CN101319225B - 一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用，该表达载体是将酿酒酵母基因组rDNA的1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子三个表达元件插入到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体中，并在启动子上游和终止子下游设计了两个同尾酶的酶切位点而构建成的。本发明的酿酒酵母多基因表达载体具有同时表达多个外源基因的特点，其载体上的同尾酶设计可以使得多个外源基因以串联表达盒的方式连接到该载体上获得同时表达。本发明的表达载体由于采用了来源于宿主酿酒酵母自身的三个表达元件，有利于外源基因在宿主中稳定、高效的表达。

Description

一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种可实现多基因同时表达的、高拷贝数的、酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

酿酒酵母常规质粒为附加型质粒，可以在酿酒酵母中以高拷贝数量存在，但在没有选择压力存在时是不稳定的，易丢失，同时由于工业用酵母菌株的工作环境比较恶劣，而且生产原料的化学成分又比较复杂，存在一定的不确定性，都会对附加型质粒发生干扰，更易造成丢失，因此附加型质粒难以实现外源基因的稳定表达，不适于大规模应用。于是酿酒酵母用的整合型质粒载体便开始发展起来，但早期的整合型质粒载体(例如YIp5)的整合位点是营养标记基因，在染色体上的拷贝数较少，导致外源基因在染色体上整合的拷贝数也较少，因此产物表达量少，不能满足大量生产外源蛋白质的需求。

因此，为了提高外源基因在酿酒酵母中的表达量、稳定性，必须采用整合型质粒载体，而且要保证像附加型质粒那样的高拷贝数，就需要选用整合位点本身是酿酒酵母染色体上的多拷贝基因，才能有效解决上述问题。同时，鉴于多基因共表达的需求也越来越多，很多研究都希望能同时表达两种甚至几种外源基因，而普通表达载体一次通常只能插入一个外源基因，或者插入两个融合表达的基因，但这并不是真正意义上的共表达，而是把两个基因合到一起表达出一种融合蛋白，不是两个独立的蛋白。因此若能在同一个载体上同时表达多个外源基因，对于功能基因、基因工程研究都将具有重要意义。

发明目的

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种能同时高效稳定表达多种外源基因的高拷贝数酿酒酵母多基因表达载体。

本发明的另一个目的是提供上述酿酒酵母多基因表达载体的构建方法。

本发明的另一个目的是提供上述酿酒酵母多基因表达载体在表达多种外源基因方面的应用。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一种酿酒酵母多基因表达载体，该表达载体是将酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子三个表达元件插入到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体中，并在磷酸甘油激酶启动子上游和磷酸甘油激酶终止子下游设计有同尾酶的酶切位点，即得酿酒酵母多基因表达载体。

上述酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。酿酒酵母基因组中的rDNA序列是以9.1kb的长度高度重复的，是构建高拷贝数整合型载体的首选同源重组位点。根据T.S.Lopes等人(Lopes TS，de Wijs IJ，Steenhauer SI，Verbakel J，PlantaRJ.Factors affecting the mitotic stability of high-copy-numberintergration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1996，12(5)：467-477)的研究表明，用于介导整合的rDNA区域，不应包含其RNA polymerase I的起始转录区，同时整合于rDNA区域的外源基因片断大小接近rDNA单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高。根据这一要求，本发明通过对酿酒酵母rDNA序列和构成本发明载体的其他表达元件长度的分析，从而确定作为本发明表达元件的酿酒酵母基因rDNA的1.8kb片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述磷酸甘油激酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述磷酸甘油激酶终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体可以是各种该类型的载体，如pBluescript IISK(-)载体等。

上述磷酸甘油激酶启动子上游和磷酸甘油激酶终止子下游所设计的同尾酶酶切位点为NheI和XbaI。如果构建的酿酒酵母表达载体中在启动子上游和终止子下游不设计有同尾酶酶切位点，则所得载体一次只能进行一个基因的转化和表达，即使在启动子和终止子之间加入多个基因进行转化和表达，表达出来的也只是多个基因融合的一个蛋白；而本专利构建的酿酒酵母多基因表达载体在启动子上游和终止子下游设计有同尾酶酶切位点，因此可以在一个载体上同时串联多个表达盒(expression cassette)，且每个表达盒都有各自的启动子、终止子和外源基因，从而实现了多基因的共表达。

