualesquiera dos o más (por ejemplo, varias) formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación y puede dar lugar a polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0028] ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida a partir de una célula eucariótica o procariótica. El ADNc carece de secuencias intrónicas que puedan estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluido el empalme, antes de aparecer como ARNm maduro empalmado.
[0029] Material celulósico: El término "material celulósico" se refiere a cualquier material que contiene celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, que se produce después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y se fortalece con lignina polimérica entrecruzada covalentemente con hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y, por lo tanto, un beta-(1-4)-D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas generalmente se unen con hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular.
[0030] La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, cáscaras, vainas y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de árboles. El material celulósico puede ser, entre otros, residuos agrícolas, material herbáceo (incluidos los cultivos energéticos), residuos sólidos municipales, residuos de fábricas de pulpa y papel, residuos de papel y madera (incluidos los residuos forestales) (véase, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, director editorial, volumen 65, págs. 23-40, Springer-Verlag, Nueva York). Se entiende aquí que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de la pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mixta. En un aspecto preferido, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosas y lignina.
[0031] Secuencia codificante: El término "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
[0032] Fragmento: El término "fragmento" se refiere a un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes de los extremos amino y/o carboxilo de un polipéptido principal maduro; donde el fragmento tiene actividad enzimática. En un aspecto, un fragmento contiene al menos el 85 %, por ejemplo, al menos el 90 % o al menos el 95 % de los residuos de aminoácidos del polipéptido maduro de una enzima.
[0033] Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final después de la traducción y de cualquier modificación postraduccional, como el procesamiento del terminal N, el truncamiento del terminal C, la glicosilación, la fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro de una xilanasa I de A. fumigatus consiste en los aminoácidos 27 a 532 de la SEQ iD N.°: 2 según el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 26 de la SEQ ID N.°: 2 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II de A. fumigatus consiste en los aminoácidos 20 a 454 de la SEQ ID N.°: 4 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID N.°: 4 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una beta-glucosidasa de A. fumigatus consiste en los aminoácidos 20 a 863 de la SEQ ID N.°: 6 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID N.°: 6 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de un polipéptido GH61 de Penicillium sp. consiste en los aminoácidos 26 a 253 de la SEQ ID N.°: 8 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 25 de la SEQ ID N.°: 8 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una xilanasa I de A. fumigatus consiste en los aminoácidos 18 a 364 de la SEQ ID N.°: 10 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 17 de la SEQ ID N.°: 10 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I de T. reesei consiste en los aminoácidos 18 a 514 de la SEQ ID N.°: 18 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 17 de la SEQ ID N.°: 18 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una celobiohidrolasa II de T. reesei consiste en los aminoácidos 19 a 471 de la SEQ ID N.°: 20 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 18 de la SEQ ID N.°: 20 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro de una beta-glucosidasa de T. reesei consiste en los aminoácidos 20 a 744 de la SEQ ID N.°: 22 basándose en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID N.°: 22 son un péptido señal.
[0034] Se sabe en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido.
[0035] Secuencia codificante del polipéptido maduro: El término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad enzimática. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I de A. fumigatus consiste en los nucleótidos 79 a 1596 de la SEQ ID N.°: 1 del presente documento o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP (Nielsen et al/., 1997, supra) que predice que los nucleótidos 1 a 78 de la SEQ ID N.°: 1 en el presente documento codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una celobiohidrolasa I de A fumigatus consiste en los nucleótidos 58 a 1700 de la SEQ ID N.°: 3 del presente documento o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP que predice que los nucleótidos 1 a 57 de la SEQ ID N.°: 3 del presente documento codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de una beta-glucosidasa de A fumigatus consiste en los nucleótidos 58 a 2580 de la SEQ ID N.°: 5 del presente documento o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP que predice que los nucleótidos 1 a 57 de la SEQ ID N.°: 5 del presente documento codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro de un polipéptido GH61 de Penicillium sp. consiste en los nucleótidos 76 a 832 de la SEQ ID N.°: 7 del presente documento o la secuencia de ADNc de los mismos basándose en el programa SignalP que predice que los nucleótidos 1 a 75 de la SEQ ID N.°: 7 en el presente documento codifican un péptido señal.
[0036] Enzima progenitora: El término "progenitora" se refiere a una enzima a la que se le hace una alteración para producir una variante. La progenitora puede ser un polipéptido de origen natural (tipo salvaje) o una variante del mismo.
[0037] Rastrojo de maíz pretratado: El término "PCS" o "rastrojo de maíz pretratado" se refiere a un material celulósico obtenido del rastrojo de maíz mediante el tratamiento con calor y ácido sulfúrico diluido, el pretratamiento alcalino o el pretratamiento neutro.
[0038] Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".
[0039] Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, TrenMS Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son la penalización de abertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (EMBOSS versión de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de gaps en el alineamiento)
[0040] Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son la penalización por abertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NcBl NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de gaps en el alineamiento)
[0041] Subsecuencia: El término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante de un polipéptido maduro; en el que la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad enzimática. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos el 85 %, por ejemplo, al menos el 90 % o al menos el 95 % de los nucleótidos de la secuencia codificante del polipéptido maduro de una enzima.
[0042] Variante: El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene actividad enzimática o potenciadora de enzimas que comprende una alteración, es decir, una sustitución, una inserción y/o una deleción, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir un aminoácido adyacente e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición.
[0043] Enzima de tipo salvaje: El término enzima "de tipo salvaje" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0044]
La fig. 1 muestra una comparación del rendimiento de etanol cuando se utilizan cuatro composiciones celulolíticas diferentes (es decir, celulasas A, B, C y D) durante la fermentación junto con una glucoamilasa. La fig. 2 muestra la producción neta de glucosa de una composición celulolítica de Trichoderma reesei con concentraciones variables de beta-glucosidasa de la familia GH3A de Aspergillus fumigatus de tipo salvaje, variante L89M G91L F100D 1140V 1186V S283G N456E F512Y, variante L89M G91L 1140V 1186V y variante F100D S283G N456E F512Y.
La fig. 3: Conjunto 1 modelos de %MS de masa de vinaza ligera y torta húmeda. La tendencia creciente de la masa de vinaza ligera frente a la dosis de composición celulolítica indica que el incremento de agua se desplazó a la vinaza ligera bajo el tratamiento con celulasa.
La fig. 4: Conjunto 2 modelos de %MS de masa de vinaza ligera y torta húmeda. La tendencia creciente de la masa de la vinaza ligera frente a la dosis indica que el incremento de agua se desplazó a la vinaza ligera bajo el tratamiento con composición celulolítica, con un efecto de saturación de alrededor de 100 micro g/g MS.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Procesos para generar productos de fermentación a partir de materiales gelatinizados que contienen almidón [0045] En este aspecto, la invención se refiere a procesos de elaboración de productos de fermentación, que comprenden
(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa; opcionalmente presacarificar el material licuado antes del paso (b);
(b) sacarificar el material licuado;
(c) fermentar usando un organismo fermentador;
en donde una enzima generadora de fuentes de carbohidratos y una composición celulolítica están presentes o se añaden durante el paso de fermentación (c) o la sacarificación y fermentación simultáneas, en donde la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 6 y comprende una o varias sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G91L, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y.
[0046] La composición celulolítica puede derivarse de Trichoderma reesei, Humicola insolens o Chrysosporium lucknowense. La composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa.
[0047] La composición celulolítica puede comprender algo de hemicelulasa, como, por ejemplo, xilanasa y/o betaxilosidasa. La hemicelulasa puede provenir del organismo productor de la composición celulolítica o de otras fuentes, es decir, la hemicelulasa puede ser ajena al organismo productor de la composición celulolítica, como, por ejemplo, Trichoderma reesei.
[0048] En una realización preferida, el contenido de hemicelulasa en la composición celulolítica constituye menos del 10 % en peso, por ejemplo, menos del 5 % en peso de la composición celulolítica.
[0049] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, y la composición celulolítica se agregan durante un paso de presacarificación llevado a cabo antes de la sacarificación y la fermentación simultáneas.
[0050] En una realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa, preferiblemente una combinación de glucoamilasa y alfa-amilasa.
[0051] Más adelante, en la sección "Enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos (enzimas sacarificantes)", en la sección "Alfa-amilasas" y en los ejemplos se describen ejemplos de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos adecuadas, preferiblemente una glucoamilasa y una alfa-amilasa.
[0052] La enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, es preferiblemente una glucoamilasa que comprende una actividad secundaria de alfa-amilasa, por ejemplo, una variante termoestable de la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y dominio de unión al almidón (SBD) (SEQ ID N.°: 11 en el presente documento).
[0053] En una realización específica, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una mezcla de glucoamilasa obtenida de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 o la SEQ ID N.°: 9 en el presente documento, glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como la SEQ ID N.°: 2 en WO 06/69289 o la SEQ iD N.°: 10 en el presente documento, y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD descritos como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 o la SEQ ID N.°: 11 en el presente documento. La relación entre los componentes puede ser preferiblemente de alrededor de 65:15:1.
[0054] En una realización, la alfa-amilasa es la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus que tiene un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un dominio de unión al almidón (SBD) (SEQ ID N.°: 11 en este documento) que además comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; o G128D Y141W D143N K192R P219C (usando la SEQ ID N.°: 11 para la numeración).
[0055] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos y/o la composición celulolítica se añaden durante la presacarificación realizada antes del paso de sacarificación (b) y/o el paso de fermentación (c). La enzima generadora de fuentes de carbohidratos y la composición celulolítica también se pueden añadir durante la presacarificación llevada a cabo antes de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
[0056] En una realización del proceso de la invención, la presacarificación se lleva a cabo a una temperatura de 40­ 75 °C, por ejemplo, de 50-70 °C, preferiblemente de 60°C; un pH entre 4-6, preferiblemente 5; durante un período de 30-360 minutos, por ejemplo, de 60-420 minutos, por ejemplo, alrededor de 150-180 minutos.
[0057] En una realización, el contenido de hemicelulasa en la composición celulolítica constituye menos del 10 % en peso, tal como menos del 5 % en peso de la composición celulolítica.
[0058] En una realización preferida, la beta-glucosidasa es una variante de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus que se muestra en la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento, que además comprende cualquiera de las siguientes sustituciones:
• F100D S283G N456E F512Y;
• L89M G91L 1186V 1140V;
• 1186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y (usando la SEQ ID N.°: 6 para la numeración).
[0059] En una realización preferida, la composición celulolítica se obtiene de Trichoderma reesei y comprende además una o varias de:
(i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus, preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento;
(ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus, preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento;
(iii) una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de las mismas con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando la s Eq ID N.°: 6 en el presente documento para la numeración).
[0060] En una realización adicional del proceso de la invención, hay una trehalasa presente o se añade durante la presacarificación, la sacarificación y/o la sacarificación y fermentación simultáneas o secuenciales. Como se muestra en el ejemplo 5, la combinación de una composición celulolítica y una trehalasa aumenta el rendimiento de etanol.
[0061] Además, también se encontró que los procesos de la invención dan como resultado beneficios finales (después de la recuperación del producto de fermentación, por ejemplo, etanol). Después de la fermentación, el producto de fermentación puede recuperarse, preferiblemente por destilación, separando el material fermentado en una fracción líquida (es decir, producto de fermentación), como etanol, y una fracción sólida (es decir, vinazas enteras). Después de la recuperación del producto de fermentación, la fracción sólida (es decir, vinaza entera) se puede deshidratar y separar en una fase sólida (es decir, torta húmeda) y una fase líquida (vinaza ligera), por ejemplo, mediante centrifugación. Tal como se muestra en el ejemplo 6, se obtiene una deshidratación mejorada.
[0062] En una realización, la composición celulolítica se obtiene de Trichoderma reesei, Humicola insolens o Chrysosporium lucknowense. En una realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa.
[0063] En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica como, por ejemplo, una derivada del género Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, como la descrita en WO 2005/074656 como SEQ ID N.°: 2; o una derivada del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, como la descrita en WO 2005/074647 como SEQ ID N.°: 7 y SEQ ID N.°: 8; o una derivada de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, como la descrita en WO 2010/138754 como SEQ ID N.°: 1 y SEQ ID N.°: 2; o una derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii, como la descrita en WO 2011/041397 o como la SEQ ID N.°: 8 en el presente documento.
[0064] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBH I), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, la Cel7a CBHI descrita en la SEQ ID N.°: 6 en WO 2011/057140 o la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento, o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei.
[0065] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa II (CBH II), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus o como la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento; o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, o una cepa del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, como la celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris. En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa.
[0066] En una realización, la composición celulolítica comprende beta-glucosidasa y CBH.
[0067] En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa y una CBH I.
[0068] En una realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa y una CBH I.
[0069] En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.
[0070] En una realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.
[0071] En una realización, la composición celulolítica es una composición celulolítica de Trichoderma reesei que comprende además un polipéptido GH61A de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica descrita en WO 2011/041397 y una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 2 de WO 2005/047499) o la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento con las siguientes sustituciones F100D, S283G, N456E, F512Y.
[0072] En una realización, la composición celulolítica se dosifica de 0.0001-3 mg EP/g de MS, preferiblemente, 0.0005-2 mg EP/g de MS, preferiblemente 0.001-1 mg/g de MS, más preferiblemente 0.005-0.5 mg EP/g de MS y aún más preferiblemente 0.01-0.1 mg EP/g de MS.
