CN103725624B - 一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，具体公开了一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母。该基因重组酿酒酵母是将α-淀粉酶基因（α-amylase）、糖化酶（glucoamylase）基因、酸性蛋白酶（acid？protease）基因通过酿酒酵母多基因共表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。本发明将上述三种酶基因同时转入酿酒酵母中实现分泌表达，从而使得本发明的重组酵母能够同时分泌α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶，因此能够高效地降解餐厨废弃物中的主要营养成分淀粉和蛋白质，使之成为重组酵母生长和发酵所需的碳源和氮源，实现了餐厨废弃物-乙醇的高效转化。

Description

一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母
技术领域
本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母。
背景技术
目前我国车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来车与人争粮的问题，直接推动粮食价格的不断上涨，并且会有引发食物短缺的危机。解决方式是尽量由非粮的可再生生物质为原料生产乙醇。餐厨废弃物是一种数量巨大的可再生生物质资源，在我国每年的餐厨废弃物产量在6000万吨以上，大部分被用来喂猪、填埋、焚烧，甚至制造“地沟油”，造成了严重的环境污染，少部分得以合理利用，比如制造堆肥和沼气等等，但经济效益低下。因此，用这些餐厨废弃物作为原料来生产燃料乙醇将会是一个颇具前景的发展方向，既可以变废为宝，又可以缓解粮食与能源危机。
餐厨废弃物是一种营养丰富的可再生生物质，富含淀粉、糖类、蛋白质、脂肪等有机物，其中有机物含量占干物质的95%以上。餐厨废弃物同时还含有维生素、氮、磷、硫、钾、钙、镁等微量元素，营养元素齐全，能够被生物再利用，具有再利用价值。由于餐厨废弃物含水量高、营养物质丰富，在常温条件下微生物会利用各类有机物和无机盐快速繁殖进行代谢，使餐厨废弃物腐烂发臭，污染环境，为处理带来麻烦。
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是工业上进行乙醇发酵的首选菌种，具有将葡萄糖高效转化为乙醇的能力，但其缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖的酶，以及缺乏降解蛋白质成为多肽和氨基酸的酶，在自然条件下不能直接利用餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质作为碳源和氮源来发酵产生乙醇。因此，若需将餐厨废弃物作为原料发酵生产乙醇，必须将能降解淀粉和蛋白质的酶基因导入酿酒酵母并实现分泌表达，以遗传工程手段弥补酿酒酵母降解利用餐厨废弃物的能力缺陷，使得基因重组酿酒酵母可以利用自身分泌的淀粉酶和蛋白酶将餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质降解成为可以利用的碳源——葡萄糖和氮源——多肽和氨基酸，从而可实现利用餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的工业化目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母。
本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母的构建方法。
一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母，该基因重组酿酒酵母是将α-淀粉酶（α-amylase,AMY）基因、糖化酶（glucoamylase,GA）基因、酸性蛋白酶（acidprotease,AP）基因通过酿酒酵母表达载体同时转入酿酒酵母并获得正确的分泌表达而构建成的。
本发明的重点在于将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因转入酿酒酵母中并使其分泌表达，所用的工具为酿酒酵母表达载体，作为一种优选方案，所述的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母多基因共表达载体；酿酒酵母多基因共表达载体可以实现将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因同时转入酿酒酵母中。作为一种优选方案，所述酿酒酵母多基因共表达载体为载体pScIKP（制备方法见专利ZL200810029630.6），当然也可以使用其他类型的酿酒酵母多基因共表达载体。
