CN113564197A - 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 - Google Patents
一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113564197A CN113564197A CN202110773909.0A CN202110773909A CN113564197A CN 113564197 A CN113564197 A CN 113564197A CN 202110773909 A CN202110773909 A CN 202110773909A CN 113564197 A CN113564197 A CN 113564197A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ptg
- pmk
- vector
- pmmk
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 23
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims description 12
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 101100083742 Caenorhabditis elegans pmk-1 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 13
- 101100083746 Caenorhabditis elegans pmk-3 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 101100083745 Caenorhabditis elegans pmk-2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 3
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 24
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 abstract description 10
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 101150051546 LEA gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101710148428 Late embryogenesis abundant protein, group 3 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 101100235066 Arabidopsis thaliana LEA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- -1 LEA4 Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101100020734 Arabidopsis thaliana LEA6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100020735 Arabidopsis thaliana LEA7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100532514 Arabidopsis thaliana SAG21 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100020732 Citrus sinensis LEA5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000639792 Homo sapiens U2 small nuclear ribonucleoprotein A' Proteins 0.000 description 1
- 101710175541 Late embryogenesis abundant protein 19 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100235057 Oryza sativa subsp. japonica LEA17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001004658 Oryza sativa subsp. japonica Late embryogenesis abundant protein 17 Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 101000929856 Raphanus sativus Late embryogenesis abundant protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100034465 U2 small nuclear ribonucleoprotein A' Human genes 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种构建简便、高效的植物多基因编辑载体方法，其包括pMK‑(1‑12)中间载体及终载体pMMK‑Cas9。载体构建的方法包括以下步骤：将多个sgRNA通过多顺反子tRNA‑gRNA方式连接到pMK(1‑12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1‑8个sgRNAs，得到pMK(1‑12)‑PTG载体；将多个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK‑Cas9载体上，pMMK‑Cas9可以连接2个到7个pMK(1‑12)‑PTG载体上的U6/U3表达盒，得到pMMK‑PTG载体，根据不同的靶位点和小载体组合，可达到2‑56个靶位点的多基因编辑。整个流程只需要一次PCR反应和两次“金门”连接体系即可完成，流程简单快速。本发明还以该载体敲除水稻LEA基因家族25个成员为例，验证该载体多基因编辑的高效性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物高效快速的多基因编辑载体及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑技术，具有构建简便、标记效率高的特点，因此被广泛用于基因编辑研究。CRISP/Cas9主要包括两个核心元件：Cas表达盒和sgRNA表达盒，Cas表达盒由RNA聚合酶II等强启动子(Ubi、35S等)和NOS等终止子组成；sgRNA表达盒则由RNA聚合酶III启动子(U6或U3等)驱动，连续6个以上多聚碱基T终止。在研究中往往需要同时对多个基因进行基因编辑，在动物中进行多基因编辑只需要将多个sgRNA表达盒的质粒进行共转染即可获得多基因编辑材料，而在植物中一般需要将Cas9表达盒、sgRNA表达盒以及筛选标记共同装配到一个载体中，通过农杆菌介导的稳定遗传转化，实现多基因定点编辑。
目前最常用植物多基因编辑系统主要分为两类：一类为多转录元件系统(multi-component transcriptional unit system,MCTU)，即将多个sgRNA表达盒装配到一个载体上，这类系统的构建一般是通过多次不同的酶切连接将多个的sgRNA表达盒依次构建到载体上，这种构建过程费时费力，且由于工程化的植物内源U6、U3启动子数目有限，过度重复启动子会影响多基因编辑效率，一般MCTU系统的靶位点不超过8个；另一类被称为双转录元件系统(two-component transcriptional unit system,TCTU)，这类系统中sgRNA表达盒是将多个sgRNA通过RNA自剪切元件，如核酶、tRNA前体和Csy4等串联在一起，成为同一个转录单元，并通过RNA剪切方式将多个sgRNA分离释放。这类系统的构建利用“金门”克隆方法，通过IIS型限制性内切酶，如BsaI、Esp3 I、BbsI、AarI产生的非回文粘性末端，同时将多个DNA片段连接在一起。由于“金门”克隆方法的限制，随着DNA片段数的增多构建变得越来困难，一般一个转录单元连接的sgRNAs不超过8个，且由于启动子活性的影响，随着转录单元长度的增加会导致远离启动子的sgRNAs转录水平下降，从而影响编辑效率。
发明内容
基于以上多基因编辑存在的构建过程复杂、编辑位点数目有限的缺点，本发明提供了一种用于植物的高效快速多基因编辑载体及其构建方法，可实现对植物基因组2-56个位点进行同时编辑。该多基因编辑载体结合了MCTU和TCTU的特点，构建方法简单、快速。同时，本发明将提供的多基因编辑载体用于靶向水稻胚胎后期丰富蛋白LEA家族的25个成员，并成功获得23个位点被编辑的突变植株，说明该系统对多个位点的编辑效率高。
本发明的第一个目的是提供一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将多个sgRNA通过多顺反子tRNA-gRNA方式连接到pMK-(1-12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1个到多个sgRNAs，得到pMK(1-12)-PTG载体；
(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK-Cas9载体上，pMMK-Cas9连接2个到7个pMK(1-12)-PTG载体上U6/U3表达盒，得到pMMK-PTG载体。
进一步地，所述pMK(1-12)是一套12个用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的中间载体，其中pMK1、pMK10、pMK11各含有一个OsU6表达盒，OsU6表达盒核苷酸序列如SEQID NO.1所示；pMK2、pMK3、pMK8、pMK9各含有一个OsU3表达盒，OsU3表达盒核苷酸序列如SEQID NO.2所示；pMK4、pMK5各含有一个OsU6a表达盒，OsU6a表达盒核苷酸序列如SEQID NO.3所示；pMK6、pMK7、pMK12各含有一个OsU6b表达盒，OsU6b核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，将sgRNA构建到pMK(1-12)中间载体上，包括以下步骤：
(A)根据基因靶位点序列，通过CRISPR-GE网站在线设计靶序列，合成引物，引物以pGTR(Xie et al.ProcNatlAcadSciUSA,2015,112:3570-3575)为模板扩增出带有不同靶标序列的tRNA-gRNA单元；
所述根据靶序列合成的引物序列特征如下所示：
gRNA[x]-F(SEQ ID NO.5)：
gRNA[x]-R(SEQ ID NO.6)：
扩增方式如图1所示，以上引物以pGTR为模板扩增出带有不同靶标序列的tRNA-gRNA单元，得到的tRNA-gRNA单元序列如下所示：
TAGGTCTCCN9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAN1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12 TGAGACCCG。(SEQ ID NO.7)
所述N1-N20分别表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。