[0073] El almidón se forma dentro de las células vegetales como pequeños gránulos insolubles en agua. Cuando se colocan en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad de líquido e hincharse. A temperaturas de hasta aproximadamente 50°C a 75°C, el hinchamiento puede ser reversible. Sin embargo, con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado "gelatinización". El almidón granulado que se va a procesar puede tener una calidad de almidón altamente refinada, preferiblemente con una pureza de al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99.5 % o puede ser un almidón más crudo que contiene materiales que comprenden, por ejemplo, cereales integrales molidos, incluyendo las fracciones no amiláceas, como residuos de gérmenes y fibras. La materia prima como, por ejemplo, cereales integrales, puede reducirse en tamaño de partícula, por ejemplo, mediante molienda, para abrir la estructura y permitir un procesamiento posterior. Se prefieren dos procesos de acuerdo con la invención: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco se muelen y utilizan granos enteros. La molienda en húmedo brinda una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica a menudo en lugares donde el hidrolizado de almidón se usa en la producción de, por ejemplo, jarabes. Tanto la molienda en seco como en húmedo son bien conocidas en la técnica del procesamiento de almidón y pueden usarse en un proceso de la invención. En una realización, el tamaño de partícula se reduce hasta un valor entre 0.05 y 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm, o de modo que al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 % del material que contiene almidón pase a través de un tamiz con una malla de 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente una malla de 0.1-0.5 mm.
[0074] La licuefacción se lleva a cabo en presencia de una alfa-amilasa, preferiblemente una alfa-amilasa bacteriana y/o una alfa-amilasa fúngica ácida. En una realización, también está presente una fitasa durante la licuefacción.
[0075] Durante la licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más cortas (maltodextrinas) mediante una alfa-amilasa. La licuefacción se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión en caliente de tres pasos. La suspensión se calienta entre 60 y 95 °C (por ejemplo, 70-90°C) y se le añade una alfaamilasa para iniciar la licuefacción (dilución).
[0076] La suspensión puede, en una realización, cocinarse a chorro a 95-140 °C, por ejemplo, a 105-125°C, durante aproximadamente 1-15 minutos, por ejemplo, alrededor de 3-10 minutos, especialmente alrededor de 5 minutos. Luego, la suspensión se enfría a 60-95°C y se agrega más alfa-amilasa para obtener la hidrólisis final (licuefacción secundaria). El proceso de cocción a chorro se lleva a cabo a un pH de 4.5 a 6.5, normalmente a un pH entre 5 y 6. La alfa-amilasa se puede añadir como una dosis única, por ejemplo, antes de la cocción a chorro.
[0077] El proceso de licuefacción se lleva a cabo a una temperatura de entre 70 y 95 °C, por ejemplo, entre 80 y 90 °C, por ejemplo, alrededor de 85 °C, durante aproximadamente 10 minutos a 5 horas, normalmente durante 1 a 2 horas. El pH está entre 4 y 7, por ejemplo, entre 5.5 y 6.2. Para garantizar una estabilidad óptima de la enzima en estas condiciones, se puede añadir calcio opcionalmente (para proporcionar 1-60 ppm de iones de calcio libres, por ejemplo, aproximadamente 40 ppm de iones de calcio libres). Después de dicho tratamiento, el almidón licuado tendrá normalmente un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.
[0078] Generalmente, la licuefacción y las condiciones de licuefacción son bien conocidas en la técnica.
[0079] Los ejemplos de alfa-amilasas se describen en la sección "Alfa-amilasas" más adelante.
[0080] La sacarificación se puede llevar a cabo utilizando condiciones bien conocidas en la técnica con una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular una glucoamilasa o una beta-amilasa y, opcionalmente, una enzima desramificadora, como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, una etapa de sacarificación completa puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. Sin embargo, es común hacer una presacarificación de típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente alrededor de 60 °C, seguida de sacarificación completa durante la fermentación en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a una temperatura en el rango de 20-75 °C, por ejemplo, 25-65 °C y 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH de aproximadamente entre 4 y 5, normalmente alrededor de pH 4.5.
[0081] Las etapas de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo secuencial o simultáneamente. En una realización, la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente (se denominan "SSF"). No hay una etapa de retención para la sacarificación, lo que significa que el organismo fermentador, como la levadura, y la(s) enzima(s), se agregan de manera conjunta. La SSF se lleva a cabo típicamente a una temperatura de 20-40 °C, por ejemplo, 26-34 °C, preferiblemente alrededor de 32 °C, cuando el organismo fermentador es levadura, por ejemplo, una cepa del género Saccharomyces, en particular una cepa de Saccharomyces cerevisiae, especialmente cuando el producto de fermentación es etanol.
[0082] Otros productos de fermentación pueden fermentarse en condiciones y temperaturas bien conocidas por los expertos en la materia, adecuadas para el organismo fermentador en cuestión.
[0083] El producto de fermentación puede recuperarse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por destilación. Los ejemplos de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos, incluidas las glucoamilasas, se describen en la sección "Enzimas" más adelante.
[0084] En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la conversión de un material que contiene almidón en azúcares/dextrinas, los pasos de:
(x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y
(y) formar una suspensión que comprende agua y el material que contiene almidón.
[0085] Los métodos para reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una realización, el material que contiene almidón se muele para reducir el tamaño de partícula.
[0086] La suspensión acuosa puede contener del 10 a 55 % en peso de materia seca (MS), preferiblemente del 25­ 45 % en peso de materia seca (MS), más preferiblemente del 30-40 % en peso de materia seca (MS) del material que contiene almidón.
[0087] En una realización, la composición celulolítica y/o la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, por ejemplo, la glucoamilasa, se agregan durante la fermentación o la SSF de acuerdo con el proceso de la invención en combinación con una proteasa. Esto proporciona un mayor rendimiento de etanol. Esto también proporciona beneficios, por ejemplo, mejora la extracción de aceite en la parte final del proceso.
Materiales que contienen almidón
[0088] Cualquier material de partida adecuado que contenga almidón puede usarse en un proceso de la presente invención. El material de partida se selecciona generalmente basándose en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materiales de partida que contienen almidón, adecuados para usar en los procesos de la presente invención, incluyen cebada, judías, mandioca, cereales, maíz, milo, guisantes, patatas, arroz, centeno, sagú, sorgo, batatas, tapioca, trigo. y cereales integrales, o cualquier mezcla de los mismos. El material que contiene almidón también puede ser un tipo de maíz y cebada ceroso o no ceroso. En una realización preferida, el material que contiene almidón es maíz. En una realización preferida, el material que contiene almidón es trigo.
Productos de fermentación
[0089] El término "producto de fermentación" se refiere a un producto creado por un método o proceso que incluye la fermentación usando un organismo de fermentación. Los productos de fermentación incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (por ejemplo, H2 y CO2); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas. En una realización preferida el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, licores neutros potables; o etanol industrial o productos utilizados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria del cuero y la industria tabacalera. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, cerveza negra, porter, lager, amargas, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido calórico o cerveza light. En una realización preferida, el producto de fermentación es etanol.
Organismos fermentadores
[0090] El término "organismo fermentador" se refiere a cualquier organismo, incluyendo los organismos bacterianos y fúngicos, tales como levaduras y hongos filamentosos, adecuados para producir un producto de fermentación deseado. Los organismos fermentadores adecuados según la invención son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares fermentables, tales como arabinosa, fructosa, glucosa, maltosa, manosa o xilosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado.
[0091] Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen organismos fúngicos como la levadura. La levadura preferida incluye cepas de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces uvarum; cepas de pichia, en particular Estipitis pichia, por ejemplo, Estipitis pichia CBS 5773 o Pichia pastoris; cepas de cándida, en particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis, o Candida utilis. Otros organismos fermentadores incluyen cepas de Hansenula, en particular Hansenula anomala o Hansenula polimorfa; cepas de Kluyveromyces, en particular Kluyveromyces fragilis o Kluyveromyces marxianus; y cepas de Schizosaccharomyces, en particular Schizosaccharomyces pombe.
[0092] Los organismos fermentadores bacterianos preferidos incluyen cepas de Escherichia, en particular Escherichia coli, cepas de Zymomonas, en particular Zymomonas mobilis, cepas de zymobacter, en particular zymobacter palmae, cepas de Klebsiella, en particular Klebsiella oxitoca, cepas de Leuconostoc, en particular Leuconostoc mesenteroides, cepas de Clostridium, en particular Clostridium butyricum, cepas de Enterobacter, en particular Enterobacter aerogenes y cepas de Thermoanaerobacter, en particular Thermoanaerobacter BG1L1 (Appl. Microbiol. Biotech. 77: 61-86), Thermoanaerobacter etanolicus, Thermoanaerobacter mathranii o Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. También se contemplan las cepas de Lactobacillus, así como las cepas de Corynebacterium glutamicum R, Bacillus thermoglucosidasius y Geobacillus thermoglucosidasius.
[0093] En una realización, el organismo fermentador es un organismo de fermentación de azúcar C6, como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.
[0094] En una realización, el organismo fermentador es un organismo de fermentación de azúcar C5, como una cepa de, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.
[0095] En una realización, el organismo fermentador se añade al medio de fermentación de manera que el recuento de organismos fermentadores viables, como la levadura, por ml de medio de fermentación esté en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente alrededor de 5*107.
[0096] La levadura es el organismo fermentador preferido para la fermentación de etanol. Se prefieren las cepas de Saccharomyces, especialmente las cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente cepas que sean resistentes a altos niveles de etanol, es decir, hasta, por ejemplo, aproximadamente un 10, 12, 15 o 20 % o más en volumen de etanol.
[0097] En una realización, la levadura que utiliza C5 es una cepa de Saccharomyces cerevisiae descrita en WO 2004/085627.
[0098] En una realización, el organismo fermentador es una célula microbiana eucariota C5 descrita en WO 2010/074577 (Nedalco).
[0099] En una realización, el organismo fermentador es una célula eucariota C5 transformada capaz de isomerizar directamente xilosa a la xilosa descrita en US 2008/0014620.
[0100] En una realización, el organismo fermentador es una célula de fermentación de azúcar C5 descrita en WO 2009/109633.
[0101] La levadura comercialmente disponible incluye LNF SA-1, LNF BG-1, LNF PE-2 y LNF CAT-1 (disponible en LNF Brasil), levadura RED STAR™ y eThANOL RED™ (disponible en Fermentis/Lesaffre, EE. UU.), FALI (disponible en Fleischmann's Yeast, EE. UU.), levadura fresca SUpERSTART y THERMOSACC™ (disponible en Ethanol Technology, WI, EE. UU.), BIOFEr M AFT y XR (disponible en NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE. UU.), Ge RT STRAn D (disponible en Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible en MSM Specialties).
[0102] De acuerdo con la invención, el organismo fermentador capaz de producir un producto de fermentación deseado a partir de azúcares fermentables se cultiva preferiblemente en condiciones precisas a una tasa de crecimiento particular. Cuando el organismo fermentador se introduce/añade al medio de fermentación, el organismo fermentador inoculado pasa por una serie de etapas. Inicialmente no se produce crecimiento. Este período se denomina "fase de retraso" y puede considerarse un periodo de adaptación. Durante la siguiente fase, denominada "fase exponencial", la tasa de crecimiento aumenta gradualmente. Después de un período de máximo crecimiento, la velocidad cesa y el organismo en fermentación entra en "fase estacionaria". Después de un periodo adicional de tiempo, el organismo fermentador entra en la "fase de muerte", en la que disminuye el número de células viables. Fermentación
[0103] Las condiciones de fermentación se determinan en basándose en, por ejemplo, el tipo de material vegetal, los azúcares fermentables disponibles, los organismos fermentadores y/o el producto de fermentación deseado. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de fermentación adecuadas. La fermentación puede, según la invención, llevarse a cabo en las condiciones utilizadas convencionalmente. Los procesos de fermentación preferidos son los procesos anaeróbicos.
[0104] Por ejemplo, las fermentaciones pueden llevarse a cabo a temperaturas de hasta 75 °C, por ejemplo, entre 40-70 °C, tal como entre 50-60 °C. Sin embargo, también se conocen bacterias con un óptimo de temperatura significativamente más bajo hasta alrededor de la temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C). Se pueden encontrar ejemplos de organismos fermentadores adecuados en la sección "Organismos fermentadores" anterior.
[0105] Para la producción de etanol con levadura, la fermentación puede durar de 24 a 96 horas, en particular de 35 a 60 horas. En una realización, la fermentación se lleva a cabo a una temperatura entre 20 y 40 °C, preferiblemente entre 26 y 34 °C, en particular alrededor de 32 °C. En una realización, el pH es de pH 3 a 6, preferiblemente alrededor de pH 4 a 5.
[0106] Otros productos de fermentación pueden fermentarse a temperaturas conocidas por el experto en la técnica como adecuadas para el organismo de fermentación en cuestión.
[0107] La fermentación se lleva a cabo típicamente a un pH en el rango entre 3 y 7, preferiblemente de pH 3.5 a 6, por ejemplo, alrededor de pH 5. Las fermentaciones normalmente duran de 6 a 96 horas.
[0108] Los procesos de la invención se pueden realizar por lotes o como un proceso continuo. Las fermentaciones pueden llevarse a cabo en un sistema de ultrafiltración en el que el retentato se mantiene bajo recirculación en presencia de sólidos, agua y el organismo fermentador, y en el que el permeato es el líquido que contiene el producto de fermentación deseado. Se contemplan igualmente métodos/procesos realizados en reactores de membrana continua con membranas de ultrafiltración y donde el retentato se mantiene bajo recirculación en presencia de sólidos, agua y los organismos fermentadores y donde el permeato es el líquido que contiene el producto de fermentación.
[0109] Después de la fermentación, el organismo fermentador puede separarse de la suspensión fermentada y reciclarse.
Medio de fermentación
[0110] La frase "medios de fermentación" o "medio de fermentación" se refiere al entorno en el que se lleva a cabo la fermentación y comprende el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de carbohidratos metabolizada por el(los) organismo(s) fermentadores.
