CN115058446A - 大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用。该大豆多基因表达载体包括至少2个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒中的sgRNA靶序列识别区对应不同靶基因；每个所述sgRNA表达盒中的大豆U6启动子不同。该大豆多基因编辑表达载体不仅可以补充大豆多基因编辑的方法，同时可以有效的提高编辑效率。

Description

大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats，CRISPR)的基因组编辑技术主要通过细胞内Cas9蛋白结合一条末端与目标基因20碱基互补的单链非编码RNA(single guide RNA，sgRNA)，利用互补的20碱基引导序列(guide RNA，gRNA)锁定目的基因，在Cas9蛋白作用下切割目的基因，通过生物体内的非同源重组或同源重组机制对断裂DNA进行非精确修复，从而导致目的基因发生突变。自2013年首次报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于植物之后，CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛地应用于不同植物目标基因的定点突变，是获得植物基因功能研究所需突变体的一种重要技术手段。

CRISPR/Cas9基因编辑技术可以高效地获得目的基因的突变体，而且等位基因的双突变体在T0代就能获得，这为植物基因功能研究节省了大量的时间。CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导形成的突变体能在子代中稳定的遗传，可以用子代进行基因功能研究。CRISPR-Cas9基因编辑技术同样在作物品种改良上获得了广泛的应用。Wang等首次报道了在面包小麦中抗白粉病基因MLO进行突变，获得了抗白粉病的小麦株系。对油菜BnaMAX1基因的编辑可以有效的改善油菜株型并增加产量。Li等对棉花CLA基因的编辑获得了不含棉酚的棉花。Pramanik等对番茄Pel和Mol1基因的编辑，使番茄获得了对黄化曲叶病毒和白粉病的抗性。Qi等对玉米MS26基因的编辑，创制了玉米雄性不育系，使一步法实现玉米杂交育种成为现实。CRISPR/Cas9基因编辑技术以其简单、高效、快速和费用低的特点，已成为植物以及作物的基础研究和遗传改良的必不可少的工具。

大豆是由四倍体进化而来的二倍体作物，基因组经历了2次复制而具有高度的重复性，约75％基因存在多个拷贝。对大豆基因功能研究，往往涉及同一家族多个基因的功能研究，因此开发多基因编辑载体，对大豆多基因编辑已成为大豆基因功能研究的一种有效手段。目前在植物中已开发了多个多基因编辑技术，利用植物体内RNA核酸酶对tRNA的自剪切作用，Xie等将多个sgRNA用tRNA进行串联，在水稻中实现了对多个基因的编辑。利用拟南芥U6-26启动子串联表达不同sgRNA，在烟草中对多个基因进行了编辑。Ma等利用水稻U6和U3启动子的串联，在水稻中实现了多基因的编辑。

发明内容

大豆约75％基因存在多个拷贝，大豆基因家族往往存在多个功能相似的基因，如本发明实施例所用的miR396基因家族包含有11个功能相似的miR396基因，因此需迫切开发多基因编辑载体对功能相似的基因进行编辑。本发明的目的之一在于提供一种可用于大豆的多基因编辑表达载体。

本发明提供了一种大豆多基因编辑表达载体，包括至少2个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒中的sgRNA靶序列识别区对应不同靶基因；每个所述sgRNA表达盒中的大豆U6启动子不同。

可选地，根据上述的载体，所述大豆U6启动子为GmU6-2、GmU6-8、GmU6-10和GmU6-11中任一种。

可选地，根据上述的载体，所述Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区编码序列为SEQID No.2的第1548-1624位所示。

可选地，根据上述的载体，所述多基因编辑表达载体包括4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；所述4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件为如下四种表达盒任意组合方式串联形成：

1)包括大豆U6启动子GmU6-2、sgRNA靶序列识别区A和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；2)包括大豆U6启动子GmU6-8、sgRNA靶序列识别区B和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区的sgRNA表达盒；3)包括大豆U6启动子GmU6-10、sgRNA靶序列识别区C和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区的sgRNA表达盒；4)包括大豆U6启动子GmU6-11、sgRNA靶序列识别区D和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区的sgRNA表达盒；

所述sgRNA靶序列识别区A、B、C和D分别结合不同靶基因。

上述大豆多基因编辑表达载体还可包括Cas9蛋白基因，序列如SEQ ID No.16的第1-4132位。

可选地，根据上述的载体，所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列包括SEQID No.14或SEQ ID No.15所示序列。所述多基因编辑表达载体的核苷酸序列也可包括将SEQ ID No.14或SEQ ID No.15中的sgRNA靶序列识别区替换为不同的sgRNA靶序列识别区所获的序列。例如，所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列为下述实施例制备的pmiR396-GmU6n-gDNA载体序列、pGRF-GmU6n-gDNAn载体序列和/或pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体序列。

本发明还提供了一种制备上述载体的方法，包括采用同尾酶将上述载体中不同大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒进行串联，得到所述载体。

可选地，根据上述的方法，包括如下步骤：

1)制备表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组，所述载体组由多个表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组成，所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体依次包括限制性内切酶A酶切识别位点、大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒和限制性内切酶B酶切识别位点，所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区、Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区和限制性内切酶C酶切识别位点，所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶C为同尾酶；

2)用限制性内切酶A和限制性内切酶B对所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体分别酶切，收集不同的大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒；

3)用限制性内切酶B和限制性内切酶C对1个所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体酶切，收集载体骨架，再2)获得的1个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒与所述载体骨架连接，得到连接2个表达盒的载体，即为目的载体。

可选地，根据上述的方法，步骤3)后还包括：

4)用限制性内切酶B和限制性内切酶C对所述连接后的载体酶切，收集连接2个表达盒的载体骨架，再将2)获得的另一个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒与所述连接2个表达盒的载体骨架连接，得到连接3个表达盒的载体；

依次类推，直到获得连接多个表达盒的载体，即为目的载体。

所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体可由构建载体制备而成，其依次包括限制性内切酶A酶切识别位点、大豆U6启动子、指示基因(例如PDS基因)、Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区、限制性内切酶C酶切识别位点和限制性内切酶B酶切识别位点。具体可为下述实施例制备的载体pGmU6-sgRNA3.0。

可选地，根据上述的方法，所述同尾酶为Xho I和Sal I。例如，所述限制性内切酶A为Xho I，且所述限制性内切酶C为Sal I；或所述限制性内切酶A为Sal I，且所述限制性内切酶C为Xho I。

限制性内切酶B酶切识别位点与限制性内切酶A和限制性内切酶C酶切识别位点均不同。例如，限制性内切酶B为BamH I。

所述大豆U6启动子可为GmU6-2(SEQ ID No.3)、GmU6-8(SEQ ID No.4)、GmU6-10(SEQ ID No.2中的第411-716位)或GmU6-11(SEQ ID No.5)。

上述的大豆多基因编辑表达载体在基因编辑或制备基因编辑产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。

同尾酶(isocaudamer)是切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。这一类的限制酶来源各异，识别位点也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片段与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。例如：BamH I和Bgl II，Sal I和Xho I就是常见的同尾酶。

大豆有11个U6启动子，不同启动子具有不同的基因编辑效率。与拟南芥U6启动子相比，大豆U6启动子驱动sgRNA的表达具有更高的基因编辑效率，因此利用大豆不同U6启动子进行多基因表达载体的构建，是对大豆多基因编辑的一种有效方法。本发明利用大豆特有的不同U6启动子驱动表达sgRNA，利用载体上同尾酶将不同大豆U6启动子表达的sgRNA进行串联，成功构建了可以同时对大豆多个基因进行编辑的基因编辑载体。