(B)设计带有II型限制酶切位点的扩增引物：PTG pMK(1-12)F和PTG CRISPR R，与步骤(1)同时进行扩增反应，用于将tRNA-gRNA串联元件连接在对应的pMK(1-12)小载体上；
所述的II型限制性内切酶包括(BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI)；
优选的，使用的II型限制性内切酶酶切位点为BsaI；
步骤(2)所述的扩增引物如下：
PTG pMK1/10/11F(SEQ ID NO.8)：
GTACGGGTCTCATGTGGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK2/3/8/9F(SEQ ID NO.9)：
GTACGGGTCTCATGGCAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK 4/5F(SEQ ID NO.10)：
GTACGGGTCTCATGCCGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK6/7/12F(SEQ ID NO.11)：
GTACGGGTCTCATGTTGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG CRISPR R(SEQ ID NO.12)：
GACTAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG；
所述PTG pMK(1-12)F和PTG CRISPR R引物带有与对应pMK(1-12)中间载体酶切位点反向互补序列的接头；
(C)将步骤(1)和步骤(2)扩增获得的tRNA-gRNA单元及接头通过IIS型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆的方法连接到对应的pMK(1-12)中间载体上，得到含有多顺反子tRNA-sgRNA的pMK(1-12)-PTG载体。
优选地，每个U6或U3表达盒只转录8个以内的sgRNA的转录子以防止转录水平下降。
进一步地，多片段连接方法使用的II型限制性内切酶包括(BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI)。
优选的，II型限制型内切酶使用的是BsaI。
(D)获得的pMK(1-12)-PTG载体通过通用引物M13F(SEQ ID NO.13)和M13R(SEQ IDNO.14)进行菌落PCR鉴定，通过扩增条带大小确认阳性克隆中插入的sgRNA数目，再通过Sanger测序进一步鉴定插入sgRNA类型。菌落PCR条带大小为504bp+163*n，其中，n＝插入sgRNA数目。
进一步地，步骤(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上U6/3表达盒连接到pMMK-Cas9载体，pMK(1-12)中间载体的连接顺序为：
连接2个U6/U3时，pMK 1+pMK 2连接到pMMK-Cas9；
连接3个U6/U3时，pMK 1+pMK 3+pMK 4连接到pMMK-Cas9；
连接4个U6/U3时，pMK 1+pMK 3+pMK5+pMK6连接到pMMK-Cas9；
连接5个U6/U3时，pMK1+pMK3+pMK5+pMK7+pMK8连接到pMMK-Cas9；
连接6个U6/U3时，pMK1+pMK 3+pMK5+pMK7+pMK 9+pMK 10连接到pMMK-Cas9；
连接7个U6/U3时，pMK1+pMK3+pMK5+pMK7+pMK9+pMK11+pMK12连接到pMMK-Cas9。
如附图2所示，是上述多个pMK(1-12)-PTG载体上U6/3表达盒连接到pMMK-Cas9载体的连接示意图。
进一步地，多个pMK(1-12)中间载体连接pMMK-Cas9方法使用II型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将步骤(1)中获得的多个pMK(1-12)中间载体上的U6/3表达盒连接在pMMK-Cas9载体上；
所述II型限制性内切酶包括(BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI)；优选地，使用的II型限制性内切酶酶切位点为AarI。
更进一步，获得的质粒通过Sanger测序验证。
本发明提供利用上述构建方法获得的若干个sgRNA串联表达的载体。
本发明还提供了上述构建方法得到的工具载体或成套工具载体。
本发明还提供了一种试剂盒，含有上述引物及工具载体或成套工具载体。
本发明还提供了上述的工具载体或成套工具载体在CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑系统中的应用。所述植物为双子叶植物和/或单子叶植物。进一步优选的，所述植物为水稻。
本发明的核心在于，利用常见载体及通用序列，高效、快速构建2-56个由不同启动子启动的sgRNA，同时靶向不同的目的基因片段，实现高效特异的多基因编辑；同时，该构建方法快捷、灵活，可根据需要构建不同数量的sgRNA,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为tRNA-gRNA单元序列示意图。
图2中A为pMK(1-12)中间载体和pMMK载体示意图，B为pMK(1-12)中间载体连接顺序示意图。
图3中A为OsLEA24敲中间载体pMK(1-12)-PTG组装策略示意图；B为OsLEA24敲中间载体连接到pMMK-Cas9组装策略示意图。
图4中A为OsLEA24敲鉴定所用引物示意图；B为OsLEA24敲载体图谱示意图；C为OsLEA24敲阳性克隆鉴定示意图。
图5中A为水稻LEA基因家族每个位点基因编辑效率及突变类型示意图；B为水稻LEA1、LEA2、LEA4、LEA5、LEA6、LEA7的具体突变情况示意图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施案例，将该多基因编辑载体用于靶向水稻胚胎后期丰富蛋白LEA家族的25个成员，并成功获得23个位点被编辑的突变植株，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明,均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种将多个sgRNA快速构建到pMK(1-12)载体构建方法，包括如下步骤：
(1)获取OsLEA1、OsLEA2、OsLEA4、OsLEA5、OsLEA6、OsLEA7、OsLEA9、OsLEA10、OsLEA11、OsLEA13、OsLEA15、OsLEA17、OsLEA18、OsLEA19、OsLEA20、OsLEA21、OsLEA22、OsLEA23、OsLEA24、OsLEA27/28、OsLEA30、OsLEA31、OsLEA33、OsLEA34基因的序列信息。根据数据库CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)设计目的基因的靶位点。
设计靶位点要避免核心区域(9-20)脱靶(2)GC含量在40-70％(3)不能含有GGTCTC序列(4)避免设计的接头重复。设计的靶位点、引物名称及序列见下表1。
(2)以pGTR(Xie et al.ProcNatlAcadSciUSA,2015,112:3570-3575)质粒为模板，用设计的引物通过金牌mix DNA聚合酶(北京擎科生物技术有限公司)扩增克隆含有靶位点、tRNA和guide RNA的序列。各个目的条带命名、扩增程序详见下表3和表4。
目的条带扩增扩增完成之后进行凝胶电泳检测，检测条带大小正确后剩余样品直接过柱回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化目的片段，将多个DNA片段按照一定顺序用金门组装法连接，DNA片段用II型限制性内切酶BsaI(NEB公司)和T4 DNA连接酶(NEB公司)进行酶切-连接循环反应连接到pMK中间载体中，连接反应体系详见表5。
(3)取10uL反应液转化大肠杆菌感受态DH5a(上海唯地生物技术有限公司)，采用羧苄青霉素抗性平板筛选。挑取抗性菌落后利用PCR进行阳性克隆检测，检测引物的序列见表1，鉴定的PCR反应程序详见表6。
(4)PCR扩增完成后，进行凝胶电泳检测，阳性菌落的PCR扩增片段大小需考虑靶点数，带有4个sgRNA扩增片段大小约为1100bp。
对测序结果正确的阳性克隆菌液进行质粒抽提，送公司测序，检测扩增片段
是否正确，正确的片段序列如下：
pMK1-PTG
pMK3-PTG
pMK5-PTG
pMK7-PTG
pMK9-PTG
pMK10-PTG
在SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的串联片段序列中，下划线部分为各个靶点序列，斜体为OsU6/U3/U6a/U6b启动子序列，加粗为gRNA骨架序列，gRNA骨架序列和靶点序列之间为tRNA序列。
表1 OsLEA24 tRNA-gRNA单元扩增引物
| 引物名称 | 寡核苷酸序列(5’-3’) |
| M13F | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| LEA7R | GAAGTTAGCGAGCATGTCGT |
| LEA6F | ATCGGCAGGAGCGGGACGAT |
| LEA17R | ATGGCGTCGAGGCAGGACAG |
| LEA15NF | GCGACGCCATTGTGTCGAGC |
| LEA22R | AGACGTCGTAGTACGCGCTG |
| LEA21F | AGCTAACTAGTGTTTGGCAA |
| UBI-N-R | ATCTCTAGAGAGGGGCACGA |
| PTG pMK1/10/11F | GTACGGGTCTCATGTGGAACAAAGCACCAGTGGTCTA |
| PTG pMK2/3/8/9F | GTACGGGTCTCATGGCAACAAAGCACCAGTGGTCTA |
| PTG PMK4/5F | GTACGGGTCTCATGCCGAACAAAGCACCAGTGGTCTA |
| PTG pMK6/7/12F | GTACGGGTCTCATGTTGAACAAAGCACCAGTGGTCTA |
| PTG CRISPR R | GACTAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG |
表2 OsLEA24基因型鉴定引物
表3各目的片段名称
| Part1 | Part2 | Part3 | Part4 | Part5 | |
| pMK1-PTG | pMK1F-LEA1R | LEA1F-LEA2R | LEA2F-LEA4R | LEA4F-LEA5R | LEA5F-CRISPR R |
| pMK3-PTG | pMK3F-LEA6R | LEA6F-LEA7R | LEA7F-LEA9R | LEA9F-LEA10R | LEA10F-CRISPR R |
| pMK5-PTG | pMK5F-LEA11R | LEA11F-LEA13R | LEA13F-LEA15R | LEA15F-LEA18R | LEA18F-CRISPR R |
| pMK7-PTG | pMK7F-LEA19R | LEA19F-LEA20R | LEA20F-LEA21R | LEA21F-LEA22R | LEA22F-CRISPR R |
| pMK9-PTG | pMK3F-LEA23R | LEA23F-LEA24R | LEA24F-LEA27R | LEA27F-LEA28R | LEA28F-CRISPR R |