[0111] El medio de fermentación puede comprender otros nutrientes y estimulador(es) del crecimiento para el(los) organismo(s) fermentador(es). Los estimuladores de nutrientes y crecimiento se utilizan ampliamente en la técnica de la fermentación e incluyen fuentes de nitrógeno, como el amoníaco; vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.
Recuperación
[0112] Después de la fermentación el producto de fermentación puede separarse del medio de fermentación. El medio de fermentación se puede destilar para extraer el producto de fermentación deseado o el producto de fermentación deseado se puede extraer del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o de filtración de membrana. Alternativamente, el producto de fermentación puede recuperarse por separación. Los métodos para la recuperación son bien conocidos en la técnica.
Enzimas
[0113] La(s) enzima(s) y los polipéptidos descritos a continuación deben usarse en una "cantidad eficaz" en los procesos de la presente invención. Lo siguiente debe leerse en el contexto de la descripción de la enzima en la sección "Definiciones" anterior.
Composiciones celulolíticas utilizadas en un proceso de la invención
[0114] La composición celulolítica utilizada en un proceso de la invención para fabricar productos de fermentación puede derivar de cualquier microorganismo.
[0115] En una realización, la composición celulolítica se obtiene de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei; una cepa de Humicola, por ejemplo, una cepa de Humicola insolens y/o una cepa de Chrysosporium, por ejemplo, una cepa de Chrysosporium lucknowense.
[0116] En una realización preferida, la composición celulolítica se obtiene de una cepa de Trichoderma reesei.
[0117] La composición celulolítica puede comprender uno o varios de los siguientes polipéptidos, incluyendo las enzimas: polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica, beta-glucosidasa, Cb Hi y CBHII, o una mezcla de dos, tres o cuatro de los mismos.
[0118] La composición celulolítica puede comprender algo de hemicelulasa, como, por ejemplo, xilanasa y/o betaxilosidasa. La hemicelulasa puede provenir del organismo productor de la composición celulolítica o de otras fuentes, por ejemplo, la hemicelulasa puede ser ajena al organismo productor de la composición celulolítica, como, por ejemplo, Trichoderma reesei.
[0119] En una realización preferida, el contenido de hemicelulasa en la composición celulolítica constituye menos del 10 % en peso, por ejemplo, menos del 5 % en peso de la composición celulolítica.
[0120] En una realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa.
[0121] En una realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa.
[0122] En otra realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa y una CBH.
[0123] En otra realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa y una CBHI.
[0124] En otra realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa y una CBHI.
[0125] En otra realización, la composición celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBHI y una CBHII.
[0126] En otra realización, la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa, una CBHI y una CBHII.
[0127] La composición celulolítica puede comprender además una o varias enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina.
[0128] En una realización, la celulasa es una o varias enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa.
[0129] En una realización, la endoglucanasa es una endoglucanasa I.
[0130] En una realización, la endoglucanasa es una endoglucanasa II.
Beta-glucosidasa
[0131] En una realización la variante tiene al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento.
[0132] La beta-glucosidasa es de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, como, por ejemplo, la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 6 en el presente documento) que comprende una o varias sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G9lL, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y; por ejemplo, una variante de la misma con las siguientes sustituciones:
• F100D S283G N456E F512Y;
• L89M G91L 1186V 1140V;
• 1186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y.
[0133] En una realización, el número de sustituciones está entre 1 y 4, por ejemplo 1,2, 3 o 4 sustituciones.
[0134] En una realización, la variante comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 100, una sustitución en una posición correspondiente a la posición 283, una sustitución en una posición correspondiente a la posición 456 y/o una sustitución en una posición correspondiente a la posición 512.
[0135] En una realización preferida, la variante de beta-glucosidasa comprende las siguientes sustituciones: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr en la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento.
[0136] En una realización preferida, la beta-glucosidasa tiene un valor de carga ED50 relativo de menos de 1.00, preferiblemente menos de 0.80, por ejemplo, preferiblemente menos de 0.60, como entre 0.1 y 0.9, como entre 0.2 y 0.8, como 0.30 y 0.70. .
Polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica
[0137] La composición celulolítica usada de acuerdo con la invención puede comprender en una realización uno o más polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica. En una realización, la composición enzimática comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica como, por ejemplo, una derivada del género Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, como la descrita en WO 2005/074656 como SEQ ID N.°: 2; o una derivada del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, como la descrita en WO 2005/074647 como SEQ ID N.°: 7 y SEQ ID N.°: 8; o una derivada de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, como la descrita en WO 2010/138754 como SEQ ID N.°: 2; o una derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii, como la descrita en WO 2011/041397 o como la SEQ ID N.°: 8 en el presente documento
[0138] En una realización, el polipéptido GH61 de Penicillium sp. que tiene actividad potenciadora celulolítica o su homólogo se seleccionan del grupo que consiste en:
(i) un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica que comprende el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 8 en el presente documento;
(ii) un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 8 en el presente documento;
(iii) un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 7 en el presente documento; y
(iv) un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica codificado por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de astringencia alta, por ejemplo, condiciones de astringencia muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la s Eq iD N.°: 7 en el presente documento o con el complemento de longitud completa de la misma.
Celobiohidrolasa I
[0139] La composición celulolítica utilizada según la invención puede comprender en una realización una o varias CBH I (celobiohidrolasas I). En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBHI), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, la Cel7A CBHI descrita en la SEQ ID N.°: 6 en WO 2011/057140 o la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento, o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei.
[0140] En una realización, la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus o su homóloga se seleccionan del grupo que consta de:
(i) una celobiohidrolasa I que comprende el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento; (ii) una celobiohidrolasa I que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento;
(iii) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1 en el presente documento; y
(iv) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de astringencia alta, por ejemplo, condiciones de astringencia muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 1 en el presente documento o con el complemento de longitud completa de la misma. Celobiohidrolasa II
[0141] La composición celulolítica utilizada según la invención puede comprender en una realización una o más CBH II (celobiohidrolasa II). En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa II (CBHII), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, la de la SEQ ID N.°: 4 del presente documento o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, o una cepa del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, por ejemplo, la celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris.
[0142] En una realización, la celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus o su homóloga se seleccionan del grupo que consta de:
(i) una celobiohidrolasa II que comprende el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento; (ii) una celobiohidrolasa II que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento;
(iii) una celobiohidrolasa I codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70 %, por ejemplo, un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 3 en el presente documento; y
(iv) una celobiohidrolasa II codificada por un polinucleótido que se hibrida al menos en condiciones de astringencia alta, por ejemplo, condiciones de astringencia muy alta, con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 3 en el presente documento o con el complemento de longitud completa de la misma. Composiciones celulolíticas
[0143] En una realización, la composición celulolítica comprende una composición celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (WO 2005/074656) y una proteína de fusión beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).
[0144] En otra realización, la composición celulolítica comprende una composición celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (SEQ ID N.°: 2 en Wo 2005/074656) y una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 2 de WO 2005/047499).
[0145] En otra realización, la composición celulolítica comprende una composición celulolítica de Trichoderma reesei que comprende además un polipéptido GH61A de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica descrita en WO 2011/041397, una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 2 de WO 2005/047499) o una variante de las mismas con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y.
[0146] La composición enzimática de la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para su uso, como, por ejemplo, un caldo de fermentación crudo con o sin células eliminadas, un lisado celular con o sin residuos celulares, una composición enzimática purificada o semipurificada o una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de Trichoderma, como fuente de las enzimas.
[0147] La composición enzimática puede ser un polvo o granulado seco, un granulado que no se convierte en polvo, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las composiciones de enzimas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con procesos establecidos.
Alfa-amilasas
[0148] De acuerdo con la invención, puede usarse cualquier alfa-amilasa, por ejemplo, de origen fúngico, bacteriano o vegetal. En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, por ejemplo, una alfa-amilasa ácida fúngica o ácida bacteriana. El término "alfa-amilasa ácida" se refiere a una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) que, añadida en una cantidad eficaz, tiene una actividad óptima a un pH en el intervalo de 3 a 7, preferiblemente de 3.5 a 6, o más preferiblemente de 4 -5.
Alfa-amilasas bacterianas
[0149] Una alfa-amilasa para el uso en la presente invención puede ser una alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo, derivada de Bacillus. En una realización preferida la alfa-amilasa de Bacillus se obtiene de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis, pero también puede obtenerse de otros Bacillus sp.
[0150] Los ejemplos específicos de alfa-amilasas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens de la SEQ ID N.°: 5 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis de la SEQ ID N.°: 4 en WO 99/19467 y la alfaamilasa de Bacillus stearothermophilus de la SEQ ID N.°: 3 en WO 99/19467. En una realización, la alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con cualquiera de las secuencias que se muestran en las SEQ ID N.°: 3, 4 o 5, respectivamente, en WO 99/19467.
[0151] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido, especialmente uno descrito en cualquiera de las siguientes: WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, y WO 02/10355. Las variantes específicas de alfa-amilasa se describen en las patentes EE. UU. n.° 6.093.562, 6.187.576 y 6.297.038 e incluyen las variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) que tienen una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179 a G182, preferiblemente una doble deleción descrita en WO 96/23873 (véase, por ejemplo, página 20, líneas 1-10), preferiblemente correspondientes a delta(181-182) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus establecida en la SEQ ID N.°: 3 descrita en WO 99/19467 o la eliminación de los aminoácidos R179 y G180 utilizando la SEQ ID N.°: 3 en WO 99/19467 para numeración. Se prefieren aún más las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente las alfaamilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una doble deleción correspondiente a una delta(181-182) y además comprenden una sustitución N193F (también denominada 1181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la BSG alfa-amilasa de tipo salvaje establecida en la SEQ ID N.°: 3 descrita en WO 99/19467.
Alfa-amilasas híbridas bacterianas
[0152] La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa híbrida, por ejemplo, una alfa-amilasa que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (que se muestra en la SEQ ID N.°: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa obtenida de Bacillus amyloliquefaciens (se muestra en la SEQ ID N.°: 5 de WO 99/19467), con una o varias, especialmente todas, de las siguientes sustituciones:
G48A T49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis en la SEQ ID N.°: 4 de WO 99/19467). También se prefieren las variantes que tienen una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras alfa-amilasas de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la deleción de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la deleción de E178 y G179 (usando la SEQ ID N.°: 5 de WO 99/19467 para la numeración de las posiciones).
[0153] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana se dosifica en una cantidad de 0.0005-5 KNU por g de MS (materia seca), preferiblemente 0.001-1 KNU por g de MS, por ejemplo, alrededor de 0.050 KNU por g de MS.
Alfa-amilasas fúngicas
[0154] Las alfa-amilasas fúngicas incluyen alfa-amilasas derivadas de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, alfaamilasas de Aspergillus kawachii, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae.
[0155] Una alfa-amilasa fúngica ácida preferida es una alfa-amilasa que presenta una alta identidad, es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad con la parte madura de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N.°: 10 en WO 96/23874.
[0156] Otra alfa-amilasa ácida preferida se obtiene de una cepa de Aspergillus niger. En una realización preferida, la alfa-amilasa fúngica ácida es una alfa-amilasa de Aspergillus niger divulgada como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL con el número de acceso principal P56271 y descrita en WO 89/01969 (Ejemplo 3). Una alfa-amilasa fúngica ácida comercialmente disponible derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible en Novozymes A/S, Dinamarca).
[0157] Otras alfa-amilasas de tipo salvaje incluyen aquellas derivadas de una cepa de Meripilus y Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Meripilus giganteus o Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178).
[0158] En una realización preferida, la alfa-amilasa se deriva de Aspergillus kawachii (Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; y además como EMBL: #AB008370).
[0159] La alfa-amilasa fúngica también puede ser una enzima de tipo salvaje que comprende un dominio de unión al almidón (SBD) y un dominio catalítico de alfa-amilasa, o una variante del mismo.
Alfa-amilasas híbridas fúngicas
[0160] En una realización preferida, la alfa-amilasa ácida fúngica es una alfa-amilasa híbrida. Los ejemplos de alfaamilasas híbridas fúngicas incluyen las descritas en WO 2005/003311, la publicación de solicitud de patente EE. UU. n.° 2005/0054071 (Novozymes) y WO 2006/069290 (Novozymes). Una alfa-amilasa híbrida puede comprender un dominio catalítico (CD) de alfa-amilasa y un dominio/módulo de unión a carbohidratos (CBM), tal como un dominio de unión al almidón (SBD), y opcionalmente un enlazador.
[0161] Los ejemplos de alfa-amilasas híbridas incluyen las descritas en las tablas 1 a 5 de los ejemplos en WO 2006/069290 incluyendo la variante con el dominio catalítico JA118 y el SBD de Athelia rolfsii (SeQ ID N.°: 100 en WO 2006/069290), la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador AMG de Athelia rolfsii y SBD (SEQ ID N.°: 101 en WO 2006/069290), la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con conector de glucoamilasa y SBD de Aspergillus niger (que se describe en la tabla 5 como una combinación de secuencias de aminoácidos SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 72 y SEQ ID N.°: 96 en la solicitud EE. UU. n.° 11/316.535) o como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 y la SEQ ID N.°: 11 en el presente documento, y la alfa-amilasa de Meripilus giganteus con enlazador de glucoamilasa Athelia rolfsii y SBD (SEQ ID N.°: 102 en WO 2006/069290). Otras alfa-amilasas híbridas se enumeran en las tablas 3, 4, 5 y 6 en el ejemplo 4 de la solicitud EE. UU. n.° 11/316.535 y WO 2006/069290.
