CN1473197A - 在乙醇制备中的次级液化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过发酵制备乙醇的方法，该方法包括在热稳定酸性α－淀粉酶或热稳定的产麦芽糖酸性α－淀粉酶存在下的次级液化作用步骤。

Description

在乙醇制备中的次级液化
技术领域
本发明涉及一种制备乙醇(ethanol)的方法。
背景技术
乙醇可广泛地应用于工业化学，汽油添加剂或直接的液体燃料。作为燃料或燃料添加剂，乙醇显著降低气体排放同时改进发动机性能。作为可再生的燃料，乙醇显著降低国家对有限的和主要的化石燃料资源的依赖，同时显著降低空气中二氧化碳的净积累。利用发酵方法来制备乙醇。许多公开物涉及到通过发酵制备乙醇，其中例如US 5,231,017和CA 1,143,677。EP 138428中提到利用乙醇工业中的液化作用制备黑曲霉α-淀粉酶。
需要进一步改进乙醇的制备方法。
发明内容
本发明涉及一种通过发酵制备乙醇的方法，该方法包括在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的(maltogenic)酸性(acid)α-淀粉酶存在下的次级液化作用步骤。特别是，提供了一种基于作为包含淀粉的原料的整个谷物(whole grain)来制备乙醇的改进方法。
因此，本发明涉及一种自包含淀粉的原料制备乙醇的方法，所述包含淀粉的原料，优选的是基于整个谷物，该方法包括下述步骤：(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；(b)喷射式蒸煮(jet cooking)；(c)在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用步骤；和(d)糖化作用和发酵作用以制备乙醇；其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行。
本发明的方法在步骤a)，(b)，(c)和(d)之前，之间和/或之后还可包括一或多个附加的步骤，例如，诸如在步骤(d)之后回收乙醇。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的或可获得的产物以及该产物的用途，例如，作为燃料酒精或添加剂。
本发明进一步地还涉及尤其是在自整个谷物(whole grain)制备乙醇的方法的次级液化作用步骤中，热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶的用途。
附图简述
图1显示的是按照本发明的一实施方案制备乙醇的方法流程图。初级液化作用步骤可以通过在淤浆槽中存在的α-淀粉酶进行实施而次级液化作用的步骤在图中称为“液化作用”。
发明详述
乙醇的制备
本发明提供一种制备乙醇的方法，尤其是在自干磨(dry milled)的整个谷物制备乙醇的方法中改进次级液化作用的步骤。
本发明涉及一种通过发酵制备乙醇的方法，该方法包括在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用步骤。一种特别有意义的实施方案涉及本发明的发酵方法，其中原料是已被分割成精细部分的整个谷物，优选的是通过干磨法进行。
因此，本发明一方面涉及一种自包含淀粉的原料制备乙醇的方法，该方法包括：
(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；
(b)喷射式蒸煮；
(c)在热稳定酸性α-淀粉酶存在下的液化作用；
(d)糖化作用和发酵作用以制备乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行。
原料
在一实施方案中，含淀粉的原料选自：块茎，根和整个谷物；以及前面的任意组合。在一实施方案中，含淀粉的原料得自谷类。含淀粉的原料可以，例如选自玉米，玉米芯(cobs)，小麦，大麦，木薯，高粱，黑麦，买罗高粱(milo)和马铃薯；或前面的任意组合。
在本发明的乙醇制备方法中，原料优选的是整个谷物或至少是整个谷物的主要部分。包含许多种类淀粉的整个谷物可以用作原料，包括：玉米(corn(maize))，买罗高粱，马铃薯，木薯，高粱，小麦和大麦。
因此，在一实施方案中，包含淀粉的原料是整个谷物，其选自玉米，买罗高粱，马铃薯，木薯，高粱，小麦和大麦；或前面的任意组合。在一优选的实施方案中，包含淀粉的原料是选自谷物，小麦和大麦或其任意组合的整个谷物。
原料还可以由淀粉加工的例流物组成或包括淀粉加工的侧流物(sidestreem)-例如包含不适合制备浆的C6碳水化合物加工流物(processstreams)。在其它的实施方案中，原料不由自淀粉加工的侧流物组成或不包括自淀粉加工的侧流物。
处理步骤
本发明的主要处理步骤在一实施方案中描述，分为下面的主要方法阶段：粉碎(在整个谷物用作原料时)，初级液化作用，通过喷射式蒸煮进行热处理，次级液化作用，糖化作用，发酵，蒸馏。
在优选的实施方案中，本发明的方法包括在步骤(a)前的下述步骤：i)干磨整个谷物；和ii)形成包括磨过的谷物和水的浆。
制备酒精的个别的处理步骤可以分批的或连续地进行。对于其中所有的处理步骤分批进行的本发明的方法或其中所有的处理步骤连续进行的本发明的方法，或其中一或多个处理步骤分批进行而一或多个处理步骤连续流(continuous flow)进行的本发明的方法同等考虑。
级联的方法是其中一或多个处理步骤以连续进行的方法的实例并为本发明所考虑。级联方法进一步的信息和其它的乙醇方法可查阅The AlcoholTextbook.Ethanol production by fermentation and distillation.Eds.T.P.Lyons，D.R.Kesall and J.E.Murtagh.Nottingham University Press1995。
粉碎(milling)
因此，在本发明方法优选的实施方案中，包含淀粉的原料是整个谷物，并且该方法包括在步骤a)前，即在初级液化作用前粉碎整个谷物的步骤。换句话说，本发明还包括本发明的方法，其中包含淀粉的原料可通过包括粉碎整个谷物的方法获得，优选的是例如通过锤磨机或轧磨机(roller mils)的干磨。磨碎(grinding)也被理解为粉碎(milling)。
在具体的实施方案中，本发明的方法进一步包括在初级液化作用步骤前(即在步骤(a)前)的步骤，该步骤为：
i.粉碎整个谷物；
ii形成包括已粉碎谷物和水的浆以获得含淀粉的原料。
粉碎整个谷物以展开结构并且允许进一步的加工。在酒精制备中正常地使用两种粉碎方法：湿或干磨。术语“干磨”表示粉碎整个谷物。在干磨中整个谷物被碾磨并用于该方法的其余部分。湿磨法(wet milling)能很好地将胚(germ)和粉(淀粉颗粒和蛋白)分离，但在其中并联制备浆的位置有例外。
因此，在本发明优选的实施方案中，由于包括次级液化作用步骤的干磨法有利制备乙醇，所以使用干磨法。
液化作用
在液化作用方法中，降解(水解)包含淀粉的原料(优选的是粉碎过的整个谷物原料形式)生成麦芽糖糊精(糊精)。在优选的实施方案中，在本发明初级液化作用方法中，水解包含淀粉的原料(优选的是粉碎过的整个谷物原料形式)成DE(葡萄糖等价物的缩写)高于4。DE代表“葡萄糖等价物”，并用来测定还原C6糖类的末端。纯的葡萄糖的DE为100。葡萄糖(也称葡糖)是还原糖，无论淀粉酶何时水解淀粉中葡萄糖-葡萄糖键，会暴露两个新的葡萄糖末端基团。至少其中之一可用作还原糖。因此，在还原糖中测定水解的程度升高。所得值与基于纯葡萄糖的标准曲线比较-由此得到术语葡萄糖等价物。DE可以例如利用纯葡萄糖为参照，使用Fehlings液体通过与淀粉形成铜络合物测定，接着通过碘滴定来定量。换而言之：样品中的DE(葡萄糖等价物定义为还原糖类(测定葡萄糖等价物)的量)表示为溶解干物质的总量的w/w％。还可通过新亚铜试剂试验(neocuproine assay)(Dygert，LiFloridana(1965)Anal.Biochem.No 368)测定。新亚铜试剂试验的原理是将CuSO4加入到样品中，通过还原糖和还原Cu2+，形成的新亚铜试剂络合物在450nm测定。
通过酸处理或酶处理进行水解。液化作用，优选的是进行酶处理，优选的是α-淀粉酶处理。在一实施方案中，通过下述进行液化作用，制备包括粉碎的原料的浆(优选的是粉碎的整个谷物)和水，加热浆到60-95℃，优选80-85℃，将酶加到引发液化作用(thinning)。这也称为“初级液化作用”，即在处理步骤喷射式蒸煮(jet-cooking)(步骤(b))前发生。本发明方法中的液化作用在任何适合所研究酶的条件下(即，例如pH，温度，和时间)进行。在本发明方法的范围内，其中步骤(a)的液化作用在60-95℃进行10-120分钟，优选的是在75-90℃进行15-40分钟。在一实施方案中，步骤(a)的液化作用在约pH4-7的范围内进行，优选的是约pH4.5-6.5。浆的pH值调节与否取决于所用酶的性质。因此，在一实施方案中pH调节为例如通过添加NH3例如上调约1个单位。所调节的pH在添加α-淀粉酶时有利于进行。在一优选的实施方案中，不能调节pH，并且α-淀粉酶具有相应合适的pH活性模式，例如在pH约为4时有活性。