上述酿酒酵母多基因表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)引物设计与表达元件的扩增：根据酿酒酵母的基因组序列，设计酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子的特异性扩增引物，并以酿酒酵母基因组DNA为模板，对酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段进行PCR扩增和产物纯化，对磷酸甘油激酶启动子进行PCR扩增和产物纯化，对磷酸甘油激酶终止子进行PCR扩增和产物纯化；

(2)将上述磷酸甘油激酶启动子的PCR扩增纯化产物和大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体同时用相同的酶进行双酶切后，将磷酸甘油激酶启动子的PCR扩增纯化产物连接入大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体，获得第一次连接产物；

(3)将上述磷酸甘油激酶终止子的与上述第一次连接产物同时用相同的酶进行双酶切后，将磷酸甘油激酶终止子的PCR扩增纯化产物连接入第一次连接产物，得到第二次连接产物；

(4)将上述酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的PCR扩增纯化产物和上述第二次连接产物同时用相同的酶进行双酶切后，将酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的PCR扩增纯化产物连接入第二次连接产物，即得酿酒酵母多基因表达载体。

上述步骤(2)中，所述双酶切的酶切位点为Sal I和BamH I；上述步骤(3)中，所述双酶切的酶切位点为Xba I和BamH I；上述步骤(4)中，所述双酶切的酶切位点为Sac I和Xba I；上述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，所述连接均采用的是DNA连接酶连接。

上述步骤(1)中，作为表达元件PCR扩增模板的酿酒酵母基因组DNA可以采用任何一种酿酒酵母菌的基因组DNA。

上述酿酒酵母多基因表达载体可用于表达多种外源基因，且因为该表达载体在其启动子上游和终止子下游分别有两个同尾酶的酶切位点，利用这两个同尾酶，可以实现多个表达盒在载体上依次头尾相连形成串联连接，并且每个表达盒均带有独立的启动子、终止子和外源基因，从而可以实现多个外源基因的同时表达。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的酿酒酵母多基因表达载体采用的磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子来源于酿酒酵母，在同一物种获得的启动子和终止子将更加有利于外源基因在该物种中的表达；2.本发明的酿酒酵母多基因表达载体采用的是酿酒酵母基因组rDNA的1.8kb片段，减小了整个载体的大小，利于插入更多的外源基因进行转化；3.本发明的酿酒酵母多基因表达载体能利用同源重组原理将外源基因整合到酿酒酵母菌株的染色体上，使得外源基因不易丢失，实现了外源基因在酿酒酵母菌株中的稳定表达；4.本发明使用酿酒酵母基因组中的rDNA重复序列作为外源基因的整合位点，这种rDNA重复序列在酿酒酵母基因组中有100-200个拷贝，大大提高了外源基因整合在酿酒酵母染色体上的拷贝数，从而实现了外源基因的高效表达；5.本发明在酿酒酵母多基因表达载体上的启动子上游和终止子下游分别设计了两个同尾酶的酶切位点，利用这两个同尾酶，可以实现多个外源基因以表达盒的形式在载体上依次头尾相连形成串联连接，从而实现多个外源基因的同时表达；6.本发明中的三个表达元件插入到任何一类酿酒酵母可用的载体中，并在启动子上游和终止子下游加上同尾酶的酶切位点设计，都可以使得外源基因整合到酿酒酵母基因组上，并实现多种外源基因的同时表达，和高拷贝数转录及表达。

附图说明

图1为本发明的酿酒酵母多基因表达载体的构建流程图；

图2为外源基因eg3和cbh2利用本发明的酿酒酵母多基因表达载体进行共表达的重组质粒的构建流程图；

图3为外源基因eg3和cbh2的转基因酿酒酵母菌转化子对纤维素的降解作用的检验结果图；

其中：0为未处理的纤维素，1为用pScIKP-eg3的转化子上清处理过的纤维素，2为用pScIKP-cbh2的转化子上清处理过的纤维素，3为用pScIKP-ec的转化子上清处理过的纤维素。

