CN103987850A - 用于产生发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由含淀粉材料产生发酵产物的方法，其中在液化过程中存在和/或加入细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶和糖源生成酶。本发明还涉及适用于本发明方法的组合物。

Description

用于产生发酵产物的方法
技术领域
本发明涉及由含淀粉材料产生发酵产物的方法。本发明也涉及适合用于本发明方法的组合物。
对序列表的引用
本发明包含计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。
背景技术
由含淀粉材料产生发酵产物例如乙醇在本领域是公知的。如今，在工业上使用两种不同类型的方法。最常用的方法通常被称为“常规方法”，包括使用细菌α-淀粉酶在高温下(通常在80～90℃，pH5～6)使糊化淀粉液化，之后在葡糖淀粉酶和发酵生物体的存在下进行同步糖化发酵(SSF)。另一个公知的方法，通常被称为“生淀粉水解”法(RSH法)，包括通常在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化温度的温度下同时糖化并发酵颗粒淀粉。
尽管发酵产物产生方法在过去的十年间有显著改善，但显著量的剩余淀粉材料未被转化成期望的发酵产物如乙醇。因此，对于提供与传统方法相比能够提供较高发酵产物收率的由含淀粉材料产生发酵产物例如乙醇的方法仍存在期望和需求。
发明内容
本发明涉及使用发酵生物体由含淀粉材料产生发酵产物例如特别是乙醇的方法。
在第一个方面，本发明涉及产生发酵产物例如乙醇的方法，包括以下步骤：
i)使用
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶，
在60～80℃的温度下使含淀粉材料液化；
ii)使用糖源生成酶进行糖化；
iii)使用发酵生物体进行发酵。
在实施方式中，在步骤i)的液化过程中，还存在和/或加入蛋白酶，例如金属蛋白酶。
在实施方式中，在步骤i)的液化过程中，还存在和/或加入普鲁兰酶。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，优选为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的。在实施方式中，细菌α-淀粉酶得自嗜热脂肪芽孢杆菌(WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1)，其可以截短为具有约491个氨基酸。在实施方式中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶如上述截短并还具有I181*+G182*缺失(相对于WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1)或I181*+G182*缺失及N193F取代。在优选实施方式中，细菌α-淀粉酶得自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/019467中的SEQ ID NO:3或本文中的SEQ ID NO:1)，其截短为例如具有约491个氨基酸。截短的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶也可以具有选自以下的突变：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F；和
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
在实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶为真菌来源。在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶得自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)并具有黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶接头与SBD。在具体实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是微小根毛霉α-淀粉酶的变体，其具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头与SBD并还具有一种或多种以下取代：G128D、D143N、K192R，例如G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ ID NO:14进行编号)。
在另一实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶得自曲霉(Aspergillus)，例如具有白曲霉(Aspergillus kawachii)接头与SBD的黑曲霉α-淀粉酶或白曲霉α-淀粉酶本身。
在实施方式中，在液化过程中存在和/或加入的糖源生成酶不同于在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的糖源生成酶。
特别考虑的糖源生成酶是葡糖淀粉酶。在优选实施方式中，在液化过程中加入的葡糖淀粉酶来自青霉属(Penicillium)，特别是在公开为WO2011/127802(其并入本文以作参考)的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2并且在本文示为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，或者是在共同待决US申请第61/531,189号或US申请第61/566,046号或PCT/US12/053779中公开的草酸青霉葡糖淀粉酶的具有K79V取代的蛋白酶稳定蛋白工程化变体。
在优选实施方式中，糖源生成酶是在公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2且在本文示为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:15的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，其具有K79V取代(使用SEQ ID NO:15中示出的成熟序列进行编号)。相对于在共同待决的US申请第61/531,189号和US申请第61/566,046号或PCT/US12/053779(其并入本文以作参考)中公开的亲本，K79V葡糖淀粉酶变体对蛋白酶降解的敏感性降低。
在优选实施方式中，在糖化和/或发酵例如SSF过程中存在和/或加入的糖源生成酶是真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或米曲霉(Aspergillusoryzae)；或木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(T.reesei)；或篮状菌属(Talaromyces)的菌株，优选埃默森篮状菌(T.emersonii)。在实施方式中，在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶可以得自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别是在WO2011/066576(Novozymes)中记载的密孔菌属菌株，或来自粘褶菌属(Gloephyllum)的菌株，特别是在WO2011/068803(Novozymes)中记载的粘褶菌属菌株，或黑层孔菌属(Nigrofomes)的菌株，特别是在公开为WO2012/064351(Novozymes)的PCT/US10/058375中公开的黑层孔菌菌株。
在第二个方面，本发明涉及组合物，其包含：
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。
在本发明的实施方式中，例如金属蛋白酶的蛋白酶和/或普鲁兰酶包含在组合物中。也可以包含其他酶。
合适的细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶和糖源生成酶特别是葡糖淀粉酶的实例可以在以下在“酶”部分中找到。
附图说明
图1示出在75℃和pH4.8使用嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体、得自微小根毛霉的生淀粉水解α-淀粉酶变体和草酸青霉葡糖淀粉酶变体进行液化接着使用埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)进行SSF54小时之后的乙醇浓度。
具体实施方式
本发明涉及使用发酵生物体由含淀粉材料产生发酵产物例如特别是乙醇的方法。
本发明的发明人已经示出，本发明的方法具有多个优点。实施例5示出在乙醇工艺中收率增加，其中在乙醇工艺中，在75℃和pH4.8的液化过程中存在细菌α-淀粉酶、生淀粉降解α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合，之后使用酿酒酵母进行54小时的同步糖化发酵(SSF)。
在第一个方面，本发明涉及由含淀粉材料产生发酵产物例如乙醇的方法，包括以下步骤：
i)使用
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶，
在60～80℃的温度下使含淀粉材料液化；
ii)使用糖源生成酶进行糖化；
iii)使用发酵生物体进行发酵。
在实施方式中，本发明的方法进一步在液化步骤i)之前包括以下步骤：
a)降低含淀粉材料的粒度，优选通过干磨；
b)形成包含含淀粉材料和水的浆料(slurry)。
浆料可以包含10～55w/w-％干固形物(DS)，优选25～45w/w-％干固形物(DS)，更优选30～40w/w-％干固形物(DS)的含淀粉材料。
用作起始材料的含淀粉材料通常例如通过磨制而减小粒度，以打开结构并允许进一步的加工。
通常而言，有两种类型的磨制：湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合。干磨和湿磨在本领域都是公知的。根据本发明，优选干磨。在实施方式中，粒度减小到0.05～3.0mm，优选为0.1～0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料可通过具有0.05～3.0mm筛网、优选为0.1～0.5mm筛网的筛。在另一实施方式中，至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、特别是至少90％的含淀粉材料可通过具有#6筛网的筛。
液化步骤i)过程中的pH通常为4～6，优选为4.5～5.0或4.5～4.8或5～6。液化过程中的温度可以在70～80℃，例如75～80℃，优选为约75℃。通常在液化步骤(i)过程中将含淀粉材料加热0.1～10小时，例如1～3小时，例如约1.5小时。
细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶和糖源生成酶特别是葡糖淀粉酶，以及任选的蛋白酶和/或普鲁兰酶可以加到水性浆料中以起始液化(稀化(thinning))。在实施方式中，将一部分酶共混物添加至水性浆料中，而剩余的酶在液化步骤i)中添加。
在实施方式中，水性浆料可以被喷煮(jet-cooked)，从而在步骤i)的液化之前使浆料进一步糊化。喷煮可以在95～145℃，例如105～125℃，例如110～145℃，优选120～140℃，例如125～135℃，优选约130℃的温度下进行约1～15分钟，优选约3～10分钟，特别是约5分钟。
在实施方式中，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)相继或同时进行。在优选的实施方式中，步骤ii)和iii)同时进行(SSF工序)。在优选实施方式中，加入糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶。糖源生成酶例如葡糖淀粉酶可以不同于在液化步骤i)中加入的酶。
在实施方式中，糖化步骤ii)在20～75℃、优选40～70℃例如约60℃的温度下于4～5的pH例如约pH4.5进行。
此外，发酵步骤iii)或同步糖化发酵(SSF)可以在25～40℃，例如28～35℃，例如30～34℃，优选约32℃的温度下进行，其中发酵进行6～120小时，特别是24～96小时，例如约54小时。
合适的细菌α-淀粉酶的实例可以在以下的“细菌α-淀粉酶”部分找到。在优选实施方式中，细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，优选得自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是在WO99/019467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1所示的那个，例如截短为例如具有约491个氨基酸、例如485～495个氨基酸的那个。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶也可以是变体，例如以下所列的和/或在WO2011/082425(并入本文以作参考)中公开的那些中的一种。
生淀粉水解α-淀粉酶的实例可以在以下“生淀粉水解α-淀粉酶”部分中找到。在实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源。在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶得自微小根毛霉α-淀粉酶并具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD。在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是还具有一个以下取代的上述者的变体：G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ ID NO:14进行编号)。
糖源生成酶包括特别是葡糖淀粉酶的实例可以在以下“糖源生成酶”部分中找到。糖源生成酶在70℃和pH5.3下具有至少70％、例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性。
在优选实施方式中，葡糖淀粉酶来自青霉属，特别是在公开为WO2011/127802(并入本文以作参考)的PCT/CN10/071753中公开为SEQID NO:2并示于本文中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:15的草酸青霉菌株，或者是在共同待决US申请第61/531,189或US申请第61/566,046号或PCT/US12/053779中公开并具有K79V取代的草酸青霉葡糖淀粉酶的蛋白酶稳定蛋白工程化变体。
在实施方式中，蛋白酶也存在于液化步骤i)的过程中。蛋白酶的实例可以在以下“蛋白酶”部分中找到。在实施方式中，蛋白酶是金属蛋白酶。在优选实施方式中，蛋白酶得自嗜热子囊菌属(Thermoascus)，优选为黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，特别是在本文的SEQ ID NO:3或WO2010/008841的SEQ IDNO:1的氨基酸1～177(成熟多肽)中公开的黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)。
含淀粉材料
根据本发明，可以使用任何合适的含淀粉材料。起始材料通常基于所期望的发酵产物进行选择。适用于本发明方法的含淀粉材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、菜豆或甘薯、或其混合物、或从其得到的淀粉、或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。优选的含淀粉材料是玉米和小麦。
糖化和发酵