初级液化作用步骤之后，优选的是将浆在合适的条件下进行喷射式蒸煮以进一步使淀粉凝胶化，例如，诸如在温度为95-140℃，优选的是105-125℃以确保凝胶化。在一实施方案中，步骤(b)中的喷射式蒸煮在下述条件下进行1-10分钟，105-150℃和例如pH4-7；优选的是1-5分钟，105-120℃和例如pH4.5-6；诸如，例如约5分钟，约105℃，和例如pH约5.0。如本文所用的，术语喷射式蒸煮一般也包括获得相似结果的任何其它的方法。
然后优选的是将浆冷却，例如到约60-95℃，并且将更多的酶加入以获得最终的水解；后者称为“次级液化作用”。即喷射式蒸煮之后的液化作用，通过本发明的方法添加至少热稳定的酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶获得。
步骤(c)中的次级液化作用在合适的条件(pH，温度，和处理时间)下进行。步骤(c)中的次级液化作用可以例如在60-95℃，10-120分钟，优选的是70-85℃，15-80分钟，pH4.5-6.5。在一实施方案中，对于次级液化作用不能调节pH。在一优选的实施方案中，次级液化作用期间的pH至多约5。
在一优选的实施方案中，本发方法的次级液化作用步骤中包含例如得自干磨整个谷物的淀粉的原料水解成DE的范围约为5-15，例如8-15，8-14，诸如例如约范围10-14的DE，例如约10-12。
液化作用的方法(初级和次级液化作用的方法)在合适的pH下进行，例如pH4.5-6.5，例如pH在约5和pH约6之间。
粉碎的和液化作用的整个谷物也被认为是醪液(mash)。
糖化作用
通过酵母产生可被新陈代谢的低分子量的糖DP1-2，优选的是进一步水解自液化作用的产麦芽糖糊精；这也称为“糖化作用”。在葡糖淀粉酶存在下通过酶解进行水解。除了葡糖淀粉酶外，也可存在α-糖甙酶和/或酸性α-淀粉酶。
充分的糖化作用持续可达到72小时。然而，糖化作用和发酵(SSF)可以结合，并且在本发明的一些实施方案中可以包括1-4小时的预糖化作用步骤。预糖化作用在任何合适的方法条件下进行。在优选的实施方案中，预糖化作用在30-65℃，例如约60℃，和在例如pH的范围为4-5，尤其在约pH4.5下进行。
因此，在一实施方案中，本发明的方法可进一步包括预糖化作用步骤，如本文所描述的，其可在次级液化作用步骤(c)之后和步骤(d)之前进行。
在其它实施方案中，本发明的方法不包括预糖化作用步骤并且糖化作用用仅在发酵期间是必需进行的，例如通过存在葡糖淀粉酶和可选择的植酸酶下。
发酵
将发酵所用的微生物添加到醪液中。发酵一直进行到产生出所需量的乙醇；这可以，例如进行24-96小时，例如35-60小时。发酵期间的温度和pH为适合所研究的微生物的温度和pH，例如，诸如温度范围约为26-34℃，例如约32℃，并且pH在约pH3-6的范围，例如约pH4-5。
在优选的实施方案中，实施同时进行的糖化作用和发酵(SSF)方法，其中糖化作用没有迟滞阶段，这表明酵母和糖化作用的酶基本上一起加入。在一实施方案中，刚好在发酵之前，在温度高于50℃下，将SSF引入预糖化作用步骤。
在一实施方案中，在葡糖淀粉酶和/或蛋白酶存在下实施发酵。
在另一实施方案中，本发明方法中次级液化作用步骤中添加热稳定的酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶有可能替代发酵步骤中存在的葡糖淀粉酶的活性。因此，涉及本发明制备乙醇的方法的一实施方案，在添加发酵步骤中或在发酵步骤前没有添加葡糖淀粉酶。
蒸馏
本发明的方法进一步包括回收乙醇；因此酒精可以从发酵的材料中分离出并纯化。接着发酵，可蒸馏醪液以提取乙醇。纯度达到例如约96vol.％乙醇的乙醇可通过本发明的方法获得。
因此，在一实施方案中，本发明的方法进一步包括：(e)蒸馏以获得乙醇。步骤(d)中的发酵和步骤(e)中的蒸馏可同时和/或分别/依次地进行；任选地可以后接一或多个处理步骤以进一步地精制乙醇。
蒸馏的副产品和再循环：
在本发明方法的一实施方案中，自蒸馏方法中的水成的副产品(″酒糟物(Whole Stillage)″，cf.图1)分为两种级分，例如通过离心：1)″湿谷物(Wet Grain)″(固相，见图1)，和2)″酒糟水(Thin Stillage)″(上清，见图1)。
在一实施方案中，进入本发明方法中的含淀粉的原料为干磨过的整个谷物，本发明的方法包括步骤(a)，(b)，(c)，(d)，和(e)及进一步包括步骤：
(f)分离步骤(e)中蒸馏产生的酒糟物，为湿谷物和酒糟水；和
(g)在初级液化作用步骤(a)之前再回收酒糟水至包含淀粉的原料。
在一实施方案中，本发明的方法，酒糟水(cf.图1)被再循环到磨碎的整个谷物浆。
典型的在转鼓式干燥机中干燥湿谷物的级分。干燥的产物称为″ 蒸馏器变干谷物(Distillers Dried Grain)”(见图1)，可用作例如动物饲料。
蒸发酒糟水级分提供两级分(见图1)：(i)4-6％DS的冷凝物(Condensate)级分(主要为淀粉，蛋白质，和细胞壁成分)，和(ii)浆(Syrup)级分，主要由极限糊精和不可发酵的糖组成，可以与湿谷物(Wet Grains)(来自酒糟物分离步骤)一起引入以提供称为″蒸馏器变干谷物″的产品，其也可用作动物饲料。
术语″酒糟水″用于酒糟物的上清(见图1)，典型的，酒糟水包含4-6％DS(主要为淀粉，蛋白质)以及温度约为60-90℃。
本发明另一实施方案中，酒糟水不再循环，但蒸发酒糟水的冷凝流再循环至包含磨过的整个谷物的浆以喷射蒸煮。
本发明的一实施方案涉及制备乙醇的方法，该方法包括下面的步骤：
(a)在有α-淀粉酶活性下，包含淀粉的原料的初级液化作用；
(b)喷射式蒸煮步骤(a)的材料；
(c)在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的步骤(b)的材料的次级液化作用；和
(d)糖化作用和发酵作用以制备乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行。
任选地糖化作用和发酵可以分步进行。因此，本发明还涉及制备乙醇的方法，该方法包括下面的步骤：
(a)在有α-淀粉酶活性下，包含淀粉的原料的初级液化作用；
(b)喷射式蒸煮步骤(a)的材料；
(c)在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的步骤(b)的材料的次级液化作用；和
(d)糖化作用；
(e)发酵作用以制备乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行，并且其中同时或接着(d)进行(e)。
本发明还涉及制备乙醇的方法，该方法包括下面的步骤：
a)干磨整个谷物；
b)形成包括已粉碎谷物和水的浆；
c)在α-淀粉酶存在下的液化作用；
(d)喷射式蒸煮；
(e)在热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用；
(f)在植酸酶和/或葡糖淀粉酶存在下进行糖化作用和发酵作用以制备乙醇；
(g)蒸馏
任选地后接一或多个步骤以进一步提炼乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)按照(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)的顺序进行；和
其中步骤(g)同时与步骤(f)和/或在其后进行。
在进一步的实施方案中，本发明制备乙醇的方法，可包括下面的步骤：
a)粉碎整个谷物；
b)形成包括已粉碎整个谷物和水的浆；
c)在α-淀粉酶存在下进行液化作用；
(d)在葡糖淀粉酶存在下进行糖化作用和利用微生物进行发酵；
(f)蒸馏发酵的材料，提供两种流1)酒精和2)酒糟物；
(g1)回收酒精以进一步提炼；任选地，
(g2)分离酒糟物为二级分：1)湿谷物，和2)酒糟水；
(h1)干燥整个谷物级分以提供包含产物的蛋白质，和任选地
(h2)蒸发酒糟水，提供两种流：1)冷凝流和2)浆；
其中在有或没有进一步的处理下，酒糟水和任选地自步骤(h2)的冷凝液再循环到步骤(b)。酶活性α-淀粉酶