[0162] En una realización preferida, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus. En una realización, la alfa-amilasa es un híbrido que comprende además un enlazador y un módulo de unión a carbohidratos. En una realización, la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus tiene un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un SBD descritos como V039 en la tabla 5 en Wo 2006/069290 o la SEQ ID N.°: 11 en el presente documento. Se contemplan específicamente las variantes de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus descritas en WO2013/006756 [0163] La variante de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus puede comprender una sustitución en una o varias posiciones correspondientes a las posiciones 128, 143, 141, 192, 20, 76, 123, 136, 142, 165, 219, 224, 265, 383 y 410 del polipéptido maduro de la s Eq ID N.°: 11, donde la variante tiene actividad de alfa amilasa.
[0164] En una realización, la variante de alfa amilasa tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 11.
[0165] En una realización, la alfa-amilasa original tiene al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % , al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % y/o al menos el 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID N.°: 11.
[0166] En las realizaciones preferidas, la variante de alfa-amilasa comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones: D165M; Y141W; y 141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H+Y141W; G20S Y141W; A76G Y141W; G128D Y141W; G128D D143N; P219C Y141W; N142D D143N; Y141W K192R; Y141W D143N; Y141W N383R; Y141W P219C A265C; Y141W N142D D143N; Y141W K192R V410A; G128D Y141W D143N; Y141W D143N P219C; Y141W D143N K192R; G128D D143N K192R; Y141W D143N K192R P219C; G128D Y141W D143N K192R; o G128D Y141W D143N K192R P219C (usando la SEQ ID N.°: 11 para la numeración).
[0167] Otros ejemplos de alfa-amilasas híbridas incluyen las descritas en la publicación de solicitud de patente n.° 2005/0054071, incluyendo las descritas en la tabla 3 en la página 15, como la alfa-amilasa de Aspergillus niger con enlazador de Aspergillus kawachii y dominio de unión al almidón.
[0168] Otras alfa-amilasas presentan un alto grado de identidad de secuencia con cualquiera de las alfa-amilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad con las secuencias enzimáticas maduras descritas anteriormente.
[0169] Se puede añadir una alfa-amilasa ácida según la invención en una cantidad de 0.001 a 10 AFAU/g MS, preferiblemente de 0.01 a 5 AFAU/g MS, especialmente de 0.3 a 2 AFAU/g MS o de 0.001 a 1 FAU-F/ g MS, preferiblemente de 0.01 a 1 FAU-F/g MS.
Productos comerciales de alfa-amilasa
[0170] Las composiciones comerciales preferidas que comprenden alfa-amilasa incluyen MYCOLASE™ (MSM), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC y SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™ L-40 000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ ALPHA,, SPEZYME™ DELTA AA, GC358, GC980, SPEZYME™ CL y SPEZYME™ RSL (Danisco A/S), y la alfa-amilasa fúngica ácida de Aspergillus niger denominada SP288 (disponible en Novozymes A/S, Dinamarca).
Enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos (enzimas sacarificantes)
[0171] El término "enzima generadora de fuentes de carbohidratos" incluye glucoamilasa (un generador de glucosa), beta-amilasa y amilasa maltogénica (ambos generadores de maltosa) y también alfa-glucosidasa, isoamilasa y pululanasa. Una enzima generadora de fuentes de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que puede ser utilizado como fuente de energía por los organismos de fermentación en cuestión, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invención para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol. El carbohidrato generado puede convertirse directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, preferiblemente etanol. Según la invención, se puede usar una mezcla de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos. Las mezclas incluyen combinaciones que comprenden al menos una glucoamilasa y una alfa-amilasa, especialmente una amilasa ácida, incluso más preferiblemente una alfa-amilasa fúngica ácida.
[0172] La relación entre la actividad de la glucoamilasa (AGU) y la actividad de la alfa-amilasa fúngica ácida (FAU-F) (es decir, AGU por FAU-F) puede ser en una realización preferida de la invención entre 0.1 y 100 AGU/FAU-F, en particular entre 2 y 50 AGU/FAU-F, por ejemplo, en el rango de 10-40 AGU/FAU- F, especialmente cuando se realiza una fermentación en un solo paso (hidrólisis de almidón crudo - RSH), es decir, cuando la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente (es decir, sin un paso de licuefacción).
[0173] En un proceso convencional de almidón a etanol (es decir, incluyendo un paso de licuefacción), la relación puede ser preferiblemente como se define en EP 140410, especialmente cuando la sacarificación y la fermentación se realizan simultáneamente.
Glucoamilasas
[0174] Una glucoamilasa puede obtenerse de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger (Boel et al., 1984, EMBO J.
3(5): 1097-1102), o variantes de las mismas, como las descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori descrita en WO 84/02921, la glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con estabilidad térmica mejorada: G137A y G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); enlaces disulfuro, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; e introducción de residuos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.
[0175] Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasa de Athelia rolfsii (anteriormente designado Corticium rolfsii) (ver patente EE. UU. n.° 4.727.026 y Nagasaka et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotech. 50: 323-330), glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente EE. UU. N.° Re. 32.153), y Talaromyces thermophilus ( patente EE. UU. n.° 4.587.215).
[0176] Las glucoamilasas bacterianas incluyen glucoamilasas de Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831), Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea y Leucopaxillus giganteus, todas descritas en WO 2006/069289; o Peniophora rufomarginata descritas en WO2007/124285 o PCT/US2007/066618; o una mezcla de las mismas. Puede usarse una glucoamilasa híbrida en la presente invención. Los ejemplos de glucoamilasas híbridas se describen en WO 2005/045018. Los ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida descrita en las tablas 1 y 4 del ejemplo 1.
[0177] La glucoamilasa puede tener un alto grado de identidad de secuencia con cualquiera de las glucoamilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad con las secuencias enzimáticas maduras mencionadas anteriormente.
[0178] Las composiciones de glucoamilasa comercialmente disponibles incluyen AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL y AMG™ E (de Novozymes A/S, Dinamarca); OPTIDEX™ 300, GC480™ y GC147™ (de Genencor Int., EE. UU.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de MSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int.).
Las glucoamilasas se pueden añadir en una cantidad de 0.02-20 AGU/g MS, preferiblemente 0.1-10 AGU/g MS, especialmente entre 1-5 AGU/g MS, por ejemplo, 0.1-2 AGU/g MS, por ejemplo 0.5 AGU/g MS o en una cantidad de 0.0001-20 AGU/g MS, preferiblemente 0.001-10 AGU/g MS, especialmente entre 0.01-5 AGU/g MS, por ejemplo 0.1­ 2 AGU/g MS.
Beta-amilasas
[0179] Una beta-amilasa (E.C 3.2.1.2) es el nombre que tradicionalmente se le da a las amilasas maltogénicas de actividad exo, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-alfa-glucosídicos en amilosa, amilopectina y polímeros de glucosa relacionados. Las unidades de maltosa se eliminan sucesivamente de los extremos de la cadena no reductora de forma escalonada hasta que la molécula se degrada o, en el caso de la amilopectina, hasta que se alcanza un punto de ramificación. La maltosa liberada tiene la configuración anomérica beta, de ahí el nombre de beta-amilasa.
[0180] Se han aislado beta-amilasas de varias plantas y microorganismos (Fogarty y Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology 15: 112-115). Estas beta-amilasas se caracterizan por tener un óptimo de temperatura en el rango de 40 °C a 65 °C y un pH óptimo en el rango de 4.5 a 7. Una beta-amilasa de cebada comercialmente disponible es NOVOZYM™ WBA de Novozymes A/S, Dinamarca y SPEZYME™ BBA 1500 de Genencor Int., EE. UU. Amilasas maltogénicas
[0181] La amilasa también puede ser una alfa-amilasa maltogénica (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, EC 3.2.1.133), que cataliza la hidrólisis de amilosa y amilopectina a maltosa en configuración alfa. Una amilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837 de Bacillus stearothermophilus está disponible comercialmente en Novozymes A/S. Las alfaamilasas maltogénicas se describen en las patentes EE. UU. n.° 4.598.048, 4.604.355 y 6.162.628.
[0182] La amilasa maltogénica se puede añadir en una cantidad de 0.05-5 mg de proteína total/gramo de MS o 0.05­ 5 MANU/g MS.
Fitasas
[0183] Puede usarse cualquier fitasa en un proceso de la presente invención. Las fitasas son enzimas que degradan los fitatos y/o el ácido fítico al hidrolizar específicamente el enlace éster entre el inositol y el fósforo. A la actividad de fitasa se le atribuye la disponibilidad de fósforo e iones en muchos ingredientes. En algunas realizaciones, la fitasa es capaz de liberar al menos un fosfato inorgánico a partir de un hexafosfato de inositol (por ejemplo, ácido fítico). Las fitasas se pueden agrupar según su preferencia por una posición específica del grupo éster de fosfato en la molécula de fitato en la que se inicia la hidrólisis (por ejemplo, 3-fitasa (EC 3.1.3.8) o 6-fitasa (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo de fitasa es la mioinositol-hexakifosfato-3-fosfohidrolasa.
[0184] Las fitasas se pueden obtener a partir de microorganismos tales como organismos fúngicos y bacterianos. Por ejemplo, la fitasa se puede obtener de hongos filamentosos como Aspergillus (por ejemplo, A. ficuum, A. fumigatus, A. niger, y A. terreus), Cladosporium, Mucor (por ejemplo, Mucor piriformis), Myceliophthora (por ejemplo, M. thermophila), Penicillium (por ejemplo, P. hordei (ATCC n.° 22053)), P. piceum (ATCC n.° 10519) o P. brevicompactum (ATCC n.° 48944), Talaromyces (por ejemplo, T. thermophilus), Thermomyces (WO 99/49740) y Trichoderma spp. (por ejemplo, T. reesei).
[0185] En una realización, la enzima degradante de fitato se obtiene a partir de levadura (por ejemplo, Arxula adeninivorans, Pichia anomala, Schwanniomyces occidentalis), bacterias gram-negativas (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) y bacterias gram-positivas (por ejemplo, Bacillus spp. tal como Bacillus subtilis).
[0186] La fitasa también se puede obtener de Citrobacter, Enterbacter o Peniophora.
[0187] En una realización, la fitasa se obtiene de Buttiauxiella spp., por ejemplo, B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiasa, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae. En algunas realizaciones, la fitasa es una fitasa descrita en WO 2006/043178 o en la solicitud de patente EE. UU n.° 11/714.487.
[0188] En una realización preferida, la fitasa tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, al menos un 93 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % al menos un 98 % y al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N.°: 31 de la solicitud de patente EE. UU. n.° 12/263.886.
[0189] Las fitasas disponibles comercialmente son NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHZYME (Danisco A/S, Diversa) y FINASE (AB Enzymes). El método para determinar la actividad de fitasa microbiana y la definición de una unidad de fitasa se describe en Engelen et al., 1994, Journal of AOAC International 77: 760-764. La fitasa puede ser una fitasa de tipo salvaje, una variante activa o un fragmento activo de la misma.
Pululanasas
[0190] Puede usarse cualquier pululanasa en un proceso de la presente invención. En una realización, la pululanasa es una pululanasa GH57, por ejemplo, una pululanasa obtenida de una cepa de Thermococcus,, incluyendo Thermococcus, sp. AM4, Thermococcus, sp. HJ21, Thermococcus barophilus, Thermococcus gammatolerans, Thermococcus hydrothermalis, Thermococcus kodakarensis, Thermococcus litoralis y Thermococcus onnurineus; o de una cepa de Pyrococcus, por ejemplo, Pyrococcus abyssi y Pyrococcus furiosus.
Proteasas
[0191] Puede añadirse una proteasa durante la presacarificación, la sacarificación, la fermentación y la sacarificación y fermentación simultáneas en los procesos antes mencionados que incluyen una etapa de licuefacción (es decir, donde el material que contiene almidón se gelatiniza). También se puede añadir una proteasa durante la fermentación en los procesos de almidón crudo antes mencionados (es decir, donde el material que contiene almidón no se gelatiniza). La proteasa puede ser cualquier proteasa. En una realización preferida la proteasa es una proteasa ácida de origen microbiano, preferentemente de origen fúngico o bacteriano. Se prefiere una proteasa fúngica ácida, pero también pueden usarse otras proteasas.
[0192] Las proteasas adecuadas incluyen proteasas microbianas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas preferidas son proteasas ácidas, es decir, proteasas caracterizadas por la capacidad de hidrolizar proteínas en condiciones ácidas por debajo de pH 7.
[0193] La proteasa fúngica ácida puede obtenerse de Aspergillus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium y Torulopsis. En particular, la proteasa se puede obtener de Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42(5), 927-933), Aspergillus niger (ver, por ejemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66) o Aspergillus oryzae, por ejemplo la proteasa pepA y proteasas ácidas de Mucor miehei o Mucor pusillus.
[0194] La proteasa puede ser una proteasa neutra o alcalina, por ejemplo, una proteasa derivada de una cepa de Bacillus. Una proteasa particular se deriva de Bacillus amyloliquefaciens y tiene la secuencia obtenible en Swissprot como número de acceso P06832. Las proteasas pueden tener al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos descrita en la base de datos Swissprot, número de registro P06832, por ejemplo, al menos un 92 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o particularmente al menos un 99 % de identidad.
[0195] La proteasa puede tener al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, como, por ejemplo, al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos descrita como la SEQ ID N.°: 1 en WO 2003/048353 o la SEQ ID N.°: 13 en este documento por ejemplo un 92 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o particularmente al menos un 99 % de identidad.
[0196] La proteasa puede ser una proteasa similar a la papaína seleccionada del grupo que consiste en proteasas dentro de EC 3.4.22.* (cisteína proteasa), por ejemplo, EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaína), EC 3.4.22.14 (actinidaína), EC 3.4.22.15 (catepsina L), Ec 3.4.22.25 (glicilendopeptidasa) y EC 3.4.22.30 (caricaína).