在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在和/或加入一种或多种糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶。糖源生成酶可以优选为葡糖淀粉酶，但也可以是选自β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的酶。
糖源生成酶(包括葡糖淀粉酶)的实例可以在以下“在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的糖源生成酶”部分中找到。
当相继进行糖化和发酵时，步骤ii)中的糖化可以使用本领域公知的条件进行。例如，糖化步骤ii)可以持续约24至约72小时。然而，通常仅在30～65℃通常约60℃的温度下进行通常40～90分钟的预糖化，之后在同步糖化发酵(SSF)的发酵过程中进行糖化。糖化可以在20～75℃、优选40～70℃、通常约60℃的温度下在4～5的pH通常约pH4.5下进行。
同步糖化发酵(SSF)广泛用于工业规模的发酵产物生产方法中，特别是乙醇生产方法中。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。糖化没有保持阶段，意味着例如酵母的发酵生物体与酶可以一起加入。根据本发明，SSF通常在25℃～40℃的温度下进行，例如28℃～35℃，例如30℃～34℃，优选为约32℃。在实施方式中，发酵进行6～120小时，特别是24～96小时。在实施方式中，pH为3.5～5，特别是3.8～4.3。
发酵培养基
“发酵培养基”(“fermentation media”或“fermentation medium”)是指发酵进行的环境并包括发酵底物(即经由发酵生物体代谢的糖源)。发酵培养基可以包含用于发酵生物体的营养物质和生长刺激剂。营养物质和生长刺激剂广泛用于发酵领域中，且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质、或其组合。
发酵生物体
术语“发酵生物体”是指适用于本发明方法中的发酵的任何生物体，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体能够产生所期望的发酵产物。特别适合的发酵生物体能够将糖例如葡萄糖或麦芽糖直接地或间接地发酵即转化成所期望的发酵产物，例如乙醇。发酵生物体的实例包括真菌生物体例如酵母。优选的酵母，特别是用于乙醇产生的，包括酵母菌菌株，特别是酿酒酵母。
在一个实施方式中，将发酵生物体添加至发酵培养基中，从而每mL发酵培养基中成活发酵生物体例如酵母的计数为105～1012，优选为107～1010，特别为约5x107。
市售可得的酵母包括，例如RED STAR ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA得到)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA得到)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从EthanolTechnology,WI,USA得到)、BIOFERM AFT和XR(可从NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation,GA,USA得到)、GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden得到)、和FERMIOL(可从DSM Specialties得到)。
发酵产物
术语“发酵产物”是指由包括使用发酵生物体的发酵步骤的方法所产生的产物。根据本发明包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在优选实施方式中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或用在可消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如发酵的乳产品)、皮革业和烟草业的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ales)、烈性黑啤酒(stouts)、钵尔透黑啤酒(porters)、贮藏啤酒(lagers)、苦啤酒(bitters)、麦芽酒(malt liquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。优选的所使用发酵方法包括醇发酵法。发酵产物优选为乙醇。根据本发明方法得到的发酵产物可以是乙醇。发酵产物，例如特别是乙醇，可以用作通常与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，也可以用作可饮用的乙醇。在优选实施方式中，发酵产物是燃料乙醇。
回收
在发酵之后，可以将发酵产物从发酵培养基中分离。可以对浆液进行蒸馏，以提取所期望的发酵产物。或者，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所期望的发酵产物。发酵产物也可以通过气提或其他本领域公知的方法来回收。
酶
细菌α-淀粉酶
根据本发明，在液化过程中存在和/或加入细菌α-淀粉酶、连同生淀粉水解酶以及在70℃和pH5.3下具有至少70％、例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％热稳定性的糖源生成酶。
任选地，在液化过程中也存在或加入蛋白酶和/或普鲁兰酶。
术语“细菌α-淀粉酶”是指分类在EC3.2.1.1的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可以例如得自芽孢杆菌属的菌株，芽孢杆菌属有时候也称为地芽孢杆菌属(Geobacillus)。在优选实施方式中，芽孢杆菌α-淀粉酶得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但是也可以得自其它芽孢杆菌。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO99/19467中SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、以及WO99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列并入本文以作参考)。在实施方式中，α-淀粉酶可以是与WO99/19467中SEQ ID NO:3、4或5分别所示序列的任一者具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的酶。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶可以是与WO99/19467中SEQ IDNO:3或本文中SEQ ID NO:1所示的任意序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或至少100％同一性的酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体。这样的变体的实例可以在WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355的任一者中找到(所有文件均并入本文以作参考)。具体的α-淀粉酶变体公开在US专利第6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中(并入本文以作参考)并包括在R179、G180、I181和/或G182位点处具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常称为BSGα-淀粉酶)变体，缺失优选为WO96/23873中公开的双缺失--参见例如第20页第1～10行(并入本文以作参考)，优选为与WO99/19467中公开的SEQ ID NO:3或本文SEQID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置181和182的缺失，或者使用WO99/19467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1(文献并入本文以作参考)进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其相比于在WO99/19467中公开的SEQ ID NO:3中或本文SEQ ID NO:1中示出的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有与位置181和182的缺失对应的双缺失并还包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶也可以在示于WO99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中与S239对应的位置上具有取代，或为WO99/19467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体。在优选的实施方式中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选为S242Q变体(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
在实施方式中，变体在嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中具有E188突变，例如E188P取代(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
在优选实施方式中，细菌α-淀粉酶可以是截短的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。特别地，截短使得WO99/19467中SEQ ID NO:3或本文SEQID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶为约491个氨基酸长度。
细菌杂合α-淀粉酶
细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C端氨基酸残基和得自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ IDNO:5中所示)的37个N端氨基酸残基的α-淀粉酶。在优选的实施方式中，杂合体具有一个或多个，特别是所有的以下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选具有一个或多个以下突变(或其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或位置176和179之间的两个残基的缺失，优选为E178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在优选实施方式中，细菌α-淀粉酶是在Richardson等人,2002,TheJournal of Biological Chemistry277(29):26501-26507中公开的嵌合α-淀粉酶(称为BD5088)的成熟部分或其变体。此α-淀粉酶与WO2007/134207中的SEQ ID NO:2中所示者相同。成熟酶序列在位置1的起始“Met”氨基酸后面开始。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶是热稳定性细菌α-淀粉酶。在实施方式中，热稳定性细菌α-淀粉酶是WO2011/082425(并入本文以作参考)中公开的那种。在实施方式中，热稳定性细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属(或地芽孢杆菌属)的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，尤其是WO99/019467中公开为SEQ ID NO:3或本文中SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌，具有双缺失I181+G182和取代N193F，还包含其他突变：
-V59A+Q89R+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
-V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+D281N；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K；
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F；
-V59A+G108A；
-V59A+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
-V59A+G108A+S242Q+M284V；
-V59A+G108A+M284V；
-V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+M284V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
-V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
-V59A+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V；
-V59A+M284V；
-A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-G108A+M284V；
-E129V+K177L+R179E；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T；
-E129V+K177L+R179E+S242Q；
-E129V+K177L+R179E+M284V；
-E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-K220P+N224L+S242Q+Q254S；
-K220P+N224L+Q254S；
-S242Q+M284V；
-M284V。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶变体可以是与WO99/19467中SEQID NO:3或本文中SEQ ID NO:1中所示任意序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但少于100％同一性的酶。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶在pH4.5、75℃和0.12mM CaCl2下具有至少20、例如至少25、例如至少30、例如至少40、例如至少50、例如至少60、例如至少70、例如至少80、例如至少90、例如至少100、例如至少110、例如至少120、例如至少130、例如至少140、例如至少150、例如至少160、例如至少170、例如至少180、例如20～300、例如50～300、例如60～300、例如70～300、例如80～300、例如90～300、例如100～300、例如120～300、例如140～300、例如160～300、例如180～300的T1/2(min)。
如果是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的话，细菌α-淀粉酶通常以0.0005～5KNU/g DS的量加入，优选为0.001～1KNU/g DS，例如约0.06KNU/g DS或0.0005～5KNU(S)/g DS，优选为0.001～1KNU(S)/g DS，例如约0.060KNU(S)/g DS。