“初级液化作用”优选的是在存在例如衍生自微生物或植物的α-淀粉酶下进行。优选的α-淀粉酶是真菌或细菌源。根据本发明特别考虑的是芽孢杆菌属α-淀粉酶(常指的是“Termamyl样的(Termamyl-like)α-淀粉酶”)，变体，和其杂种。熟知的Termamyl样α-淀粉酶包括衍生自地衣芽孢杆菌(商品化购得为TermamylTM)，解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶。其它Termamyl样α-淀粉酶包括衍生自芽孢杆菌菌株NCIB12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375，所有这些在WO 95/26397中详述，以及由Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31所述的α-淀粉酶。本发明中Termamyl样α-淀粉酶是在WO 99/19467中3页18行到6页27行所定义的α-淀粉酶。所研究的变体和杂种在WO 96/23874，WO 97/41213，和WO99/19467中描述，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，α-淀粉酶TTC，与WO 99/19467中公开的SEQ ID NO：3所示的野生型氨基酸序列相比具有下面的突变δ(181-182)+N193F(也表示I181*+G182*+N193F)。所研究的α-淀粉酶衍生自曲霉属的菌株包括米曲酶和黑曲霉。
商业的α-淀粉酶产物和包含α-淀粉酶的产品包含TERMAMYLTM SC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER，(Novozymes A/S，Denmark)和DEX-LOTM，SPEZYMETM AA，和SPEZYMETM DELTA AA(自Genencor Int.)。
其它所研究的α-淀粉酶是EP 1,022,334中公开的KSM-K36α-淀粉酶，保存为FERM BP 6945，以及EP 1,022,334中公开的KSM-K38α-淀粉酶，保存为FERM BP-6946。还研究了变体，尤其是丹麦专利申请PA 2000 11533中所公开的变体(自Novozymes A/S)。
“次级液化作用”在存在α-淀粉酶，尤其是在存在本文所述的本发明方法中次级液化作用步骤中使用的热稳定酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶下进行。α-淀粉酶优选的是衍生自微生物包括真菌和细菌或衍生自植物。优选的热稳定酸性α-淀粉酶是细菌源的。优选的热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶是真菌源。
应理解的是所加入的酶量为用于所述方法的真实条件下有效量，例如步骤(c)中加入有效量的热稳定酸性α-淀粉酶。
在本发明方法进一步的实施方案中，除了加入热稳定酸性α-淀粉酶外，还加入不是热稳定酸性α-淀粉酶的α-淀粉酶。
本文一实施方案中热稳定酸性α-淀粉酶中的术语“热稳定”指的是使用0.1M柠檬酸盐(citrate)缓冲液和4.3mM Ca2+，在pH5.0，达到90℃时酶具有活性。
在液化作用和发酵期间，在所提供的pH例如诸如在pH2.5-5.5使用0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+下，热稳定酸性α-淀粉酶应具有的活性。所述酶优选的是在至少在pH3-5具有活性。应理解的是所述酶在所提到的pH范围外仍具有活性。
本文所用热稳定酸性α-淀粉酶的实例是选自下述组的α-淀粉酶：LE399；米曲酶TAKAα-淀粉酶(EP 238 023)；EP 383,779 B2中公开的黑曲霉α-淀粉酶([0037]部分(还见实施例1中黑曲霉基因克隆)；EP 140,410的实施例1中公开的黑曲霉α-淀粉酶；商业真菌黑曲霉α-淀粉酶FUNGAMYL(Novozymes A/S)；和ClaraseTM(自Genencor Int.，USA)，后者均源自曲霉属。
LE399是杂交的α-淀粉酶。具体地，LE399包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445 C-末端氨基酸残基(在WO 99/1946 7中SEQ ID NO：4所示)和源自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(在WO 99/19467中SEQ ID NO：5表示)的37N-末端氨基酸残基，具有下面的取代：G48A+T491+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467中SEQ ID NO：4编号)。
通过“热稳定酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用”应理解为通过如本文所定义的有效量的热稳定酸性α-淀粉酶处理，本发明方法的次级液化作用步骤中的液化作用。
使用例如下面的方法：950微升0.1M柠檬酸盐+4.3mM Ca2+缓冲液在60℃温育1小时来检测热/pH稳定性。添加缓冲液(4AFAU/ml)中50微升酶。在0和60分钟时取出2×40微升样品并在冰上冷却。温育前(0分钟)测定的活性(AFAU/ml)用作参考(100％)。百分比的下降计算为温育时间的函数。为了测定热稳定性，使用不同的温度，例如50，60，70，80，90℃重复试验。为了测定pH稳定性，使用不同的pH例如pH2.5；3；3.5；4；4.5；5，重复试验。
本发明方法的α-淀粉酶，特别是热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶的实例是具有SEQ ID NO：1(也称SP288)中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶和其变体，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比该变体具有一或多个氨基酸残基缺失，取代和/或插入；变体具有α-淀粉酶的活性，优选的是热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶。
因此，本发明方法的次级液化作用步骤中所用的α-淀粉酶可以是例如α-淀粉酶，尤其是热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶，具有与SEQ ID NO：1有至少70％的同一性，优选的是与SEQ ID NO：1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性。在本发明中，两种氨基酸序列间的同一性程度通过以％所给的参数“同一性”描述。为了本发明的目的，两种氨基酸序列间的同一性程度优选的是通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)和同一性表以及下面的序列多重对比参数：缺口罚(Gap penalty)10，gap length penalty(缺口长度罚)10。Pairwise序列对比参数Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(windows)＝5，对角线(diagonals)＝5。
因此，本发明方法中所用的热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶可以例如也是α-淀粉酶，尤其是热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶，具有SEQ IDNO：1片段的氨基酸序列。在本文中使用的术语例如SEQ ID NO：1的变体和片段的“α-淀粉酶”或“热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶”时，应理解的是该酶具有酶活性。本文所用SEQ ID NO：1的“片段”是具有自该氨基酸序列的胺基和/或羧基末端缺失的一或多个氨基酸的多肽。优选的是，片段包含至少50个氨基酸残基或100个氨基酸残基。
由SEQ ID NO：1所给的酶也在Boel E.等中公开“在α-淀粉酶中的钙的结合：两种自曲霉属的酶的X-射线衍射的研究在2.1-A解析”。Biochemistry，29：6244-6249，Publ.Year：1990，例如在表1中和“材料与方法”的相同。
在本发明方法次级液化作用步骤中所使用的α-淀粉酶是在由Guy-Jean Moulin和Pierre Galzy的Agric.Biol.Chem.，43：1165-1171，1979中公开的α-淀粉酶。
应理解的是本发明实际条件(温度，pH)添加有效量的酶，例如在步骤(c)中添加有效量的热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶。
本发明进一步的实施方案中，在次级液化作用步骤中除了添加热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶(例如本文所述的SEQ ID NO：1的α-淀粉酶和其变体)外，也可添加不是本文所定义的热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶，例如α-淀粉酶TTC。
热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶应在液化作用和发酵期间在所提供的pH下具有活性；例如在pH范围为pH2.5-5.5使用0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+，由DE12α-淀粉酶TTC液化作用在30％干物质的谷类淀粉组成的底物。该酶优选的是至少在pH3-5，优选的是至少pH2.5-5具有活性。应理解的是该酶在所提到的pH范围之外也具有活性。
本文中术语“产麦芽糖的(maltogenic)”指的是能释放相对高量的酶活性产物的α-麦芽糖的酶。
在一特别有趣的实施方案中，术语“产麦芽糖的”指的是在60℃，pH4.5使用DE12α-淀粉酶TTC液化的30％干物质谷类淀粉的酶和以1AFAU/g干物质使用该酶，该酶在24小时内催化基于总量淀粉的至少15％，至少20％，至少25％，至少30w/w麦芽糖的形成。麦芽糖的含量可以例如通过本领域技术人员已知HPLC测定。
本文术语“DE 12α-淀粉酶TTC液化的谷类淀粉”指的是用于检测α-淀粉酶产麦芽糖化(maltogenisity)的底物，是用α-淀粉酶TTC液化DE12的谷类淀粉。
术语“热稳定”指的是在高温时酶相对稳定。在一实施方案中，该酶可以在70℃使用具有30％的干物质的DE12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉作为底物，pH5.5，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+，维持高于其活性90％1小时。
术语“酸性”指的是该酶在低pH下相对稳定。在一实施方案中，在pH3.5-5.0(例如pH4)的范围维持其高于70％的活性，优选的是pH3.8-4.7(例如pH4.2)，在条件：DE12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质的底物，温度40℃，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+。
在一实施方案中，本发明次级液化作用步骤中所用酶的pH窗(window)(模式(profile))如下：酶的最大活性发现在约pH4.2和/或酶在pH3.5-5.0(例如pH4)的范围维持其高于70％的活性，在条件：DE12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质为底物，温度40℃，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+。
在一实施方案中，本发明次级液化作用步骤中所用α-淀粉酶的温度窗(window)(模式)如下：DE12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质为底物，pH5.5，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+，在温度50-80℃维持其高于80％的活性。
本发明次级液化作用步骤中所用α-淀粉酶可以催化水解β-环糊精，其是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列酶的之一特征。
通过表达“热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用”应理解为通过如本文所定义的有效量的热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶处理，本发明方法的次级液化作用步骤中的液化作用。次级液化作用中所使用的α-淀粉酶优选的是热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶。术语“热稳定酸性α-淀粉酶”本文中指的是热稳定，酸性的和产麦芽糖的。在一实施方案中，本文α-淀粉酶是至少是热稳定的和酸性的。任选的是如本文定义的产麦芽糖的(maltogenic)。
热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶可以在初级液化作用步骤中实施；然而，如果在次级液化作用步骤中添加该酶，会获得最大的效果。
糖化作用或SSF期间所用的酶活性
葡糖淀粉酶
糖化作用步骤或糖化作用和发酵作用(SSF)同时进行的步骤可以在葡糖淀粉酶存在下实施。葡糖淀粉酶可以是任何来源的，例如衍生自微生物或植物。优选的是衍生自选自下面组的真菌的或细菌源的葡糖淀粉酶：黑曲霉葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al.(1984)，EMBO J.t(5)，p.1097-1102)，或其变体，例如WO 92/00381和WO 00/041236中公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)，米曲酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，5(4)，p.941-949)，或其变体或片段。
其它研究的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括促进热稳定性变体：G137A和G139A(Chen et al.(1996)，Prot.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen et al.(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen et al.(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe et al.(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；在位点A435和S436引入Pro残基(Li et al.(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。此外，Clark Ford于1997年10月17日提交的论文ENZYME ENGINEERING 14，Beijing/ChinaOct 12-17，97，Abstract number：Abstract book p.0-61。摘要表明在泡盛曲霉葡糖淀粉酶位点G137A，N20C/A27C和S30P的突变改进热稳定性。其它葡糖淀粉酶包括踝节菌属葡糖淀粉酶，尤其是衍生自踝节菌属emersonii(WO 99/28448)，踝节菌属leycettanus(US patent no.Re.32，153)，踝节菌属duponti，踝节菌属thermopiles(US patent no.4,587,215)。所研究的细菌葡糖淀粉酶包括自梭状芽胞杆菌属的葡糖淀粉酶，尤其是C.thermoamylolyticum(EP 135,138)，和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)。
商业的产品包括SANTM SUPERTM和AMGTM E(自Novozymes A/S)。
蛋白酶
在糖化作用步骤，SSF和/或发酵步骤中添加蛋白酶，增加FAN(游离氨基氮)的水平，并且增加酵母代谢率，以及进一步产生更高的发酵效率。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌的和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性的蛋白酶，即低于pH7的酸性条件下，水解蛋白质的能力的特征鉴定的蛋白酶。
在一优选的实施方案中，该蛋白酶是选自真菌的蛋白酶，例如衍生自曲霉菌属菌株的酸性真菌蛋白酶。
合适的酸性的真菌蛋白酶类包括衍生自曲霉属，毛霉属，酒曲菌属(Rhizopus)，念珠菌属，革盖菌属，疫病霉属(Zndothia)，Enthomophtra，耙菌属(Irpex)，青霉属，Sclerotiumand Torulopsis的真菌的蛋白酶。尤其考虑的是衍生自黑曲霉(见例如Koaze et al.，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，A spergillus saitoi(see，e.g.，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida et al.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933，棘孢曲霉(WO 95/02044)，或米曲酶，例如pepA蛋白酶；和自微小毛霉(Mucor pusillus)和米赫毛霉的酸性蛋白酶。
还考虑的是中性的或碱性蛋白酶，诸如衍生自芽胞杆菌属菌株的蛋白酶。不是酸性蛋白酶的细菌的蛋白酶，包括商业途径购得的产品Alcalasee和Neutraseo(得自Novozymes A/S)。
其它的酶：
在糖化作用/预糖化作用或SSF期间还可使用一种或更多种附加的酶。附加的酶包括例如支链淀粉酶和/或植酸酶。因此，在一实施方案中，为了促进发酵添加葡糖淀粉酶和/或5-植酸酶。
植酸酶：
本发明所用的植酸酶可以是任何能影响无机磷酸盐自植酸(肌醇六磷酸)或任何其盐(肌醇六磷酸盐)的释放的酶。植酸酶根据其在初始水解步骤中的特异性即根据磷酸酯基团首先被水解而分类。本发明所用植酸酶具有植酸酶的特异性，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶。
合适剂量的植酸酶例如在5.000-250.000 FYT/g DS的范围内，尤其是10.000-100.000 FYT/g DS。
植酸酶活性可以测定FYT单位，一个FYT为每分钟释放1微摩无机正磷酸盐的酶量。在下面的条件下：pH5.5；温度37℃；底物：浓度为0.0050mole/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。
植酸酶可以是任何源的，例如微生物，诸如衍生自Peniophra lycii或米曲酶的菌株。其可以重组或非重组产生。植酸酶可以衍生自例如植物或微生物，例如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。
植物植酸酶可以是来自小麦麸，玉米，大豆(soy bean)或百合花粉。合适的植物植酸酶描述于Thomlinson et al，Biochemistry，1(1962)，166-171；Barrientos et al，Plant.Physio.，106(1994)，1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139。
细菌酶可以自芽胞杆菌属(Bacillus)，假单胞菌属或埃希氏杆菌属(Escherichia)，特别是枯草芽孢杆菌或E.coli.。合适的细菌植酸酶描述于Paver and Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 151：1102-1108；Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences23：1207-1220；Greiner et al，Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993；WO 98/06856；WO 97/33976；WO 97/48812。
酵母植酸酶或肌醇单磷酸酶可以衍生自糖酵母属(Saccharomyces)或许旺氏酵母属，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或西方许旺氏酵母。前者的酶已描述为合适的酵母植酸酶，描述于Nayini et al，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17：24-26；Wodzinski etal，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303；AU-A-24840/95；
丝状真菌的植酸酶可以是衍生自Ascomycota(ascomycetes)fungalphylum或phylum Basidiomycota，例如曲霉属，Thermomyces(也称腐质菌属)，毁丝霉属，Manascus，青霉属，隔孢伏革菌属，田头菇属，Paxillus，或栓菌属，特别是土曲霉，黑曲霉，黑曲霉var.awamori，无花果曲霉，T.lanuginosus(也称为H.lanuginosa)，毁丝霉属thermophila，隔孢伏革菌属lycii，平田头菇(Agrocybe pediades)，Manascus anka，Paxillusinvoltus，或绒毛栓菌。合适的真菌植酸酶描述于Yamada et al.，1986，Agric.Biol.Chem.322：1275-1282；Piddington et al.，1993，Gene 133：55-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 98/28408；WO 98/28409；JP 767635；WO 98/44125；WO 97/38096；WO 98/13480。
修饰的植酸酶或植酸酶变体可通过本领域已知的方法获得。尤其是在EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330中公开的方法。
用于发酵的微生物
优选的是(d)步骤中使用微生物发酵。微生物可以是真菌微生物，例如酵母或细菌。合适的细菌可以是例如发酵单胞菌属的种，例如运动发酵单胞菌，和E.Coli。丝状真菌的实例包括青霉属种的菌株。用于乙醇制备的生物体优选的是酵母，例如毕赤氏酵母属或糖酵母属(Sacharomyces)。本发明优选的酵母是糖酵母属的种，尤其是酿酒酵母或面包糖酵母。
通过本发明方法制备的产品的用途
本发明方法得到的乙醇可以用于例如燃料乙醇；饮用乙醇，及可饮用的中度烈酒，或工业乙醇包括燃料添加剂。
另一方面，本发明涉及在制备乙醇的方法中的次级液化作用步骤中热稳定的酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶的用途；包括本发明公开的方法中的次级液化作用步骤中热稳定的酸性α-淀粉酶或热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶的用途。
本发明方法的优点
通过实施本发明次级液化作用步骤中热稳定的酸性α-淀粉酶，本发明方法提供了一种改进的制备乙醇的方法。通过本发明的方法提高了总产量和/或加工的经济性。本发明的方法有可能降低发酵时间。而且，本发明的方法可以促进发酵效率，例如通过降低残留的淀粉而不会残留在发酵中。而且，本发明的方法可以降低或消除预糖化作用步骤的需要。
通过实施本发明次级液化作用步骤中热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶，本发明方法提供了一种改进的制备乙醇的方法。通过本发明的方法提高了总产量和/或加工的经济性。所述的热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶在用于次级液化作用步骤时，与目前使用非产麦芽糖的α-淀粉酶相比，产生更高量的可发酵的糖(麦芽糖)。这会减少发酵时间和/或葡糖淀粉酶的剂量，葡糖淀粉酶是形成可发酵糖必须的。与非产麦芽糖的α-淀粉酶相比，由于形成低分子量的分子，粘度会降低。降低粘度是在例如热交换器和干燥器中所希望的。而且，发酵情况中，热稳定的产麦芽糖的酸性α-淀粉酶具有活性，并且由于该酶具有内降解(endo-breakdown)机制，它可以与葡糖淀粉酶组合，葡糖淀粉酶是胞外酶，能够更有效地在发酵期间水解淀粉。因此本发明的方法有可能降低发酵时间。本发明方法可以促进发酵效率，例如通过降低残留的淀粉而不是残留在发酵中。而且，本发明的方法可以降低或消除预糖化作用步骤的需要。
材料与方法
测定粘度
基于处理加热醪液到50-70℃。使用基于Haake VT02 rotation粘度计测定下面的粘度处理。粘度单位是厘泊(cps)，其与粘度水平成比例。
测定α-淀粉酶的活性(KNU)
KNU用于测定具有高pH最适度的细菌α-淀粉酶。
Phadebas试验
α-淀粉酶活性通过实施Phadebas片剂为底物的方法测定。Phadebas片剂(PhadebasAmylase Test，由Pharmacia Diagnostic提供)包含交联的不能溶解的蓝色淀粉聚合物，其已经用牛血清蛋白和缓冲物混合并片剂化。
对于每一单独的测量，将一片剂悬浮于含5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，pH用NaOH调整为所需值)。在所需温度下水浴中实施检测。将待检的α-淀粉酶稀释到x ml的50mM Britton Robinson缓冲液中。将1ml该α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton Robinson缓冲液中。α-淀粉酶水解该淀粉可给出可溶的蓝色片段的。所得蓝色溶液的吸光度，在620nm分光光度测定，为α-淀粉酶的活性。
重要的是温育10或15分钟(检测时间)之后所测的620nm吸光度在620nm在0.2到2.0吸光度单位的范围之内。在该吸光度范围之内，活性与吸光度间是线性的(Lambert-Beer law)。酶的稀释必须由此调整到适合该标准。在特定组的反应条件(温度，pH，反应时间，缓冲条件)下，1mg所给α-淀粉酶水解一定量底物，并且产生蓝色。蓝色强度在620nm测定。所测的吸光度与在所给定组条件下α-淀粉酶的特异性活性(活性/纯α-淀粉酶蛋白mg)成正比。
备选方法
通过采用PNP-G7底物的方法测定α-淀粉酶活性。PNP-G7是p-硝基苯-α，D-maltoheptaoside的缩写，它是封闭的低聚糖，可通过内淀粉酶切割。切割之后，包括在试剂盒中的α糖甙酶消化底物以释放游离的黄色的PNP分子，由此可通过可见的光谱测定法(spectophometry)于λ＝405nm(400-420nm.)测定。包含PNP-G7底物和α-糖甙酶的试剂盒通过Boehringer-Mannheim(cat.No.1054635)制备。
为制备底物，添加一瓶底物(BM 1442309)到5ml缓冲液(BM1442309)中。为制备α-糖甙酶，添加一瓶α-糖甙酶(BM 1462309)到45ml缓冲液(BM1442309)中。通过混合5mlα-糖甙酶溶液和0.5ml底物制备使用液。
实施该试验：转移20微升酶溶液到96孔微量滴定板并于25℃温育。25℃添加200微升使用液。混合溶液并预温育1分钟，在OD 405nm在3分钟时间里每15秒测定吸光度。
时间依赖吸光度曲线的斜率正比于在所给定组条件下α-淀粉酶的特异性活性(每mg酶的活性)
FAU活性的测定
一真菌α-淀粉酶的单位(FAU)定义为基于下面的标准条件每小时破碎5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，Batch 9947275)的酶量：
底物                 可溶的淀粉
温度                    37℃
pH                      4.7
反应时间                7-20分钟
酸性α-淀粉酶的活性(AFAU)测定
酸性α-淀粉酶的活性在AFAU(酸性真菌α-淀粉酶的单位)中测定，其是相对于标准酶测定。
所用标准为AMG 300 L(自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，公开于Boel et al.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)和WO92/00381)。在该AMG中中性α-淀粉酶室温下储存3周后自约1 FAU/mL降低到低于0.05FAU/mL。
在该AMG标准中酸性α-淀粉酶按照下面的描述测定。该方法中，1 AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘形成与淀粉的蓝色络合物，但没有产物降解。蓝色的强度由此与淀粉的浓度成正比。使用反比色法测定淀粉酶活性为特定分析条件下淀粉浓度的降低。
                α-淀粉酶淀粉+碘                →            糊精+低聚糖
                40℃，pH2.5蓝色/紫罗兰色       t＝23秒             脱色标准条件/反应条件：(每分钟)底物：                   淀粉，约0.17g/L缓冲液：                 Citate，约0.03M碘(I2)：                0.03g/LCaCl2：                 1.85mMpH：                     2.50±0.05温育温度：               40℃反应时间：               23秒波长：                   λ＝590nm酶浓度：                 0.025AFAU/mL酶的工作范围：           0.01-0.04AFAU/mL
如果进一步的详述若需要优选的是Novozymes A/S EB-SM-0259.02/01中的，在此引入作为参考。
实施例
实施例1
使用热稳定酸性α-淀粉酶的次级液化作用
400mL已磨过的谷类浆通过细菌α-淀粉酶液化作用并于105℃喷射式蒸煮5分钟；所得谷类醪液具有30％干物质，DE7和pH5.0。加热醪液到80℃。使用VT 180粘度计测定粘度至500 CPS。
所述醪液用自黑曲霉的热稳定酸性α-淀粉酶处理。酶的上样为0.25AFAU/g干物质，1AFAU定义为在标准条件下(37℃，pH2.5，0.01M醋酸盐缓冲液)水解5.25g淀粉的酶量，通过添加碘-钾(iodine-potassium)-碘化物使水解的淀粉仅稍微有色。
30分钟后，测定粘度和DE值到350 CPS和DE12，表明获得最终的谷类醪液的液化作用。
实施例2
采用热稳定产麦芽糖酸性α-淀粉酶的次级液化
400mL已磨过的谷类浆通过α-淀粉酶TTC液化作用并于105℃喷射式蒸煮5分钟；所得谷类浆具有30％干物质，DE7和pH5.0。加热浆到80℃。使用VT 180粘度计测定粘度至500 CPS。
所述醪液用具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的自黑曲霉的热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶处理。酶的用量为0.25AFAU/g干物质，1AFAU定义为在标准条件下(37℃，pH2.5，0.01M醋酸盐缓冲液)水解5.25g淀粉的酶量，通过添加碘-钾(iodine-potassium)-碘化物使水解的淀粉仅稍微有色。
30分钟后，测定粘度和DE值到350 CPS和DE12，表明获得最终的谷类醪液的液化作用。
                      序列表<110>诺维信公司(Novozymes A/S)<120>在乙醇制备中的次级液化<130>10113.204<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>484<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220><223>SEQ ID NO：1<400>1Leu Ser Ala Ala Ser Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr1               5                   10                  15Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr
        20                  25                  30Gly Asn Glu Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asp His
    35                  40                  45Leu Asp Tyr Ile Glu Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro
50                  55                  60Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His65                  70                  75                  80Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr
            85                  90                  95Ala Asp Asn Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met
        100                 105                 110Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asp His Met Gly Tyr Ala Gly Asn
    115                 120                 125Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser
130                 135                 140Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met145                 150                 155                 160Val Glu Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu
            165                 170                 175Asp Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala
        180                 185                 190Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val
    195                 200                 205Leu Glu Val Gln Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ser Gly
210                 215                 220Val Tyr Cys Val Gly Glu Ile Asp Asn Gly Asn Pro Ala Ser Asp Cys225                 230                 235                 240Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp
            245                 250                 255Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu
        260                 265                 270Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu
    275                 280                 285Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Lys Tyr
290                 295                 300Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu305                 310                 315                 320Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ala
            325                 330                 335Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr
        340                 345                 350Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile
    355                 360                 365Arg Lys Leu Ala Ile Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn
370                 375                 380Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Ala Lys Gly Thr385                 390                 395                 400Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly
            405                 410                 415Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr
        420                 425                 430Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser
    435                 440                 445Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser 6ly Leu Pro Arg Val Leu Leu
450                 455                 460Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg465                 470                 475                 480Leu Tyr Val Glu

Claims (58)

1.一种通过发酵制备乙醇的方法，该方法包括在热稳定酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用步骤。
2.一种从包含淀粉的原料制备乙醇的方法，该方法包括下面的步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；
(b)喷射式蒸煮；
(c)在热稳定酸性α-淀粉酶存在下的次级液化作用；
(d)糖化作用；和
(e)发酵作用以制备乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行，并且其中(e)与(d)同时进行或在(d)之后进行。
3.权利要求1-2中任一项的方法，进一步包括回收乙醇。
4.权利要求1-3中任一项的方法，进一步包括预糖化作用的步骤，其是在次级液化作用步骤(c)之后和步骤(d)之前进行的。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中包含淀粉的原料选自：块茎，根和整个谷物；以及前面的任意组合。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中包含淀粉的原料得自谷类。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中包含淀粉的原料选自：玉米，玉米芯，小麦，大麦，黑麦，买罗高粱和马铃薯；或前面的任意组合。
8.权利要求5的方法，其中包含淀粉的原料是整个谷物，该谷物选自玉米，小麦或大麦或其任一组合。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中包含淀粉的原料是整个谷物，并且所述方法包括在步骤(a)之前粉碎整个谷物的步骤。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中包含淀粉的原料是通过包含粉碎整个谷物的方法获得的。
11.权利要求1-5中任一项的方法，在步骤(a)前进一步包括步骤：
i)粉碎整个谷物；
ii)形成包括已粉碎谷物和水的浆以获得含淀粉的原料。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中粉碎步骤是干磨法步骤。
13.权利要求9-11中任一项的方法，其中粉碎步骤是湿磨法步骤。
14.权利要求1-5中任一项的方法，其中包含淀粉的原料是来自淀粉加工的侧流物。
15.权利要求1-14中任一项的方法，进一步包括下面的步骤：
(f)蒸馏以获得乙醇；
其中步骤(e)中的发酵和步骤(f)中的蒸馏是同时或分别地/依次地进行；任选的是后接一或多个处理步骤以进一步提炼乙醇。
16.权利要求15的方法，其中包含淀粉的原料是被粉碎的整个谷物，该方法进一步包括下面的步骤：
(g)将步骤(f)中蒸馏制备的酒糟物分为湿谷物和酒糟水；和
(h)在步骤(a)前回收酒糟水至包含淀粉的原料。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中步骤(e)中的发酵使用微生物进行，例如细菌和真菌，例如发酵单胞菌和糖酵母。
18.权利要求17的方法，其中微生物能发酵糖为乙醇。
19.权利要求17或18的方法，其中微生物是酵母，例如酿酒酵母。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中发酵在葡糖淀粉酶和/或蛋白酶存在下进行。
21.权利要求20的方法，其中蛋白酶是微生物蛋白酶，例如选自真菌蛋白酶，例如衍生自曲霉菌属优选的是黑曲霉的菌株的酸性真菌蛋白酶。
22.权利要求20的方法，其中蛋白酶是中性的或碱性蛋白酶，例如衍生自芽胞杆菌属菌株的蛋白酶。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中添加葡糖淀粉酶和/或植酸酶以启动发酵。
24.权利要求23的方法，其中植酸酶是微生物，例如衍生自Peniophralycii或米曲酶的菌株
25.权利要求23的方法，其中葡糖淀粉酶是微生物，例如衍生自黑曲霉或Talaromyces emersonii。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中步骤(a)中的α-淀粉酶是微生物，例如细菌α-淀粉酶，包括例如热稳定细菌α-淀粉酶。
27.权利要求26的方法，其中α-淀粉酶衍生自芽孢杆菌属的菌株或曲霉属的菌株。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中步骤(c)中的热稳定酸性α-淀粉酶是真菌，例如衍生自黑曲霉。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中步骤(c)中的液化材料已经液化至DE 5-15，例如8-12，例如10-12。
30.权利要求29的方法，在步骤(a)前包括下述的步骤：
i)粉碎整个谷物；和
ii)形成包括已粉碎谷物和水的浆。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中步骤(a)中的液化作用在60-95℃进行10-120分钟，优选的是75-90℃进行15-40分钟。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中步骤(c)中的液化作用在60-95℃进行10-120分钟，优选的是75-85℃进行15-80分钟。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中步骤(c)中除了热稳定酸性α-淀粉酶外还加入不是热稳定酸性α-淀粉酶的α-淀粉酶，即例如α-淀粉酶TTC。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中热稳定酸性α-淀粉酶是热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其中热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶是具有与SEQ ID NO：1有至少70％的同一性，优选的是与SEQ ID NO：1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶。
36.权利要求1-34中任一项的方法，其中热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶如权利要求41-46定义。
38.一种通过发酵制备乙醇的方法，该方法包括在α-淀粉酶存在下的次级液化作用步骤，该α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：1有至少70％的同一性，优选的是具有与SEQ ID NO：1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性的氨基酸序列。
39.一种自包含淀粉的原料制备乙醇的方法，该方法包括下面的步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下，包含淀粉的原料的液化作用；
(b)喷射式蒸煮；
(c)在α-淀粉酶存在下的次级液化作用，该α-淀粉酶与SEQ ID NO：1有至少70％的同一性，优选的是具有与SEQ ID NO：1有至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％的同一性：和
(d)糖化作用；和
(e)发酵作用以制备乙醇；
其中步骤(a)，(b)，(c)和(d)按照(a)，(b)，(c)，(d)的顺序进行，并且其中(e)与(d)同时进行或在(d)之后进行。
40.权利要求38或39的方法，其中所述的α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
41.权利要求38-40中任一项的方法，其中次级液化作用步骤中α-淀粉酶是产麦芽糖的，使得在使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质，在60℃，pH4.5，，使用1AFAU/g干物质的酶剂量，所述酶在24小时内催化基于总量淀粉的至少15％，至少20％，至少25％，至少30w/w麦芽糖的形成。
42.权利要求38-41中任一项所述的方法，其中次级液化作用步骤中所用的α-淀粉酶是热稳定的，该酶在下面的条件下在温度70℃，维持高于其活性90％1小时，使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质为底物，pH5.5；0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+。
43.权利要求38-42中任一项所述的方法，其中次级液化作用步骤中所用的α-淀粉酶是热稳定的，使得酶在下面的条件下在温度50-80℃，维持高于其活性80％15分钟，使用DE 12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质为底物，pH5.5，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+。
44.权利要求38-43中任一项所述的方法，其中次级液化作用步骤中所用的α-淀粉酶是酸性的，使得酶在下面的条件下在pH3.5-5.0(例如pH4)维持的活性比其活性的70％高：DE 12α-淀粉酶TTC液化谷类淀粉在30％的干物质为底物，温度40℃，0.1M柠檬酸盐缓冲液和4.3mM Ca2+。
45.权利要求38-39中任一项所述的方法，其中次级液化作用步骤中所用的α-淀粉酶是：
i)如权利要求42和/或权利要求43中所定义的热稳定的；
ii)如权利要求44中所定义的酸性的。
46.权利要求45的方法，其中所述的热稳定酸性α-淀粉酶也是
iii)如权利要求41中所定义的产麦芽糖的。
47.权利要求38-45中任一项的方法，其中制备乙醇方法中所用的包含淀粉的原料为权利要求5-10中任一项所定义。
48.权利要求38-45中任一项所定义的方法，进一步包括权利要求3-4或11-33中任一项所定义的处理步骤。
49.权利要求1-48中任一项定义的方法，其中次级液化作用和发酵基本同时进行，其中用于次级液化作用的α-淀粉酶通过优选的是酵母的微生物表达，该微生物被遗传修饰以表达α-淀粉酶。
50.权利要求1-49中任一项的方法，进一步包括在一或多个处理步骤中添加一或多个附加酶。
51.权利要求50的方法，其中附加的酶不是α-淀粉酶。
52.权利要求51的方法，其中附加的酶不是热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶。
53.权利要求1-52任一项所述的方法，其中所用的处理步骤分批进行或其中所有的处理步骤持续进行，或其中一或多个处理步骤分批进行而一或多个处理步骤连续进行。
54.遗传修饰酵母以表达权利要求35-36或权利要求41-47任一项所定义的α-淀粉酶。
55.热稳定酸性α-淀粉酶在制备乙醇的方法中次级液化作用步骤中的用途。
56.热稳定产麦芽糖的酸性α-淀粉酶在制备乙醇的方法中次级液化作用步骤中用途。
57.权利要求55或56的用途，其中用于本发明方法的包含淀粉的原料是如权利要求5-10任一项所述定义的。
58.权利要求55-56的用途，其中乙醇用作燃料酒精和/或燃料添加剂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1997735B (zh) * 2004-05-27 2012-02-22 金克克国际有限公司 白曲霉酸稳定性α淀粉酶和在颗粒淀粉水解中的应用
CN104812905A (zh) * 2012-11-30 2015-07-29 诺维信公司 用于生产发酵产物的方法

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