[0197] En una realización, la proteasa es una preparación de proteasa derivada de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus oryzae. En otra realización, la proteasa se deriva de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente Rhizomucor miehei. En otra realización, la proteasa es una preparación de proteasa, preferiblemente una mezcla de una preparación proteolítica derivada de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus oryzae, y una proteasa derivada de una cepa de Rhizomucor, preferiblemente Rhizomucor miehei.
[0198] Las proteasas de ácido aspártico se describen, por ejemplo, en Handbook of Proteolytic Enzymes, editado por A.J. Barrett, N.D. Rawlings y J.F. Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, Capítulo 270. Los ejemplos de proteasas de ácido aspártico incluyen, por ejemplo, las descritas en Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195-198; y Gomi et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem 57: 1095-1100.
[0199] La proteasa también puede ser una metaloproteasa, que se define como una proteasa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) proteasas pertenecientes a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas acidas);
(b) metaloproteasas pertenecientes al grupo M del manual antes mencionado;
(c) metaloproteasas aún no asignadas a clanes (designación: clan MX) o pertenecientes a cualquiera de los clanes MA, MB, MC, MD, ME, MF, MG, MH (tal como se define en las páginas 989-991 del manual antes mencionado);
(d) otras familias de metaloproteasas (tal como se define en las páginas 1448-1452 del manual antes mencionado);
(e) metaloproteasas con un motivo HEXXH;
(f) metaloproteasas con un motivo HEFTH;
(g) metaloproteasas pertenecientes a cualquiera de las familias M3, M26, M27, M32, M34, M35, M36, M41, M43 o M47 (tal como se define en las páginas 1448-1452 del manual antes mencionado);
(h) metaloproteasas pertenecientes a la familia M28E; y
(i) metaloproteasas pertenecientes a la familia M35 (tal como se define en las páginas 1492-1495 del manual antes mencionado).
[0200] En otras realizaciones particulares, las metaloproteasas son hidrolasas en las que el ataque nucleofílico a un enlace peptídico está mediado por una molécula de agua, que se activa mediante un catión metálico divalente. Ejemplos de cationes divalentes son zinc, cobalto o manganeso. El ion metálico puede mantenerse en su lugar mediante ligandos de aminoácidos. El número de ligandos puede ser cinco, cuatro, tres, dos, uno o cero. En una realización particular el número es dos o tres, preferentemente tres.
[0201] No existen limitaciones sobre el origen de la metaloproteasa utilizada en un proceso de la invención. En una realización, la metaloproteasa se clasifica como EC 3.4.24, preferiblemente EC 3.4.24.39. En una realización, la metaloproteasa es una metaloproteasa estable en ácido, por ejemplo, una metaloproteasa fúngica estable en ácido, por ejemplo, una metaloproteasa derivada de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670 (clasificada como EC 3.4.24.39). En otra realización, la metaloproteasa se deriva de una cepa del género Aspergillus, preferiblemente una cepa de Aspergillus oryzae.
[0202] En una realización, la metaloproteasa tiene un grado de identidad de secuencia con los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, o preferiblemente los aminoácidos 1 a 177 (el polipéptido maduro) de la SEQ ID N.°: 1 de WO 2010/008841 o la SEQ ID N.°: 13 en el presente documento (una metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus) de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 82 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, por ejemplo, un 99 %; y que tienen actividad de metaloproteasa. En realizaciones particulares, la metaloproteasa consta de una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad con la SEQ ID N.°: 1 o la SEQ ID N.°: 13 en el presente documento tal como se ha mencionado anteriormente.
[0203] La metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus es un ejemplo preferido de una metaloproteasa adecuada para el uso en un proceso de la invención. Otra metaloproteasa se deriva de Aspergillus oryzae y comprende la secuencia de SEQ ID N.°: 11 descrita en WO 2003/048353, o los aminoácidos -23-353; -23-374; -23-397; 1-353; 1­ 374; 1-397; 177-353; 177-374; o 177-397 de la misma, y la SEQ ID N.°: 10 descrita en WO 2003/048353.
[0204] Otra metaloproteasa adecuada para el uso en un proceso de la invención es la metaloproteasa de Aspergillus oryzae que comprende la SEQ ID N.°: 5 de WO 2010/008841, o una metaloproteasa es un polipéptido aislado que tiene un grado de identidad con la SEQ ID N.°: 5 de al menos aproximadamente un 80 %, al menos un 82 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 97 %; y que tienen actividad metaloproteasa. En realizaciones particulares, la metaloproteasa consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 5.
[0205] En una realización particular, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte o quince aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de la metaloproteasa de Thermoascus aurantiacus o Aspergillus oryzae.
[0206] En otra realización, una metaloproteasa tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en diez, nueve, ocho, siete, seis o cinco aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177, o 1 a 177 de las secuencias de aminoácidos de estas metaloproteasas, por ejemplo, en cuatro, en tres, en dos o en un aminoácido.
[0207] En realizaciones particulares, la metaloproteasa: a) comprende o b) consiste en
i) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de la SEQ ID N.°: 1 de WO 2010/008841;
ii) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177­ 374 o 177-397 de la SEQ ID N.°: 3 de WO 2010/008841;
iii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 5 de WO 2010/008841; o
variantes alélicas, o fragmentos, de las secuencias de i), ii) y iii) que tienen actividad de proteasa.
[0208] Un fragmento de los aminoácidos -178 a 177, -159 a 177 o 1 a 177 de la SEQ ID N.°: 1 de WO 2010/008841 o de los aminoácidos -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 o 177-397 de la SEQ ID N.°: 3 de WO 2010/008841 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados del extremo amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una realización, un fragmento contiene al menos 75 residuos de aminoácidos, o al menos 100 residuos de aminoácidos, o al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos, o al menos 160 residuos de aminoácidos, o al menos 165 residuos de aminoácidos, o al menos 170 residuos de aminoácidos, o al menos 175 residuos de aminoácidos.
[0209] En otra realización, la metaloproteasa se combina con otra proteasa, por ejemplo, una proteasa fúngica, preferiblemente una proteasa fúngica ácida.
[0210] Los productos disponibles comercialmente incluyen ALCALASE®, ESPERASE™, FLAVOURZYME™, NEUTRASE®, RENILASE®, NOVOZYM™ FM 2.0L e iZyme BA (disponible en Novozymes A/S, Dinamarca) y GC106™ y SPEZYME™ FAN de Genencor International, Inc., EE. UU.
[0211] La proteasa puede estar presente en una cantidad de 0.0001-1 mg de proteína enzimática por g de MS, preferiblemente de 0.001 a 0.1 mg de proteína enzimática por g de MS. Alternativamente, la proteasa puede estar presente en una cantidad de 0.0001 a 1 LAPU/g MS, preferiblemente de 0.001 a 0.1 LAPU/g Ms y/o de 0.0001 a 1 mAU-RH/g MS, preferiblemente de 0.001 a 0.1 mAU-RH/g MS.
Trehalasas
[0212] Las trehalasas son enzimas que degradan la trehalosa a su unidad de monosacáridos (es decir, glucosa). De acuerdo con la invención, la trehalasa puede ser una única trehalasa, o una combinación de dos o más trehalasas de cualquier origen, por ejemplo, origen vegetal, mamífero o microbiano (por ejemplo, de origen bacteriano o fúngico). En una realización, la trehalasa es de origen mamífero, como la trehalasa porcina. En una realización preferida, la trehalasa es de origen fúngico, preferiblemente de origen en la levadura. En una realización, la trehalasa se deriva de una cepa de Saccharomyces, por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En una realización preferida, la trehalasa se deriva de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei, por ejemplo, la descrita en la SEQ ID N.°: 12 en el presente documento.
[0213] Las trehalasas se clasifican en EC 3.2.1.28 (alfa,alfa-trehalasa) y EC. 3.2.1.93 (alfa,alfa-fosfotrehalasa). Las clases de EC se basan en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB). La descripción de las clases de EC se puede encontrar en Internet, por ejemplo, en "http://www.expasy.org/enzima/". Las trehalasas son enzimas que catalizan las siguientes reacciones: EC 3.2.1.28:
Alfa,alfa-trehalosa H2O = 2 D-glucosa;
EC 3.2.1. 93: Alfa,alfa-trehalosa 6-fosfato H2O <=> D-glucosa D-glucosa 6-fosfato;
[0214] Las dos clases de enzimas se denominan "trehalasas" en el contexto de la presente invención. En una realización preferida, la trehalasa se clasifica como EC 3.2.1.28. En otra realización, la trehalasa se clasifica como EC 3.2.1.93. En la realización, la trehalasa es una trehalasa neutra. En otra realización, la trehalasa es una trehalasa ácida.
[0215] Los ejemplos de trehalasas neutras incluyen, entre otros, trehalasas de Saccharomyces cerevisiae (Londesborouh et al. (1984) "Characterization of two trehalases from baker's yeast" Biochem J 219, 511-518; Mucor roxii (Dewerchin et al (1984), "Trehalase activity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxii spores", J. Bacteriol. 158, 575-579); Phycomyces blakesleeanus (Thevelein et al (1983), "Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilization during early germination of Phycomyces blakesleeanus spores" J. Gen Microbiol. 129, 719-726); Fusarium oxysporium (Amaral et al (1996), "Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii" Can. J Microbiol. 41, 1057-1062);
[0216] Los ejemplos de trehalasas neutras incluyen, entre otros, trehalasas de Saccharomyces cerevisiae (Parvaeh et al. (1996) "Purification and biochemical characterization of the ATH1 gene product, vacuolar acid trehalase from Saccharomyces cerevisiae" FEBS Lett. 391, 273-278); Neurospora crassa (Hecker et al (1973), Location of trehalase in the ascospores of Neurospora: Relation to ascospore dormancy and germination". J. Bacteriol. 115, 592-599); Chaetomium aureum (Sumida et al. (1989), "Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27. J. Ferment. Bioeng. 67, 83-86); Aspergillus nidulans (d'Enfert et al. (1997), "Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose". Mol. Microbiol. 24, 203­ 216); Humicola grisea (Zimmerman et al. (1990). "Purification and properties of an extracellular conidial trehalase from Humicola grisea var. thermoidea", Biochim. Acta 1036, 41-46); Humicola grisea (Cardello et al. (1994), "A cytosolic trehalase from the thermophilhilic fungus Humicola grisea var. thermoidea", Microbiology UK 140, 1671­ 1677; Scytalidium thermophilum (Kadowaki et al. (1996), "Characterization of the trehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum" Biochim. Biophys. Acta 1291, 199-205); y Fusarium oxysporium (Amaral et al (1996), "Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii" Can. J Microbiol. 41, 1057-1062).
[0217] También se conoce una trehalasa de la soja (Aeschbachetet al (1999) "Purification of the trehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA", Plant Physiol 119, 489-496).
[0218] Las trehalasas también están presentes en el intestino delgado y el riñón de los mamíferos.
[0219] La trehalasa comercialmente disponible incluye la trehalasa porcina disponible en SIGMA, EE. UU. (n.° de producto A8778).
[0220] La trehalasa puede añadir o estar presente en cualquier dosificación efectiva junto con la composición celulolítica durante la presacarificación o la sacarificación y/o la fermentación, que incluye, entre otras, de 1 a 500 unidades Sigma por litro de medio de fermentación, preferiblemente 10-100 unidades Sigma por litro de medio de fermentación.
Materiales y métodos
Celulasa A: Composición celulolítica derivada de Trichoderma reesei (CELLUCLAST™ 1.5 l, Novozymes)
[0221] Celulasa B: Composición celulolítica derivada de Trichoderma reesei que comprende el polipéptido GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica derivado de una cepa de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID N.°: 2 en Wo 2005/074656); beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (proteína de fusión descrita en WO 2008/057637); y xilanasa de Aspergillus aculeatus (descrita en WO 94/21785 como la SEQ ID N.°: 5 (denominada Xyl II).
[0222] Celulasa C: Composición celulolítica derivada de Trichoderma reesei que comprende el polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (SEQ ID N.°: 2 en WO 2005/074656), una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 2 en WO 2005/047499 o la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento).
[0223] Celulasa D: Composición celulolítica derivada de Trichoderma reesei que comprende el polipéptido GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica derivado de una cepa de Penicillium emersonii (SEQ iD N.°: 2 en WO 2011/041397 o la SEQ ID N.°: 8 en el presente documento), la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 2 en WO 2005/047499 o la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento) variante F100D, S283G, N456E, F512Y descrita en WO 2012/044915 o en la solicitud PCT en trámite PCT/US11/054185; la Cel7A CBH1 de Aspergillus fumigatus descrita como la SEQ ID N.°: 6 en WO2011/057140 y la SEQ ID N.°: 2 en el presente documento y la CBH II de Aspergillus fumigatus descrita como la SEQ ID N.°: 18 en WO 2011/057140 y como la SEQ ID N.°: 4 en el presente documento.
[0224] Glucoamilasa E: Glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 o la SEQ ID N.°: 9 en el presente documento, glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como la SEQ ID N.°: 2 en WO 06/69289 o la SEQ ID N.°: 10 en el presente documento, y alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD descritos como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 o la SEQ ID N.°: 11 en el presente documento (proporción entre componentes de aproximadamente 65:15:1).
[0225] Glucoamilasa E2: Glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 o la SEQ ID N.°: 9 en el presente documento, glucoamilasa de Trametes cingulata descrita como la SEQ ID N.°: 2 en WO 06/69289 o la SEQ ID N.°: 10 en el presente documento, y una variante de alfa-amilasa (AA PE96) de Rhizomucor pusillus con enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y SBD descritos como V039 en la tabla 5 en WO 2006/069290 o la SEQ ID N.°: 11 en el presente documento con las siguientes mutaciones: G128D+D143N usando la SEQ ID N.°: 11 para la numeración (proporción entre componentes de aproximadamente 25:6:1).