包含细菌α-淀粉酶的市售组合物的实例包括BANTM、TERMAMYLTMSC、LIQUOZYMETMX、LIQUOZYMETMSC、(Novozymes)、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA、SPEZYMETMDELTA AA、GC358、GC980和SPEZYMETM RSL(Danisco A/S)、以及Verenium,USA的FUELZYMETM。
生淀粉水解α-淀粉酶
在本发明的方法中，在液化步骤i)过程中存在生淀粉水解α-淀粉酶，连同细菌α-淀粉酶以及在70℃和pH5.3下具有至少70％，例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％热稳定性的糖源生成酶。
任选地，在液化过程中也存在或加入蛋白酶和/或普鲁兰酶。
如本文所用的，“生淀粉水解α-淀粉酶”是指能够在低于淀粉的糊化温度的温度直接降解生淀粉颗粒的α-淀粉酶。淀粉的糊化温度可以为51℃～78℃，糊化初始温度可以从约51℃变动至68℃。
生淀粉水解α-淀粉酶可以是任何来源。在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶得自真菌生物体例如丝状真菌。
在实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶得自曲霉菌株，例如黑曲霉或白曲霉。
在优选实施方式中，真菌酸性生淀粉水解α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。
在实施方式中，生淀粉水解酶是杂合酶，其包含具有α-淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列以及糖结合模块的氨基酸序列、以及任选的接头，其中催化模块是真菌来源。这些酶的具体实例是以下具体在WO2005/003311的表3和表4中公开的酶。生淀粉水解酶包括以下表格中的那些：
变体 催化模块 接头 SBD
JA001 黑曲霉AA(SP288) 白曲霉AA 白曲霉AA
JA002 SP288 白曲霉AA 黑曲霉AMG
JA003 SP288 白曲霉AA 埃默森篮状菌AMG
JA004 SP288 白曲霉AA 罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)AMG
JA005 SP288 白曲霉AA 芽孢杆菌MA
JA007 白曲霉AA 白曲霉AA 白曲霉AA
JA008 SP288 黑曲霉AMG 黑曲霉AMG
JA009 SP288 罗氏阿太菌AMG 黑曲霉AMG
JA010 SP288 PEPT 黑曲霉AMG
JA011 SP288 罗氏阿太菌AMG 罗氏阿太菌AMG
JA012 SP288 白曲霉AA 黑曲霉AMG+罗氏阿太菌AMG
在优选实施方式中，生淀粉水解酶具有黑曲霉催化域和白曲霉α-淀粉酶(AA)或罗氏阿太菌葡糖淀粉酶(AMG)SBD。
在另一优选实施方式中，生淀粉降解酶是白曲霉α-淀粉酶。
其它关注的生淀粉水解杂合α-淀粉酶的具体实例包括在WO2006/069290中公开的那些，特别是具有罗氏阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(美国申请第60/638,614中的SEQ ID NO:101)。
在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶，由在WO2006/069290(Novozymes A/S)的表格5中公开为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶构成。
也包括具有罗氏阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)α-淀粉酶(美国申请第60/638,614中的SEQ IDNO:102)。
在另一个实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶，由WO2006/069290(Novozymes A/S)中公开的大型亚灰树花菌α-淀粉酶构成。
在本文实施例5中使用的生淀粉水解α-淀粉酶是在共同待决的US临时申请第61/505,192号(其并入本文以作参考)中公开的微小根毛霉α-淀粉酶的变体。
RSH AA96是如下的微小根毛霉α-淀粉酶变体，其具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD以及以下取代：G128D+D143N(使用本文的SEQID NO:14进行编号)。
RSH AA101是如下的微小根毛霉α-淀粉酶变体，其具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD以及以下取代：G128D+D143N+K192R(使用本文的SEQ ID NO:14进行编号)。
在一个实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶定义为具有至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2的生淀粉降解指数的酶，其中生淀粉降解指数为降解生淀粉的活性与降解糊化淀粉的活性的比率(Ra/Ga)。优选地，生淀粉水解α-淀粉酶定义为具有高于1的生淀粉降解指数的酶。对糊化淀粉的活性通过测量在2％糊化(例如玉米)淀粉反应混合物中经由酶产生的葡萄糖释放而测定。活性通过在每小时每mg为4mol的纯活性酶中产生的还原糖的释放而进行测定。之后，可以使用相同的检定来测量酶对生淀粉的活性，但是用2％生(例如玉米)淀粉替代2％糊化(例如玉米)淀粉。在两个检定中，温度为40℃，使用相同的pH和缓冲液，孵育时间为6小时，这还在以下的“材料和方法”部分中描述。
用在本发明中的生淀粉水解α-淀粉酶也包括与本文所述的生淀粉水解α-淀粉酶具有高度序列同一性的α-淀粉酶。在实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶与本文公开的生淀粉水解α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的生淀粉水解α-淀粉酶。例如，生淀粉水解α-淀粉酶包括与WO2006/069290的表5中公开为V039的或本文中SEQ ID NO:13或14的杂合α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的生淀粉水解α-淀粉酶。
在一个实施方式中，可以在液化步骤i)中以每g DS为0.01～1000微克酶蛋白(EP)的量加入生淀粉水解α-淀粉酶，例如每g DS为0.1～500微克EP，例如每g DS为1～200微克EP，例如每g DS为1～100微克EP。
糖源生成酶
根据本发明，在液化过程中存在和/或加入在70℃和pH5.3下具有至少70％、例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的糖源生成酶(优选为葡糖淀粉酶)，连同细菌α-淀粉酶和生淀粉水解α-淀粉酶。也可以在液化步骤i)过程中存在和/或加入蛋白酶和/或普鲁兰酶。
术语“糖源生成酶”包括生成可发酵的糖的任何酶。糖源生成酶能够产生糖，该糖能够在例如用于本发明的产生发酵产物例如乙醇的方法中用作所考虑的发酵生物体的能源。所生成的糖可以直接地或间接地转化成所期望的发酵产物，优选为乙醇。根据本发明，可以使用糖源生成酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生成剂)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生成剂)。
在实施方式中，糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶，在70℃、pH5.3下具有至少70％，例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性。
在实施方式中，糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶，按实施例4(pH最适条件)所述测定，在pH4.5下具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％的相对活性。
在实施方式中，糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶，按实施例4(pH稳定性)所述测定，在pH4.5下具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的pH稳定性。
在具体和优选的实施方式中，糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选为真菌来源，优选为丝状真菌，例如来自青霉属的菌株，特别是在公开为WO2011/127802(其并入本文以作参考)的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2并且示为本文SEQ ID NO:9的草酸青霉菌株，或在共同待决US申请第61/531,189号或US申请第61/566,046号或PCT/US12/053779中公开的具有K79V取代(使用本文中的SEQ IDNO:15进行编号)的草酸青霉变体。K79V葡糖淀粉酶变体与亲本相比对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
在实施方式中，葡糖淀粉酶与公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中示为SEQ ID NO:2或示为本文SEQ ID NO:9中的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
蛋白酶
根据本发明，可以在步骤i)的液化过程中存在和/或加入蛋白酶，连同细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶、以及在70℃和pH5.3下具有至少70％热稳定性的糖源生成酶(优选为葡糖淀粉酶)。
蛋白酶可以是任何蛋白酶。在优选实施方式中，蛋白酶是微生物来源的酸性蛋白酶，优选为真菌或细菌来源。优选酸性真菌蛋白酶，也可以使用其他蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即以在pH7以下的酸性条件下水解蛋白的能力为特征的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可以得自曲霉属、假丝酵母属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。具体而言，蛋白酶可以得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)、泡盛曲霉(Hayashida等人,1977,Agric.Biol.Chem.42(5),927-933)、黑曲霉(参见，例如Koazeet al.,1964,Agr.Biol.Chem.Japan28：216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan28：66)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)，例如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉(Mucormiehei)或微小毛霉(Mucor pusillus)的酸性蛋白酶。
蛋白酶可以是中性或碱性蛋白酶，例如得自芽孢杆菌菌株的蛋白酶。具体蛋白酶得自解淀粉芽孢杆菌并具有可在Swissprot以登录号P06832中得到的序列。蛋白酶可以与在Swissprot数据库中以登录号P06832公开的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％同一性。
蛋白酶可以与在WO2003/048353中公开为SEQ ID NO:1或本文中SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％的序列同一性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％同一性。
蛋白酶可以是选自EC3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)蛋白酶的木瓜蛋白酶样蛋白酶，例如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝摩蛋白酶)、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在实施方式中，蛋白酶是得自曲霉属菌株例如米曲霉的蛋白酶制剂。在另一实施方式中，蛋白酶得自根毛霉属菌株，优选为米黑根毛霉。在另一实施方式中，蛋白酶是蛋白酶制剂，优选为得自曲霉属菌株例如米曲霉的蛋白水解制剂与得自根毛霉属菌株优选米黑根毛霉的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶记载在例如Handbook of Proteolytic Enzymes,Edited by A.J.Barrett,N.D.Rawlings and J.F.Woessner,Academic Press,San Diego,1998,章节270中。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如在Berka等人,1990,Gene96：313；Berka等人,1993,Gene125:195-198；和Gomi等人,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100(并入本文以作参考)中公开的那些。
蛋白酶也可以是金属蛋白酶，其定义为选自以下的蛋白酶：
(a)属于EC3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶；优选为EC3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；
(b)属于上述手册中M组的金属蛋白酶；
(c)没有分到族(名称：MX族)或属于MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH族(在上述手册的989～991页定义)中任一族的金属蛋白酶；
(d)金属蛋白酶的其他家族(如在以上手册的1448～1452页定义)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47家族中任一族的金属蛋白酶(如在以上手册的1448～1452页定义)；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及
(i)属于M35家族的金属蛋白酶(如在以上手册的1492～1495页中定义)。
在其他具体实施方式中，金属蛋白酶是对于肽键的亲核攻击由水分子介导的水解酶，其通过二价金属阳离子活化。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。金属离子可以通过氨基酸配体而原位保持。配体的数量可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施方式中，数量为二或三，优选为三。
对用于本发明方法的金属蛋白酶的来源没有限制。在实施方式中，金属蛋白酶分类为EC3.4.24，优选为EC3.4.24.39。在一个实施方式中，金属蛋白酶是酸稳定性金属蛋白酶，例如真菌酸稳定性金属蛋白酶，例如得自嗜热子囊菌菌株优选为黄嗜热子囊菌菌株特别是黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(分类为EC3.4.24.39)。在另一实施方式中，金属蛋白酶得自曲霉属菌株，优选米曲霉菌株。
在一个实施方式中，金属蛋白酶与WO2010/008841的SEQ IDNO:1或本文SEQ ID NO:3(黄嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178～177、-159～177或优选为氨基酸1～177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％例如至少98％、例如至少99％的序列同一性；并且具有金属蛋白酶活性。在具体实施方式中，金属蛋白酶由与上述SEQ ID NO:1或示为本文的SEQ ID NO:3具有同一性的氨基酸序列构成。