本发明提供的大豆多基因编辑表达载体不仅可以补充大豆多基因编辑的方法，同时可以有效的提高编辑效率，这对遗传转化效率低效的大豆基因编辑具有重要的应用价值。

附图说明

图1为pGmU6-sgRNA3.0载体构建以及结构示意图。

图2为多靶位点Cas9载体构建。

图3为pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体结构示意图。

图4为实施例2PCR产物测序(A)及PCR-T7 Endonuclease I酶切法(B)检测基因突变。

图5为实施例2部分突变检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大豆Williams 82由本实验室保存，记载于Sun X，Hu Z，Chen R，et al.Targetedmutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.Sci Rep.2015，10342。

菌株为大肠杆菌菌株Trans1-T1，购买于北京全式金生物技术有限公司，发根农杆菌K599由中国农科院作科所侯文胜老师课题组惠赠，记载于Cai Y，Chen L，Liu X，etal.CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Soybean Hairy Roots.PLoS ONE.2015，10(8)：e0136064.。

质粒pGmU6-10-sgRNA2.0、pGmU6-2、pGmU6-8、pGmU6-11和pCambia3301-Cas9由本实验室保存。

2×PCR Master Mix、快速限制性内切酶、T4 DNALigase购于Fermentas公司，2×TransStart FastPfu PCR SurperMix，Trans1-T1感受态细胞购买于北京全式金生物技术有限公司，植物基因组DNA提取试剂盒、快捷型植物基因组DNA提取试剂盒、质粒小提中量试剂盒、普通DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，EZ-HiFi无缝组装克隆试剂盒购于GenStar生物技术有限公司，2xPhusion超保真PCRMaster Mix，Gibson组装试剂盒购买于NEB，MURASHIGE&SKOOG BASAL SALT MIXTURE购买于Phyto Tech。

引物合成和测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

下述实施例中所涉及序列如表1。

表1序列名称及编号

序列名称	序列编号
		pGmU6-10-sgRNA2.0	SEQ ID No.1
pGmU6-10-sgRNA3.0	SEQ ID No.2
		GmU6-2	SEQ ID No.3
GmU6-8	SEQ ID No.4
		GmU6-11	SEQ ID No.5
miR396-gDNA1	SEQ ID No.6
		miR396-gDNA2	SEQ ID No.7
miR396-gDNA3	SEQ ID No.8
		miR396-gDNA4	SEQ ID No.9
GRF-gDNA1	SEQ ID No.10
		GRF-gDNA2	SEQ ID No.11
GRF-gDNA3	SEQ ID No.12
		GRF-gDNA4	SEQ ID No.13
pmiR396 sgRNA核心序列	SEQ ID No.14
		pGRF sgRNA核心序列	SEQ ID No.15
pCambia3301-Cas9	SEQ ID No.16

下述实施例所用引物序列如表2。

表2引物序列

实施例1、多基因编辑表达载体构建

1.pGmU6-10-sgRNA3.0载体构建

在载体pGmU6-10-sgRNA2.0的基础上，加入拟南芥PDS基因，构建为pGmU6-10-sgRNA3.0载体。具体为，将pGmU6-10-sgRNA2.0载体用Bsa I酶切；用引物对PDS-HF/R克隆拟南芥PDS基因；利用同源重组的方法将载体pGmU6-10-sgRNA2.0和拟南芥PDS基因连接，构建为pGmU6-10-sgRNA3.0载体，pGmU6-10-sgRNA3.0载体结构示意图如图1中的C所示，pGmU6-10-sgRNA3.0载体序列中，第405-410位为Xho I酶切识别位点，第411-716核苷酸为GmU6-10启动子，第722-1543核苷酸为PDS基因，第1548-1624位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第1644-1649位为Sal I酶切识别位点，第1661-1666位为BamH I酶切识别位点。

1.1pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切

在PCR管中加入如下试剂：

混匀，37℃，30min。

1.2pGmU6-10-sgRNA2.0 Bsa I酶切产物回收(按试剂盒说明书进行回收)

(1)1％琼脂糖电泳30min

(2)在紫外灯下，将目的条带从琼脂糖凝胶上切下，放入已灭菌的离心管内称重，1mg凝胶视为100μl。

(3)向凝胶中加入1倍体积的PN溶液，65℃水浴5min左右，加热溶解中，适当的翻转几次离心管，或延长加热时间，确保凝胶充分溶解。

(4)待溶解的凝胶降到室温时，将其转移到吸附柱上(先将吸附柱经平衡液处理)，静止2min左右，12000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放到收集管中。

(5)向吸附管中加入700μl PW漂洗液，静止2min后，12000rpm，离心30s，摒弃废液，重复洗涤一次。掉到废液后，再12000rpm，离心2min。

(6)室温下静止2-5min，使多余的酒精充分挥发。加入30μl的EB洗脱缓冲液，室温静止5min，12000rpm，离心2min，收集DNA溶液，即为pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物，该产物用于与PDS DNA进行连接构建pGmU6-10-sgRNA3.0载体。

1.3拟南芥PDS基因扩增

扩增体系如下：

反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃，30s，72℃ 30s，32个循环；72℃，5min；4℃保温。

1.4拟南芥PDS基因切胶回收

方法同1.2pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物回收，获得PDS扩增产物。

1.5pGmU6-10-sgRNA2.0和PDS同源重组

在PCR管中加入以下试剂

反应程序为：50℃ 30min，使pGmU6-10-sgRNA2.0酶切产物与PDS DNA连接，获得连接产物。

1.6转化和测序验证

(1)在超净工作台内，将步骤1.5获得的连接产物加入到含有50μl冰上融化的大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞的离心管内，轻弹离心管管底混匀，冰浴30min。调节水浴锅温度至42℃。

(2)半小时后，将完成步骤(1)的离心管置于42℃水浴锅中热激30s，随后转移入冰上冰浴2min。

(3)在超净工作台内，向冰浴2min后的离心管内加入500μl不含抗生素的LB培养基，颠倒混匀后，在37℃，200rpm摇床上培养1h。

(4)培养1h后，5000rpm，离心2min，去除上清液，各离心管内留200μl液体培养基为宜。用移液枪混匀后，均匀涂抹在含有Kan抗生素的固体培养基上。暗条件下，37℃倒置培养至菌落出现(约12h)。

(5)随机挑取3-5个克隆进行测序验证。

测序结果含有正确的BstE II酶切位点，Avr II酶切位点和PDS序列的克隆即为pGmU6-10-sgRNA3.0阳性克隆。

1.7pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取

(1)向吸附柱内加入500μl平衡液BL处理吸附柱，12000rpm，离心30s。倒掉废液，重新放回收集管上。

(2)取10ml OD₆₀₀为2.0的pGmU6-10-sgRNA3.0阳性克隆菌液分批次加入干净的离心管中，12000rpm，离心30s，去上清。

(3)向步骤(2)收集菌体的离心管中加入500μl溶液P1(已加RNaseA)，用涡旋仪涡旋使细胞沉淀悬浮起来。

(4)再加入500μl溶液P2，缓慢反转6-8次，此过程不宜超过5min，菌液变清即可。

(5)向步骤(4)离心管中加入700μl溶液P3，立即混匀，以免产生局部沉淀，影响提取效率。12000rpm，离心10min。

(6)将步骤(5)收集的上清液加入经平衡液处理的吸附柱上，室温放置2min，12000rpm，离心30s。倒掉收集管内的废液，重新将吸附柱放到离心管内。

(7)向步骤(6)吸附柱中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm，离心30s，倒掉废液。

(8)向步骤(7)吸附柱内加入600μl漂洗液PW，洗涤2min后，12000rpm离心30s。重复此步骤一次。

(9)将步骤(8)吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液。室温下静止5min左右，使其彻底晾干。