[0226] La Trehalasa de Trichoderma reesei se muestra en la SEQ ID N.°: 12 en el presente documento
[0227] Levadura: ETHANOL RED (Fermentis)
Métodos
Actividad de glucoamilasa (AGU)
[0228] La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades de glucoamilasa (AGU).
[0229] La unidad de glucoamilasa novo (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar de 37 °C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.
[0230] Se puede utilizar un sistema de autoanalizador. Se agrega mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa para que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH, lo que se determina utilizando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.
Figure imgf000026_0001
[0231] Un dosier (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible a petición en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de alfa-amilasa ácida
Determinación de FAU-F
[0232] FAU(F) Las unidades de alfa-amilasa fúngica (Fungamyl) se miden en relación con un estándar enzimático de una concentración declarada. El sustrato del ensayo es 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-alfa,D-maltoheptaósido (etilideno-G7-PNP).
Condiciones de reacción
Temperatura 37 °C
pH 7.15
Longitud de onda 405 nm
Tiempo de reacción 5 min
Tiempo de medición 2 min
[0233] Un dosier (EB-SM-0216.02) que describe este método estándar con más detalle está disponible a petición en Novozymes A/S, Dinamarca.
Determinación de AFAU
[0234] La actividad de alfa-amilasa ácida puede medirse en AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida), que se determinan en relación con un estándar enzimático. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degradan 5.260 mg de materia seca de almidón por hora en las condiciones estándar mencionadas a continuación.
[0235] La alfa-amilasa ácida, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucano-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza los enlaces alfa-1,4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad del color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especificadas.
ALFA-AMILASA
ALMIDÓN+YODO ----- ,no — > DEXTRINAS+OLIGOSACÁRIDOS
k \ = 5 r n9 n0 nm ™ , p l l Z ,J
azul/violeta t = 23 seg. decoloración
[0236] Condiciones estándar/condiciones de reacción:
Sustrato: Almidón soluble, aprox. 0.17 g/l
Tampón: Citrato, aprox. 0.03 M
Yodo (12): 0.03 g/l
CaCl2: 1.85 mM
pH: 2.50 ± 0.05
Temperatura de incubación: 40 °C
Tiempo de reacción: 23 segundos
Longitud de onda: 590 Nm
Concentración enzimática: 0.025 AFAU/ml
Rango de trabajo de la enzima: 0.01-0.04 AFAU/ml
[0237] Un dosier EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible previa solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de alfa-amilasa (KNU)
[0238] La actividad amilolítica se puede determinar utilizando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición del almidón de patata modificado por la enzima, seguida de la mezcla de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón, el color azul se debilita y gradualmente se convierte en un marrón rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.
[0239] Una Unidad Kilo Novo de alfa amilasa (KNU) se define como la cantidad de enzima que, en condiciones estándar (es decir, a 37 °C /- 0.05; Ca2+ 0.0003 M; y pH 5.6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.
[0240] Un dosier EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible previa solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de proteasa (AU)
[0241] La actividad de la proteasa puede determinarse con hemoglobina desnaturalizada como sustrato. En el método de Anson con hemoglobina para la determinación de la actividad de la proteasa, la hemoglobina desnaturalizada se digiere y la hemoglobina no digerida se precipita con ácido tricloroacético (TCA). La cantidad de producto soluble de TCA se determina con reactivo de fenol, que da un color azul con tirosina y triptófano.
[0242] Una Unidad Anson (AU) se define como la cantidad de enzima que en condiciones estándar (es decir, 25 °C, pH 7.5 y 10 min de tiempo de reacción) digiere la hemoglobina a una velocidad inicial tal que se libera por minuto una cantidad de producto soluble de TCA que da el mismo color con el reactivo fenol que un miliequivalente de tirosina.
[0243] Un dosier AF 4/5 que describe el método analítico con más detalle está disponible previa solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca.
SIGMA™ Ensayo enzimático para trehalasa
[0244] Una unidad SIGMA convertirá 1.0 micromol de trehalosa en 2.0 micromoles de glucosa por minuto a pH 5.7 a 37 °C (la glucosa liberada se determina a pH 7.5).
Determinación del ED50 relativo
[0245] El ED50 relativo (valor de carga de hidrólisis medio máximo) se determina como se describe en el ejemplo 3 usando el software Graphpad Prism 3.0 o una nueva versión u otro software similar.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Rendimiento de etanol para cuatro composiciones celulolíticas añadidas durante la SSF
[0246] Para todas las muestras se utilizó puré de maíz producido industrialmente por East Kansas Agri-Energy. Se descongeló un recipiente de 5 galones que contenía el puré licuado, se dividió en cantidades más pequeñas (botellas Nalgene con tapón de rosca de 1 litro) y se volvió a congelar. Se descongeló un litro de este puré durante aproximadamente 4 horas antes de comenzar este estudio. El puré se complementó con 3 ppm de penicilina y 1000 ppm de urea usando soluciones de 1 g/l de penicilina y 200 g/l de urea, respectivamente, y se ajustó a pH 5.0 con H2SO4 al 40 %. El contenido de materia seca del puré se midió en una balanza de humedad Mettler-Toledo (halógena HB43-S), con un valor resultante de 33 % Ms . Se añadieron aproximadamente 5 g del puré industrial en tubos de centrífuga cónicos de 15 ml con tapas abatibles (NUNC #362694). Se realizaron un total de 212 fermentaciones. Las enzimas se dosificaron de acuerdo con las especificaciones de dosificación de la siguiente tabla y el volumen de solución madre para agregar a la fermentación se determinó mediante la ecuación:
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000028_0001
[0247] Se añadió glucoamilasa E a todas las muestras y luego se dosificó una dosis de celulasa sobre este fondo. Se dosificó agua en cada muestra de modo que el volumen total añadido de enzima y agua fuera de aproximadamente 400 microlitros/5 g de muestra para producir un %MS final del 30 %. La levadura rehidratada (5.5 g de levadura Ethanol Red de Fermentis en 100 ml de agua del grifo a 35 °C incubada a 32 °C durante 30 minutos) se dosificó a 110 microlitros de solución de levadura en cada muestra de 5 g. Los tubos se pesaron en el momento 0 y luego se fermentaron durante 52 horas a 32 °C.
Análisis HPLC
[0248] Al final del tiempo de fermentación, 50 microlitros de H2SO4 al 40 % se añadió a cada muestra y se agitó en vórtice para asegurar la mezcla. Las muestras se centrifugaron a 1570 x g (3000 rpm) durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa Beckman Coulture (Allegra 6R) con rotor GH3.8 y luego se filtró en viales de HPLC a través de filtros de jeringa de 0.45 micras (Whatman) antes de enviarlos para el análisis de HPLC.
Sistema HPLC: Serie 1100/1200 de Agilent con software Chemstation
Desgasificador
Bomba cuadrática
Muestreador automático
Compartimento de columna con calentador
Detector de índice de refracción (IR)
Columna: Columna de exclusión de iones Bio-Rad HPX- 87H 300 mm x 7.8 mm piezas n.° 125-0140 Cartucho de protección Bio-Rad cation H piezas n.° 125-0129, piezas de soporte n.° 125-0131
Método: H2SO40.005 M fase móvil
Caudal de 0.6 ml/min
Temperatura de la columna - 65 °C
Temperatura del detector de IR - 55°C
[0249] El método cuantifica varios analitos usando estándares de calibración para dextrinas (DP4+), maltotriosa, maltosa, glucosa, fructosa, ácido acético, ácido láctico, glicerol y etanol. Se utiliza una calibración de 4 puntos que incluye el origen.
[0250] Los resultados del rendimiento de etanol y de los aumentos sobre el control a las 52 horas de fermentación se resumen en la fig. 1.
[0251] Los resultados muestran que las cuatro celulasas (composiciones celulolíticas) brindan un beneficio adicional significativo en el rendimiento de etanol cuando se añaden en una SSF además de la glucoamilasa E. Aunque la celulasa A proporciona más de un 1 % de incremento de etanol con una dosificación de 3000 microgramos EP/g MS, es inferior en comparación con la celulasa B, C y D. A 5000 microgramos EP/g MS, la celulasa B proporciona un aumento del rendimiento de etanol del 3.8 %. Las celulasas C y D dan como resultado rendimientos de etanol del 5.8-6.0 %, respectivamente, con una dosificación de 5000 microgramos de EP/gMS.
[0252] Los resultados muestran que las composiciones celulolíticas para hidrolizar materias primas celulósicas dan rendimientos de etanol significativamente mayores cuando se aplican durante la fermentación junto con glucoamilasa en puré de maíz licuado en concentraciones significativamente más bajas que la dosificación de 3 a 10 miligramos EP/g de celulosa de estos complejos de celulasa en la hidrólisis de lignocelulosas.
Ejemplo 2
Determinación del valor de carga ED50 relativo y la actividad específica de tipo salvaje de la beta-glucosidasa GH3A de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 6) y la variante F100D S283G N456E F512Y
[0253] Pretratamiento de rastrojo de maíz (PCS): El rastrojo de maíz se pretrató en el Laboratorio Nacional de Energía Renovable (en inglés Energy National Renewable Energy Laboratory o NREL) del Departamento de Energía de EE. UU. utilizando ácido sulfúrico al 1.4 % (p/v) durante 2 minutos a 190 °C. Los sólidos insolubles en agua en el rastrojo de maíz pretratado (PCS) contenían un 57.5 % de celulosa, un 4.6 % de hemicelulosa y un 28.4 % de lignina. La celulosa y la hemicelulosa se determinaron mediante una hidrólisis con ácido sulfúrico en dos etapas con análisis posterior de azúcares mediante cromatografía líquida de alta resolución utilizando el procedimiento analítico estándar NREL #002. La lignina se determinó gravimétricamente después de hidrolizar las fracciones de celulosa y hemicelulosa con ácido sulfúrico usando el procedimiento analítico estándar NREL #003.
[0254] El rastrojo de maíz pretratado se lavó repetidamente usando agua de ósmosis inversa y, a continuación, se realizó la decantación de la fracción sobrenadante, hasta que el pH medido fue superior a 4.0. El rastrojo de maíz pretratado lavado (peso seco inicial de 32.35 % de ST) se molió posteriormente antes de su uso en un triturador multiusos húmedo Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, India). El peso seco del rastrojo de maíz pretratado lavado con agua y molido fue del 7.4 % de ST.
[0255] De acuerdo con los ejemplos en WO 2012/044915 se construyó y se purificó la beta-glucosidasa GH3A de tipo salvaje de Aspergillus fumigatus (SEQ ID N.°: 6 en este documento) y la variante F100D S283G N456E F512Y (variante 1). Se evaluaron por su capacidad para mejorar la hidrólisis del PCS mediante una preparación de proteína celulolítica de Trichoderma reesei compuesta por CELLUCLAST® 1.5 l (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) suplementada con una adición del 10 % de polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (obtenido como se describe en WO 2005/074656) y una adición del 2 % de SHEARZYME® 2X (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), en adelante denominada "composición de proteínas celulolíticas de Trichoderma reesei'.
[0256] La hidrólisis de PCS se realizó utilizando placas de pocillos profundos de 2.2 ml (Axygen, Union City, CA, EE. UU.) en un volumen de reacción total de 1.0 ml. La hidrólisis se realizó con 50 mg de pCs lavado, molido y tamizado por ml de tampón de acetato de sodio 50 mM pH 5.0 que contenía sulfato de manganeso 1 mM, 40 g de glucosa por ml y una carga proteica fija de 2.24 mg de composición celulolítica de T. reesei por gramo de celulosa y una adición entre el 0 y el l0 % (por proteína) a la carga base de enzima CELLUCLAST 1.5 l con la beta-glucosidasa de la familia 3A purificada de Aspergillus fumigatus (2.24 mg de la composición celulolítica de T. reesei por g de celulosa y entre 0 y 0.2 mg de la beta-glucosidasa de la familia 3A de Aspergillus fumigatus o una variante de la misma por g de celulosa). Los ensayos de hidrólisis se realizaron por triplicado durante 72 horas a 50 °C. Después de la hidrólisis, las muestras se filtraron con una placa de filtro de 96 pocillos MULTISCREEN® de 0.45 |_im (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) y se analizó el contenido de azúcar de los filtrados como se describe más adelante. Cuando no se usaban inmediatamente, las alícuotas azucaradas filtradas se congelaron a -20 °C.
[0257] Se midieron concentraciones de azúcar de muestras diluidas en H2SO4 0.005 M después de la elución mediante H2SO40.005 M con ácido benzoico al 0.05 % p/p para un caudal de 0.6 ml por minuto de una columna HPX-87H AMINEX® de 4.6 x 250 mm (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.) a 65 °C con cuantificación por integración de señales de glucosa y celobiosa a partir de la detección del índice de refracción (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) calibrado con muestras de azúcar pura. Los equivalentes resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa para cada reacción.
[0258] La glucosa liberada se calculó restando los niveles de glucosa medidos en el PCS solo de los medidos en el PCS con una mezcla de enzimas.
[0259] Los resultados que se muestran en la fig. 2 demostraron que la variante de beta-glucosidasa F100D S283G N456E F512Y (variante 1) de Aspergillus fumigatus tiene una actividad específica más alta que la betaglucosidasa de tipo salvaje de Aspergillus fumigatus (libera más glucosa a una determinada concentración de enzima que la enzima de tipo salvaje a la misma concentración en las condiciones especificadas).
[0260] El ED50 relativo (valor de carga de hidrólisis medio máximo) para el tipo salvaje y la variante 1 se muestra en la tabla a continuación del ejemplo 3.