| pMK10-PTG | pMK1F-LEA30R | LEA30F-LEA31R | LEA31F-LEA33R | LEA33F-LEA34R | LEA34F-CRISPR R |
表4 PCR反应程序
表5 pMK中间载体金门组装反应
表6 pMK-PTG阳性克隆鉴定PCR反应程序
实施例2
本实施例将提供一种将多个pMK-PTG中间载体上OsU6/3表达盒连接到pMMK-Cas9的多基因编辑载体构建方法，包括如下步骤：
将实施例1获得的pMK1-PTG、pMK3-PTG、pMK5-PTG、pMK7-PTG、pMK9-PTG、pMK10-PTG中间载体按照一定顺序用金门组装法连接，中间载体上OsU6/3表达盒用II型限制性内切酶AarI(Thermofisher公司)和T4 DNA连接酶(NEB公司)进行酶切-连接循环反应连接到pMMK-Cas9基因编辑载体中，连接反应体系详见表7。
取10uL反应液转化大肠杆菌感受态Dh5a(上海唯地生物技术有限公司)，采用浓度为100ng/mL卡那霉素抗性平板筛选。挑取抗性菌落后利用PCR进行阳性克隆检测，检测引物的序列见表1，鉴定的PCR反应程序详见表8。
PCR扩增完成后，进行凝胶电泳检测，阳性菌落的PCR扩增片段大小需考虑所扩增片段在载体上的距离，M13F-LEA7R、LEA6F-LEA17R、LEA15F-LEA22R、LEA21F-UBI-N-R扩增片段大小分别为为1781bp、1844bp、2114bp、2665bp。菌落PCR及pMMK-PTG载体构建示意图见图3和图4。
对测序结果正确的阳性克隆菌液进行质粒抽提，送公司测序，检测扩增片段是否正确，正确的片段序列如下：
pMMK-PTG
SEQ ID NO.21所示的串联片段序列中，下划线部分为各个靶点序列，斜体为OsU6/U3/U6a/U6b启动子序列，加粗为gRNA骨架序列，gRNA骨架序列和靶点序列之间为tRNA序列。
表7 pMMK-Cas9编辑载体金门组装反应
表8 pMMK-PTG阳性克隆鉴定PCR反应程序
实施例3.将pMMK-PTG多基因编辑载体转化水稻愈伤组织
通过农杆菌介导的转化方法，将实施例2获得的多基因编辑载体pMMK-PTG转化到农杆菌(EHA105)中，然后侵染水稻愈伤组织。转化品种为“秀水134”。详细的转化步骤及使用的各种培养基配方参考文献：Komari T.Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.[J].Plant Journal for Cell&Molecular Biology,2010,6(2):271-282。
实施例4.转基因植株鉴定
用CTAB法提取转基因水稻再生植株的基因组DNA，通过扩增载体上sgRNA序列对转基因植株进行阳性检测，检测引物为M13F和LEA7R，引物序列参见上表1，发明人团队对一个批次的16株进行检测，其中13株为阳性，阳性率为81.25％。
对于经过PCR检测为阳性的转基因水稻植株，进一步针对各个靶点附近序列设计横跨该靶位点前后150-250bp的检测引物。本发明针对24个目的基因所设计的检测引物具体命名和序列参见表9。
表9 pMMK-Cas9基因型鉴定引物
实施例5阳性转基因植株的编辑结果分析
发明人团队挑选了13株阳性转基因苗里面的11株(#1、#4、#5、#7、#8、#9、#12、#13、#14、#15、#16)进行靶基因的扩增和测序分析，这11株的编辑效率和突变类型见图5A。
鉴定的25个靶位点中，除了LEA17是参考基因组与秀水134不同外，剩下的24个靶位点中有19个突变率为100％，1个突变率为91％，2个突变率为81.8％，1个突变率为18.18％和一个位点是0。整体上该系统的编辑效率在绝大多数位点的编辑效率都达到了100％，效率低的2个位点可能是与基因组的情况有关。
进一步分析如图5B，发现每个位点的大多数突变情况都一致，如LEA4的突变主要突变类型是-1纯合突变、LEA5主要突变类型+A纯合突变。大部分位点突变类型都是纯合或双等位突变，只有LEA2、LEA7、LEA11、LEA30和LEA33这5个位点的主要突变类型是杂合突变。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征的所有可能组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海师范大学
<120> 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 349
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtggaga ccatctagac ggtctctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttt 349
<210> 2
<211> 484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta 60
tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca 120
ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga 180
aaccacgtga tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca 240
tgaagccttt caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa 300
caaagactag tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag 360
ttgtgcagat gatccgtggc agagaccatc tagacggtct ctgttttaga gctagaaata 420
gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 480
tttt 484
<210> 3
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttttcctg tagttttccc acaaccattt tttaccatcc gaatgatagg ataggaaaaa 60
tatccaagtg aacagtattc ctataaaatt cccgtaaaaa gcctgcaatc cgaatgagcc 120
ctgaagtctg aactagccgg tcaactatac aggctatcga gatgccatac acgagacggt 180
agtaggaact aggaagacga tggttgattc gtcaggcgaa atcgtcgtcc tgcagtcgca 240
tctatgggcc tggacggaat aggggaaaaa attggccgga taggagggaa aggcccaggt 300
gcttacgtgc gaggtaggcc tgggctctca gcgcttcgat tcgttggcac cggggtagga 360
tgcaatagag agcaacgttt agtaccacct cgcttagcta aactggactg ccttatatgc 420
gcgggtgctg gcttggctgc cgggagacca tctagacggt ctctgtttta gagctagaaa 480
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 540
tttttt 546
<210> 4
<211> 439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcaagaacg aactaagccg gacaaaaaaa aaaaaggagc acatatacaa accggtttta 60
ttcatgaatg gtcacgatgg atgatggggc tcagacttga gctacgaggc cgcaggcgag 120
agaagcctag tgtgctctct gcttgtttgg gccgtaacgg aggatacggc cgacgagcgt 180
gtactaccgc gcgggatgcc gctgggcgct gcgggggccg ttggatgggg atcggtgggt 240
cgcgggagcg ttgaggggag acaggtttag taccacctcg cctaccgaac aatgaagaac 300
ccaccttata accccgcgcg ctgccgcttg tgttgggaga ccatctagac ggtctctgtt 360
ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 420
accgagtcgg tgctttttt 439
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taggtctccn nnnnnnnnnn ngttttagag ctagaa 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggtctcan nnnnnnnnnn ntgcaccagc cggg 34
<210> 7
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taggtctccn nnnnnnnnnn ngttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60
ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcaac aaagcaccag tggtctagtg 120
gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat tcccggctgg tgcannnnnn 180
nnnnnntgag acccg 195
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtacgggtct catgtggaac aaagcaccag tggtcta 37
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtacgggtct catggcaaca aagcaccagt ggtcta 36
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtacgggtct catgccgaac aaagcaccag tggtcta 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtacgggtct catgttgaac aaagcaccag tggtcta 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gactaggtct ccaaacaaaa aaaaaagcac cgactcg 37
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 15
<211> 1108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtgaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 300
gggttcgatt cccggctggt gcaaaggtgc aggacatggt gaggttttag agctagaaat 360