黄嗜热子囊菌金属蛋白酶是适用于本发明方法的金属蛋白酶的优选实例。另一金属蛋白酶得自米曲霉并包含WO2003/048353中所公开的SEQ ID NO:11或其氨基酸-23～353；-23～374；-23～397；1～353；1～374；1～397；177～353；177～374；或177～397，和WO2003/048353中所公开的SEQ ID NO:10的序列。
另一适用于本发明方法的金属蛋白酶是包含WO2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或者金属蛋白酶是与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的同一性的分离多肽；且具有金属蛋白酶活性。在具体实施方式中，金属蛋白酶由WO2010/008841(并入本文以作参考)的SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成。
在具体实施方式中，金属蛋白酶的氨基酸序列与黄嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178～177、-159～177或+1～177相差四十、三十五、三十、二十五、二十或十五个氨基酸。
在另一个实施方式中，金属蛋白酶的氨基酸序列与这些金属蛋白酶氨基酸序列的氨基酸-178～177、-159～177或+1～177相差十、或九、或八、或七、或六、或五个氨基酸，如相差四、三、二或一个氨基酸。
在具体实施方式中，金属蛋白酶a)包含以下氨基酸序列，或b)由以下氨基酸序列构成：
i)WO2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178～177、-159～177或+1～177的氨基酸序列；
ii)WO2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23～353、-23～374、-23～397、1～353、1～374、1～397、177～353、177～374或177～397的氨基酸序列；
iii)WO2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)、ii)和iii)序列的具有蛋白酶活性的等位变体或片段。
WO2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178～177、-159～177、或+1～177或WO2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23～353、-23～374、-23～397、1～353、1～374、1～397、177～353、177～374或177～397的片段是从这些氨基酸序列的氨基端和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方式中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。
在另一个实施方式中，金属蛋白酶与另一蛋白酶组合，另一蛋白酶为例如真菌蛋白酶，优选为酸性真菌蛋白酶。
市售可得的产品包括ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、NOVOZYMTMFM2.0L和iZyme BA(可从Novozymes A/S,Denmark得到)以及来自Genencor International,Inc.,USA的GC106TM和SPEZYMETMFAN。
蛋白酶可以以每g DS为0.0001～1mg酶蛋白，优选每g DS为0.001～0.1mg酶蛋白的量存在。或者，蛋白酶可以以0.0001～1LAPU/gDS的量存在，优选0.001～0.1LAPU/g DS和/或0.0001～1mAU-RH/gDS，优选0.001～0.1mAU-RH/g DS。
在实施方式中，用于本发明方法的蛋白酶是热稳定性蛋白酶，优选为在WO2011/072191(并入本文以作参考)中公开的那个，其可以具有
i)作为80℃/70℃的相对活性确定的高于20％的热稳定性值；和/或
ii)作为85℃/70℃的相对活性确定的高于10％的热稳定性值。
在实施方式中，蛋白酶具有：
-作为80℃/70℃的相对活性确定的高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％的热稳定性值，和/或
-作为85℃/70℃的相对活性确定的高于12％、高于14％、高于16％、高于18％、高于20％的热稳定性值；和/或
-作为80℃的剩余活性确定的高于20％、高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％的热稳定性值；和/或
作为84℃的剩余活性确定的高于20％、高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％的热稳定性值。
纯化的变体可以具有如实施例3中公开的使用Zein-BCA检定确定的在85℃高于90、高于100的热稳定性。
“相对活性”和“剩余活性”的确定如实施例2中所述般确定。
在优选实施方式中，用于本发明方法中的热稳定性蛋白酶是定义为属于EC3.4.24(金属内肽酶)、优选为EC3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶的“金属蛋白酶”。
为确定指定蛋白酶是否为金属蛋白酶，参照以上“蛋白水解酶的手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)”和其中表明的原理。该确定方法可以对所有类型的蛋白酶执行，天然存在的或野生型蛋白酶；或基因工程蛋白酶或合成蛋白酶。
蛋白酶活性可以使用任何合适的检定进行测定，其中采用底物，底物包括与所考虑蛋白酶的特异性相关的肽键。同样地，检定pH和检定温度将适用于所考虑蛋白酶。检定pH值的实例是pH6、7、8、9、10或11。检定温度的实例为30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。
蛋白酶底物的实例是酪蛋白，例如天青精(Azurine)-交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。两种蛋白酶检定记载于以下“材料&方法”部分，其中所谓的“AZCL-酪蛋白检定”是优选检定。
在实施方式中，蛋白酶具有由AZCL-酪蛋白检定确定的JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的活性的至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少100％。
对用于本发明方法中的热稳定性蛋白酶的来源没有限制，只要其满足上述定义的热稳定性特征。蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要蛋白酶具有上述定义的热稳定性特征。在优选实施方式中，蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施方式中，用于本发明方法的蛋白酶是真菌来源，例如真菌金属蛋白酶，例如得自嗜热子囊菌属菌株，优选为黄嗜热子囊菌菌株，特别是黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670的真菌金属蛋白酶(分类为EC3.4.24.39)。
在实施方式中，蛋白酶是示于WO2003/048353中所公开SEQ IDNO:2的金属蛋白酶的成熟部分或示于WO2010/008841中SEQ IDNO:1且示于本文SEQ ID NO:3的成熟部分的变体，具有以下突变：
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L.
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
在实施方式中，热稳定性蛋白酶变体与WO2003/048353中所公开SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO2010/008841中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但少于100％的同一性。
在实施方式中，蛋白酶得自火球菌属(Pyrococcus)的菌株，例如激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株。在实施方式中，蛋白酶是示于US专利第6,358,726-B1中SEQ ID NO:1的那个(Takara ShuzoCompany)。在另一个实施方式中，蛋白酶是本文SEQ ID NO:16中所公开的那个，或与US专利第6,358,726-B1号中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:16具有至少80％同一性，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可以从Takara Bio,Japan购买。
激烈火球菌蛋白酶是热稳定性蛋白酶。发现Takara Bio,Japan的市售激烈火球菌蛋白酶产品(Pfu S)在pH4.5下具有如本文实施例2般确定的110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性。
普鲁兰酶
根据本发明，在液化、糖化和/或发酵过程中可以进一步存在普鲁兰酶。
在实施方式中，在液化步骤i)过程中存在和/或加入普鲁兰酶。
在另一实施方式中，在糖化或同步糖化发酵(SSF)过程中存在和/或加入普鲁兰酶。
普鲁兰酶(EC3.2.1.41，普鲁兰多糖6-葡聚糖水解酶)是以它们水解例如支链淀粉和普鲁兰多糖中α-1,6-糖苷键的能力为特征的脱支酶。
普鲁兰酶可以是任何普鲁兰酶。在实施方式中，普鲁兰酶是细菌普鲁兰酶，特别是得自芽孢杆菌属菌株、特别是得自Bacillusderamificans菌株的普鲁兰酶。EP605,040公开了得自Bacillusderamificans的这些普鲁兰酶。
在实施方式中，普鲁兰酶是WO00/01796中公开的变体。关注的普鲁兰酶包括美国专利第4,560,651号(并入本文以作参考)公开的得自Bacillus amyloderamificans的普鲁兰酶、WO01/151620(并入本文以作参考)中公开为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶、WO01/151620(并入本文以作参考)中公开为SEQ ID NO:4的Bacillus deramificans、以及在WO01/151620(并入本文以作参考)中公开为SEQ ID NO:6并记载于FEMS Mic.Let.115:97-106(1994)的来自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的普鲁兰酶。
根据本发明而关注的其他普鲁兰酶包括来自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)特别是WO92/02614中公开的沃氏火球菌DSMNo.3773的普鲁兰酶。
在实施方式中，普鲁兰酶是GH57家族普鲁兰酶。在实施方式中，普鲁兰酶包括WO2011/087836(并入本文以作参考)中公开的X47结构域。更具体地，普鲁兰酶可以得自热球菌属(Thermococcus)的菌株，包括Thermococcus litoralis和Thermococcus hydrothermalis，例如示于SEQ ID NO:11在X47结构域后面的X4位点处截短的Thermococcushydrothermalis普鲁兰酶(即，SEQ ID NOS：11和12的氨基酸1～782)。普鲁兰酶也可以是Thermococcus litoralis与Thermococcushydrothermalis普鲁兰酶的杂合体或在WO2011/087836(并入本文以作参考)中公开或在本文SEQ ID NO:12中公开的具有截短位点X4的热T.hydrothermalis/T.litoralis杂合酶。
在另一实施方式中，普鲁兰酶得自热球菌属菌株，例如特别是Thermococcus hydrothermalis。在实施方式中，普鲁兰酶是Thermococcushydrothermalis的变体。在实施方式中，普鲁兰酶包含X47结构域。在实施方式中，普鲁兰酶是截短的，例如2011/087836中公开的那种。在实施方式中，普鲁兰酶包含X46结构域例如WO2011/076123中公开的那种。
在液化和糖化和/或发酵过程中加入的普鲁兰酶可以不同。例如，在实施方式中，在液化步骤i)过程中存在和/或加入的普鲁兰酶得自Thermococcus hydrothermalis，而在糖化和/或发酵过程中任选加入的普鲁兰酶得自Bacillus deramificans。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的检定在以下“材料&方法”部分中描述。
根据本发明，普鲁兰酶可以以有效量加入，其包括每克DS为约0.0001～10mg酶蛋白的优选量，优选为每克DS为0.0001～0.10mg酶蛋白，更优选为每克DS为0.0001～0.010mg酶蛋白。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的检定在以下“材料&方法”部分中描述。
市售可得的普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETMD2(Novozymes A/S,Denmark)、OPTIMAX L-300(Danisco,USA)和AMANO8(Amano,Japan)。
在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的糖源生成酶
根据本发明，可以在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶。糖源生成酶可以不同于在液化步骤i)中存在和/或加入的糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶
根据本发明，在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶可以得自任何合适的来源，例如得自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源，选自曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)或其变体，例如在WO92/00381、WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；在WO84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.55(4):941-949(1991))，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人,1995,Prot.Eng.8:575-582)；N182(Chen等人,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它葡糖淀粉酶包括罗氏阿太菌(之前的名称为罗氏伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见US专利第4,727,026号和Nagasaka等人,1998,“Purification and properties of theraw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,Appl.Microbiol.Biotechnol.50:323-330)、篮状菌属葡糖淀粉酶特别是得自埃默森篮状菌(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利第RE32,153号)、杜邦篮状菌(Talaromyces duponti)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利第4,587,215号)。在优选实施方式中，在糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO99/28448中公开的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
在实施方式中，葡糖淀粉酶是表现出与WO99/28448中示为SEQID NO:7的成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。
所关注的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)、和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)和瓣环栓菌(Trametescingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)；和WO2006/069289中公开的大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)；或WO2007/124285中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。根据本发明，也包括杂合葡糖淀粉酶。实例是WO2005/045018中公开的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括在实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(杂合体并入本文以作参考)。
在实施方式中，葡糖淀粉酶得自密孔菌属的菌株，特别是WO2011/066576(Novozymes)中记载的密孔菌属的菌株，或来自粘褶菌属的菌株，特别是在WO2011/068803(Novozymes)中记载的粘褶菌属菌株，或黑层孔菌属的菌株，特别是在公开为WO2012/064351(Novozymes)的PCT/US10/058375中公开的黑层孔菌菌株。
也包括表现出与任意上述葡糖淀粉酶具有高度同一性的葡糖淀粉酶，即，与上述成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。
在实施方式中，葡糖淀粉酶是表现出与WO2011/066576中示为SEQ ID NO:2、4或6中任一个的成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。
在实施方式中，葡糖淀粉酶是表现出与WO2011/068803中示为SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16或18中任一个的成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性的葡糖淀粉酶。
在实施方式中，糖源生成酶(例如，优选为葡糖淀粉酶)可以以0.0001～20AGU/g DS的量加入，优选为0.001～10AGU/g DS，特别是0.01～5AGU/g DS，例如0.1～2AGU/g DS。
市售可得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRA L、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA和AMGTME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300、GC480、GC417(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
产麦芽糖淀粉酶
在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的糖源生成酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(普鲁兰多糖1,4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶可从Novozymes A/S购买得到。产麦芽糖α-淀粉酶记载在US专利第4,598,048、4,604,355和6,162,628号中，其并入本文以作参考。
在优选实施方式中，产麦芽糖淀粉酶可以以0.05～5mg总蛋白/克DS或0.05～5MANU/g DS的量添加。
包含细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶和糖源生成酶的组合物
可以在本发明的方法中，在液化步骤i)过程中加入本发明的组合物。本发明的组合物包含细菌α-淀粉酶、生淀粉水解α-淀粉酶和糖源生成酶。组合物还可以包含蛋白酶和/或普鲁兰酶和其它酶。
因此，在这个方面，本发明涉及组合物，其包含
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃和pH5.3下具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属的淀粉。合适的细菌α-淀粉酶记载在以上“细菌α-淀粉酶”部分中。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶与WO99/019467中公开的SEQ IDNO:3或本文SEQ ID NO:1的多肽成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同一性。
在优选实施方式中，细菌α-淀粉酶得自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，特别是包含与位置181和182的缺失对应的双缺失并还包含N193F取代的变体(也标记为I181*+G182*+N193F)。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是WO2011/082425中公开的或在以下具体公开的变体。
优选的细菌α-淀粉酶得自本文SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短成具有约491个氨基酸且具有选自以下的突变：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+H208Y+K220P
+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F；和
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
在实施方式中，细菌α-淀粉酶变体与WO99/019467中公开的SEQID NO:3或本文SEQ ID NO:1的多肽成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％以及甚至最优选至少95％例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
合适的生淀粉水解酶记载在以上“生淀粉水解α-淀粉酶”部分中。
在实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源。在优选实施方式中，生淀粉水解α-淀粉酶是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头与SBD并具有一个或多个以下取代的微小根毛霉α-淀粉酶的变体：G128D、D143N、K192R，例如特别是G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ ID NO:14进行编号)。
合适的糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶，记载在以上“糖源生成酶”部分中。
在实施方式中，糖源生成酶是在70℃和pH5.3具有至少70％例如至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的葡糖淀粉酶，是葡糖淀粉酶。在优选实施方式中，葡糖淀粉酶来自青霉属，特别是在公开为WO2011/127802(其并入本文以作参考)的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2并且示为本文SEQ ID NO:9的草酸青霉菌株，或在共同待决US申请第61/531,189号或US申请第61/566,046号或PCT/US12/053779(Novozymes)中公开的草酸青霉葡糖淀粉酶的具有K79V取代的蛋白酶稳定蛋白工程化变体(使用本文SEQ ID NO:15进行编号)。
在另一实施方式中，糖源生成酶是示于SEQ ID NO:9中的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:9具有至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的葡糖淀粉酶。
在实施方式中，组合物还包含蛋白酶。蛋白酶可以是真菌或细菌来源。合适的蛋白酶记载在以上“蛋白酶”部分中。
在实施方式中，蛋白酶是金属蛋白酶。在实施方式中，蛋白酶得自嗜热子囊菌属，优选黄嗜热子囊菌的菌株，特别是在本文SEQ IDNO:3中或WO2010/008841中SEQ ID NO:1的氨基酸1～177(成熟多肽)中公开的黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)。
在实施方式中，蛋白酶得自火球菌属的菌株，优选激烈火球菌的菌株，例如示为US6,258,726中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:16的那种。
在实施方式中，蛋白酶是与US专利第6,258,726号中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:16具有至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的那种。
在实施方式中，本发明的组合物包含：
-得自嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶；
-得自微小根毛霉的生淀粉水解α-淀粉酶；
-得自草酸青霉菌的在70℃和pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。
在实施方式中，组合物还包含得自黄嗜热子囊菌或激烈火球菌的蛋白酶。
在实施方式中，组合物还包含普鲁兰酶。合适的普鲁兰酶记载在以上“普鲁兰酶”部分中。
在实施方式中，普鲁兰酶得自热球菌属，例如示于SEQ ID NO:11中并在X47结构域后截短的Thermococcus hydrothermalis菌株普鲁兰酶(即，SEQ ID NO:11中的氨基酸1～782)。
材料&方法
材料：
参照α-淀粉酶A：具有突变I181*+G182*+N193F并截短至491个氨基酸(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。α-淀粉酶(BAA1407)：具有突变V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+H208Y+K220P+N224L+Q254S并截短至491个氨基酸(使用本文SEQ ID NO:1进行编号)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
α-淀粉酶(RSH AA96)：在WO2006/069290(Novozymes A/S)的表5中公开为V039或公开为本文SEQ ID NO:14的由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶构成的杂合α-淀粉酶，且具有以下取代：G128D+D143N。
α-淀粉酶(RSH AA101)：在WO2006/069290(Novozymes A/S)的表5中公开为V039或公开为本文SEQ ID NO:14的由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶构成的杂合α-淀粉酶，且具有以下取代：G128D+D143N+K192R。
葡糖淀粉酶(AMG001)：如共同待决US申请第61/531,189号所公开，在公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2且示为本文SEQ ID NO:9和15的具有K79V取代(使用本文SEQ IDNO:15进行编号)的草酸青霉葡糖淀粉酶成熟部分。
葡糖淀粉酶(AMG SPU)：WO99/28448中公开的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶，具有来自WO06/069289中公开的瓣环栓菌的约20％的葡糖淀粉酶活性，以及来自WO2006/069290(Novozymes A/S)的表5中公开为V039或公开为本文SEQ ID NO:14的由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头及SBD的微小根毛霉α-淀粉酶构成的杂合α-淀粉酶的副活性(sideactivity)。
玉米：在2010年11月从Corn LP得到实施例5中使用的磨碎玉米和逆流物(backset)。磨碎玉米和逆流物的干固形物(％DS)含量通过在105℃烘箱干燥3小时而分别测定为86.78％和7.93％。
酵母：RED STAR ETHANOL REDTM，可从Red Star/Lesaffre,USA得到。
方法
同一性：两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”进行描述。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性以及两个核苷酸序列之间的同一性可以通过“比对”程序而确定，其是Needleman-Wunsch比对(即，全局比对)。该程序用于多肽以及核苷酸序列的比对。缺省的打分矩阵BLOSUM50用于多肽比对，缺省的同一性矩阵用于核苷酸比对。第一个残基空缺的罚分，对于多肽为-12，对于核苷酸为-16。对其他残基空缺的罚分，对于多肽为-2，且对于核苷酸为-4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见Pearson and Lipman,1988,"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS85:2444-2448,and Pearson,1990,"Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA,"Methods in Enzymology183:63-98)。FASTA蛋白比对使用对空缺大小没有限制的Smith-Waterman算法(参见"Smith-Waterman algorithm",Smith and Waterman,1981,J.Mol.Biol.147:195-197)。
蛋白酶检定
AZCL-酪蛋白检定
将0.2％的蓝色底物AZCL-酪蛋白的溶液边搅拌边混悬在硼砂(Borax)/NaH2PO4缓冲液(pH9)中。在搅拌时将溶液分配到微滴定板(各个孔100微升)，加入30微升酶试样并将板在45℃和600rpm下在Eppendorf Thermomixer中孵育30分钟。将变性的酶试样(100℃煮沸20min)用作空白。在孵育后，通过将微滴定板转移到冰上来停止反应，通过在4℃以3000rpm离心5分钟而将有色溶液从固体中分离出。将60微升上清液转移到微滴定板并使用BioRad酶标仪在595nm测量吸光度。
pNA-检定
将50微升含有蛋白酶的样本加到微滴定板，通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9.0稀释至10mL)使检定起始。监测室温下OD405的升高，作为蛋白酶活性的量度。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)量度。
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃和pH4.3的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，其中底物为23.2mM麦芽糖，缓冲液为0.1M醋酸盐，反应时间为5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)加到葡萄糖脱氢酶试剂中，从而使存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述所述反应中特异性地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，其使用光度计在340nm进行确定，以作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 醋酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5～4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更加具体描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可以应要求从Novozymes A/S,Denmark得到，该文件夹并入本文以作参考。
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可以使用马铃薯淀粉作为底物而进行确定。该方法基于酶对改性马铃薯淀粉的分解，通过将淀粉/酶溶液的样本与碘液混合来跟踪反应。起初，形成蓝黑色，但是在淀粉的分解过程中，蓝色变弱，并逐渐变成红棕色，其与有色玻璃标准物进行比较。
一个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH5.6)使5260mg淀粉干底物MerckAmylum solubile糊精化的酶量。
更加详细地描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可以应要求从Novozymes A/S,Denmark得到，该文件夹并入本文以作参考。
KNU(S)α-淀粉酶活性
KNU(S)用来确定嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的活性并记载于WO99/19467的35～41页(并入本文以作参考)。
确定普鲁兰酶活性(NPUN)
以NPUN表示的内切-普鲁兰酶活性相对于Novozymes普鲁兰酶标准物而测量。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红普鲁兰多糖(Megazyme)，pH5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。活性使用红普鲁兰多糖以NPUN/ml进行测定。
将1mL稀释样本或标准物在40℃孵育2分钟。加入0.5mL2％红普鲁兰多糖、0.5M KCl、50mM柠檬酸pH5并混合。将试管在40℃孵育20分钟，并通过添加2.5mL80％乙醇来停止反应。将试管在室温下静置10～60分钟，之后在4000rpm离心10分钟。之后在510nm测量上清液的OD，并使用标准曲线来计算活性。
本发明在下述实施例中以更多细节描述，提供所述实施例以说明本发明，但不意欲以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。所有本文中引用的参考文献就其中描述的部分具体地通过提述并入本文。
生淀粉降解酶(Ra/Ga)检定
获得生淀粉降解酶指数(Ra/Ga)值的操作指南如下所示：
1)检定在40℃的温度下进行。
2)首先，基于生淀粉得到酶的pH图谱(profile)。从活性百分比vs.pH的作图得到图谱。最适pH值用于检定中。
3)可以使用任何类型的淀粉，例如小麦、玉米、大麦、稻等。在实施例中，所使用的生淀粉是玉米淀粉。使用生淀粉的2％溶液。或者，为获得糊化淀粉溶液，将生淀粉的溶液在糊化温度以上加热至少60分钟。在玉米的情况下，生淀粉的溶液加热至70℃，持续至少60分钟。
4)反应溶液包含糊化淀粉(或生淀粉)和缓冲液。用在检定中的缓冲液的组成基于酶的pH最适值而不同。缓冲液组成和浓度对于生淀粉活性测量和糊化淀粉活性测量必须相同。
5)用于检定中的酶浓度对于生淀粉活性测量和糊化淀粉活性测量必须相同。
6)酶活性通过确定溶液中的还原糖而测量。适当的方法如下所示：使用二硝基水杨酸来确定还原糖的Bernfield的方法记载在Bernfield,1955,Methods Enzymology1：149-158中，且使用联喹啉二羧酸二铜(copper-bicinchoninate)确定还原糖的方法记载于Fox等人,1991,Analytical Biochemistry195:93-96或Waffenschmidt等人,1987,Anal.Biochem.165:337-340。在确定还原糖之前，将溶液煮沸3分钟并离心使酶失活。
7)测量酶活性的孵育时间为6小时。
8)酶活性表达为每小时每mg纯活性酶所产生的还原糖数。
9)对糊化淀粉的活性通过测量在2％糊化(例如，玉米)淀粉反应混合物中经酶产生的葡萄糖释放而测定，且对生淀粉的活性通过测量在2％生(例如，玉米)淀粉反应混合物中经酶产生的葡萄糖释放而测定。活性通过在每小时每mg纯活性酶4mol下产生的还原糖释放而测定。
实施例
实施例1
α-淀粉酶变体的稳定性
通过将参照α-淀粉酶和变体在pH4.5和5.5以及75℃和85℃的温度下用0.12mM CaCl2孵育，之后使用底物(淀粉酶检定试剂盒，E33651,Molecular Probes)进行剩余活性确定，来确定参照α-淀粉酶(嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，具有突变I181*+G182*+N193F，截短成491个氨基酸(使用本文中SEQ ID NO:1进行编号))和其α-淀粉酶变体的稳定性。
纯化的酶样本在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2，pH5.0)中稀释成0.5和1或者5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将20微升酶样本转移到48孔PCR MTP中，并向各个孔加入180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐、150mM MES、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2、pH4.5或5.5)并混合。检定使用两个浓度的酶进行，一式两次。在75℃或85℃孵育前，移取20微升并储存在冰上作为对照样本。在PCR仪中在75℃和85℃进行孵育。在孵育后，将样本在剩余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl2、pH5.5)中稀释成15ng/mL，并将25微升稀释的酶转移到黑色384-MTP。通过向各个孔添加25微升底物溶液(100微克/ml)，使用EnzChek底物来确定剩余活性。使用激发滤光片在485-P nm并使用发射滤光片在555nm(荧光酶标仪为Polarstar,BMG)每分钟确定荧光度，持续15分钟。对于每个设定，将剩余活性针对对照样品归一化。
假定对数衰减，使用等式T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)来计算半衰期(T1/2(min))，其中T是以分钟计的检定孵育时间，且％RA是检定中确定的剩余活性％。
使用该检定设定，对于参照α-淀粉酶及其变体确定半衰期，示于表1。
表1
ND：未确定
结果表明，α-淀粉酶变体比参照α-淀粉酶具有显著更高的半衰期和稳定性。
实施例2
蛋白酶变体的制备和热稳定性的测试
所使用的化学品是至少试剂级别的市售产品。
菌株和质粒：
将大肠杆菌(E.coli)DH12S(可得自Gibco BRL)用于酵母质粒拯救。pJTP000是在TPI启动子控制下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，由WO01/92502中记载的pJC039构建而来，其中已经插入黄嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO03/048353)。
酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his4-539用于蛋白酶变体表达。其记载在J.Biol.Chem.272(15):9720-9727(1997)中。
培养基和底物
10X基础溶液：不含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/L，琥珀酸盐100g/l，NaOH60g/l。
SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100mL)100mL/L，5％苏氨酸4mL/L，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径为0.20微米的过滤器对溶液进行无菌处理。将琼脂(2％)和H2O(约761mL)一起高压灭菌并分别除菌。将SC-葡萄糖溶液加到琼脂溶液中。
YPD：Bacto蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/L，20％葡萄糖100mL/L。
YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。
PEG/LiAc溶液：40％PEG400050ml，5M醋酸锂1mL。
96孔玉米蛋白微滴定板：
各个孔包含200微升的0.05～0.1％玉米蛋白(Sigma)、0.25mMZnSO4和1％琼脂于20mM醋酸钠缓冲液中，pH4.5。
DNA操纵
除非另外指出，使用在Sambrook等人.(1989)Molecular cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等人.(编辑)"Current protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995；Harwood,C.R.and Cutting,S.M.(编辑)中记载的分子生物学的标准方法进行DNA操纵和转化。
酵母转化
使用醋酸锂法进行酵母转化。将0.5微升载体(通过限制性内切酶消化)和1微升PCR片段进行混合。将该DNA混合物、100微升YNG318感受态细胞和10微升YEAST MAKER载体DNA(Clontech)加入12mL聚丙烯管(Falcon2059)中。加入0.6mL PEG/LiAc溶液并温和混合。在30℃和200rpm孵育30分钟，之后42℃下30分钟(热击)。转移到eppendorf管，并离心5秒。除去上清液并溶解在3mL YPD中。将细胞混悬液在200rpm和30℃孵育45分钟。将混悬液倒入SC-葡萄糖板中并在30℃孵育3天以长成菌落。酵母总DNA通过Zymoprep酵母质粒微量制备试剂盒(ZYMO research)进行提取。
DNA测序
通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行大肠杆菌转化，以进行DNA测序。通过碱法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA Engine进行PCR。使用ABI PRISMTM310遗传分析仪来确定所有DNA序列。
构建蛋白酶表达载体
将嗜热子囊菌M35蛋白酶基因用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)进行扩增。将所得的PCR片段与经限制性酶消化以除去特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶基因的pJC039载体(记载在WO2001/92502中)一起导入到酿酒酵母YNG318中。
回收SC-葡萄糖板上酵母克隆中的质粒，以确认内部序列，并命名为pJTP001。
构建酵母文库和定点(site-directed)变体
酵母文库和定点变体通过SOE PCR法(通过重叠延伸的剪接，参见“PCR:A practical approach”,p.207-209,Oxford University press,eds.McPherson,Quirke,Taylor)，之后进行酵母的体内重组而进行构建。
用于扩增和测序的通用引物
通过SOE法，引物AM34(SEQ ID NO:6)和AM35(SEQ ID NO:7)连同简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)用于制备含有任何突变片段的DNA片段，或仅仅是扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。
通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化物混合。将混合的溶液导入到酿酒酵母中以构建文库或通过体内重组构建定位变体。
相对活性检定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至含有YPD+Zn培养基的96孔微滴定板的孔中，并在28℃培养3天。将培养上清液施于96孔玉米蛋白微滴定板并在至少两个温度(例如，70℃和80℃)下孵育多于4个小时或过夜。板中玉米蛋白的浊度测定为A630，并将相对活性(较高/较低温度)确定为热活性改善的指标。选择比亲本变体具有更高相对活性的克隆并确定序列。
剩余活性检定
将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种至96孔微滴定板的孔中并在28℃培养3天。将培养上清液在特定温度(80℃或84℃，以4℃作为参照)在20mM醋酸钠缓冲液pH4.5中孵育10分钟后，使用偶氮酪蛋白(Megazyme)在65℃测量蛋白酶活性，以确定剩余活性。选择比亲本变体具有更高剩余活性的克隆并确定序列。
偶氮酪蛋白检定
将20微升的样本与150微升的底物溶液(4mL于乙醇中的12.5％偶氮酪蛋白，于96mL的20mM醋酸钠pH4.5中，含有0.01％triton-100和0.25mM ZnSO4)混合，并孵育4小时或更长时间。
在添加20微升/孔的100％三氯醋酸(TCA)溶液后，离心平板，并移取100微升的上清以测量A440。
米曲霉中蛋白酶变体的表达
将含有蛋白酶变体基因的构建体用于构建曲霉表达载体。曲霉表达载体由基于与构巢曲霉磷酸丙糖异构酶非翻译前导序列(Pna2/tpi)融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子以及黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)的表达盒构成。同时存在于质粒中的是来自构巢曲霉的曲霉选择性标记物amdS，其使得能够以乙酰胺作为唯一氮源进行生长。将用于蛋白酶变体的表达质粒转化到曲霉中，如Lassen等人,2001,Appl.Environ.Microbiol.67:4701-4707中所记载。对于各个构建体，分离10～20个菌株，纯化，并在摇瓶中培养。
所表达变体的纯化
将0.22μm过滤的发酵样本的pH调整到4.0。
将样本放置在具有磁力搅拌的冰浴上。添加小量等分试样的(NH4)2SO4(对应于约2.0～2.2M(NH4)2SO4，不考虑添加化合物时的体积增加)。
在最终添加(NH4)2SO4后，伴随着温和的磁力搅拌，将样本在冰浴上孵育最少45分钟。
离心：装配有R20A2转子头的Hitachi himac CR20G高速冷冻离心机，5℃，20,000rpm，30min。
将所形成的沉淀物溶解于200mL50mM醋酸钠pH4.0。
使用0.22微米PES PLUS膜(IWAKI)，通过真空抽吸来过滤样本。
使用在冷室中过夜超滤(来自Vivascience的Vivacell250，装配有5kDa MWCO PES膜)，将样本脱盐/缓冲液交换至50mM醋酸钠pH4.0。使用50mM醋酸钠pH4.0将存留的样本稀释到200ml。样本的电导率优选小于5mS/cm。
将样本装载到用50mM醋酸钠pH4.0平衡的阳离子交换柱。使用3个柱体积的结合缓冲液(50mM醋酸钠pH4.0)将未结合样本从柱中洗出，并使用线性梯度0～100％洗脱缓冲液(50mM醋酸钠+1MNaCl pH4.0)以10个柱体积对样本洗脱。
将收集的级分通过内切蛋白酶检定进行检定(参见下文)，之后对选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切蛋白酶检定和SDS-PAGE来汇集级分。
内切蛋白酶检定
将Protazyme OL片/5ml的250mM醋酸钠pH5.0通过磁力搅拌进行溶解(底物：Megazyme的内切蛋白酶Protazyme AK片–cat.#PRAK11/08)。
在搅拌下，将250微升的底物溶液转移到1.5mL Eppendorf管中。
将25微升的样本加到各个管中(空白是样本缓冲液)。
将管在Thermomixer上在50℃振荡(1000rpm)温育15分钟。
将250微升1M NaOH加到各个管，接着进行涡旋。
在16,100x G于25℃离心3分钟。
将200微升上清液转移到MTP，并记录590nm处的吸光度。
实施例3
使用纯化酶得到的所选择蛋白酶变体的温度概况
将示出良好热稳定性的所选择蛋白酶变体进行纯化，并将纯化酶用在以下所述的玉米蛋白-BCA检定中。在示出的升高温度下孵育酶60分钟之后，在60℃确定剩余蛋白酶活性。
玉米蛋白-BCA检定
进行玉米蛋白-BCA检定以检测在不同温度经由变体蛋白酶从玉米蛋白释出的可溶蛋白定量。
操作指南：
将10微升的10微克/mL酶溶液和100微升0.025％玉米蛋白溶液混合在微滴定板(MTP)中。
在不同温度下孵育60分钟。
添加10微升的100％三氯醋酸(TCA)溶液。
将MTP在3500rpm下离心5分钟。
取出15微升到含有100微升BCA检定溶液(Pierce Cat#：23225，BCA蛋白检定试剂盒)的新MTP中。
在60℃孵育30分钟。
测量A562。
结果示于表5中。与野生型(WT)蛋白酶相比，所有的测试蛋白酶变体均示出改善的热稳定性。
表5 玉米蛋白-BCA检定
实施例4
草酸青霉葡糖淀粉酶的表征
草酸青霉葡糖淀粉酶公开在本文的SEQ ID NO:9中。
底物.底物：1％可溶淀粉(Sigma S-9765)于去离子水中
反应缓冲液：0.1M醋酸盐缓冲液，pH5.3
葡萄糖浓度测定试剂盒：Wako葡萄糖检定试剂盒(LabAssayglucose,WAKO,Cat#298-65701)。
反应条件.将20微升可溶淀粉和50微升醋酸盐缓冲液pH5.3混合。将30微升酶溶液(50微克酶蛋白/ml)加到100微升的终体积，之后在37℃孵育15分钟。
通过Wako试剂盒测定葡萄糖浓度。
所有工作平行进行。
最适温度.为评估草酸青霉葡糖淀粉酶的最适温度，在20、30、40、50、60、70、80、85、90和95℃进行以上记载的“反应条件”检定。结果示于表6。
表6 最适温度
温度(℃) 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95
相对活性(％) 63.6 71.7 86.4 99.4 94.6 100.0 92.9 92.5 82.7 82.8
从结果可以看出，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件的最适温度为50℃～70℃，且葡糖淀粉酶在95℃保持超过80％的活性。
热稳定性.为评估草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件检定修改为，酶溶液和醋酸盐缓冲液在20、30、40、50、60、70、75、80、85、90和95℃预孵育15分钟。在孵育之后，将20微升淀粉加到溶液中，并如上所述进行检定。
结果示于表7。
表7 热稳定性
温度(℃) 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95
相对活性(％) 91.0 92.9 88.1 100.0 96.9 86.0 34.8 36.0 34.2 34.8
从结果可以看出，在预孵育15分钟后，草酸青霉葡糖淀粉酶直到70℃都是稳定的，其保持超过80％的活性。
最适pH.为评价草酸青霉葡糖淀粉酶的最适pH，将上述的反应条件检定在pH2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0下进行。使用以下缓冲液来替代反应条件检定中所述的醋酸盐缓冲液：100mM琥珀酸，HEPES，CHES，CAPSO，1mM CaCl2，150mMKCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH将pH调整成2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0或11.0。
结果示于表8中。
表8.最适pH
从结果可以看出，草酸青霉葡糖淀粉酶在给定条件下在pH5.0具有最高活性。草酸青霉葡糖淀粉酶在较广pH范围内有活性，其从pH2到7保持超过50％的活性。
pH稳定性.为评价草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，将反应条件检定修改为，使用在最适pH部分描述的缓冲液，将酶溶液(50微克/mL)在pH为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中预孵育20小时。在预孵育之后，将20微升可溶淀粉加到溶液中至终体积为100微升，并如上所述进行检定。
结果示于表9。
表9pH稳定性
从结果可以看出，在预孵育20小时后，草酸青霉葡糖淀粉酶从pH3到pH7是稳定的，并且其在pH8降低活性。
实施例5
在75℃和pH4.80下液化的改善的乙醇产生方法
将磨碎的玉米和逆流物用于该研究。磨碎玉米和逆流物的干固形物(％DS)含量通过在105℃烘箱干燥3小时而分别测定为86.78％和7.93％。
醪制备.制备9个不同的玉米浆料用于液化。向5x200g的lab-o-mat小罐(Mathis,Inc.)中加入35.29g磨碎玉米、37.71g自来水和30.00g逆流物。对于所有浆料，逆流物比率设定为30％。在添加这些成分后，如果需要的话，使用40％H2SO4将浆料的pH调整到4.80。使用去离子水制备所有浓缩酶的储液。将所有酶的等份物加到各个lab-o-mat小罐中，以达到表10所示的终浓度。最后，将去离子水加到浆料中，以确保对于所有浆料的起始DS％是相同的。
表10
然后关闭所有小罐。将它们放置到lab-o-mat中，并使用以下程序进行液化(表11)：
表11.
液化: 升温 5deg/min rpm＝30
Lab-o-mat 升温时间 17min
液化温度 75℃
液化时间 113min
在表11所述程序的最后，将所有的小罐从lab-o-mat中移出，并立即在冰浴中冷却。
发酵设定.在完全冷却后，向所有的醪加入尿素和青霉素，以分别达到750和3ppm的终浓度。使用40％H2SO4或50％NaOH将醪调整到pH5.0。测量醪的最终干固形物％并记录为32.44％。
将约5g的各个醪转移到预先称重的15mL塑料Falcon离心管中，以用于发酵。向各个管的盖子钻小孔，以允许发酵过程中的CO2释放。对于各个处理制备五个重复发酵。在醪转移之后，对所有管进行再次称量，以获得初始样本重量。之后，向各个管中加入100微升再水化的Red Star Ethanol Red酵母(通过称量5.5g干酵母到150mL锥形瓶中，加入100mL自来水并在32℃水浴搅拌30分钟，从而再水化)，稀释的AMG SPU葡糖淀粉酶(稀释在去离子水中)的等份物需要达到0.50AGU/g DS的起始浓度。最后将合适量的去离子水加到各个管中，从而加到各个管的液体总体积相对于样本重量是相同的。之后，重新称量所有的管，之后将其放置到设定于32℃的预热水浴中。发酵总共进行54小时。在约7小时后，将管剧烈涡旋，之后在剩余的发酵时间内每天重新称量两次。根据以下等式，从重量损失数据中计算各个管中每克干固形物产生的乙醇克数：
在发酵54小时后，取出三个重复管，以用于HPLC分析。将取出的样本用50微升40％H2SO4处理以停止发酵，并充分涡旋。之后将样本在1570x g离心10分钟，之后经0.45微米注射式过滤器过滤到HPLC小瓶中。最后对样本进行HPLC分析，以对DP4+、DP3、DP2、葡萄糖、果糖、乳酸和醋酸、丙三醇和乙醇的量进行定量。
结果
图1示出在54小时发酵后对于各处理获得的平均HPLC结果。当向液化在BAA1407α淀粉酶的顶部加入RSH AA96、RSH AA101和AMG001葡糖淀粉酶时，测量到乙醇产生中的显著增加。
本发明在以下段落中描述：
段1.一种用于由含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括以下步骤：
i)使用
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶，
在60～80℃的温度下使含淀粉材料液化；
ii)使用糖源生成酶进行糖化；
iii)使用发酵生物体进行发酵。
段2.根据段1的方法，在液化步骤i)之前还包括以下步骤：
a)降低含淀粉材料的粒度，优选通过干磨；
b)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
段3.根据段1或2的方法，其中至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、特别是至少90％的含淀粉材料可通过具有#6筛网的筛。
段4.根据段1～3中任一段的方法，其中液化步骤i)过程中的pH为4～6，优选为4.5～5.0或4.5～4.8或5.0～6.0。
段5.根据段1～4中任一段的方法，其中液化过程中的温度为70～80℃，例如75～80℃，优选为约75℃。
段6.根据段1～5中任一段的方法，其中液化进行0.1～10小时，例如1～3小时，例如约1.5小时。
段7.根据段6的方法，其中喷煮步骤在步骤i)的液化之后进行，例如其中喷煮在110～145℃，优选120～140℃，例如125～135℃，优选约130℃的温度下进行约1～15分钟，优选约3～10分钟，特别是约5分钟。
段8.根据段1～7中任一段的方法，其中糖化和发酵相继或同时进行。
段9.根据段1～8中任一段的方法，其中糖化在20～75℃、优选40～70℃例如约60℃的温度下于4～5的pH例如约pH4.5进行。
段10.根据段1～9中任一段的方法，其中发酵或同步糖化发酵(SSF)在25～40℃，例如28～35℃，例如30～34℃，优选约32℃的温度下进行，其中发酵进行6～120小时，特别是24～96小时。
段11.根据段1～10中任一段的方法，其中发酵产物是醇，优选为乙醇，特别是燃料乙醇、可饮用乙醇和/或工业乙醇。
段12.根据段1～11中任一段的方法，其中发酵产物在发酵之后例如通过蒸馏而回收。
段13.根据段1～12中任一段的方法，其中含淀粉原料是全谷粒。
段14.根据段1～13中任一段的方法，其中含淀粉材料得自玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)、西米、木薯、树薯粉、木薯粉、高粱、稻或马铃薯。
段15.根据段1～14中任一段的方法，其中发酵生物体是酵母，优选为酵母属的菌株。
段16.根据段1～15中任一段的方法，其中发酵生物体是酿酒酵母菌株。
段17.根据段1～16中任一段的方法，其中细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属(也称为地芽孢杆菌属)的菌株。
段18.根据段17的方法，其中细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属或地芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌的变体，例如WO99/019467中SEQ IDNO:3或本文中SEQ ID NO:1示出的那种，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是截短的，优选具有491个氨基酸。
段19.根据段1～18中任一段的方法，其中细菌α-淀粉酶与WO99/019467中公开的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1的多肽成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同一性。
段20.根据段17～19中任一段的方法，其中细菌α-淀粉酶在pH4.5、75℃和0.12mM CaCl2下具有至少20、例如至少25、例如至少30、例如至少40、例如至少50、例如至少60、例如至少70、例如至少80、例如至少90、例如至少100、例如至少110、例如至少120、例如至少130、例如至少140、例如至少150、例如至少160、例如至少170、例如至少180、例如20～300、例如50～300、例如60～300、例如70～300、例如80～300、例如90～300、例如100～300、例如120～300、例如140～300、例如160～300、例如180～300的T1/2(min)。
段21.根据段17～20中任一段的方法，其中细菌α-淀粉酶得自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短成具有491个氨基酸且具有选自以下的突变：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F；和
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
段22.根据段17～21中任一段的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶是具有以下突变的变体：I181*+G182*，优选为I181*+G182*+N193F，其中使用WO99/019467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1进行编号。
段23.根据段1的方法，其中细菌α-淀粉酶是在Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry277(29):26501-26507中公开的嵌合α-淀粉酶，优选是称为BD5088或示为WO2007/134207中SEQID NO:2的氨基酸1～435的那种。
段24.根据段1～23的方法，其中生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源，优选为具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头与SBD和另外一个或多个以下突变的微小根毛霉α-淀粉酶的变体：G128D、D143N、K192R，如G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ IDNO:14进行编号)。
段25.根据段1～24中任一段的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或加入的糖源生成酶是葡糖淀粉酶。
段26.根据段25的方法，其中糖源生成酶是在70℃、pH5.3下具有至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
段27.根据段25或26的方法，其中糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％的相对活性的葡糖淀粉酶。
段28.根据段25～27中任一段的方法，其中糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的pH稳定性的葡糖淀粉酶。
段29.根据段25～28中任一段的方法，其中糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选得自青霉属的菌株，特别是在公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:9和15的草酸青霉菌株，或其具有K79V取代的变体(使用本文中的SEQ IDNO:15进行编号)。
段30.根据段25～29中任一段的方法，其中葡糖淀粉酶与公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中示为SEQ ID NO:2或示为本文SEQ ID NO:9中的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
段31.根据段1～30中任一段的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入葡糖淀粉酶。
段32.根据段1～31中任一段的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶为真菌来源，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属菌株，优选埃默森篮状菌，或密孔菌属菌株，或粘褶菌属菌株。
段33.根据段1～32中任一段的方法，其中在液化过程中还存在或加入蛋白酶。
段34.根据段33的方法，其中蛋白酶为真菌或细菌来源。
段35.根据段33或34的方法，其中蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定的高于20％的热稳定性值。
段36.根据段33～35中任一段的方法，其中蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定的高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％的热稳定性值。
段37.根据段33～36中任一段的方法，其中蛋白酶是金属蛋白酶。
段38.根据段33～37中任一段的方法，其中蛋白酶是得自嗜热子囊菌属菌株、优选为黄嗜热子囊菌菌株、特别是黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。
段39.根据段33～38中任一段的方法，其中蛋白酶是公开为WO2003/048353中公开的SEQ ID NO.2的成熟部分或WO2010/008841中SEQ ID NO:1的成熟部分或本文SEQ ID NO:3的金属蛋白酶的变体。
段40.根据段33～39中任一段的方法，其中蛋白酶变体与WO2003/048353中所公开SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO2010/008841中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但少于100％的同一性。
段41.根据段33～40中任一段的方法，其中蛋白酶得自火球菌属菌株。
段42.根据段33～41中任一段的方法，其中蛋白酶得自激烈火球菌菌株。
段43.根据段33～42中任一段的方法，其中蛋白酶是示于US专利第6,258,726号中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13中的那种。
段44.根据段33～43中任一段的方法，其中蛋白酶是与US专利第6,258,726号中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13具有至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的那种。
段45.根据段1～44中任一段的方法，其中在液化和/或糖化过程中还存在普鲁兰酶。
段46.一种组合物，包含
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。
段47.根据段46的组合物，其中α-淀粉酶得自芽孢杆菌属的菌株，例如嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO99/019467中SEQ ID NO:3示出或本文中SEQ ID NO:1示出的那种。
段48.根据段46或47的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶是具有以下突变的变体：I181*+G182*，优选为I181*+G182*+N193F，其中使用WO99/019467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1进行编号。
段49.根据段46～48中任一段的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶截短成具有约491个氨基酸。
段50.根据段46～49中任一段的组合物，其中细菌α-淀粉酶与WO99/019467中公开的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1的多肽成熟部分具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同一性。
段51.根据段46～50中任一段的组合物，其中α-淀粉酶在pH4.5、75℃和0.12mM CaCl2下具有至少20、例如至少25、例如至少30、例如至少40、例如至少50、例如至少60、例如至少70、例如至少80、例如至少90、例如至少100、例如至少110、例如至少120、例如至少130、例如至少140、例如至少150、例如至少160、例如至少170、例如至少180、例如20～300、例如50～300、例如60～300、例如70～300、例如80～300、例如90～300、例如100～300、例如120～300、例如140～300、例如160～300、例如180～300的T1/2(min)。
段52.根据段46～51中任一段的组合物，其中细菌α-淀粉酶得自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短成具有约491个氨基酸且具有选自以下的突变：
-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F；和
-E129V+K177L+R179E+I181*+G182*+N193F+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
段53.根据段46～52中任一段的组合物，其中生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源，优选为具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头与SBD和另外一个或多个以下突变的微小根毛霉α-淀粉酶的变体：G128D、D143N、K192R，如G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ IDNO:14进行编号)。
段54.根据段46～53中任一段的组合物，其中糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选为在70℃、pH5.3下具有至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
段55.根据段46～54中任一段的组合物，其中糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％的相对活性的葡糖淀粉酶。
段56.根据段46～55中任一段的组合物，其中糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的pH稳定性的葡糖淀粉酶。
段57.根据段46～56中任一段的组合物，其中糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选得自青霉属的菌株，特别是在公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:9和15的草酸青霉菌株，或其具有K79V取代的变体(使用本文中的SEQ IDNO:15进行编号)。
段58.根据段46～57中任一段的组合物，其中葡糖淀粉酶与公开为WO2011/127802的PCT/CN10/071753中示为SEQ ID NO:2或示为本文SEQ ID NO:9中的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
段59.根据段46～58中任一段的组合物，其还包含蛋白酶。
段60.根据段46～59中任一段的组合物，其还包含金属蛋白酶。
段61.根据段46～60中任一段的组合物，其中蛋白酶具有作为80℃/70℃的相对活性确定的高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％的热稳定性。
段62.根据段46～61中任一段的组合物，其中蛋白酶具有作为85℃/70℃的相对活性确定的高于12％、高于14％、高于16％、高于18％、高于20％的热稳定性。
段63.根据段46～62中任一段的组合物，其中蛋白酶是得自本文SEQ ID NO:3中所示的黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶的变体。
段64.根据段46～63中任一段的组合物，其中蛋白酶得自火球菌属菌株。
段65.根据段46～64中任一段的组合物，其中蛋白酶得自激烈火球菌菌株。
段66.根据段46～65中任一段的方法，其中蛋白酶是US6,258,726中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13所示的那种。
段67.根据段46～66中任一段的方法，其中蛋白酶是与US6,258,726中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13具有至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的那种。
段68.根据段46～67中任一段的组合物，还包括普鲁兰酶。
段69.根据段46～68中任一段的组合物，包含：
-得自嗜热脂肪芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶；
-得自微小根毛霉的生淀粉水解α-淀粉酶；
-得自草酸青霉菌的在70℃和pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。

Claims (20)

1.一种用于产生发酵产物的方法，包括以下步骤：
a)使用
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶，
在60～80℃的温度下使含淀粉材料液化；
b)使用糖源生成酶进行糖化；
c)使用发酵生物体进行发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵产物是醇，优选为乙醇，特别是燃料乙醇、可饮用乙醇和/或工业乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌α-淀粉酶得自芽孢杆菌属(Bacillus)(也称为地芽孢杆菌属(Geobacillus))的菌株。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源，优选为具有黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶接头与SBD和另外一个或多个以下突变的微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)α-淀粉酶的变体：G128D、D143N、K192R，如G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ ID NO:14进行编号)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶是在70℃、pH5.3下具有至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％的相对活性的葡糖淀粉酶。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的pH稳定性的葡糖淀粉酶。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选得自青霉属(Penicillium)的菌株，特别是公开为本文SEQ ID NO:9和15的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，或其具有K79V取代的变体(使用本文中的SEQ ID NO:15进行编号)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶与本文SEQ IDNO:9所示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，另外其中在液化过程中存在或加入蛋白酶。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，另外其中在液化和/或糖化过程中存在普鲁兰酶。
12.一种组合物，包含：
-细菌α-淀粉酶；
-生淀粉水解α-淀粉酶；
-在70℃、pH5.3具有至少70％热稳定性的糖源生成酶。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述α-淀粉酶得自芽孢杆菌属的菌株，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如本文中SEQ ID NO:1示出的那种。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述生淀粉水解α-淀粉酶是真菌来源，优选为具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头与SBD和另外一个或多个以下突变的微小根毛霉α-淀粉酶的变体：G128D、D143N、K192R，如G128D+D143N或G128D+D143N+K192R(使用本文中的SEQ ID NO:14进行编号)。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的组合物，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选为在70℃、pH5.3下具有至少75％、优选至少80％、优选至少85％的热稳定性的葡糖淀粉酶。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的组合物，其中所述糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％的相对活性的葡糖淀粉酶。
17.根据权利要求12～16中任一项所述的组合物，其中所述糖生成酶是在pH4.5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％的pH稳定性的葡糖淀粉酶。
18.根据权利要求12～17中任一项所述的组合物，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选得自青霉属的菌株，特别是公开为本文SEQ IDNO:9和15的草酸青霉菌株，或其具有K79V取代的变体(使用本文中的SEQ ID NO:15进行编号)。
19.根据权利要求12～18中任一项所述的组合物，其中所述葡糖淀粉酶与本文SEQ ID NO:9所示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
20.根据权利要求12～19中任一项所述的组合物，还包含蛋白酶和/或普鲁兰酶。
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