(10)将步骤(9)吸附柱放入另一干净的离心管内，向吸附膜中间位置加入150μlEB洗脱缓冲液，室温下溶解5min，12000rpm离心2min收集质粒DNA，-20℃保存，备用。

电泳检测结果如图1中的A所示，其中，泳道M为DL2000，泳道1为PDS PCR扩增产物电泳，泳道2为pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物电泳，泳道3为pGmU6-10-sgRNA3.0BstEII和Avr II双酶切产物电泳，BstE II和AvrII双酶切pGmU6-10-sgRNA3.0载体验证了PDS基因的连入，pGmU6-10-sgRNA3.0载体和pGmU6-10-sgRNA2.0载体相比，前者更容易从胶图上直接判断酶切是否成功(酶切后有两条带)，这也是PDS基因连入的目的。

2.pGmU6-2-sgRNA3.0载体构建

在pGmU6-10-sgRNA3.0载体的基础上，用大豆U6启动子GmU6-2替换GmU6-10，构建pGmU6-2-sgRNA3.0载体。

以pGmU6-2-sgRNA3.0载体构建具体为，将pGmU6-10-sgRNA3.0载体用BstE II和Xho I双酶切，去掉GmU6-10；然后用引物对GmU6-2-HF/R从pGmU6-2质粒(载体)中扩增GmU6-2；用同源重组的方式将切去GmU6-10的pGmU6-10-sgRNA3.0载体骨架和GmU6-2启动子DNA同源重组，构建为pGmU6-2-sgRNA3.0载体。pGmU6-2-sgRNA3.0载体是将pGmU6-10-sgRNA3.0载体的GmU6-10(即pGmU6-10-sgRNA3.0载体第411-716位核苷酸)替换为GmU6-2所获得的载体，结构示意图如图1中的C所示。

2.1pGmU6-10-sgRNA3.0BstE II和Xho I双酶切

在PCR管中加入如下试剂：

混匀，37℃，30min。

2.2pGmU6-10-sgRNA3.0酶切产物回收

回收方法参照1.2pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物回收方法回收pGmU6-10-sgRNA3.0酶切产物。

2.3GmU6-2启动子扩增

扩增体系如下：

反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃，30s，72℃ 30s，25个循环；72℃，5min；4℃保温。

2.4GmU6-2启动子DNA切胶回收

方法参照1.2pGmU6-10-sgRNA2.0 Bsa I酶切产物回收方法回收GmU6-2启动子DNA。

2.5pGmU6-10-sgRNA3.0和GmU6-2启动子DNA同源重组

在PCR管中加入以下试剂

反应程序为：50℃ 30min。

2.6转化和测序验证

方法参照1.6的转化和测序验证，测序后获得pGmU6-2-sgRNA3.0载体。

2.7pGmU6-2-sgRNA3.0质粒提取

质粒提取方法参照1.7pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取的方法提取pGmU6-2-sgRNA3.0质粒，-20℃保存备用。

3.pGmU6-8-sgRNA3.0和pGmU6-11-sgRNA3.0载体构建

在pGmU6-10-sgRNA3.0载体的基础上，用大豆U6启动子GmU6-8，GmU6-11替换GmU6-10，分别构建pGmU6-8-sgRNA3.0，pGmU6-11-sgRNA3.0载体。

将pGmU6-10-sgRNA3.0载体用BstE II和Xho I双酶切，去掉GmU6-10；然后用引物对GmU6-8-HF/R从pGmU6-8质粒(载体)中扩增GmU6-8；用同源重组的方式将切去GmU6-10的pGmU6-10-sgRNA3.0载体骨架和GmU6-8启动子DNA同源重组，构建为pGmU6-8-sgRNA3.0载体，pGmU6-8-sgRNA3.0载体是将pGmU6-10-sgRNA3.0载体的GmU6-10(即pGmU6-10-sgRNA3.0载体第411-716位核苷酸)替换为GmU6-8所获得的载体，结构示意图如图1中的C所示。

将pGmU6-10-sgRNA3.0载体用BstE II和Xho I双酶切，去掉GmU6-10；然后用引物对GmU6-11-HF/R从pGmU6-11质粒(载体)中扩增GmU6-11；用同源重组的方式将切去GmU6-10的pGmU6-10-sgRNA3.0载体骨架和GmU6-11启动子DNA同源重组，构建为pGmU6-11-sgRNA3.0载体，pGmU6-11-sgRNA3.0载体是将pGmU6-2-sgRNA3.0载体的GmU6-10(即pGmU6-10-sgRNA3.0载体第411-716位核苷酸)替换为GmU6-11所获得的载体，结构示意图如图1中的C所示。

具体构建方法同2.pGmU6-2-sgRNA3.0载体构建，载体构建成功后参照1.7pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取的方法提取pGmU6-8-sgRNA3.0和pGmU6-11-sgRNA3.0质粒，-20℃保存备用。

pGmU6-2-sgRNA3.0、pGmU6-8-sgRNA3.0、pGmU6-10-sgRNA3.0和pGmU6-11-sgRNA3.0下述统称为pGmU6-sgRNA3.0。

电泳结果如图1中B所示，其中，泳道M为为DL2000，泳道1为pGmU6-10-sgRNA3.0BstE II和Xho I双酶切产物电泳，泳道2为GmU6-2 PCR扩增产物电泳，泳道3为GmU6-8 PCR扩增电泳，泳道4为GmU6-11PCR扩增电泳。

4.多靶位点Cas9载体(多基因编辑表达载体)构建

选取靶基因(同一基因家族不同基因)设计gDNA，将pGmU6-sgRNA3.0载体双酶切(切掉PDS基因)，用同源重组方式与gDNA连接，构建带有不同gDNA和GmU6启动子的载体pGmU6-gDNA，也可被称作表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体。再将其中一个载体酶切切开，把从另外几个载体上酶切获得的不同的GmU6-gDNA陆续连接到同一个载体上，最终获得多个sgRNA串联表达载体p(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)-(U6-2：gDNA3)-(U6-11：gDNA4)(pGmU6n-gDNAn)。最后将pCambia3301-Cas9酶切切开，把从串联表达载体上酶切获得的pGmU6n-gDNAn串联序列连接到pCambia3301-Cas9载体上，最终构建获得多靶位点Cas9载体(pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn)。

4.1设计并获得gDNA

本实施例选取Gma-miR396家族9个基因(miR396a/b/c/d/e/f/h/i/j)和Gma-GRF家族24个基因(GRF1～24)作为靶基因进行定点突变。在miR396前体序列中找到成熟序列，获取成熟序列附近PAM位点上游20bp序列，设计CRISPR/Cas9的靶位点。从大豆基因组数据库中获取大豆GRF基因中miR396靶位点(CGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA)中的PAM位点(CCT和TGG)上游20bp序列，分别设计CRISPR/Cas9的靶位点。miR396-gDNA1/2/3/4及GRF-gDNA1/2/3/4寡核苷酸(即gRNA编码基因，sgRNA靶序列识别区)序列见序列表。人工合成miR396-gDNA1/2/3/4及GRF-gDNA1/2/3/4。

4.2多个sgRNA串联表达载体构建(以miR396为例)

(1)pGmU6-2-sgRNA3.0、pGmU6-8-sgRNA3.0、pGmU6-10-sgRNA3.0和pGmU6-11-sgRNA3.0质粒DNA进行BstE II和Avr II双酶切，酶切方法同2.1pGmU6-10-sgRNA3.0BstEII和Xho I双酶切。酶切后琼脂糖电泳，电泳结果如图2中A所示，其中泳道M为DL2000，泳道1为pGmU6-2-sgRNA3.0载体酶切产物电泳，泳道2为pGmU6-8-sgRNA3.0载体酶切产物电泳，泳道3为pGmU6-10-sgRNA3.0载体酶切产物电泳，泳道4为pGmU6-11-sgRNA3.0载体酶切产物电泳，小片段为切掉的PDS基因，大片段为载体骨架。回收目的片段(即大片段的载体骨架)，回收方法同1.2pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物回收，获得不同的pGmU6-sgRNA3.0。

(2)将不同的pGmU6-sgRNA3.0分别与相对应的寡核苷酸(表3所示)进行同源重组，构建形成带有不同gDNA和不同GmU6启动子的载体pGmU6-2/8/10/11-gDNA1/2/3/4。将miR396-gDNA和不同的pGmU6-sgRNA3.0同源重组获得的载体分别命名为pmiR396-GmU6-2-gDNA3、pmiR396-GmU6-8-gDNA2、pmiR396-GmU6-10-gDNA1和pmiR396-GmU6-11-gDNA4，将GRF-gDNA和不同的pGmU6-sgRNA3.0同源重组获得的载体分别命名为pGRF-GmU6-2-gDNA3、pGRF-GmU6-8-gDNA2、pGRF-GmU6-10-gDNA1和pGRF-GmU6-11-gDNA4。同源重组方法同1.5pGmU6-10-sgRNA和PDS同源重组。

表3 pGmU6-sgRNA3.0与相对应的寡核苷酸

载体	miR396-gDNA	GRF-gDNA
			pGmU6-2-sgRNA3.0	miR396-gDNA3	GRF-gDNA3
pGmU6-8-sgRNA3.0	miR396-gDNA2	GRF-gDNA2
			pGmU6-10-sgRNA3.0	miR396-gDNA1	GRF-gDNA1
pGmU6-11-sgRNA3.0	miR396-gDNA4	GRF-gDNA4

(3)挑取克隆进行测序验证，测序正确的克隆进行质粒提取。提取方法同1.7pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取。

(4)将测序正确的质粒pmiR396-GmU6-2-gDNA3、pmiR396-GmU6-8-gDNA2和pmiR396-GmU6-11-gDNA4进行Xho I和BamH I双酶切，质粒pmiR396-GmU6-10-gDNA1进行SalI和BamH I双酶切(如构建下述pGRF-GmU6n-gDNAn，则将pGRF-GmU6-2-gDNA3、pGRF-GmU6-8-gDNA2和pGRF-GmU6-11-gDNA4进行Xho I和BamH I双酶切，pGRF-GmU6-10-gDNA1进行Sal I和BamH I双酶切)。Xho I和BamH I双酶切质粒回收短片段(GmU6-gDNA)，Sal I和BamH I双酶切质粒回收长片段(载体骨架)。酶切回收方法同1.1和1.2回收相应的片段。pGmU6-gDNA载体双酶切产物电泳结果见图2中的B，其中，泳道M为DL2000，泳道1为pmiR396-GmU6-10-gDNA1 BamH I和Sal I双酶切产物电泳，泳道2～4分别为pmiR396-GmU6-2-gDNA3、pmiR396-GmU6-8-gDNA2、pmiR396-GmU6-11-gDNA4载体BamHI和Xho I双酶切产物电泳。

随后将回收的DNA片段用T4连接酶连接，将两个GmU6-gDNA连接到一起。第一轮连接中，载体骨架为pmiR396-GmU6-10-gDNA1 Sal I和BamH I双酶切产物，GmU6-gDNA为pmiR396-GmU6-8-gDNA2 BamH I和Xho I双酶切产物，连接产物为pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)。

在PCR管中加入以下试剂：

22℃条件下，反应30min获得连接产物。

(5)连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞，转化方法同1.6转化和测序验证。

(6)阳性克隆进行测序，获得质粒pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)。质粒提取，质粒提取方法同1.7pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取。

(7)重复(4)-(6)进行第二轮连接，载体骨架为pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)Sal I和BamH I双酶切产物，GmU6-gDNA为pmiR396-GmU6-2-gDNA3 BamH I和Xho I双酶切产物，连接产物为pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)-(U6-2：gDNA3)。

重复(4)-(6)进行第三轮连接，载体骨架为pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)-(U6-2：gDNA3)Sal I和BamH I双酶切产物，GmU6-gDNA为pmiR396-GmU6-11-gDNA4BamH I和Xho I双酶切产物，连接产物为pmiR396-(U6-10：gDNA1)-(U6-8：gDNA2)-(U6-2：gDNA3)-(U6-11：gDNA4)(下述简称pmiR396-GmU6n-gDNAn)。

pmiR396-GmU6n-gDNAn为Gma-miR396 sgRNA串联表达载体，是将pGmU6-10-sgRNA3.0序列第717-1548位核苷酸替换为pmiR396 sgRNA核心序列获得的载体。pmiR396sgRNA核心序列的第1-74位为启动子U6-10(即大豆U6启动子)，第75-94位为miR396-gDNA1(即sgRNA靶序列识别区)，第95-180位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第198-517位为启动子U6-8(即大豆U6启动子)，第518-537位为miR396-gDNA2(即sgRNA靶序列识别区)，第538-621位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第639-897位为启动子U6-2(即大豆U6启动子)，第898-917位为miR396-gDNA3(即sgRNA靶序列识别区)，第918-1001位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第1019-1312位为启动子U6-11(即大豆U6启动子)，第1313-1342位为miR396-gDNA4(即sgRNA靶序列识别区)，第1343-1425位为Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区。pmiR396 sgRNA核心序列也可被称作4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件，其中，第1-180位为一个sgRNA表达盒，第198-621位为一个sgRNA表达盒，第639-1001位为一个sgRNA表达盒，第1019-1425位为一个sgRNA表达盒。

在连接过程中，将回收的DNA片段用T4连接酶连接，将两个GmU6-gDNA连接到一起。同时在载体两端引入了一对同尾酶Xho I和Sal I，利用同尾酶连接导致酶切位点的消失，重复上面的步骤后，将不同U6启动子驱动的sgRNA串联到一个载体上。

采用上述相同的方法制备pGRF-GmU6n-gDNAn。pGRF-GmU6n-gDNAn为Gma-GRFsgRNA串联表达载体，是将pGmU6-10-sgRNA3.0序列第717-1548位核苷酸替换为pGRF sgRNA核心序列获得的载体。pGRF sgRNA核心序列的第1-74位为启动子U6-10(即大豆U6启动子)，第75-94位为pGRF-gDNA1(即sgRNA靶序列识别区)，第95-180位为Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区，第198-517位为启动子U6-8(即大豆U6启动子)，第518-537位为pGRF-gDNA2(即sgRNA靶序列识别区)，第538-621位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第639-897位为启动子U6-2(即大豆U6启动子)，第898-917位为pGRF-gDNA3(即sgRNA靶序列识别区)，第918-1001位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区，第1019-1312位为启动子U6-11(即大豆U6启动子)，第1313-1342位为pGRF-gDNA4(即sgRNA靶序列识别区)，第1343-1425位为Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区。pGRF sgRNA核心序列也可被称作4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件，其中，第1-180位为一个sgRNA表达盒，第198-621位为一个sgRNA表达盒，第639-1001位为一个sgRNA表达盒，第1019-1425位为一个sgRNA表达盒。

4.3pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体构建

上述获得的串联表达载体和pCambia3301-Cas9表达载体分别进行EcoR I和HindIII双酶切，酶切方法同1.1的酶切方法。酶切后琼脂糖电泳，回收相关片段，其中串联表达载体回收短片段(GmU6n-gDNAn)，pCambia3301-Cas9表达载体回收载体骨架大片段，回收方法同1.2pGmU6-10-sgRNA2.0Bsa I酶切产物回收。两回收片段用T4 DNA连接酶进行连接获得连接产物，连接方法同4.2多个sgRNA串联表达载体构建的连接方法。连接产物转化至Transl-T1感受态细胞，挑取克隆进行测序，转化测序方法同1.6.转化和测序验证。测序正确的克隆进行质粒提取获得pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体，提取方法同1.7.pGmU6-10-sgRNA3.0质粒提取。pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体用EcoR I和Hind III双酶切验证连接是否成功。

结果见图2中的C，泳道M为1kb Ladder，泳道1为pCambia3301-Cas9载体用EcoR I和Hind III双酶切产物电泳，泳道2为pmiR396-GmU6n-gDNAn载体用EcoR I和Hind III双酶切产物电泳，泳道3为pCambia3301-Cas9-miR396-GmU6n-gDNAn载体电泳，泳道4为pCambia3301-Cas9-miR396-GmU6n-gDNAn载体用EcoR I和Hind III双酶切产物电泳，该载体用EcoR I和Hind III双酶切，产生载体骨架大片段和pmiR396-GmU6n-gDNAn小片段两条带，验证了pCambia3301-Cas9载体GmU6n-gDNAn的连入。

pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体结构示意如图3所示，LB：T-DNA左边界序列，GmU6：大豆GmU6启动子序列，gDNA：guide DNA序列，sgRNA scaffold：Cas9蛋白结合的引导序列(Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区)，CaMV35S：花椰菜花叶病毒35s启动子，NLS：核蛋白引导序列，Cas9：Cas9基因，NOS：胭脂碱合酶基因终止子。pCambia3301-Cas9-pmiR396-GmU6n-gDNAn载体是将pCambia3301-Cas9序列第13102-13157位核苷酸替换为pmiR396sgRNA核心序列获得的载体。pCambia3301-Cas9-pGRF-GmU6n-gDNAn载体是将pCambia3301-Cas9序列第13102-13157位核苷酸替换为pGRF sgRNA核心序列获得的载体。

实施例2、多靶位点Cas9载体应用

一、发根农杆菌转化

(1)取50μl K599感受态细胞中加入1μl质粒DNA(即上述制备的pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体)，冰浴5min；

(2)迅速转移到液氮中冷冻5min，37℃水浴孵育5min，再冰浴5min；

(3)加入500μl LB培养基(不含抗生素)，28℃，230rpm培养3小时；

(4)涂到LB固体培养基(含终浓度50mg/L Kan和50mg/L Str)中，28℃倒置培养48小时后可见农杆菌菌落长出，即为含有pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体的K599农杆菌。

二、大豆发状根诱导

(1)将大豆Williams 82播种于混合土中(含蛭石与营养土1∶1)，置于白天28℃，晚上20℃环境中生长；

(2)一周后大豆子叶刚展开时的幼苗用于农杆菌K599侵染。用1ml注射器挑取含有pCambia3301-Cas9-GmU6n-gDNAn载体的K599菌落，在大豆子叶节处扎孔侵染子叶节；

(3)为了保持侵染部位处于高湿环境，侵染过后用塑料杯罩住，暗培养24h后正常培养一周；

(4)将大豆转移至营养液中，待侵染部位长出发状根后(大约一周)剪去大豆主根和不在侵染位点生长的根，添加营养液；

(5)待从侵染位点长出的发状根长到4-5cm时取根提取DNA。

三、植物基因组DNA提取

(1)取新鲜发状根100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(2)加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。

(3)12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。

(4)加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15s。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)重复操作步骤6。

(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TB，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液(即植物基因组DNA)收集到离心管中。

四、突变位点检测

突变位点的检测方法包括被编辑靶基因的PCR产物直接测序，或PCR产物T7Endonuclease I酶切检测，以及单克隆测序。

PCR扩增目的基因GRF及miR396，扩增引物见表2。扩增方法同实施例1中的扩增方法。扩增条带单一的PCR产物可以直接测序，或PCR产物T7 Endonuclease I酶切检测。检测阳性的PCR产物或扩增条带不单一的PCR产物连接转化后挑取单克隆测序。

PCR产物T7酶切然后琼脂凝胶电泳检测：

T7酶切检测程序：

95℃条件下，反应5min，再用梯度PCR降温至室温。然后每个反应中加入0.5μl T7酶，37℃条件下，反应30min，用1.5％琼脂凝胶电泳检测。

PCR产物连接到pEASY-T1克隆载体上，PCR管中加入以下试剂：

25℃条件下，反应20min。连接产物Transl-T1感受态细胞，转化方法同实施例1转化方法。然后随机挑取单克隆测序

图4中的A为目的条带单一的PCR产物直接测序，黑色标识序列为gDNA，gDNA附近出现重叠峰，表明基因发生了突变，图4中的B为用T7 Endonuclease I酶切后电泳，泳道1-12代表不同单根DNA中扩增的GRF基因的酶切产物，没有突变目的条带单一，有突变的目的条带不单一(箭头标识)，泳道M为分子量marker，D2000。靶基因没有发生突变的酶切产物条带单一，发生突变的位点被T7 Endonuclease I识别并切割，酶切产物条带不单一。

在一条发状根中检测到miR396/GRF基因的PCR产物测序出现重叠峰，或PCR产物-T7Endonuclease I酶切产物条带不单一，说明在同一条发状根中同时有多个miR396/GRF基因发生突变。再将有突变的PCR产物连接T1载体，挑取单克隆测序鉴定突变类型。部分结果如图5所示，斜体为PAM位点，灰底部分为gDNA，WT表示野生型对照中基因序列，396n/GRFn表示发状根中miR396或GRF基因的突变序列，虚线表示缺失碱基，//表示省略碱基，括号内数据表示缺失突变碱基数量。结果发现一条发状根中存在多个miR396/GRF基因发生突变，miR396的突变发生在成熟序列附近，GRF突变发生在miR396靶位点附近，说明构建的大豆CRISPR-Cas9多基因编辑载体具有多基因编辑功能。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2981

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcgag aaaataaatg 420

gtaaaatgtc aaatcaaaac taggctgcag tatgcagagc agagtcatga tgatactact 480

tactacaccg attcttgtgt gcagaaaaat atgttaaaat aattgaatct ttctctagcc 540

aaatttgaca acaatgtaca ccgttcatat tgagagacga tgcttcttgt ttgctttcgg 600

tggaagctgc atatactcaa cattactcct tcagcgagtt ttccaactga gtcccacatt 660

gcccagacct aacacggtat tcttgtttat aatgaaatgt gccaccacat ggattgagag 720

accaaggtct cagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 780

acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttttgagc tcggatcgtc gactctagat 840

tcgcggatcc tcgactgcag aggcctgcat gcaagcttgg tgtaatcatg gtcatagctg 900

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 960

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 1020

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 1080

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 1140

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 1200

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 1260

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 1320

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 1380

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 1440

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 1500

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 1560

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 1620

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 1680

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 1740

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 1800

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 1860

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 1920

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 1980

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaagcc caatctgaat aatgttacaa 2040

ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 2100

catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 2160

ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 2220

tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 2280

atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca 2340

gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 2400

gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca 2460

attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 2520

ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gtttttccgg ggatcgcagt 2580

ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 2640

aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 2700

tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaagc gatagattgt 2760

cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 2820

gttggaattt aatcgcggcc tcgacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt 2880

attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc 2940

aatgtaacat cagagatttt gagacacggg ccagagctgc a 2981

<210> 2

<211> 3797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcgag aaaataaatg 420

gtaaaatgtc aaatcaaaac taggctgcag tatgcagagc agagtcatga tgatactact 480

tactacaccg attcttgtgt gcagaaaaat atgttaaaat aattgaatct ttctctagcc 540

aaatttgaca acaatgtaca ccgttcatat tgagagacga tgcttcttgt ttgctttcgg 600

tggaagctgc atatactcaa cattactcct tcagcgagtt ttccaactga gtcccacatt 660

gcccagacct aacacggtat tcttgtttat aatgaaatgt gccaccacat ggattggtga 720

ccgcgcacaa ccctttccag tttctaggct taatgtgaat caaatataga gtagtttact 780

ggaagatatc ttttggatat atattttgtt aagttgttat tgtgttctct ggttcttagg 840

ttaggttctt gtttgttccg ttttaacaat ttacctatct tattggagag cgatatttat 900

gatgtgatat ttgtcttcct ccagatagct gcatggaagg atgaagatgg ggactggtat 960

gagactggtt tacatatttt ctgtaagtcc aaaactcata ccctctctgt tgctccccca 1020

atatatttgt tacatatatc ttatcagctc taccatcaat ttgaagaaag ttgcaaaaca 1080

ctggttaaat tatattgtat cttgttttcc ctgttattac ttttcgttac tgatactctc 1140

ttcatgttct tgttggaagt cggtgcttat ccgaatgtgc agaatttatt tggagaactt 1200

gggatcaatg atcggttgca gtggaaggaa cactccatga tttttgctat gccaagtaaa 1260

cctggagaat ttagtagatt tgacttccca gatgtcctac cagcaccctt aaatggtgag 1320

agaataaact tatcgcatat tcttacttgc tagtcagctg ttataatatt actgcttcaa 1380

gtaattaaac ttttaaacta tctgatgaaa acagtggttg aactattagt tagtggcgcc 1440

atgtatttgg tttgataaaa ttggattaat gtgcacacac ttgttgaatg taaaacaaag 1500

tatgatgtaa ttgagtaaaa aagtgaggtt agtaactatg atgccatggt tttagagcta 1560

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1620

gtgctttttt ttgagctcgg atcgtcgact ctagattcgc ggatcctcga ctgcagaggc 1680

ctgcatgcaa gcttggtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 1740

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 1800

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 1860

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 1920

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 1980

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2040

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2100

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2160

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2220

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2280

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2340

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2400

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2460

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2520

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2580

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2640

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 2700

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 2760

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 2820

agttttaaat caagcccaat ctgaataatg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa 2880

aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata 2940

tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat 3000

ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa 3060

tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc 3120

cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt 3180

acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg 3240

agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa 3300

ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc 3360

taatacctgg aatgctgttt ttccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg 3420

agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct 3480

gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc 3540

tggcgcatcg ggcttcccat acaagcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc 3600

gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga 3660

cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag 3720

ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga 3780

cacgggccag agctgca 3797

<210> 3

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagctcgaga ttcgagctcg agtccaatat gccctggtgt tactgaccaa aaccagaaaa 60

aagaaacgga agtcatatac gtctaaacgg agaaatttca aagaacaaaa attggatcat 120

ttctcgattt gtgggtgtca tcttgtgcag ggcatgctaa tcttctcttt accctttccc 180

acaagactca gcgcatgttg tctcgtctca tccaagtccc acaccgccta aacttaacac 240

aatattagta tttataatga catacaacat tcaagatgtt g 281

<210> 4

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagctcgaga ttcgagctcg agtcagacaa gctagaataa agttgcaaag aaatgacagg 60

gctacaaaag gctcacctac ttctggattt accaaacttc tgtttgtccc catactccaa 120

aaacaaaacc attttttttt atcttcgttt ttgtttgctt tgactgtgag ttgaggccca 180

actttctgct tctgtccgac tctatttgat gaattttgtt tgcctcctgt gatgtggagg 240

atgtatcatt gaaagggaac gtgtctcaat gatcccacat cggccaaata tgctcattac 300

attgcgttta tatagtccca ggaaaacata tggattg 337

<210> 5

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctcgaga tggtctatga ggtggtggtt cattcaacat atagcaccta ttcattgttc 60

ctaaaacata atttaagaac aaaaacttaa acttaaataa taataataaa agagtacatc 120

gaagtatctg tgttctctat ccttctgact aacattcatg ttgtttgtat tcagcaaagg 180

gccgtgcagg atttgtgcgt cgcgctccgg ttagttattg cagtgaccgt ctctttagtc 240

ccacatcgag taattatgct tcatacagtc tgtttatata acagagatgg aacaaactgg 300

ttg 303

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagaagttc aagaaagctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgcagttc aagaaagctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacacagttc aagaaagctg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catgcagttc aagaaaactg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gttccacagg ctttcttgaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccacaggctt tcttgaacga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccgttca agaaagcctg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaatcgttca agaaagcctg 20

<210> 14

<211> 1486

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccagctgagt cccagcattg cccagacctt aacacgtact ctgtttataa tgaaatgtgc 60

caccacatgg attgtaagaa gttcaagaaa gctggtttta gagctagaaa tagcaagtta 120

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtt gctttttttt 180

gagctcggat cgtcgagagc tcaagacaag ctagaataaa gttgcaaaga aatgacaggg 240

ctacaaaagg ctcacgtact tctggattta ccaaacttct gtttgtcccc atactccaaa 300

aacaaaaccc attttttttt atcttcgttt ttgtttgctt tgactgtgag ttgaggccca 360

actttctgct tctgtccgac tctatttgat gaattttgtt tgcctcctgt gatgtggagg 420

atgtatcatt gaaagggaac gtgtctcaat gatcccacat cggccaaata tgctcattac 480

attgcgttta tatagtccca ggaaaacata tggattggat gcagttcaag aaagctggtt 540

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 600

accgagtcgg tgcttttttt tgagctcgga tcgtcgagtc caatatgccc tggtgttact 660

gaccaaaacc agaaaaaaga aacggaagtc atatacgtct aaacggagaa atttcaaaga 720

acaaaaattg gatcatttct cgatttgtgg gtgtcatctt gtgcagggca tgctaatctt 780

ctctttaccc tttcccacaa gactcagcgc atgttgtctc gtctcatcca agtcccacac 840

cgcctaaact taacacaata ttagtattta taatgacata caacattcaa gatgttgaac 900

acagttcaag aaagctggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 960

tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt tgagctcgga tcgtcgagat 1020

ggtctatgag gtggtggttc attcaacata tagcacctat tcattgttcc taaaacataa 1080

tttaagaaca aaaacttaaa cttaaataat aataataaaa gagtacatcg aagtatctgt 1140

gttctctatc cttctgacta acattcatgt tgtttgtatt cagcaaaggg ccgtgcagga 1200

tttgtgcgtc gcgctccggt tagttattgc agtgaccgtc tctttagtcc cacatcgagt 1260

aattatgctt catacagtct gtttatataa cagagatgga acaaactggt tgcatgcagt 1320

tcaagaaaac tggttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 1380

acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttttttg gatcctcgac tgcagaggcc 1440

tgcatgcaag cttggtgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtg 1486

<210> 15

<211> 1477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccagctgagt cccagcattg cccagacctt aacacgtact ctgtttataa tgaaatgtgc 60

caccacatgg attggttcca caggctttct tgaagtttta gagctagaaa tagcaagtta 120

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtt gctttttttt 180

gagctcggat cgtcgagagc tcaagacaag ctagaataaa gttgcaaaga aatgacaggg 240

ctacaaaagg ctcacgtact tctggattta ccaaacttct gtttgtcccc atactccaaa 300

aacaaaaccc attttttttt atcttcgttt ttgtttgctt tgactgtgag ttgaggccca 360

actttctgct tctgtccgac tctatttgat gaattttgtt tgcctcctgt gatgtggagg 420

atgtatcatt gaaagggaac gtgtctcaat gatcccacat cggccaaata tgctcattac 480

attgcgttta tatagtccca ggaaaacata tggattgcca caggctttct tgaacgagtt 540

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 600

accgagtcgg tgcttttttt tgagctcgga tcgtcgagtc caatatgccc tggtgttact 660

gaccaaaacc agaaaaaaga aacggaagtc atatacgtct aaacggagaa atttcaaaga 720

acaaaaattg gatcatttct cgatttgtgg gtgtcatctt gtgcagggca tgctaatctt 780

ctctttaccc tttcccacaa gactcagcgc atgttgtctc gtctcatcca agtcccacac 840

cgcctaaact taacacaata ttagtattta taatgacata caacattcaa gatgttgaaa 900

ccgttcaaga aagcctggtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 960

tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt tgagctcgga tcgtcgagat 1020

ggtctatgag gtggtggttc attcaacata tagcacctat tcattgttcc taaaacataa 1080

tttaagaaca aaaacttaaa cttaaataat aataataaaa gagtacatcg aagtatctgt 1140

gttctctatc cttctgacta acattcatgt tgtttgtatt cagcaaaggg ccgtgcagga 1200

tttgtgcgtc gcgctccggt tagttattgc agtgaccgtc tctttagtcc cacatcgagt 1260

aattatgctt catacagtct gtttatataa cagagatgga acaaactggt tggaatcgtt 1320

caagaaagcc tggttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 1380

acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttttcga ctgcagaggc ctgcatgcaa 1440

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<210> 16

<211> 13915

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggccccaa agaagaagcg caaggtcgac aagaagtact ccatcggcct cgacatcggc 60

accaattctg ttggctgggc cgtgatcacc gacgagtaca aggtgccgtc caagaagttc 120

aaggtcctcg gcaacaccga ccgccactcc atcaagaaga atctcatcgg cgccctgctg 180

ttcgactctg gcgagacagc cgaggctaca aggctcaaga ggaccgctag acgcaggtac 240

accaggcgca agaaccgcat ctgctacctc caagagatct tctccaacga gatggccaag 300

gtggacgaca gcttcttcca caggctcgag gagagcttcc tcgtcgagga ggacaagaag 360

cacgagcgcc atccgatctt cggcaacatc gtggatgagg tggcctacca cgagaagtac 420

ccgaccatct accacctccg caagaagctc gtcgactcca ccgataaggc cgacctcagg 480

ctcatctacc tcgccctcgc ccacatgatc aagttcaggg gccacttcct catcgagggc 540

gacctcaacc cggacaactc cgatgtggac aagctgttca tccagctcgt gcagacctac 600

aaccagctgt tcgaggagaa cccgatcaac gcctctggcg ttgacgccaa ggctattctc 660

tctgccaggc tctctaagtc ccgcaggctc gagaatctga tcgcccaact tccgggcgag 720

aagaagaatg gcctcttcgg caacctgatc gccctctctc ttggcctcac cccgaacttc 780

aagtccaact tcgacctcgc cgaggacgcc aagctccagc tttccaagga cacctacgac 840

gacgacctcg acaatctcct cgcccagatt ggcgatcagt acgccgatct gttcctcgcc 900

gccaagaatc tctccgacgc catcctcctc agcgacatcc tcagggtgaa caccgagatc 960

accaaggccc cactctccgc ctccatgatc aagaggtacg acgagcacca ccaggacctc 1020

acactcctca aggccctcgt gagacagcag ctcccagaga agtacaagga gatcttcttc 1080

gaccagtcca agaacggcta cgccggctac atcgatggcg gcgcttctca agaggagttc 1140

tacaagttca tcaagccgat cctcgagaag atggacggca ccgaggagct gctcgtgaag 1200

ctcaatagag aggacctcct ccgcaagcag cgcaccttcg ataatggctc catcccgcac 1260

cagatccacc tcggcgagct tcatgctatc ctccgcaggc aagaggactt ctacccgttc 1320

ctcaaggaca accgcgagaa gattgagaag atcctcacct tccgcatccc gtactacgtg 1380

ggcccgctcg ccaggggcaa ctccaggttc gcctggatga ccagaaagtc cgaggagaca 1440

atcaccccct ggaacttcga ggaggtggtg gataagggcg cctctgccca gtctttcatc 1500

gagcgcatga ccaacttcga caagaacctc ccgaacgaga aggtgctccc gaagcactca 1560

ctcctctacg agtacttcac cgtgtacaac gagctgacca aggtgaagta cgtgaccgag 1620

gggatgagga agccagcttt ccttagcggc gagcaaaaga aggccatcgt cgacctgctg 1680

ttcaagacca accgcaaggt gaccgtgaag cagctcaagg aggactactt caagaaaatc 1740

gagtgcttcg actccgtcga gatctccggc gtcgaggata ggttcaatgc ctccctcggg 1800

acctaccacg acctcctcaa gattatcaag gacaaggact tcctcgacaa cgaggagaac 1860

gaggacatcc tcgaggacat cgtgctcacc ctcaccctct tcgaggaccg cgagatgatc 1920

gaggagcgcc tcaagacata cgcccacctc ttcgacgaca aggtgatgaa gcagctgaag 1980

cgcaggcgct ataccggctg gggcaggctc tctaggaagc tcatcaacgg catccgcgac 2040

aagcagtccg gcaagacgat cctcgacttc ctcaagtccg acggcttcgc caaccgcaac 2100

ttcatgcagc tcatccacga cgactccctc accttcaagg aggacatcca aaaggcccag 2160

gtgtccggcc aaggcgattc cctccatgag catatcgcca atctcgccgg ctccccggct 2220

atcaagaagg gcattctcca gaccgtgaag gtggtggacg agctggtgaa ggtgatgggc 2280

aggcacaagc cagagaacat cgtgatcgag atggcccgcg agaaccagac cacacagaag 2340

ggccaaaaga actcccgcga gcgcatgaag aggatcgagg agggcattaa ggagctgggc 2400

tcccagatcc tcaaggagca cccagtcgag aacacccagc tccagaacga gaagctctac 2460

ctctactacc tccagaacgg ccgcgacatg tacgtggacc aagagctgga catcaaccgc 2520

ctctccgact acgacgtgga ccatattgtg ccgcagtcct tcctgaagga cgactccatc 2580

gacaacaagg tgctcacccg ctccgacaag aacaggggca agtccgataa cgtgccgtcc 2640

gaagaggtcg tcaagaagat gaagaactac tggcgccagc tcctcaacgc caagctcatc 2700

acccagagga agttcgacaa cctcaccaag gccgagagag gcggcctttc cgagcttgat 2760

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cagatcctcg actcccgcat gaacaccaag tacgacgaga acgacaagct catccgcgag 2880

gtgaaggtca tcaccctcaa gtccaagctc gtgtccgact tccgcaagga cttccagttc 2940

tacaaggtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct caatgccgtg 3000

gtgggcacag ccctcatcaa gaagtaccca aagctcgagt ccgagttcgt gtacggcgac 3060

tacaaggtgt acgacgtgcg caagatgatc gccaagtccg agcaagagat cggcaaggcg 3120

accgccaagt acttcttcta ctccaacatc atgaatttct tcaagaccga gatcacgctc 3180

gccaacggcg agattaggaa gaggccgctc atcgagacaa acggcgagac aggcgagatc 3240

gtgtgggaca agggcaggga tttcgccaca gtgcgcaagg tgctctccat gccgcaagtg 3300

aacatcgtga agaagaccga ggttcagacc ggcggcttct ccaaggagtc catcctccca 3360

aagcgcaact ccgacaagct gatcgcccgc aagaaggact gggacccgaa gaagtatggc 3420

ggcttcgatt ctccgaccgt ggcctactct gtgctcgtgg ttgccaaggt cgagaagggc 3480

aagagcaaga agctcaagtc cgtcamagga gctgctgggc atcacgatca tggagcgcag 3540

cagcttcgag aagaacccaa tcgacttcct cgaggccaag ggctacaagg aggtgaagaa 3600

ggacctcatc atcaagctcc cgaagtacag cctcttcgag cttgagaacg gccgcaagag 3660

aatgctcgcc tctgctggcg agcttcagaa gggcaacgag cttgctctcc cgtccaagta 3720

cgtgaacttc ctctacctcg cctcccacta cgagaagctc aagggctccc cagaggacaa 3780

cgagcaaaag cagctgttcg tcgagcagca caagcactac ctcgacgaga tcatcgagca 3840

gatctccgag ttctccaagc gcgtgatcct cgccgatgcc aacctcgata aggtgctcag 3900

cgcctacaac aagcaccgcg ataagccaat tcgcgagcag gccgagaaca tcatccacct 3960

cttcaccctc accaacctcg gcgctccagc cgccttcaag tacttcgaca ccaccatcga 4020

ccgcaagcgc tacacctcta ccaaggaggt tctcgacgcc accctcatcc accagtctat 4080

cacaggcctc tacgagacac gcatcgacct ctcacaactc ggcggcgatt gacagctcga 4140

atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 4200

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 4260

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 4320

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 4380

tgtcatctat gttactagat cgggaattaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg 4440

ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa 4500

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agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag 4620

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cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac 4740

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accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc 5160

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gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg 5280

gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa 5340

gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc 5400

gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg 5460

acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg 5520

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gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 6300

tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 6360

atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 6420

agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 6480

acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 6540

atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 6600

ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 6660

cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 6720

aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 6780

aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 6840

gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 6900

aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 6960

gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 7020

gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 7080

gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 7140

tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 7200

ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 7260

accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 7320

acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 7380

cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 7440

gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 7500

gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 7560

tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 7620

ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 7680

gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 7740

gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 7800

aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 7860

catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 7920

aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 7980

ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 8040

tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 8100

ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 8160

aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 8220

gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 8280

cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 8340

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 8400

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 8460

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 8520

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 8580

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 8640

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 8700

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 8760

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 8820

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 8880

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 8940

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 9000

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 9060

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 9120

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 9180

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 9240

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 9300

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 9360

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 9420

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg cattctaggt 9480

actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc 9540

ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc 9600

ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa 9660

agccacttac tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa 9720

agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt 9780

taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta 9840

agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt 9900

cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt 9960

gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc 10020

tccagccatc atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc 10080

atagcatcat gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg 10140

tcatttttaa atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca 10200

ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata 10260

ttctcatttt agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca 10320

agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa 10380

ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac 10440

ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca 10500

acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt 10560

ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg 10620

ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg 10680

gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga 10740

caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg 10800

gggatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag 10860

tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac 10920

cctataggaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc 10980

gagcttgtcg atcgacagat ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt 11040

gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc 11100

cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc 11160

gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata 11220

gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc 11280

cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca 11340

gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat 11400

gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac 11460

gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc 11520

gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc 11580

aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg 11640

gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac 11700

cggttgtaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc 11760

acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg 11820

aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc 11880

ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg 11940

agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag 12000

aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccggg 12060

atctgcgaaa gctcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc 12120

tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg 12180

tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt 12240

tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact 12300

gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt 12360

gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc 12420

gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga 12480

gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca 12540

tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt 12600

gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc 12660

tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa 12720

gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa 12780

agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag 12840

agtgtcgtgc tccaccatgt tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc 12900

gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 12960

agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 13020

tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 13080

aacagctatg accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac 13140

ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 13200

tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 13260

cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta 13320

gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttagct tcatggagtc 13380

aaagattcaa atagaggacc taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca 13440

gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac 13500

acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac 13560

ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca 13620

ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa 13680

aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc 13740

cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg 13800

atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc 13860

ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagagaaca cgggggactc ttgac 13915

Claims (10)

1.一种大豆多基因编辑表达载体，其特征在于，包括至少2个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；

每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区；

每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒中的sgRNA靶序列识别区对应不同靶基因；

每个所述sgRNA表达盒中的大豆U6启动子不同。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述大豆U6启动子为GmU6-2、GmU6-8、GmU6-10和GmU6-11中任一种。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：

所述Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区编码序列为SEQ ID No.2的第1548-1624位所示。

4.根据权利要求1-3任一所述的载体，其特征在于：

所述大豆多基因编辑表达载体包括4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；

所述4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件为如下四种表达盒任意组合方式串联形成：

1)包括大豆U6启动子GmU6-2、sgRNA靶序列识别区A和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区的sgRNA表达盒；

2)包括大豆U6启动子GmU6-8、sgRNA靶序列识别区B和Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区的sgRNA表达盒；

3)包括大豆U6启动子GmU6-10、sgRNA靶序列识别区C和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；

4)包括大豆U6启动子GmU6-11、sgRNA靶序列识别区D和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；

所述sgRNA靶序列识别区A、B、C和D分别结合不同靶基因。

5.根据权利要求1-4任一所述的载体，其特征在于：

所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列包括SEQ ID No.14或SEQ ID No.15所示序列。

6.一种制备权利要求1-5任一所述载体的方法，其特征在于：包括采用同尾酶将权利要求1-5任一所述载体中不同大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒进行串联，得到所述载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)制备表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组，所述载体组由多个表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组成，所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体依次包括限制性内切酶A酶切识别位点、大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒和限制性内切酶B酶切识别位点，所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区、Cas9蛋白结合的sgRNA scaffold区和限制性内切酶C酶切识别位点，所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶C为同尾酶；

2)用限制性内切酶A和限制性内切酶B对所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体分别酶切，收集不同的大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒；

3)用限制性内切酶B和限制性内切酶C对1个所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体酶切，收集载体骨架，再2)获得的1个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒与所述载体骨架连接，得到连接2个表达盒的载体，即为目的载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)后还包括：

4)用限制性内切酶B和限制性内切酶C对所述连接后的载体酶切，收集连接2个表达盒的载体骨架，再将2)获得的另一个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒与所述连接2个表达盒的载体骨架连接，得到连接3个表达盒的载体；

依次类推，直到获得连接多个表达盒的载体，即为目的载体。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述同尾酶为Xho I和Sal I。

10.权利要求1-5任一所述的大豆多基因编辑表达载体在基因编辑或制备基因编辑产品中的应用。

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