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca 420
acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg 480
attcccggct ggtgcagggg aaggtgagca aggccagttt tagagctaga aatagcaagt 540
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc 600
accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg 660
gctggtgcac gcgatgcagt cgaccaaggg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 720
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg 780
gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg 840
cagcaagaaa caatggcgca gcgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 900
tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttttttgt tttagagcta 960
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1020
gtgctttttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgtagcgcgt 1080
gcgccaattc tgcagacaaa tggccaat 1108
<210> 16
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta 60
tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca 120
ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga 180
aaccacgtga tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca 240
tgaagccttt caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa 300
caaagactag tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag 360
ttgtgcagat gatccgtggc acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 420
acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcaatcg gcaggagcgg gacgatgttt 480
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 540
ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 600
agacccgggt tcgattcccg gctggtgcaa cgacatgctc gctaacttcg ttttagagct 660
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 720
ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg 780
ggttcgattc ccggctggtg cattgcagga ggggttactc gggttttaga gctagaaata 840
gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgcaa 900
caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac ccgggttcga 960
ttcccggctg gtgcagagcg agagcagttg tccgggtttt agagctagaa atagcaagtt 1020
aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt 1080
tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 1140
tggcaccgag tcggtgcttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 1200
gtccgtagcg cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcctg ag 1242
<210> 17
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttttttcctg tagttttccc acaaccattt tttaccatcc gaatgatagg ataggaaaaa 60
tatccaagtg aacagtattc ctataaaatt cccgtaaaaa gcctgcaatc cgaatgagcc 120
ctgaagtctg aactagccgg tcaactatac aggctatcga gatgccatac acgagacggt 180
agtaggaact aggaagacga tggttgattc gtcaggcgaa atcgtcgtcc tgcagtcgca 240
tctatgggcc tggacggaat aggggaaaaa attggccgga taggagggaa aggcccaggt 300
gcttacgtgc gaggtaggcc tgggctctca gcgcttcgat tcgttggcac cggggtagga 360
tgcaatagag agcaacgttt agtaccacct cgcttagcta aactggactg ccttatatgc 420
gcgggtgctg gcttggctgc cgaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct 480
gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcac aaaggggaga gagaaccgtg 540
ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 600
gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg 660
tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg caagcgagag ccctcctctc gtgttttaga 720
gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 780
gtcggtgcaa caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac 840
ccgggttcga ttcccggctg gtgcagcgac gccattgtgt cgagcgtttt agagctagaa 900
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 960
caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca gacccgggtt 1020
cgattcccgg ctggtgcact gtcctgcctc gacgccatgt tttagagcta gaaatagcaa 1080
gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 1140
ttttgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa 1200
aagtggcacc gagtcggtgc ttttttgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 1260
ctagtccgta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc ctctc 1305
<210> 18
<211> 1195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgcaagaacg aactaagccg gacaaaaaaa aaaaggagca catatacaaa ccggttttat 60
tcatgaatgg tcacgatgga tgatggggct cagacttgag ctacgaggcc gcaggcgaga 120
gaagcctagt gtgctctctg cttgtttggg ccgtaacgga ggatacggcc gacgagcgtg 180
tactaccgcg cgggatgccg ctgggcgctg cgggggccgt tggatgggga tcggtgggtc 240
gcgggagcgt tgaggggaga caggtttagt accacctcgc ctaccgaaca atgaagaacc 300
caccttataa ccccgcgcgc tgccgcttgt gttgaacaaa gcaccagtgg tctagtggta 360
gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc ataacaccac 420
caccgccgtg agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 480
cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta 540
ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcagatgggg gcgagcaagg 600
acagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 660
agtggcaccg agtcggtgca acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 720
acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcaagca cgtacgtacg catcgagttt 780
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 840
ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 900
agacccgggt tcgattcccg gctggtgcaa gctaactagt gtttggcaag ttttagagct 960
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 1020