具体实施方式

实施例1表达元件的引物设计

(1)rDNA的特异性扩增引物

酿酒酵母基因组中的rDNA序列是以9.1kb的长度高度重复的，是构建高拷贝数整合型载体的首选同源重组位点。根据T.S.Lopes等人(Lopes TS，de Wijs IJ，Steenhauer SI，Verbakel J，Planta RJ.Factorsaffecting the mitotic stability of high-copy-number intergration into theribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1996，12(5)：467-477)的研究表明，用于介导整合的rDNA区域，不应包含其RNApolymerase I的起始转录区，同时整合于rDNA区域的外源基因片断大小接近rDNA单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高。根据这一要求，本发明通过对酿酒酵母rDNA序列和构成本发明载体的其他表达元件长度的分析，从而确定需要扩增1.8kb的rDNA片段作为本发明的表达元件，同时明确该片段在酿酒酵母基因组rDNA全长序列中所处的位置。

参照NCBI提供的酿酒酵母(S.cerevisiae)的基因组序列，利用生物软件oligo 6设计用于扩增rDNA 1.8kb片段的特异性引物如下：

上游引物：5′-GCTCTAGACCAGCATCCTCCTTGACTTAC-3′；

                   ↑

                   Xba I

下游引物：5′-CGAGCTCGCATTTGCTGGTTATCCAC-3′；

                    ↑

                   Sac I

(2)PGK启动子的特异性扩增引物

参考David S.McNabb等人(McNabb DS，Reed R，Marciniak RA.Dual luciferase assay system for rapid assessment of gene expression inSaccharomyces cerevisiae.Eukaryot Cell，2005，4(9)：1539-1549)构建的酿酒酵母可定量基因表达的报告系统中使用的组成型启动子(PGK1)的长度及其设计的引物，同时参照NCBI上提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组序列，设计PGK启动子的特异性扩增引物。

为了提高PCR扩增的特异性，PGK启动子区采用巢式PCR，两对引物如下：

第一轮扩增引物：

上游引物：5′-CGATCCTTATTACCGCTTTCATCC-3′；

下游引物：5′-CAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA-3′；

第二轮扩增引物：

上游引物：5′-GCGTCGAC GCTAGCGAAGTACCTTCAAAGAATGGGGTC-3′

               ↑    ↑

              Sal I Nhe I

下游引物：5′-CGGGATCCTATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAATTAC-3′；

                   ↑

                 BamH I

(3)PGK终止子的特异性扩增引物

参照NCBI提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组序列，利用生物软件oligo 6设计PGK终止子的特异性扩增引物如下：

上游引物：5’-CG GGATCC ACTAGT GATCTCCCATGTCTCTAC-3’；

                   ↑      ↑

                  BamH I Spe I

下游引物：5’-GC TCTAGA AAGCTTTTTCGAAACGCAG-3’；

                   ↑

                 Xba I

实施例2表达元件的扩增

(1)rDNA的扩增与纯化

以酿酒酵母AS2.489菌株(购自中科院微生物所菌种保藏中心)的基因组为模板，用实施例1得到的rDNA特异性扩增引物，进行PCR扩增。

PCR反应条件：

195℃ 5min

5.72℃ 10min

(2)PGK启动子的扩增与纯化

第一轮PCR扩增以酿酒酵母AS 2.489菌株的基因组为模板。

PCR反应条件：

1.95℃ 5min

5.72℃ 10min

第二轮PCR扩增以纯化后的第一轮PCR产物为模板，进行PCR扩增，获得产物为PGK启动子。

PCR反应条件：

1.95℃ 5min

5.72℃ 10min

(3)PGK终止子的扩增与纯化

以酿酒酵母AS 2.489菌株的基因组为模板，进行PCR扩增。

PCR反应条件：

1.95℃ 5min

5.72℃ 10min

实施例3酿酒酵母多基因表达载体的构建

酿酒酵母多基因表达载体的详细构建流程如图1所示，其具体步骤如下：

(1)将从pPIC9K载体(购自Invitrogen公司)上得到的G418抗性基因片段用T4连接酶连入pBluescript II SK(-)载体中，得到表达载体1，对表达载体1进行PCR特异引物扩增，酶切鉴定和测序，确保序列的正确性。