一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
S1.通过PCR扩增分别得到α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因序列；将糖化酶基因的1566位的核苷酸残基C人工突变成为T，酸性蛋白酶基因的1155位的核苷酸残基C人工突变成为T；
S2.将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因接入酿酒酵母表达载体中，构建重组多基因共表达载体；
S3.将上述构建得到的重组多基因共表达载体用限制性内切酶切割，使之线性化后转化到酿酒酵母中，构建基因重组酿酒酵母。
作为一种优选方案，S2构建重组多基因共表达载体包括如下步骤：
S11.用限制性内切酶分别切割酿酒酵母表达载体、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、酸性蛋白酶基因；
S12.将α-淀粉酶基因、糖化酶基因、酸性蛋白酶基因分别接入酿酒酵母表达载体，形成三个重组单基因载体；
S13.将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒、糖化酶基因表达盒和酸性蛋白酶基因表达盒使用限制性内切酶分别从三种重组单基因载体上切下，然后以串联表达盒amy-ga-ap的形式逐个接入同一酿酒酵母表达载体中。
作为一种优选方案，S3中所述的限制性内切酶为ApaI。
作为一种优选方案，S3中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。
作为一种优选方案，S11中用于切割α-淀粉酶基因、糖化酶基因、酸性蛋白酶基因的限制性内切酶均为BamHI和SpeI；S13中使用的限制性内切酶为同尾酶NheI和XbaI。
作为一种优选方案，所述的α-淀粉酶基因为米曲霉的α-淀粉酶基因；所述的糖化酶基因为黑曲霉的糖化酶基因；所述的酸性蛋白酶基因为黑曲霉的酸性蛋白酶基因。
作为一种最优选方案，所述的α-淀粉酶基因为米曲霉（Aspergillusoryzae）CICC40344（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）的α-淀粉酶基因；所述的糖化酶基因为黑曲霉（Aspergillusniger）CICC40179（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）的糖化酶基因；所述的酸性蛋白酶基因为黑曲霉（Aspergillusniger）CICC40179的酸性蛋白酶基因。
米曲霉CICC40344的α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，黑曲霉CICC40179的糖化酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示（其1566位的核苷酸残基C（胞嘧啶）已被人工突变成为T（胸腺嘧啶）），黑曲霉CICC40179的酸性蛋白酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示（其1155位的核苷酸残基C（胞嘧啶）已被人工突变成为T（胸腺嘧啶））。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
餐厨废弃物富含淀粉和蛋白质等营养物质，如果不经过降解，无法被酿酒酵母当做碳源和氮源所利用，因此，普通的酿酒酵母无法直接利用餐厨废弃物发酵生产乙醇。鉴于此，为了使酿酒酵母能够利用餐厨废弃物作为原料来发酵乙醇，本发明将降解淀粉和蛋白质的酶基因转入酿酒酵母中实现分泌表达，从而使得本发明的重组酵母能够分泌淀粉酶和蛋白酶，因此能够高效地降解餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质成为可利用的葡萄糖、多肽和氨基酸等碳源和氮源物质，进而可被重组酵母发酵成为乙醇。