ggtgcttttt tttttgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 1080
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttgtt ttagagctag aaatagcaag 1140
ttaaaataag gctagtccgt agcgcgtgcg ccaattctgc agacaaatgg cccac 1195
<210> 19
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta 60
tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca 120
ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga 180
aaccacgtga tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca 240
tgaagccttt caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa 300
caaagactag tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag 360
ttgtgcagat gatccgtggc acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 420
acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcacagc gcgtactacg acgtctgttt 480
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca 540
ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac 600
agacccgggt tcgattcccg gctggtgcag aggaacacgg agagccaccg ttttagagct 660
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 720
ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg 780
ggttcgattc ccggctggtg catgtgctcg cctccgccca tggttttaga gctagaaata 840
gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgcaa 900
caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac ccgggttcga 960
ttcccggctg gtgcatacca ggggcagcac ggctagtttt agagctagaa atagcaagtt 1020
aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt 1080
tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 1140
tggcaccgag tcggtgcttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 1200
gtccgtagcg cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcctg tc 1242
<210> 20
<211> 1108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtgaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 300
gggttcgatt cccggctggt gcagtgtact aggacgatga gccgttttag agctagaaat 360
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca 420
acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg 480
attcccggct ggtgcaaaca cgtcgccgta catcacgttt tagagctaga aatagcaagt 540
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc 600
accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg 660
gctggtgcaa gctggtcctc cattctctgg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 720
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg 780
gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg 840
cagatgttga cgccatgctc aggttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 900
tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttttttgt tttagagcta 960
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1020
gtgctttttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgtagcgcgt 1080
gcgccaattc tgcagacaaa tggccccc 1108
<210> 21
<211> 7200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtgaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 300
gggttcgatt cccggctggt gcaaaggtgc aggacatggt gaggttttag agctagaaat 360
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgca 420
acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg 480
attcccggct ggtgcagggg aaggtgagca aggccagttt tagagctaga aatagcaagt 540
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc 600
accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg 660
gctggtgcac gcgatgcagt cgaccaaggg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 720
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg 780
gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg 840
cagcaagaaa caatggcgca gcgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 900
tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttttttgt tttagagcta 960
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1020
gtgctttttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgtagcgcgt 1080
gcgccaattc tgcagacaaa tggccaatca ggaatcttta aacatacgaa cagatcactt 1140
aaagttcttc tgaagcaact taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat 1200
gtgcagtcag ggaccatagc acaagacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct 1260
ggaagccggg aacactgggt acgttggaaa ccacgtgatg tgaagaagta agataaactg 1320
taggagaaaa gcatttcgta gtgggccatg aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg 1380
gccggcccat tacgcaattg gacgacaaca aagactagta ttagtaccac ctcggctatc 1440
cacatagatc aaagctgatt taaaagagtt gtgcagatga tccgtggcac aaagcaccag 1500
tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat tcccggctgg 1560
tgcaatcggc aggagcggga cgatgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 1620
agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc aacaaagcac cagtggtcta 1680
gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc gattcccggc tggtgcaacg 1740
acatgctcgc taacttcgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 1800
tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcaacaaag caccagtggt ctagtggtag 1860
aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc ggctggtgca ttgcaggagg 1920
ggttactcgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 1980
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta 2040
ccctgccacg gtacagaccc gggttcgatt cccggctggt gcagagcgag agcagttgtc 2100
cgggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 2160