(2)将实施例2得到的PGK启动子的PCR产物进行双酶切(SalI和BamH I)，同时对步骤(1)得到的表达载体1进行同样的双酶切后，用T4连接酶将PGK启动子的酶切产物连入表达载体1中，得到表达载体2，对表达载体2进行PCR特异引物扩增，酶切鉴定和测序，确保序列的正确性。

(3)将实施例2得到的PGK终止子的PCR产物进行双酶切(XbaI和BamH I)，同时对步骤(2)得到的表达载体2进行同样的双酶切后，用T4连接酶将PGK启动子的酶切产物连入表达载体2中，得到表达载体3，对表达载体3进行PCR特异引物扩增，酶切鉴定和测序，确保序列的正确性。

(4)将实施例2得到的rDNA1.8kb片段的PCR产物进行双酶切(Sac I和XbaI)，同时对步骤(3)得到的表达载体3进行同样的双酶切后，用T4连接酶将PGK启动子的酶切产物连入表达载体3中，最终得到酿酒酵母多基因高拷贝数整合型表达载体，命名为pScIKP。对酿酒酵母整合表达载体进行PCR特异引物扩增，酶切鉴定和测序，确保序列的正确性。

如图1所示，为了所构建的酿酒酵母表达载体是一个能进行多基因共表达的载体，在本实施例的酿酒酵母表达载体的表达盒两端设计了NheI和XbaI两个同尾酶酶切位点。同时为了方便外源基因克隆，还在表达盒中设计了BamH I和Spe I酶切位点。

实施例4利用酿酒酵母多基因表达载体共表达纤维素酶基因eg3和cbh2

(1)eg3和cbh2酶基因共表达重组质粒的构建

利用实施例3所制备得到的酿酒酵母多基因表达载体对外源基因-纤维素酶基因eg3和cbh2进行共表达，其eg3和cbh2酶基因共表达重组质粒的构建流程如图2所示。

将从绿色木霉AS3.3711中扩增得到的内切β-1，4-葡聚糖酶基因eg3的编码序列用限制性内切酶BamH I和SpeI双酶切，连接到用同样双酶酶切过的实施例3所述的酿酒酵母多基因高拷贝数整合型表达载体pScIKP上，获得重组质粒1，命名为pScIKP-eg3。

将从绿色木霉AS3.3711中扩增得到的外切β-1，4-葡聚糖酶基因cbh2的编码序列用限制性内切酶BamH I和SpeI双酶切，连接到用同样双酶酶切过的实施例3所述的表达载体pScIKP上，获得重组质粒2，命名为pScIKP-cbh2。

用限制性内切酶Nhe I单酶切重组质粒2(pScIKP-cbh2)，同时用限制性内切酶Nhe I和Xba I双酶切重组质粒1(pScIKP-eg3)，将线性化的重组质粒pScIKP-cbh2和从重组质粒pScIKP-eg3酶切下来的含有PGK启动子和终止子的eg3表达盒用T4DNA连接酶连接并转化到大肠杆菌JM109中，进行菌落PCR和提取重组质粒酶切鉴定，鉴定出两个基因头尾相连正向串联连接的双基因共表达重组质粒，命名为pScIKP-ec。

(2)酿酒酵母转化子的筛选

在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母AS2.489(购自中科院微生物所菌种保藏中心)进行了抗性筛选标记G418的敏感性测定，发现在G418浓度为150μg/ml的YPD平板上酵母已经被抑制而不能生长，因而在筛选转化子的时候可以用超过150μg/ml的G418的浓度来筛选。

将实施例4中得到的双基因共表达重组质粒pScIKP-ec用限制性内切酶Apa I线性化后，将线性化的重组质粒用电穿孔转化法转入酿酒酵母AS2.489中，在G418的浓度为200μg/ml的YPD琼脂平板上培养3～4d后，挑取能够正常生长的菌落即为转有上述重组质粒的转化子。

(3)转基因酿酒酵母菌转化子对纤维素的降解作用的检验

将上述步骤(1)和(2)中得到的转有重组质粒pScIKP-eg3、pScIKP-cbh2和pScIKP-ec的转基因酿酒酵母菌转化子分别用YPD液体培养基在30℃，200rpm培养60h后，4℃，12000rpm离心5min，收取上清，将上清与磷酸膨胀纤维素在50℃下静置反应48h，观察不溶性纤维素残留的情况，发现转有pScIKP-ec重组质粒的转基因酿酒酵母转化子的培养上清中的不溶性纤维素减少的量最多，达到25％，如图3所示(图中0为未经酶处理的纤维素；1为转有pScIKP-eg3的转化子培养上清处理过的纤维素；2为转有pScIKP-cbh2的转化子培养上清处理过的纤维素；3为转有pScIKP-ec的转化子培养上清处理过的纤维素)，由此可证明上述步骤(2)得到的转基因酿酒酵母菌转化子共同分泌表达了纤维素酶基因eg3和cbh2，因此对纤维素产生了比单一酶效果更好的协同降解作用，证明多基因高拷贝数整合型表达载体pScIKP是有效的。

一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用序列表.txt

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1819

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>1

ccagcatcct tgacttacgt cgcagtcctc agtcccagct ggcagtattc ccacaggcta     60

taatacttac cgaggcaagc tacattccta tggatttatc ctgccaccaa aactgatgct    120

ggcccagtga aatgcgagat tcccctaccc acaaggagca gagggcacaa aacaccatgt    180

ctgatcaaat gcccttccct ttcaacaatt tcacgtactt tttcactctc ttttcaaagt    240

tcttttcatc tttccatcac tgtacttgtt cgctatcggt ctctcgccaa tatttagctt    300

tagatggaat ttaccaccca cttagagctg cattcccaaa caactcgact cttcgaaggc    360

actttacaaa gaaccgcact cctcgccaca cgggattctc accctctatg acgtcctgtt    420

ccaaggaaca tagacaagga acggccccaa agttgccctc tccaaattac aactcgggca    480

ccgaaggtac cagatttcaa atttgagctt ttgccgcttc actcgccgtt actaaggcaa    540

tcccggttgg tttcttttcc tccgcttatt gatatgctta agttcagcgg gtactcctac    600

ctgatttgag gtcaaacttt aagaacattg ttcgcctaga cgctctcttc ttatcgataa    660

cgttccaata cgctcagtat aaaaaagatt agccgcagtt ggtaaaacct aaaacgaccg    720

tacttgcatt atacctcaag cacgcagaga aacctctctt tggaaaaaaa aaacatccaa    780

tgaaaaggcc agcaatttca agttaactcc aaagagtatc actcactacc aaacagaatg    840

tttgagaagg aaatgacgct caaacaggca tgccccctgg aataccaagg ggcgcaatgt    900

gcgttcaaag attcgatgat tcacggaatt ctgcaattca cattacgtat cgcatttcgc    960

tgcgttcttc atcgatgcga gaaccaagag atccgttgtt gaaagttttt aatattttaa   1020

aatttccagt tacgaaaatt cttgtttttg acaaaaattt aatgaataga taaaattgtt   1080

tgtgtttgtt aacctctggg ccccgattgc tcgaatgccc aaagaaaaag ttgcaaagat   1140

atgaaaactc cacagtgtgt tgtattgaaa cggttttaat tgtcctataa caaaagcaca   1200

gaaatctctc accgtttgga atagcaagaa agaaacttac aagcctagca agaccgcgca   1260

cttaagcgca ggcccggctg gactctccat ctcttgtctt cttgcccagt aaaagctctc   1320

atgctcttgc caaaacaaaa aaaaaaaaat ccattttcaa aattattaaa tttctttaat   1380

gatccttccg caggttcacc tacggaaacc ttgttacgac ttttagttcc tctaaatgac   1440

caagtttgtc caaattctcc gctctgagat ggagttgccc ccttctctaa gcagatcctg   1500

aggcctcact aagccattca atcggtacta gcgacgggcg gtgtgtacaa agggcaggga   1560

cgtaatcaac gcaagctgat gacttgcgct tactaggaat tcctcgttga agagcaataa   1620

ttacaatgct ctatccccag cacgacggag tttcacaaga ttaccaagac ctctcggcca   1680

aggttagact cgctggctcc gtcagtgtag cgcgcgtgcg gcccagaacg tctaagggca   1740

一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用序列表.txt

tcacagacct gttattgcct caaacttcca tcggcttgaa accgatagtc cctctaagaa  1800

gtggataacc agcaaatgc                                               1819

<210>2

<211>977

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>2

gaagtacctt caaagaatgg ggtctcatct tgttttgcaa gtaccactga gcaggataat    60

aatagaaatg ataatatact atagtagaga taacgtcgat gacttcccat actgtaattg    120

cttttagttg tgtattttta gtgtgcaagt ttctgtaaat cgattaattt ttttttcttt    180

cctcttttta ttaaccttaa tttttatttt agattcctga cttcaactca agacgcacag    240

atattataac atctgcacaa taggcatttg caagaattac tcgtgagtaa ggaaagagtg    300

aggaactatc gcatacctgc atttaaagat gccgatttgg gcgcgaatcc tttattttgg    360

cttcaccctc atactattat cagggccaga aaaaggaagt gtttccctcc ttcttgaatt    420

gatgttaccc tcataaaaca cgtggcctct tatcaagaaa gaaattaccg tcgctcgtga    480

tttgtttgca aagagaacaa aactgaaaaa acccagacac gctcgacttc ctgtcttcct    540

attgattgca gcttccaatt tcgtcacaca acaaggtcct agcgacggct cacaggtttt    600

gtaacaagca atcgaaggtt ctggaatggc gggaaagggt ttagtaccac atgctatgat    660

gcccactgtg atctccagag caaagttcgt tcgatcgtac tgttactctc tctctttcaa    720

acagaaatgt ccgaatcgtg tgacaacaac agcctgttct cacacactct tttcttctaa    780

ccaagggggt ggtttagttt agtagaacct cgtgaaactt acatttacat atatataaac    840

ttgcataaat tggtcaatgc aagaaataca tatttggtct tttctaattc gtagtttttc    900

aagttcttag atgctttctt tttctctttt ttacagatca tcaaggaagt aattatctac    960

tttttacaac aaatata                                                   977

<210>3

<211>377

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>3

gatctcccat gtctctactg gtggtggtgc ttctttggaa ttattggaag gtaaggaatt      60

gccaggtgtt gctttcttat ccgaaaagaa ataaattgaa ttgaattgaa atcgatagat     120

caattttt tt cttttctctt tccccatcct ttacgctaaa ataatagttt attttatttt    180

ttgaatattt tttatttata tacgtatata tagactatta tttatctttt aatgattatt     240

aagattttta ttaaaaaaaa attcgtccct cttttaatgc ctttatccag tttttttttc     300

ccattcgata tttctatgtt cgggttcagc gtattttaag tttaataact cgaaaattct     360

gcgtttcgaa aaagctt                                                    377

Claims (5)

1.一种酿酒酵母多基因表达载体，其特征在于该表达载体是将酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子三个表达元件插入到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体中，并在磷酸甘油激酶启动子上游和磷酸甘油激酶终止子下游设计同尾酶的酶切位点，即得酿酒酵母多基因表达载体；

所述的酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的磷酸甘油激酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的磷酸甘油激酶终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母多基因表达载体，其特征在于所述同尾酶为Nhe I、Xba I。

3.权利要求1所述的酿酒酵母多基因表达载体的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)引物设计与表达元件的扩增：根据酿酒酵母的基因组序列，设计酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子的特异性扩增引物，并以酿酒酵母AS 2.489菌株的基因组DNA为模板，分别扩增酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子；

(2)将上述磷酸甘油激酶启动子的扩增产物和大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体同时双酶切后，将磷酸甘油激酶启动子的扩增产物连接入大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体，获得第一次连接产物；

(3)将上述磷酸甘油激酶终止子的扩增产物与上述第一次连接产物同时双酶切后，将磷酸甘油激酶终止子的扩增产物连接入第一次连接产物，得到第二次连接产物；

(4)将上述酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的扩增产物和上述第二次连接产物同时双酶切后，将酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的扩增产物连接入第二次连接产物，即得酿酒酵母多基因表达载体。

4.根据权利要求3所述酿酒酵母多基因表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，所述双酶切的酶切位点为Sal I、BamHI；步骤(3)中，所述双酶切的酶切位点为Xba I、BamH I；步骤(4)中，所述双酶切的酶切位点为Sac I、Xba I；步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，所述连接为DNA连接酶连接。

5.权利要求1所述的酿酒酵母多基因表达载体在表达多种外源基因方面的应用。

Images