Ejemplo 3
Determinación del valor de carga relativo ED50 y la actividad específica de la beta-glucosidasa de la familia GH3A de Aspergillus fumigatus variante L89M G91L F100D 1140V 1186V S283G N456E F512Y, variante L89M G91L 1140V 1186V y variante F100D S283G N456E F512Y
[0261] De acuerdo con el ejemplo 2 del presente documento y los ejemplos de WO 2012/044915 se evaluó la capacidad de la beta-glucosidasa purificada de tipo salvaje de la familia Gh3a de Aspergillus fumigatus y la variante F100D S283G N456E F512Y (variante 1), la variante L89M G91L F100D 1140V 1186V S283G N456E F512Y (variante 2) y la variante L89M G91L 1140V 1186V (variante 3) para mejorar la hidrólisis de PCS mediante la "composición celulolítica de Trichoderma reesei" (Ejemplo 2).
[0262] La hidrólisis de PCS y su análisis se realizó según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.
[0263] Los resultados que se muestran en la fig. 2 demostraron que todas las variantes de la beta-glucosidasa de la familia GH3A A fumigatus tiene una actividad específica más alta que la beta-glucosidasa de tipo salvaje (libera más glucosa a una determinada concentración de enzima que la enzima de tipo salvaje a la misma concentración en las condiciones especificadas).
[0264] El ED50 relativo (valor de carga de hidrólisis medio máximo) que se muestra en la siguiente tabla se calculó utilizando el software Graphpad Prism 3.0. Se utilizó la función integrada para el enlace de un solo sitio. Bmax se utilizó para medir la hidrólisis máxima y la Kd como ED50. Esto se hizo sin ponderación (minimización de distancias absolutas al cuadrado). Los valores de carga de ED50 relativo se calcularon a partir de los valores de carga de ED50 determinados estableciendo el valor de carga ED50 relativo para la beta-glucosidasa de tipo salvaje de Aspergillus fumigatus a 1.00.
[0265] Por ejemplo, la variante 1 solo necesita 0.45 veces la carga de tipo salvaje (% de adición de BG en la fig. 2) para proporcionar la misma liberación de glucosa (mg/ml) que el tipo salvaje después de la mitad de la carga de hidrólisis máxima.
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 4
Rendimiento de etanol al agregar composición celulolítica y glucoamilasa durante la presacarificación o la sacarificación
[0266] Todos los tratamientos se evaluaron mediante un ensayo pequeño de 5 g. Se utilizó puré de maíz producido industrialmente por IGPC Ethanol Inc (ON, Canadá) para todas las pruebas. El sólido seco (MS) del puré de maíz fue un 32.2 % y 200 g de puré de maíz se suplementaron con 0.6 ml de penicilina de 1 g/l y 1 ml de urea de 200 g/l. El pH de esta suspensión se ajustó a 5.0 con H2SO4 al 40 %. Se determinó que el sólido seco final del puré de maíz era un 31.95 %. Se añadieron aproximadamente 5 g de esta suspensión a un tubo de polipropileno de 15 ml. Los tubos se prepararon perforando un orificio de 1.5 mm (1/32 de pulgada) y luego se pesaron los tubos vacíos antes de agregar la suspensión de maíz. Los tubos se pesaron de nuevo después de agregar el puré para determinar el peso exacto del puré en cada tubo. Cada tubo se dosificó con la cantidad apropiada de enzima como se muestra en la tabla a continuación. Las dosis reales de enzima se basaron en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada tubo. Los tubos para la presacarificación se colocaron en un agitador de aire a 50 °C (sin agitación) durante 4 horas antes de pasar al baño de agua a 32 °C para la SSF. Los tubos que no estaban presacarificados se dosificaron con 100 microlitros de levadura (ETHANOL RED) propagada a alrededor de 5 g de puré de maíz, y luego se incubaron en un baño de agua a 32 °C para la SSF. Después de 4 horas de presacarificación, los tubos en los tratamientos 1 a 3 se sacaron del agitador de aire y se colocaron en un baño de agua a 32 °C para enfriarlos durante media hora (30 minutos), y luego se dosificó la levadura propagada para la SSF. Se realizaron cinco réplicas de cada tratamiento. Se tomaron muestras a las 54 horas de fermentación para el análisis HPLC. La preparación HPLC consistió en detener la reacción mediante la adición de 50 microlitros de H2SO4 al 40 %, centrifugar y filtrar a través de un filtro de 0.45 micrómetros. Las muestras se almacenaron a 4 °C hasta su análisis. Se utilizó un sistema HPLC Agilent™ 1100 acoplado con un detector de IR para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos. La columna de separación era la columna de exclusión de iones aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) de BioRad™.
Figure imgf000031_0002
Resultados
[0267] Los resultados de HPLC se resumen en la siguiente tabla. La glucoamilasa E2, junto con la celulasa A mostraron un mejor rendimiento en la presacarificación en comparación con el proceso SSF convencional con glucoamilasa E. La presencia de celulasa D mostró un mejor rendimiento que la celulasa A (CELLUCLAST™ 1.5 l) en ambos casos.
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000032_0002
Ejemplo 5
Efecto de la adición de una composición celulolítica y trehalasa durante la SSF
[0268] Todos los tratamientos se evaluaron mediante un ensayo pequeño de 5 g. Para esta prueba se utilizó puré de maíz producido industrialmente por BioFuel Energy (Fairmont, Mn). Se suplementaron 500 g de puré de maíz con 1.5 ml de penicilina de 1 g/l y 2.5 ml de urea de 200 g/l. El pH de esta suspensión se ajustó a 5.0 con H2SO4 al 40 %. Se determinó que el sólido seco final del puré de maíz era un 31.43 %. Se añadieron aproximadamente 5 g de esta suspensión a un tubo de polipropileno de 15 ml. Los tubos se prepararon perforando un orificio de 1.5 mm (1/32 de pulgada) y luego se pesaron los tubos vacíos antes de agregar la suspensión de maíz. Los tubos se pesaron de nuevo después de agregar el puré para determinar el peso exacto del puré en cada tubo. Cada tubo se dosificó con la cantidad apropiada de enzima como se muestra en la tabla a continuación. Las dosis reales de enzima se basaron en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada tubo. Los tubos se dosificaron entonces con 100 microL de levadura ETHANOL RED™ rehidratada (la levadura se rehidrata colocando 5.5 g de levadura en 100 ml de agua del grifo a 32 °C durante 30 minutos con agitación magnética) y luego se incubaron en un baño de agua a 32 °C para la SSF. Se realizaron tres réplicas de cada tratamiento. Se tomaron muestras tras 54 horas de fermentación para el análisis HPLC. La preparación HPLC consistió en detener la reacción mediante la adición de 50 microlitros de H2SO4 al 40 %, centrifugar y filtrar a través de un filtro de 0.45 micrómetros. Las muestras se almacenaron a 4 °C hasta su análisis. Se utilizó un sistema HPLC Agilent™ 1100 acoplado con un detector de IR para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos. La columna de separación era la columna de exclusión de iones aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) de BioRad™.
Figure imgf000032_0001
Resultados
[0269] Los resultados de HPLC se resumen en la siguiente tabla. Los resultados muestran que la adición de celulasa D (composición celulolítica) a la Glucoamilasa E solo (control) aumentó significativamente el título del etanol final. Además, la adición de 20 y 100 microgramos EP/g MS de trehalasa al tratamiento con glucoamilasa E+celulasa D incrementó significativamente los títulos de etanol sobre el control de glucoamilasa E+celulasa D.
Figure imgf000032_0003
Ejemplo 6
Efecto de la adición de la composición celulolítica durante la SSF en la deshidratación final
[0270] Fermentación: Para todas las muestras se utilizó puré de maíz producido industrialmente a partir de etanol de platino. Se descongeló un recipiente de 5 galones que contenía el puré licuado, se dividió en cantidades más pequeñas (botellas Nalgene con tapón de rosca de 1 litro) y se volvió a congelar. Se descongeló un litro de este puré durante aproximadamente 4 horas antes de comenzar este estudio. El puré se complementó con 3 ppm de penicilina y 1000 ppm de urea usando soluciones de 1 g/l de penicilina y 200 g/l de urea, respectivamente, y se ajustó a pH 5.0 con H2SO4 al 40 %. El contenido de materia seca del puré se midió en una balanza de humedad Mettler-Toledo (halógena HB43-S), con un valor resultante de 31.08 % Ms . Se añadieron aproximadamente 25 g del puré industrial en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml con tapas roscadas (VWR 89039-660). Se realizaron un total de 24 fermentaciones. Las enzimas se dosificaron de acuerdo con las especificaciones de dosificación en la tabla 1 a continuación y el volumen de solución madre para agregar a la fermentación se determinó mediante la ecuación:
Figure imgf000033_0002
T l 1. Tr mi n nzim i r
Figure imgf000033_0001
[0271] Se añadió glucoamilasa E2 a todas las muestras y luego se dosificó una dosis de celulasa D sobre este fondo. Se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento. Se dosificó agua en cada muestra de modo que el volumen total añadido de enzima y agua fuera de aproximadamente 285 microlitros/25 g de muestra para producir un % de MS final del 30.7 %. La levadura rehidratada (5.5 g de levadura Ethanol Red de Fermentis en 100 ml de agua del grifo a 35 °C incubada a 32 °C durante 30 minutos) se dosificó a 250 microlitros de solución de levadura en cada muestra de 25 g. Los tubos se pesaron en el momento 0 y luego se fermentaron durante 72 horas a 32 °C.
[0272] Destilación: Todas las muestras se destilaron para eliminar el etanol y generar una vinaza completa. Se utilizó un sistema de evaporación Büchi Multivapor para todas las destilaciones. La unidad destiló 12 muestras a la vez, por lo que se destilaron dos réplicas de cada uno de los seis tratamientos en cada set de destilación. Los parámetros utilizados se muestran en la tabla 2. Los tubos se pesaron después de la destilación y el peso perdido durante la destilación se reemplazó con agua DI. Los tubos se pesaron nuevamente después de la adición de agua.
Tabla 2. Parámetros de destilación
Figure imgf000033_0003
[0273] Ensayo de deshidratación: después de la destilación, las muestras se centrifugaron en grupos de 6 cada vez a 1400 x g durante 10 minutos en una centrífuga de la serie Avanti J-E con un rotor JS-5.3 (Beckman Coulter). Después de la centrifugación, las muestras se decantaron inmediatamente en tubos cónicos de 15 ml previamente pesados (NUNC #362694). Se registraron los pesos de la torta húmeda resultante y de la vinaza ligera. La torta húmeda se colocó en bandejas de secado previamente pesadas y se incubó a 55 °C durante la noche y se transfirió a 105 °C durante 2 horas. Se registraron los pesos antes y después de las incubaciones. Estos valores se usaron para calcular los valores de materia seca usando la siguiente fórmula:
d
--
Figure imgf000033_0004
Figure imgf000033_0005
[0274] Resultados: Los datos del ensayo de deshidratación se cargaron en JMP 9.0.2 para el análisis estadístico. La plataforma Fit Model se utilizó para realizar un ajuste de mínimos cuadrados estándar en los datos. Los efectos del modelo incluyeron efectos de dosis de la composición celulolítica hasta la cuarta potencia, un efecto de set para

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Proceso para generar un producto de fermentación, que comprende
(a) licuar un material que contiene almidón con una alfa-amilasa; opcionalmente presacarificar el material licuado antes del paso (b);
(b) sacarificar el material licuado;
(c) fermentar usando un organismo fermentador;
donde una enzima generadora de fuentes de carbohidratos y una composición celulolítica están presentes o se añaden durante el paso de fermentación (c) o la sacarificación y fermentación simultáneas, donde la composición celulolítica comprende una beta-glucosidasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N.°: 6 y que comprende una o varias sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G91L, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y.
2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la composición celulolítica contiene menos del 10 % en peso, por ejemplo, menos del 5 % en peso de hemicelulasa.
3. Proceso según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la beta-glucosidasa mostrada en la SEQ ID N.°: 6 comprende una sustitución del siguiente conjunto:
-F100D S283G N456E F512Y;
- L89M G91L 1186V 1140V;
- 1186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y.
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la beta-glucosidasa original tiene al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 96 %, por ejemplo, al menos un 97 %, por ejemplo, al menos un 98 %, por ejemplo, al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID N.°: 6 en el presente documento.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde la composición celulolítica comprende además uno o varios de los siguientes componentes
(i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus;
(ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus; y
(iii) un polipéptido GH61 de Penicillium sp. con actividad potenciadora celulolítica.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9617527B2 (en) * 2010-04-14 2017-04-11 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
CA2853000C (en) * 2011-10-11 2022-03-15 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
ES2935920T3 (es) * 2012-03-30 2023-03-13 Novozymes North America Inc Procesos de elaboración de productos de fermentación
ES2891339T3 (es) 2015-10-14 2022-01-27 Novozymes As Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas
CN108699572A (zh) * 2015-12-22 2018-10-23 诺维信公司 使用磷脂酶c增加发酵产物得率的方法
CN108884478A (zh) * 2016-03-01 2018-11-23 诺维信公司 在ssf方法中组合使用至少一种内切蛋白酶和至少一种外切蛋白酶以改善乙醇产量
WO2018098124A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CA3089135A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen utilization for ethanol production
MX2020008309A (es) * 2018-02-15 2020-10-14 Novozymes As Levadura mejorada para produccion de etanol.
CA3107110A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
CA3114783A1 (en) * 2018-10-08 2020-04-16 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
CN109762851B (zh) * 2018-12-27 2020-10-30 吉林中粮生化有限公司 一种稻谷加工生产燃料乙醇及副产物大米ddgs的方法
US20230023446A1 (en) * 2019-12-16 2023-01-26 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
CN111826368B (zh) * 2020-07-23 2021-11-23 中国农业科学院农产品加工研究所 I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
US20230399632A1 (en) * 2020-11-02 2023-12-14 Novozymes A/S Glucoamylase Variants and Polynucleotides Encoding Same
CN116471938A (zh) * 2020-11-02 2023-07-21 诺维信公司 具有来自青霉属的热稳定amg变体的烘焙和部分烘焙产品
JP2023547460A (ja) * 2020-11-02 2023-11-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ペニシリウム属（ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）からの熱安定性ａｍｇ多様体を有する焼成品及び下焼き品
MX2024005283A (es) 2021-11-04 2024-05-17 Danisco Us Inc Variante de polipeptido y celula de levadura recombinante.
EP4426824A1 (en) 2021-11-04 2024-09-11 Danisco US Inc. Recombinant yeast cell
US20240425888A1 (en) 2021-11-04 2024-12-26 Danisco Us Inc. Process for the production of ethanol and recombinant yeast cell
JP2025514825A (ja) * 2022-04-24 2025-05-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 熱安定性グルコアミラーゼを使用することによって粉ベースの蒸し製品を調製するための方法
CN119137280A (zh) * 2022-05-04 2024-12-13 诺维信公司 用热稳定amg变体酿造
CA3257053A1 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION, TREATMENT, SUPPRESSION AND/OR ELIMINATION OF PHYTOPATHOGENIC INFESTATIONS AND INFECTIONS
CN115725421B (zh) * 2022-10-17 2024-09-20 广西大学 草酸青霉基因工程菌gxur001及其在制备生淀粉酶制剂中应用
AU2022483869A1 (en) * 2022-10-24 2025-04-10 Novozymes A/S Baking method with thermostable amg variant and alpha-amylase
WO2024137704A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products using fiber-degrading enzymes with engineered yeast
CN120693401A (zh) 2022-12-19 2025-09-23 诺维信公司 包含阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶的组合物及其用于增加半纤维素纤维溶解的用途
CN120380140A (zh) 2022-12-19 2025-07-25 诺维信公司 具有阿魏酸酯酶和/或乙酰木聚糖酯酶活性的碳水化合物酯酶家族1（ce1）多肽和编码其的多核苷酸
WO2024137252A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Novozymes A/S Process for reducing syrup viscosity in the backend of a process for producing a fermentation product
WO2024137250A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Novozymes A/S Carbohydrate esterase family 3 (ce3) polypeptides having acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same
EP4437856A1 (en) * 2023-03-31 2024-10-02 DSM IP Assets B.V. Novel enzyme composition and novel beer brewing process
MX2025015096A (es) 2023-06-13 2026-02-03 Novozymes As Procesos para producir productos de fermentacion usando levaduras modificadas que expresan una beta-xilosidasa
WO2025122763A1 (en) * 2023-12-05 2025-06-12 BGW Sp. z o.o. Grain fractionation process
US12553067B2 (en) 2023-12-05 2026-02-17 BGW Sp. z o.o. Grain fractionation process
WO2025128568A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 Novozymes A/S Composition and use thereof for increasing hemicellulosic fiber solubilization
WO2026008449A2 (en) 2024-07-04 2026-01-08 Novozymes A/S A process for producing a fermentation product and a concentrated protein co-product

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
CA1143677A (en) 1980-04-15 1983-03-29 Lidia S. Losyakova Process for producing ethyl alcohol from amylaceous raw stock
US4560651A (en) 1981-04-20 1985-12-24 Novo Industri A/S Debranching enzyme product, preparation and use thereof
NO840200L (no) 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
DK135983D0 (da) 1983-03-25 1983-03-25 Novo Industri As Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse
US4587215A (en) 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
US4628031A (en) 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
JPS62126989A (ja) 1985-11-26 1987-06-09 Godo Shiyusei Kk コルテイシウム属担子菌の生産する酵素を用いた澱粉質の無蒸煮糖化法
JP2952604B2 (ja) 1990-04-20 1999-09-27 味の素株式会社 発酵法によるアミノ酸の製造法
US5162210A (en) 1990-06-29 1992-11-10 Iowa State University Research Foundation Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose
WO1992002614A1 (en) 1990-08-01 1992-02-20 Novo Nordisk A/S Novel thermostable pullulanases
US5231017A (en) 1991-05-17 1993-07-27 Solvay Enzymes, Inc. Process for producing ethanol
DK81293D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
FR2747131B1 (fr) 1996-04-09 1998-06-26 Orsan Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase
JP3601835B2 (ja) 1997-06-10 2004-12-15 タカラバイオ株式会社 超耐熱性プロテアーゼ発現系
EP1032654B1 (en) 1997-11-26 2009-01-21 Novozymes A/S Thermostable glucoamylase
EP1058724B1 (en) 1998-02-27 2010-12-01 Novozymes A/S Maltogenic alpha-amylase variants
KR100764528B1 (ko) 1998-07-15 2007-10-09 노보자임스 에이/에스 글루코아밀라제 변이체
JP2003504046A (ja) 1999-07-09 2003-02-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ グルコアミラーゼ変異体
AU2663801A (en) 2000-01-12 2001-07-24 Novozymes A/S Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties
ATE411971T1 (de) 2000-02-17 2008-11-15 Univ Denmark Tech Dtu Methode zur behandlung von lignin- und zellulosehaltigen stoffen
AU2001235360A1 (en) 2000-02-23 2001-09-03 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
CA2408406C (en) 2000-06-02 2014-07-29 Novozymes A/S Cutinase variants
US7244597B2 (en) 2000-11-10 2007-07-17 Novozymes A/S Secondary liquefaction in ethanol production
CN1473197A (zh) * 2000-11-10 2004-02-04 诺维信公司 在乙醇制备中的次级液化
CN1509330A (zh) 2001-05-18 2004-06-30 ŵ��ø�ɷ����޹�˾ 具有纤维二糖酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
WO2003048353A1 (en) 2001-12-07 2003-06-12 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and nucleic acids encoding same
WO2003066826A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 Genencor International, Inc. Methods for producing ethanol from carbon substrates
US20040115779A1 (en) * 2002-03-19 2004-06-17 Olsen Hans Sejr Fermentation process
EP2166091A3 (en) 2003-03-10 2015-06-10 Novozymes A/S Alcohol product processes
AU2004219649A1 (en) 2003-03-10 2004-09-23 Broin And Associates, Inc. Method for producing ethanol using raw starch
DK1682656T3 (da) 2003-10-28 2013-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med beta-glucosidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
US7129069B2 (en) 2003-10-28 2006-10-31 Novo Zymes Als Hybrid enzymes
ATE441705T1 (de) 2003-10-30 2009-09-15 Novozymes As Kohlenhydratbindende module
EP2305703B1 (en) 2004-01-30 2014-03-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
ES2389442T3 (es) 2004-02-06 2012-10-26 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de aumento celulolítica y polinucleótidos que los codifican
US20080032373A1 (en) * 2004-05-13 2008-02-07 Novozymes North America, Inc. Process Of Producing A Fermentation Product
US20060006116A1 (en) 2004-07-09 2006-01-12 Scheimann David W Method of dewatering thin stillage processing streams
DK1831385T3 (en) 2004-12-22 2015-07-13 Novozymes North America Inc Enzymes for starch processing
CN104694595A (zh) * 2005-02-07 2015-06-10 诺维信北美公司 发酵产品产生方法
EP1928901B1 (en) 2005-08-04 2011-06-15 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
CN101304949A (zh) 2005-11-08 2008-11-12 诺维信北美公司 酒糟脱水
WO2007076388A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Novozymes North America, Inc. Processes for producing a fermentation product
EP2010653A4 (en) 2006-04-19 2010-03-03 Novozymes North America Inc POLYPEPTIDES WITH GLUCCOAMYLASE ACTIVITY AND THESE CODING POLYNUCLEOTIDES
BRPI0714870A2 (pt) 2006-07-21 2013-05-28 Novozymes Inc mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia
WO2008023060A1 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Novozymes A/S Fermentation process
EP1916308A1 (en) * 2006-10-26 2008-04-30 DSMIP Assets B.V. Use of vitamins in fermentation processes for the production of amino acids
MX2009006782A (es) * 2006-12-21 2009-09-21 Verenium Corp Amilasas y glucoamilasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para formarlas y usarlas.
US9453213B2 (en) 2007-05-31 2016-09-27 Novozymes, Inc. Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
KR20100085964A (ko) 2007-11-05 2010-07-29 다니스코 유에스 인크. 변경된 특성을 가진 알파-아밀라아제 변이체
CN101247400B (zh) 2008-03-03 2011-02-02 华为技术有限公司 许可证控制方法及管理装置
WO2009121058A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Novozymes A/S Producing fermentation products in the presence of trehalase
EP2291528A1 (en) 2008-05-29 2011-03-09 Danisco US Inc. Process for alcohol and co-product production from grain sorghum
EP2364363A2 (en) * 2008-06-23 2011-09-14 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
FR2935986B1 (fr) 2008-09-12 2012-11-23 Inst Francais Du Petrole Variants de beta-glucosidase a activite amelioree et leurs utilisations.
US8338121B2 (en) 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for determining cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
CN102482657B (zh) 2009-05-07 2015-02-25 杜邦营养生物科学有限公司 里氏木霉和绳状青霉酶的酶复合物
WO2010138754A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
EP2483295B1 (en) 2009-09-29 2015-11-25 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102597228A (zh) * 2009-10-23 2012-07-18 诺维信股份有限公司 纤维二糖水解酶变体及编码其的多核苷酸
BR112012008291A8 (pt) 2009-11-06 2019-05-21 Novozymes Inc composição de enzima, célula hospedeira recombinante, e, métodos de produzir uma composição de enzima, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico
ES2534098T3 (es) 2009-11-30 2015-04-17 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
CA2782036C (en) 2009-12-01 2019-01-15 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
ES2668202T3 (es) 2009-12-11 2018-05-17 Novozymes A/S Variantes de proteasa
WO2011087836A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Novozymes A/S Pullulanase variants and uses thereof
MX2012007709A (es) 2010-01-04 2012-08-15 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa con estabilidad mejorada.
WO2011126897A2 (en) 2010-03-30 2011-10-13 Novozymes A/S Methods for enhancing by-products from fermentation processes
CA2795806C (en) 2010-04-14 2019-01-08 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
WO2012019159A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Neutral ph saccharification and fermentation
CN105886485B (zh) 2010-10-01 2019-09-24 诺维信股份有限公司 β-葡糖苷酶变体及其编码多核苷酸
CN103298932B (zh) 2010-11-08 2016-08-10 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CA2822637C (en) * 2010-12-22 2020-06-30 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
EP2668268B1 (en) * 2011-01-26 2017-05-31 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
MX2013007720A (es) * 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
ES2531247T3 (es) * 2011-02-07 2015-03-12 Novozymes North America Inc Proceso para licuefacción de almidón en presencia de piridoxamina
EP2702161A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Danisco US Inc. Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation
CN103781910B (zh) 2011-07-06 2019-04-23 诺维信公司 α淀粉酶变体及其编码多核苷酸
CA2846398A1 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Novozymes, Inc. Cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
US9856498B2 (en) 2012-03-30 2018-01-02 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
ES2935920T3 (es) * 2012-03-30 2023-03-13 Novozymes North America Inc Procesos de elaboración de productos de fermentación
BR112014026885B1 (pt) 2012-05-04 2021-08-10 Archer Daniels Midland Company Método para produzir etanol mediante fermentação de um produto de grãos integrais
US20150175980A1 (en) 2012-06-08 2015-06-25 Concordia University Novel cell wall deconstruction enzymes of scytalidium thermophilum, myriococcum thermophilum, and aureobasidium pullulans, and uses thereof
EP2875138A4 (en) * 2012-07-19 2016-04-27 Novozymes As PROCESS FOR INCREASING ENZYMATIC HYDROLYSIS OF A CELLULOSE MATERIAL
MX2015001818A (es) 2012-08-16 2015-05-07 Danisco Inc Proceso para producir glucosa a partir de almidon con el uso de la alfa-amilasa de aspergillus clavatus y una pululanasa.
US9376504B2 (en) 2012-09-17 2016-06-28 Icm, Inc. Hybrid separation
WO2014092960A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei host cells expressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof
WO2014093125A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification
US20160040202A1 (en) 2012-12-14 2016-02-11 Danisco Us Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus fumigatus and pullulanase for saccharification
EP2904105A1 (en) 2012-12-20 2015-08-12 Danisco US Inc. Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification
EP3712274A1 (en) 2013-09-11 2020-09-23 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
CN105722989B (zh) 2013-10-28 2020-12-18 丹尼斯科美国公司 发酵中的海藻糖酶

Also Published As

Publication number Publication date
EP2925872A1 (en) 2015-10-07
US11987831B2 (en) 2024-05-21
EP2925872B1 (en) 2019-07-10
CN104812905A (zh) 2015-07-29
WO2014085439A1 (en) 2014-06-05
US10526620B2 (en) 2020-01-07
ES2749652T3 (es) 2020-03-23
CA2890383A1 (en) 2014-06-05
US20210230644A1 (en) 2021-07-29
US20190062792A9 (en) 2019-02-28
US20200024620A9 (en) 2020-01-23
US20150291984A1 (en) 2015-10-15
US20200095615A1 (en) 2020-03-26
AR093680A1 (es) 2015-06-17
US20180245105A1 (en) 2018-08-30
CN114921501A (zh) 2022-08-19
US20240271167A1 (en) 2024-08-15
US10227613B2 (en) 2019-03-12
EP2925872A4 (en) 2016-04-20

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US12540340B2 (en) Processes of producing fermentation products
ES2935920T3 (es) Procesos de elaboración de productos de fermentación
EP2553110B1 (en) Processes of producing a fermentation product
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WO2015143144A1 (en) Method for enhancing activity of an x143 polypeptide