agtggcaccg agtcggtgct tttttttttg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 2220
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag 2280
ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtagcgcg tgcgccaatt ctgcagacaa 2340
atggcctgag ttttttcctg tagttttccc acaaccattt tttaccatcc gaatgatagg 2400
ataggaaaaa tatccaagtg aacagtattc ctataaaatt cccgtaaaaa gcctgcaatc 2460
cgaatgagcc ctgaagtctg aactagccgg tcaactatac aggctatcga gatgccatac 2520
acgagacggt agtaggaact aggaagacga tggttgattc gtcaggcgaa atcgtcgtcc 2580
tgcagtcgca tctatgggcc tggacggaat aggggaaaaa attggccgga taggagggaa 2640
aggcccaggt gcttacgtgc gaggtaggcc tgggctctca gcgcttcgat tcgttggcac 2700
cggggtagga tgcaatagag agcaacgttt agtaccacct cgcttagcta aactggactg 2760
ccttatatgc gcgggtgctg gcttggctgc cgaacaaagc accagtggtc tagtggtaga 2820
atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcac aaaggggaga 2880
gagaaccgtg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 2940
tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac 3000
cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc ccggctggtg caagcgagag ccctcctctc 3060
gtgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 3120
gtggcaccga gtcggtgcaa caaagcacca gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca 3180
cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg gtgcagcgac gccattgtgt cgagcgtttt 3240
agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 3300
cgagtcggtg caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca 3360
gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcact gtcctgcctc gacgccatgt tttagagcta 3420
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 3480
gtgctttttt ttttgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 3540
caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttgttt tagagctaga aatagcaagt 3600
taaaataagg ctagtccgta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc ctctctgcaa 3660
gaacgaacta agccggacaa aaaaaaaaag gagcacatat acaaaccggt tttattcatg 3720
aatggtcacg atggatgatg gggctcagac ttgagctacg aggccgcagg cgagagaagc 3780
ctagtgtgct ctctgcttgt ttgggccgta acggaggata cggccgacga gcgtgtacta 3840
ccgcgcggga tgccgctggg cgctgcgggg gccgttggat ggggatcggt gggtcgcggg 3900
agcgttgagg ggagacaggt ttagtaccac ctcgcctacc gaacaatgaa gaacccacct 3960
tataaccccg cgcgctgccg cttgtgttga acaaagcacc agtggtctag tggtagaata 4020
gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcataac accaccaccg 4080
ccgtgagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 4140
aaaagtggca ccgagtcggt gcacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg 4200
ccacggtaca gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcaga tgggggcgag caaggacagt 4260
tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 4320
caccgagtcg gtgcaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt 4380
acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc aagcacgtac gtacgcatcg agttttagag 4440
ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 4500
tcggtgcaac aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc 4560
cgggttcgat tcccggctgg tgcaagctaa ctagtgtttg gcaagtttta gagctagaaa 4620
tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 4680
tttttttttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 4740
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa 4800
ataaggctag tccgtagcgc gtgcgccaat tctgcagaca aatggcccac caggaatctt 4860
taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta tcaggcatgc 4920
atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca ggcgtcttct 4980
actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga aaccacgtga 5040
tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca tgaagccttt 5100
caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa caaagactag 5160
tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag ttgtgcagat 5220
gatccgtggc acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga 5280
cccgggttcg attcccggct ggtgcacagc gcgtactacg acgtctgttt tagagctaga 5340
aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 5400
gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga atagtaccct gccacggtac agacccgggt 5460
tcgattcccg gctggtgcag aggaacacgg agagccaccg ttttagagct agaaatagca 5520
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcaacaa 5580
agcaccagtg gtctagtggt agaatagtac cctgccacgg tacagacccg ggttcgattc 5640
ccggctggtg catgtgctcg cctccgccca tggttttaga gctagaaata gcaagttaaa 5700
ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgcaa caaagcacca 5760
gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg 5820
gtgcatacca ggggcagcac ggctagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 5880
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt tgttttagag 5940
ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 6000
tcggtgcttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgtagcg 6060
cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcctg tcggatcatg aaccaacggc ctggctgtat 6120
ttggtggttg tgtagggaga tggggagaag aaaagcccga ttctcttcgc tgtgatgggc 6180
tggatgcatg cgggggagcg ggaggcccaa gtacgtgcac ggtgagcggc ccacagggcg 6240
agtgtgagcg cgagaggcgg gaggaacagt ttagtaccac attgcccagc taactcgaac 6300