本发明的难点在于如何将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因这三种基因成功的通过酿酒酵母共表达载体一起转入酿酒酵母同时实现分泌表达。为了克服这一困难，我们必须先构建同时含有amy、ga、ap三个基因表达盒的重组载体，而在重组三基因共表达载体的构建过程中，要求各个基因序列里不能有同尾酶NheI和XbaI的酶切位点，因为如果存在这两个酶切位点，则序列在拼接成串联表达盒的过程中会被NheI和XbaI切断而无法以完整的基因序列接入共表达载体，为此我们在不改变氨基酸编码的情况下将糖化酶基因第1566位的核苷酸残基C（胞嘧啶）突变成为T（胸腺嘧啶），导致糖化酶基因序列中原先的一个NheI酶切位点被破坏掉；又将酸性蛋白酶基因第1155位的核苷酸残基C（胞嘧啶）突变成为T（胸腺嘧啶），导致酸性蛋白酶基因序列中一个原先的XbaI酶切位点被破坏掉。于是最终获得了含有三个完整基因序列表达盒的重组共表达载体pScIKP-amy-ga-ap。
附图说明
图1重组酿酒酵母多基因表达载体pScIKP-amy-ga-ap的构建流程图。
图2阳性转化子的PCR鉴定结果，a为α-淀粉酶基因扩增片段，b为糖化酶基因扩增片段，c为酸性蛋白酶基因扩增片段。
图3重组酵母α-淀粉酶和糖化酶的酶活检验（碘熏蒸染色法）。
图4重组酵母酸性蛋白酶酶活检验（酪素显色法）。
图5重组酵母利用餐厨废弃物进行乙醇发酵的发酵液相色谱检测图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。
酿酒酵母AS2.489购自中国科学院微生物所菌种保藏中心，载体pScIKP为暨南大学分子生物研究中心构建并保存，其构建方法可参照专利ZL200810029630.6。
实施例1α-淀粉酶基因amy、糖化酶基因ga和酸性蛋白酶基因ap的克隆
参照GenBank上公布的米曲霉（Aspergillusoryzae）α-淀粉酶基因amy（登录号XM_001821384），黑曲霉（Aspergillusniger）糖化酶基因ga（登录号XM_001390493.1）和酸性蛋白酶基因ap的序列（登录号XM_001401056.2），用Oligo6引物设计软件设计引物，同时添加上合适的酶切位点：
amy基因的扩增引物：
提取米曲霉CICC40344总RNA，进行反转录PCR扩增反应，将amy基因的PCR扩增产物连接到pGEM-TEasy载体（购自Promega公司）上，测序验证。
其中amy基因的PCR反应条件为：
提取黑曲霉CICC40179的总RNA，进行反转录PCR扩增反应，将ga基因和ap基因的PCR扩增产物分别连接到pGEM-TEasy载体上，测序验证。
其中ga基因的PCR反应条件为：
其中ap基因的PCR反应条件为：
米曲霉CICC40344的α-淀粉酶基因amy的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，黑曲霉CICC40179的糖化酶基因ga的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示（其1566位的核苷酸残基C（胞嘧啶）已被人工突变成为T（胸腺嘧啶）），黑曲霉CICC40179的酸性蛋白酶基因ap核苷酸序列如SEQIDNO.3所示（其1155位的核苷酸残基C（胞嘧啶）已被人工突变成为T（胸腺嘧啶））。
实施例2三种酶基因构建共表达重组载体
三种酶基因共表达重组质粒的构建流程如图1所示。
将实施例1得到的amy、ga和ap编码序列用限制性内切酶BamHI和SpeI分别从pGEM-TEasy载体上双酶切切下，分别连接到用同样双酶酶切过的载体pScIKP上，获得重组质粒pScIKP-amy、pScIKP-ga和pScIKP-ap。
用NheI和XbaI双酶切pScIKP-ga，得到含有PGK启动子和终止子的ga基因表达盒片段。用NheI单酶切pScIKP-amy使其线性化。将两者用T4DNA连接酶连接（利用NheI和XbaI是同尾酶的原理），获得重组质粒pScIKP-amy-ga。利用同样的原理，用NheI和XbaI双酶切pScIKP-ap，得到含有PGK启动子和终止子的ap基因表达盒片段，与用NheI单酶切后线性化的pScIKP-amy-ga相连，最终得到重组质粒pScIKP-amy-ga-ap。
实施例3重组酵母转化子的筛选与验证
在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母AS2.489进行抗性筛选标记G418的敏感性测定，发现在G418浓度为150μg/ml的YPD平板上酵母已经被抑制而不能生长，因而在筛选转化子的时候可以用超过150μg/ml的G418的浓度来筛选。
将实施例2得到的三基因共表达重组质粒pScIKP-amy-ga-ap用限制性内切酶ApaI线性化后，用电穿孔转化法转入酿酒酵母AS2.489中，在G418的浓度为200μg/ml的YPD琼脂平板上培养3～4d后，挑取能够正常生长的菌落即为转有上述重组质粒的转化子。以三种酶基因各自特异性的引物进行菌落PCR，均能成功扩增出各自的基因片段（见图2），验证了三种酶基因确实已经转入并整合入酿酒酵母基因组中。
实施例4重组酿酒酵母分泌的淀粉酶和蛋白酶的酶活性检验
将实施例3得到的具有G418抗性的转化子菌落接种至含有1%可溶性淀粉的YNBS平板（YNB6.7g/l，可溶性淀粉10g/l，琼脂粉15g/l）上，在30℃培养箱中孵育72h后，用碘蒸气熏蒸平板，观察有无水解透明圈。结果如图3所示，菌落周围能观察到明显的淀粉水解透明圈，表明转化子可以降解利用培养基中的淀粉作为碳源进行生长。
将实施例3得到的具有G418抗性的转化子菌落接种到含1%酪素的YPD固体培养基（0.5g酵母提取物、2g蛋白胨、1.5g琼脂加1%酪素溶液到100ml）上培养3～4天。结果如图4所示，蛋白酶能降解酪素，故能分泌蛋白酶的转化子菌落在菌落周围能形成透明的酪素水解圈。
实施例5重组酵母发酵餐厨废弃物制备乙醇
（1）培养基组成
酒母培养基：YPD培养基（酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l），高压灭菌后备用。用于重组酵母的酒母培养。
发酵培养基：餐厨废弃物，收集自广州市某高校食堂师生用餐后剩余物。将收集回来的餐厨废弃物除去杂物后使用垃圾专用粉碎处理器将餐厨废弃物粉碎，充分搅拌混匀后，分装入1L大容量三角瓶中，121℃、20min灭菌处理备用。用于重组酵母的发酵。其理化性质经测定后如下：水分含量73.8%，干物质含量26.2%，淀粉含量9.7%，蛋白含量1.0%，可溶性糖含量4.4%，其他成分含量11.1%，pH6.1。
（2）发酵过程
将重组酿酒酵母菌株活化后，以2%接种量转接至25mlYPD酒母培养基，30℃、200rpm培养24h，然后将菌液以10%接种量接种到200mlYPD培养基进行种子扩大培养，30℃、200rpm培养至对数生长期，当细胞数目达到0.8～l.2×108/mL左右，出芽率20%左右，死亡率1%以下，即为酒母成熟标志。
按发酵培养基体积的10%将培养好的种子液转接至上述灭菌后的餐厨废弃物中，开始发酵。培养条件为30℃，250rpm，自然pH，通气培养4h；然后改为30℃，150rpm，自然pH，厌氧发酵60h。发酵期间每12h取样，用高效液相色谱法检测发酵液乙醇产量（结果见图5），结果发现重组酵母产乙醇最高峰出现在52h左右，最高乙醇浓度达到66g/L，餐厨废弃物-乙醇之间的转化率达到每4g餐厨废弃物（干重）产生1g乙醇的程度。通过以上结果可知本发明构建的重组酿酒酵母能降利用解餐厨废弃物，并将其变废为宝地转化成为乙醇，所以发明人将其命名为“噬污酵母1号”。
SEQUENCELISTING
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Claims (2)

1.一种能降解利用餐厨废弃物的基因重组酿酒酵母，其特征在于：将SEQIDNO.1所示的α-淀粉酶基因amy、SEQIDNO.2所示的糖化酶基因ga以及SEQIDNO.3所示的酸性蛋白酶基因ap分别连接到pGEM-TEasy载体，然后利用BamHI和SpeI双酶切切下amy、ga和ap基因，分别连接到pScIKP载体上，获得重组载体pScIKP-amy、pScIKP-ga和pScIKP-ap；之后，用NheI和XbaI双酶切pScIKP-ga获得含有PGK启动子和终止子的ga基因表达盒片段，用NheI单酶切pScIKP-amy使其线性化，将两者用T4DNA连接酶连接，获得重组质粒pScIKP-amy-ga；再用NheI和XbaI双酶切pScIKP-ap，得到含有PGK启动子和终止子的ap基因表达盒片段，与用NheI单酶切后线性化的pScIKP-amy-ga相连，最终得到重组质粒pScIKP-amy-ga-ap；最后，将pScIKP-amy-ga-ap转入酿酒酵母，从而获得能够分泌表达α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶的重组酿酒酵母，其能够高效的利用餐厨废弃物发酵生产乙醇。
2.一种降解餐厨废弃物生产乙醇的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株活化后，以2%接种量转接至25mlYPD酒母培养基，30℃、200rpm培养24h，然后将菌液以10%接种量接种到200mlYPD培养基进行种子扩大培养，30℃、200rpm培养至对数生长期，当细胞数目达到0.8～l.2×108/mL左右，出芽率20%左右，死亡率1%以下，即为酒母成熟标志；按发酵培养基体积的10%将培养好的种子液转接至灭菌后的餐厨废弃物中，开始发酵，培养条件为30℃，250rpm，自然pH，通气培养4h；然后改为30℃，150rpm，自然pH，厌氧发酵60h。
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