gcgaccaact tataaacccg cgcgctgtcg cttgtgtgaa caaagcacca gtggtctagt 6360
ggtagaatag taccctgcca cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg gtgcagtgta 6420
ctaggacgat gagccgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 6480
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa 6540
tagtaccctg ccacggtaca gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcaaa cacgtcgccg 6600
tacatcacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt 6660
gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcaacaaa gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc 6720
ctgccacggt acagacccgg gttcgattcc cggctggtgc aagctggtcc tccattctct 6780
ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 6840
tggcaccgag tcggtgcaac aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac 6900
ggtacagacc cgggttcgat tcccggctgg tgcagatgtt gacgccatgc tcaggtttta 6960
gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc 7020
gagtcggtgc tttttttttt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 7080
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata 7140
gcaagttaaa ataaggctag tccgtagcgc gtgcgccaat tctgcagaca aatggccccc 7200
Claims (10)
1.一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将多个sgRNA通过多顺反子tRNA-gRNA方式连接到pMK-(1-12)中间载体上，每个中间载体上可以连接1个到多个sgRNAs，得到pMK(1-12)-PTG载体；
(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上的U6/U3表达盒连接到pMMK-Cas9载体上，pMMK-Cas9连接2个到7个pMK(1-12)-PTG载体上U6/U3表达盒，得到pMMK-PTG载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pMK(1-12)是一套12个用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的中间载体，其中pMK1、pMK10、pMK11各含有一个OsU6表达盒，OsU6表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pMK2、pMK3、pMK8、pMK9各含有一个OsU3表达盒，OsU3表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；pMK4、pMK5各含有一个OsU6a表达盒，OsU6a表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pMK6、pMK7、pMK12各含有一个OsU6b表达盒，OsU6b核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将多个sgRNA构建到pMK(1-12)中间载体上，首先根据基因打靶位点通过CRISPR-GE网站在线设计靶序列，合成引物，
gRNA[x]-F(SEQ ID NO.5)：
5‘-TAGGTCTCCN9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20GTTTTAGAGCTAGA A-3’
gRNA[x]-R(SEQ ID NO.6)：
5’-CGGGTCTCAN12N11N10N9N8N7N6N5N4N3N2N1TGCACCAGCCGGG-3‘；
其中，N1-N20分别表示20bp靶序列的第1位至第20位上的核苷酸。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，根据连接到pMK-(1-12)各个小载体的不同，使用扩增引物PTG pMK(1-12)F和PTG CRISPR R，同时进行扩增，PTGpMK1/10/11F的引物序列如SEQ ID NO.8所示；PTG pMK2/3/8/9F的引物序列如SEQ ID NO.9所示；PTG pMK 4/5F的引物序列如SEQ ID NO.10所示；PTG pMK6/7/12F的引物序列如SEQID NO.11所示；PTG CRISPR R的引物序列如SEQ ID NO.12所示；
PTG pMK1/10/11F(SEQ ID NO.8)：
GTACGGGTCTCATGTGGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK2/3/8/9F(SEQ ID NO.9)：
GTACGGGTCTCATGGCAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK 4/5F(SEQ ID NO.10)：
GTACGGGTCTCATGCCGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG pMK6/7/12F(SEQ ID NO.11)：
GTACGGGTCTCATGTTGAACAAAGCACCAGTGGTCTA
PTG CRISPR R(SEQ ID NO.12)：
GACTAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG
在获得tRNA-gRNA单元的同时，同时扩增获得tRNA-gRNA单元与小载体链接的接头片段，将tRNA-gRNA单元通过多片段连接方法连接到pMK(1-12)中间载体上，得到含有多顺反子tRNA-sgRNA的pMK(1-12)-PTG载体；所述多片段连接方法是使用IIS型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将多个tRNA-gRNA同时连接到pMK(1-12)中间载体，所述IIS型限制性内切酶为BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中pMK(1-12)中间载体上，U6/3启动子后面携带IIS型限制性核酸内切酶酶切位点，多顺反子tRNA-gRNA片段插入到两个IIS型限制性核酸内切酶酶切位点之间。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)将多个pMK(1-12)-PTG载体上U6/3表达盒连接到pMMK-Cas9载体，pMK(1-12)中间载体的连接顺序为：
连接2个U6/U3时，pMK 1+pMK 2连接到pMMK-Cas9；
连接3个U6/U3时，pMK 1+pMK 3+pMK 4连接到pMMK-Cas9；
连接4个U6/U3时，pMK 1+pMK 3+pMK5+pMK6连接到pMMK-Cas9；
连接5个U6/U3时，pMK1+pMK3+pMK5+pMK7+pMK8连接到pMMK-Cas9；
连接6个U6/U3时，pMK1+pMK 3+pMK5+pMK7+pMK 9+pMK 10连接到pMMK-Cas9；
连接7个U6/U3时，pMK1+pMK3+pMK5+pMK7+pMK9+pMK11+pMK12连接到pMMK-Cas9。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，多个pMK(1-12)中间载体连接pMMK-Cas9方法使用IIS型核酸内切酶酶切和连接的“金门”克隆，将多个pMK(1-12)上面的U6/3表达盒同时连接到pMMK-Cas9，所述IIS型限制性内切酶包括BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI；多个pMK(1-12)上面的U6/3表达盒同时连接到pMMK-Cas9的两个II型限制性内切酶之间。
8.权利要求1-7任一方法构建得到的工具载体或成套工具载体。
9.权利要求8所述的工具载体在CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑系统中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110773909.0A CN113564197B (zh) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110773909.0A CN113564197B (zh) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113564197A true CN113564197A (zh) | 2021-10-29 |
| CN113564197B CN113564197B (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=78164178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110773909.0A Active CN113564197B (zh) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113564197B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019967A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-17 | 南京农业大学 | GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用 |
| CN115058446A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-09-16 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016061481A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | The Penn State Research Foundation | Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies |
| CN107603980A (zh) * | 2017-08-16 | 2018-01-19 | 中国科学院华南植物园 | 一种基于PTG‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
| CN109880846A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-06-14 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用 |
| CN111019967A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-17 | 南京农业大学 | GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用 |
| CN111334527A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-26 | 江苏科技大学 | 一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用 |
| CN111613272A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-09-01 | 西湖大学 | 程序化框架gRNA及其应用 |
| CN112760304A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-05-07 | 上海师范大学 | 基于基因编辑技术的gbssi突变型蛋白及其在植物育种中的应用 |
| US20210189410A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-24 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Targeted editing of citrus genes for disease resistance |
-
2021
- 2021-07-08 CN CN202110773909.0A patent/CN113564197B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016061481A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | The Penn State Research Foundation | Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies |
| CN107027313A (zh) * | 2014-10-17 | 2017-08-08 | 宾州研究基金会 | 用于多元rna引导的基因组编辑和其它rna技术的方法和组合物 |
| CN107603980A (zh) * | 2017-08-16 | 2018-01-19 | 中国科学院华南植物园 | 一种基于PTG‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用 |
| CN109880846A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-06-14 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用 |
| CN111019967A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-17 | 南京农业大学 | GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用 |
| US20210189410A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-24 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Targeted editing of citrus genes for disease resistance |
| CN111334527A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-26 | 江苏科技大学 | 一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用 |
| CN111613272A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-09-01 | 西湖大学 | 程序化框架gRNA及其应用 |
| CN112760304A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-05-07 | 上海师范大学 | 基于基因编辑技术的gbssi突变型蛋白及其在植物育种中的应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| AULICINO 等: "Baculovirus-vectored precision delivery of large DNA 1 cargoes in human genomes", BIORXIV, pages 1 - 38 * |
| HSIEH-FENG 等: "Efficient expression of multiple guide RNAs for CRISPR/Cas genome editing", ABIOTECH, vol. 1, pages 123 - 134, XP093113900, DOI: 10.1007/s42994-019-00014-w * |
| MA 等: "A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants", MOLECULAR PLANT, vol. 8, no. 8, pages 1274 - 1284, XP055822799, DOI: 10.1016/j.molp.2015.04.007 * |
| MA 等: "CRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing in Plants: Developments and Applications", MOLECULAR PLANT, vol. 9, no. 7, pages 967 * |
| XIE 等: "Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system", PNAS, vol. 112, no. 11, pages 3570, XP055196411, DOI: 10.1073/pnas.1420294112 * |
| 王木佳 等: "化繁为简——植物多基因编辑体系的优化", 生命科学, vol. 30, no. 9, pages 980 - 986 * |
| 阚婷婷 等: "基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展", 上海师范大学学报（自然科学版）, vol. 50, no. 1, pages 51 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019967A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-04-17 | 南京农业大学 | GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用 |
| CN115058446A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-09-16 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113564197B (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2893024B1 (en) | Fluorescence activated cell sorting (facs) enrichment to generate plants | |
| WO2016106121A1 (en) | Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications | |
| CN108707635B (zh) | 用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用 | |
| CN113564197B (zh) | 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用 | |
| CN110157709B (zh) | 一种橡胶树U6基因启动子proHbU6.8及其克隆与应用 | |
| CN113564164B (zh) | 一种提高先导编辑效率的载体和方法 | |
| CN110396523B (zh) | 一种重复片段介导的植物定点重组方法 | |
| CN113462748A (zh) | Dna测序文库的制备方法及试剂盒 | |
| KR20210110790A (ko) | 외가닥 dna의 합성방법 | |
| CN106636065B (zh) | 一种全基因组高效基因区富集测序方法 | |
| CN109852668A (zh) | 一种简化基因组测序文库及其建库方法 | |
| CN113278646A (zh) | 一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用 | |
| AU2019359771A1 (en) | Barcoding of nucleic acids | |
| CN112143830A (zh) | 水稻剑叶宽调控基因nal1的分子标记及其应用 | |
| CN113667714A (zh) | 一种目标区域捕获方法、试剂盒及测序方法 | |
| CN110551763A (zh) | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN110129359B (zh) | 检测基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法以及其应用 | |
| CN113832151B (zh) | 黄瓜内源启动子及其应用 | |
| CN113388635B (zh) | 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
| CN112852805B (zh) | 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法 | |
| CN117987460A (zh) | 共表达TypeV-A型anti-CRISPR蛋白的LbCas12a植物基因组编辑系统 | |
| CN116478987A (zh) | PE-Nt4引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用 | |
| CN117677694A (zh) | 体内dna组装和分析 | |
| CN116751795A (zh) | 一种识别nnta特异位点的基因、基因编辑系统及其应用 | |
| CN116463365A (zh) | CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰系统及植物基因组表观编辑系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |