KR20210110790A - 외가닥 dna의 합성방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 외가닥 DNA의 합성방법에 관한 것으로, 구체적으로는 우라실 특이적 절단 효소(USER)을 매개로 하는 이중 가닥 DNA 자동 환형성과 회전 바퀴형 복제를 결합함으로써 외가닥 DNA를 제조하는 염기 돌연변이가 없는 외가닥 DNA의 제조공정에 관한 것이다.

Description

외가닥 DNA의 합성방법
본 발명은 생체공학분야에 관한 것으로, 특히 염기 돌연변이가 없는 외가닥 DNA의 제조공정에 관한 것이다.
유전자 회복 및 외래 기능 유전자의 삽입에 있어서, 외가닥 DNA 주형은 이중 가닥 DNA 주형에 비해 다양한 면에서 많은 장점을 가지고 있는데, 예를 들면 편집 효율이 더욱 높고, 연약한 포유동물 세포에 대한 세포 독성이 더욱 작으며, 편집 오류/비표적율이 더욱 낮다는 등이다. 여기서, 낮은 편집 오류/비표적율은 유전자 치료에서 매우 중요하다.
그러나, 현재 외가닥 DNA 주형은 어려운 기술, 높은 원가, 낮은 생산능 등 원인으로 인해 가격이 매우 높아, 이 방법을 이용한 연구 원가에 대한 제한이 크다. 화학 합성한 외가닥은 200 염기의 길이 제한이 있고, 일반적으로 매칭되어 있는 하류 정제 방법은 제품의 잘못된 서열을 제거할 수 없다. 일반적으로, 외가닥 DNA 제품의 제조방법은 핵산외부가수분해효소 소화법, 비대칭 PCR법 및 마그네틱 비드 흡착법이 있다. 그러나 이러한 방법들은 모두 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 핵산외부가수분해효소 소화법은 핵산외부가수분해효소가 안티센스 가닥을 소화하는 동시에 비특이적으로 목적 스트립을 분해할 수 있기 때문에, 요구와 완전히 일치하는 제품을 제공할 수 없다. 비대칭 PCR은 원가가 저렴한 생산 방법이지만, 서열에 대한 그 생산 효율의 요구가 명확하지 않아 그 생산 효과를 제어하기 힘들고, 안정적인 생산에 적용되지 않는다. 비오틴-스트렙트아비딘 마그네틱 비드 흡착법은 조작이 간단하고 생산량이 안정적이나, 고품질의 국외산 마그네틱 비드의 가격이 높고, 구매 대기 시간이 길어 핵심 생산 기술을 국외 제품에 두는 것에 따른 리스크에 대한 우려가 높다.
순도가 더욱 높고, 사용량이 충족하며 가격이 저렴한 외가닥 DNA 주형 제품을 개발하기 위해, 발명자는 우라실 특이적 절단 효소(USER)를 매개로 하는 이중 가닥 DNA의 자동 환형성 방법에 대해 특수한 서열 설계를 수행하여 달성한 외가닥 DNA 어닐링 과정에서의 자동 폴딩, 목적 외가닥 단편의 II형 제한 핵산내부가수분해효소를 정밀하게 절단하고 외가닥 DNA를 항온 증폭할 수 있는 회전 바퀴형 복제를 결합함으로써, 범용적이고 고효율적인 긴 외가닥 DNA의 제조공정을 개발하였다.
본 발명의 목적은 이러한 제품의 가격이 지나지게 높고 생산량이 낮다는 등 문제를 해결하기 위해 고단위, 고순도, 고서열 정확도를 가진 외가닥 DNA의 제조공정을 개발하는 것이다. 상기 공정은 200nt 이상의 외가닥 DNA의 생산량을 몇 ug로부터 몇백 ug로 향상시켜 nmol 수준을 구현할 수 있고, 1350nt의 외가닥 DNA의 생산량을 몇 ug로부터 몇십 ug로 향상시킬 수도 있다.
일예로서, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다.
단계 1(서열 분석 과정): 목적 DNA 서열(예컨대, 150~2500nt 범위 내의 임의의 DNA 서열)에 대해 생물정보학 분석을 수행하여 서열에 포함된 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 식별, 절단 부위를 확인한다. 일반적으로 사용하는 것이나 목적 서열에 포함되어 있지 않는 II형 제한 핵산내부가수분해효소(예컨대 BsaI)를 선택하고, 그 효소 절단 부위의 서열을 결정하여 목적 서열 양측의 매칭 서열 및 범용 프라이머의 설계에 사용한다.
단계 2(프라이머 설계 과정): 목적 서열 양단에 각각 좌측 매칭 서열과 우측 매칭 서열을 부가하고, 함께 유전자 합성을 수행한다. 여기서, 좌측 매칭 서열은 5’단에서부터 3’단까지 순차적으로 한 구간의 상동 서열(적어도 4개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 6~10개의 뉴클레오티드, 예컨대 8개의 뉴클레오티드), 하나의 T 뉴클레오티드, 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 인식 부위, 및 임의의 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 부가 서열을 포함하고, 상기 부가 서열과 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 인식 부위는 함께 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위(일부 실시형태에서, II형 제한 핵산내부가수분해효소 인식 부위는 그 절단 부위와 동일하고, 이 경우 부가 서열이 없음)를 구성하여 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소가 상기 부가 잔기 서열의 3’단에서 절단되도록 할 수 있으며, 우측 매칭 서열은 5’단에서부터 3’단까지 순차적으로 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 인식 부위의 역상보 서열과 한 구간의 상동 서열을 포함하고, 이 상동 서열은 좌측 매칭 서열의 상동 서열과 동일하나 3’단에는 1~3개의 뉴클레오티드가 부족하며, 상기 인식 부위의 역상보 서열의 5’단에는 임의의 1개 또는 다수의 뉴클레오티드의 부가 서열이 구비되고, 이 부가 서열과 상기 인식 부위의 역상보 서열이 함께 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위(일부 실시형태에서, II형 제한 핵산내부가수분해효소 인식 부위와 그 절단 부위가 동일하고, 이 경우 부가 서열이 없음)를 구성한다. 바람직하게, 좌측/우측 매칭 서열의 길이는 1~4개의 염기가 차이 난다.
단계 3(주형 증폭 제조-자동 환형성): 각각 우라실(U) 수식을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 양단에 좌측/우측 매칭 서열을 포함하는 유전자로 합성한 단편에 대해 PCR 증폭을 수행하되, 상기 U 수식은 프라이머 서열에서 상동 서열과 대응하는 서열의 3’에 위치한다. 생성물을 정제하고, USER 효소(New England BioLabs Inc.)를 통해 정제한 생성물을 소화하며, 상기 우라실 부위에서 절단하여 점착성 말단을 형성하고, T4 DNA 리가아제(New England BioLabs Inc.)로 2개의 점착성 말단을 연결시킴으로써, 증폭된 생성물 자체가 고리화되고 노치를 가진 dsDNA 고리를 형성하여 회전 바퀴형 복제의 기질로 사용한다.
여기서, 주형 증폭은 일반적인 PCR 과정이고, 반응 시스템은 구체적으로 사용하는 DNA 폴리메라아제 및 그 대응하는 완충액에 따라 결정되며, PCR 반응의 어닐링 온도는 구체적인 프라이머 서열에 따라 결정되고, PCR 반응의 연장시간은 구체적인 주형 서열 길이에 따라 결정된다.
여기서, USER 효소와 T4 DNA 리가아제로 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA를 제조하는 자동 고리화 반응 시스템은 다음과 같다. 정제된 이중 가닥 DNA 주형 생성물 100ng, T4 DNA 리가아제 반응 완충액 1ul 10x, USER 효소 1ul, T4 DNA 리가아제 1ul; 최종 반응 시스템이 10ul 되도록 ddH2O를 첨가; 37℃에서 30min 동안 배양; 20℃에서 30min 동안 배양한 후 온도를 4℃로 하강하고 보존한다.
단계 4(회전 바퀴형 복제): 200ul의 PCR 튜브에서, 단계 3에서 제조한 노치를 가진 환형 DNA 샘플 100ng에 증폭 완충액(500mM의 Tris-HCl, 50mM의 MgCl2, 750mM의 KCl, 40mM의 DTT, pH 8.2, 25℃) 10ul 10x, BSA(2mg/ml) 10.0ul, dNTP(10mM) 1.0ul, phi29 DNA 폴리메라아제(5U/ul) 5ul를 첨가하고, 최종 반응 시스템이 100ul 되도록 ddH2O를 첨가하며, 30℃에서 4~8 시간 증폭하고, 65℃에서 10분 동안 처리한 후 4℃로 냉각시킨다.
단계 5(어닐링-자동 폴딩): 회전 바퀴형 복제를 수행한 PCR 튜브를 PCR에 넣고 다음과 같이 어닐링 공정을 수행하여 머리핀 구조를 형성한다. 80℃, 5min, 0.1℃/s로 65℃까지 하강, 65℃, 5min, 0.1℃/s로 42℃까지 하강, 42℃, 5min, 37℃, 5min, 0.1℃/s로 4℃까지 하강한 후 4℃에서 보존한다.
단계 6(제한 핵산내부가수분해효소 절단-목적 단편의 긴 외가닥 단량체 방출): 상기 반응 생성물에 제한 핵산내부가수분해효소 완충액 15ul 10x, 앞에서 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 2ul를 첨가하고, 부피가 150ul 되도록 ddH2O를 첨가하며, 제한 핵산내부가수분해효소를 최적 반응 온도에서 60min 동안 방치한 후 열변성 불활성화를 수행한다.
단계 7(정제, 농축): 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 생성물은 목적 단편의 외가닥 DNA 생성물의 머리핀 구조를 포함하고, 목적 단편이 300nt보다 큰 경우에는 다른 불명확한 DNA 단편을 포함할 수도 있는데, 제조자는 실제 생산 및 사용 상황에 따라 마그네틱 비드 또는 아라로오스 겔 전기영동에 의해 절단한 겔을 회수하고, 회수 후 동결 건조 또는 이소프로판올 침전에 의해 농축을 수행할 수 있다.
구체적으로, 본 출원은 다음과 같은 기술방안을 제공한다.
1. (1) 제1 가닥, 및 제1 가닥과 역상보 관계인 제2 가닥으로 구성된 주형 이중 가닥 DNA 분자를 획득하는 단계;
(여기서, 제1 가닥의 서열 구조는
5’ 좌측 매칭 서열-목적 외가닥 DNA 서열-우측 매칭 서열 3’ (I)이며,
그중, 좌측 매칭 서열의 서열 구조는 XnTXqXA이고, 우측 매칭 서열의 서열 구조는 XBXq’Xn-m이며,
식에서, Xn은 n개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열이며, 5’ 뉴클레오티드는 A이고, n은 적어도 4인 임의의 정수이며,
Xq는 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 인식 부위 서열이고 목적 외가닥 DNA 서열에 존재하지 않으며, Xq’는 Xq의 역상보 서열이고, XA, XB는 각각 임의의 0개 내지 복수개의 뉴클레오티드이며, XqXA, XBXq’는 각각 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위를 구성하고, 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소가 XqXA 서열의 3’단 및 XB Xq’ 서열의 5’단에서 절단되는 것을 허용하며,
Xn-m은 Xn의 5’로부터 n-m개의 뉴클레오티드 서열이고, m은 1~3의 정수이며,
A는 아데닌 뉴클레오티드이고, T는 티민 뉴클레오티드)
(2) 주형 이중 가닥 DNA 분자를 주형으로 하고 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 PCR 증폭을 수행함으로써 목적 외가닥 DNA 서열을 가진 제1 가닥 및 상기 제1 가닥과 역상보 관계인 제2 가닥을 포함하는 DNA 이중 가닥 분자를 획득하는 단계
(여기서, 상기 정방향 프라이머는 XnUXqXA의 서열을 포함하고, 상기 역방향 프라이머는 Xn-m’XqXB’의 서열을 포함하며, 그중 Xn, Xq, XA, XB는 (1)에 기재된 바와 같고, Xn-m’는 상기 Xn-m의 역상보 서열을 가지되 U로 3’단의 T를 대체하며, XB’는 상기 XB의 역상보 서열이고, U는 우라실 뉴클레오티드)
(3) 우라실 특이적 절단 시약을 이용하여 DNA 이중 가닥 분자의 두 가닥에 포함되는 U 부위에서 각각 절단함으로써 DNA 이중 가닥 분자의 2개의 말단에 점착성 말단을 형성하는 단계;
(4) 리가아제 존재 하에 DNA 이중 가닥 분자의 2개의 점착성 말단을 상호 연결시켜 제1 가닥이 노치를 구비하는 환형 이중 가닥 DNA를 형성하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 획득한 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA에 대해 회전 바퀴형 복제를 수행하는 단계;
(여기서, 복제는 DNA 이중 가닥 분자의 센스 제1 가닥의 노치를 기점으로 하고, 제2 가닥을 주형으로 함으로써 복수개의 직렬 연결된 서열 구조를 포함하는 레플리콘을 획득한 것이며,
상기 서열 구조는
5’-XnTXqXA-목적 외가닥 DNA서열-XBXq ’-3’ (II)임)
(6) 레플리콘을 어닐링함으로써, 레플리콘의 인접한 2개의 목적 외가닥 DNA 서열 사이에 머리핀 구조를 형성하는 단계;
(여기서, 상기 머리핀 구조는 Xq’XnTXq의 서열로 구성되는 것이 바람직함)
(7) 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소로 레플리콘을 처리하고, 각각 인접한 목적 외가닥 DNA 서열 사이의 XBXq’XnTXqXA 서열의 5’단과 3’단에서 절단하여 복수개의 목적 외가닥 DNA 서열을 방출하는 단계;를 포함하는 목적 외가닥 DNA의 제조방법.
2. 청구항 1에 있어서,
상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소는 AlwI, BbsI, BbvI, BceAI, BCIVI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, HphI, HpyAV, FokI, FauI, HgaI에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 우라실 특이적 절단 시약은 우라실 특이적 절단 효소(USERTM)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리가아제는 T4 DNA 리가아제인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계(3)와 단계(4)는 동일한 반응 시스템에서 우라실 특이적 절단 시약 및 리가아제가 동시에 존재하는 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
회전 바퀴형 복제는 연속 복제 능력을 가진 DNA 폴리메라아제를 사용하고, 바람직하게는 phi29 DNA 폴리메라아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소는 BspQI인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 7에 있어서,
XqXA의 서열은 GCTCTTCN이며, 여기서 N은 A, T, C 또는 G이고, 바람직하게는 A이며; XBXq’의 서열은 N1N2N3N4GAAGAGC이고, N1, N2, N3, N4는 독립적으로 A, T, C 또는 G에서 선택되며; XBXq’의 서열은 CCTTGAAGAGC인 것이 더욱 바람직하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
n은 6~10인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
n은 8인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
m은 1인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
Xn의 서열이 AACTATAC이고, Xn-m의 서열이 AACTATA인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적 외가닥 DNA의 길이는 150~2500nt인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 주형 이중 가닥 DNA 분자를 제조하기 전에 목적 외가닥 DNA의 서열을 분석하여 목적 외가닥 DNA 서열에 절단 부위가 없는 II형 제한 핵산내부가수분해효소를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. XnTXqXA로 나타낸 서열을 가진 좌측 압타머와, XBXq’Xn-m로 나타낸 서열을 가진 우측 압타머를 포함하는 목적 DNA 서열 증폭용 키트;
(식에서, Xn은 n개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 5’ 뉴클레오티드는 A이고, n은 적어도 4인 임의의 정수이며 6~8이 바람직하고, 8이 더욱 바람직하며,
Xq는 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 인식 부위 서열이고 목적 외가닥 DNA 서열에 존재하지 않으며, Xq’는 Xq의 역상보 서열이고, XA, XB는 각각 임의의 0개 내지 복수개의 뉴클레오티드이며, XqXA, XBXq’는 각각 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위를 구성하고, 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소가 XA의 3’단 및 XB의 5’단에서 절단되는 것을 허용하며,
Xn-m은 Xn의 5’로부터 n-m개의 뉴클레오티드의 서브 서열이고, m은 1~3의 정수이며,
A는 아데닌 뉴클레오티드이고, T는 티민 뉴클레오티드).
15. 청구항 14에 있어서,
XnUXqXA의 서열을 가진 정방향 프라이머와, Xn-m’XqXB’의 서열을 가진 역방향 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트;
(여기서, Xn, Xq, XA, XB는 상기 압타머와 동일하고,
Xn-m’는 상기 Xn-m의 역상보 서열을 가지되 U로 3’단의 T를 대체하며, XB’는 상기 XB의 역상보 서열이고, U는 우라실 뉴클레오티드이며,
정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 목적 DNA 서열을 주형으로 하여 PCR 증폭을 수행함).
16. 폴리메라아제 연쇄 반응에 적용되는 DNA 폴리메라아제;
DNA 리가아제(바람직하게는 T4 DNA 리가아제);
우라실 특이적 절단 시약(바람직하게는 우라실 특이적 절단 효소);
회전 바퀴 증폭에 적용되는 DNA 폴리메라아제(바람직하게는 phi29 DNA 폴리메라아제); 및
II형 제한 핵산내부가수분해효소를 포함하는 외가닥 DNA 제조용 키트.
17. 청구항 16에 있어서,
청구항 14에서 정의한 좌측 압타머와 우측 압타머, 및 청구항 15에서 정의한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
18. 청구항 16 또는 17에 있어서,
DNA 리가아제와 우라실 특이적 절단 시약은 동일한 용기에 배치되는 것을 특징으로 하는 키트.
[발명의 효과]
본 발명에 따른 외가닥 DNA의 제조공정은 고품질의 외가닥 DNA 주형의 방법을 구현할 수 있다. 상기 공정은 대부분 조작 단계가 항온 배양 조건에서 수행되므로, 생산 설비 및 규모의 확대에 있어서 모두 높은 적합성을 가지고 있다. 또한, 제조 원료가 일반적인 프라이머와 효소 제제이므로, 고가의 스트렙트아비딘으로 수식한 마그네틱 비드를 수입할 필요가 없고, 외가닥 DNA를 대량(몇십 ug) 생산 시 원가를 크게 낮출 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 우라실로 수식한 프라이머를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)에 대해 PCR 증폭을 수행하여 획득한 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 방출한 목적 단편의 긴 외가닥 단량체의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 3은 실시예 1에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 획득한 생성물에 대해 마그네틱 비드 정제를 수행하기 전과 후의 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다. 여기서, 레인 1은 정제 전의 조생성물이고, 레인 2는 마그네틱 비드 정제를 수행한 후의 생성물이다.
도 4는 실시예 2에서 우라실로 수식한 프라이머를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)에 대해 PCR 증폭을 수행하여 획득한 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 5는 실시예 2에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 방출한 목적 단편의 긴 외가닥 단량체의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 6은 실시예 2에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 획득한 생성물에 대해 마그네틱 비드 정제를 수행한 후의 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 7은 실시예 3에서 우라실로 수식한 프라이머를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)에 대해 PCR 증폭을 수행하여 획득한 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 8은 실시예 3에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 방출한 목적 단편의 긴 외가닥 단량체의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 9는 실시예 3에서 BspQI 제한 핵산내부가수분해효소로 머리핀 구조를 절단한 후 획득한 생성물에 대해 마그네틱 비드 정제를 수행한 후의 생성물의 아라로오스 겔 전기영동 결과이다.
도 10은 대용량 염기서열 분석법(NGS)에 의해 검출된 실시예 1에 따른 생성물의 서열이다.
도 11은 대용량 염기서열 분석법(NGS)에 의해 검출된 실시예 2에 따른 생성물의 서열이다.
도 12는 대용량 염기서열 분석법(NGS)에 의해 검출된 실시예 3에 따른 생성물의 서열이다.
본 발명에 따른 방법을 명확하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부 도면 및 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1:
본 실시예에서, 상기 공정을 통해 길이가 253nt인 긴 외가닥 DNA 48ug를 제조하였다(순도 91%, 서열 정확도 100%).
테스트 샘플의 DNA 서열(SEQ ID NO: 1) 길이는 253nt이었다.
본 실시예에 따른 외가닥 DNA의 제조 과정은 다음과 같다.
1) 단계 1(서열 분석 과정): 생물정보학 소프트웨어 분석을 통해 서열에 BspQI 효소 절단 부위가 포함되어 있지 않는 것을 확인하고, 이 효소를 최종의 절단 효소로 선택하였다.
2) 단계 2(프라이머 설계 과정): 목적 서열의 양단에 각각 서열 5’-AACTATACTGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO:4)와 5’-CCTTGAAGAGCAACTATA-3’(SEQ ID NO:5)를 부가한 후 유전자 합성을 수행하였다. PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머 Pf: 5’-AACTATACUGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO: 5)와 역방향 프라이머 Pr: 5’-TATAGTUGCTCTTCAAGG-3’(SEQ ID NO:6)이고, 상기 프라이머의 합성을 수행하였다.
3) 단계 3(주형 증폭 제조-자동 환형성): 우라실로 수식한 프라이머(Pf, Pr)를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)을 증폭하였다. PCR 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00001
PCR 반응 과정은 다음과 같다.
Figure pct00002
30 사이클
PCR 생성물의 전기영동도는 도 1에 나타낸 바와 같다.
이후, 상기 PCR 생성물을 회수하고 자동 환형성 반응을 수행하였다. USER 효소와 T4 DNA 리가아제로 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA를 제조하는 자동 환형성 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00003
반응 조건: 37℃, 30min, 20℃, 30min, 온도를 4℃로 하강하고 보존한다.
4) 단계 4(회전 바퀴형 복제): 단계 3에서 제조한 노치를 가진 환형 DNA 샘플 100 ng에 대해 200ul의 PCR 튜브에서 회전 바퀴형 복제를 수행하였다(반응 조건: 30℃에서 4~8시간 배양한 후 80℃, 20min으로 효소를 불활성화). 회전 바퀴형 복제의 반응 시스템은 다음과 같다.
(100ul의 경우)
Figure pct00004
5) 단계 5(어닐링-자동 폴딩): 상기 회전 바퀴형 복제에 의한 생성물에 대해 어닐링을 수행하여 설계한 머리핀 구조를 형성하였다. 어닐링 과정: 80℃, 5min, 0.1℃/s로 65℃까지 하강, 65℃, 5min, 0.1℃/s로 42℃까지 하강, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s로 4℃까지 하강한 후 4℃에서 보존한다.
6) 단계 6(제한 핵산내부가수분해효소 절단-목적 단편의 긴 외가닥 단량체 방출): 상기 반응 생성물에 제한 핵산내부가수분해효소 완충액 15ul 10x, 앞에서 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 2ul를 첨가하고, 부피가 150ul 되도록 ddH2O를 첨가하며, 제한 핵산내부가수분해효소를 최적 반응 온도에서 60min 동안 방치한 후 열변성 불활성화를 수행하였다. 반응 조생성물의 전기영동도는 도 2에 나타낸 바와 같다.
7) 단계 7(정제, 농축): 제한 핵산내부가수분해효소로 절단한 생성물은 목적 단편의 외가닥 DNA 생성물의 머리핀 구조를 포함하였다. 상기 목적 서열의 길이가 300nt보다 작으므로, 마그네틱 비드를 통해 고효율 정제를 수행하였다. 정제 전후의 대비는 도 3과 같다. 여기서, 레인 1은 조생성물이고, 레인 2는 마그네틱 비드로 정제한 후의 생성물이며, 머리핀 구조가 효과적으로 제거되어 순도가 91%이었다. 대용량 염기 서열 분석법(NGS)에 의해 검출한 서열은 도 10과 같고, SEQ ID NO: 1과 일치하다.
실시예 2:
본 실시예에서, 상기 공정을 통해 길이가 1350nt인 긴 외가닥 DNA(SEQ ID NO: 2) 40ug를 제조하였다(순도 97%, 서열 정확도 100%).
테스트 샘플의 DNA 서열 길이는 1350nt이었다.
본 실시예에 따른 긴 외가닥 DNA의 제조 과정은 다음과 같다.
1) 단계 1(서열 분석 과정): 생물정보학 소프트웨어 분석을 통해 서열에 BspQI 효소 절단 부위가 포함되어 있지 않는 것을 확인하고, 이 효소를 최종의 절단 효소로 선택하였다.
2) 단계 2(프라이머 설계 과정): 목적 서열의 양단에 각각 서열 5’-AACTATACTGCTCTTCA-3’와 5’-CCTTGAAGAGCAACTATA-3’를 부가한 후 유전자 합성을 수행하였다. PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머 Pf: 5’-AACTATACUGCTCTTCA-3’와 역방향 프라이머 Pr: 5’-TATAGTUGCTCTTCAAGG-3’이고, 프라이머 합성을 수행하였다.
3) 단계 3(주형 증폭 제조-자동 환형성): 우라실로 수식한 프라이머(Pf, Pr)를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)를 증폭하였다. PCR 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00005
PCR 반응 과정은 다음과 같다.
Figure pct00006
30 사이클
PCR 생성물은 도 5에 나타낸 바와 같다.
이후, 상기 PCR 생성물을 회수하고 자동 환형성 반응을 수행하였다. USER 효소와 T4 DNA 리가아제로 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA를 제조하는 자동 환형성 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00007
반응 조건: 37℃, 30min, 20℃, 30min, 온도를 4℃로 하강하고 보존한다.
4) 단계 4(회전 바퀴형 복제): 단계 3에서 제조한 노치를 가진 환형 DNA 샘플 100ng에 대해 1.5ml의 원심관에서 회전 바퀴형 복제를 수행하였다(반응 조건: 30℃에서 4~8 시간 배양한 후 80℃, 20min으로 효소를 불화성화). 회전 바퀴형 복제의 반응 시스템(8 ml 반응 시스템)은 다음과 같다.
Figure pct00008
5) 단계 5(어닐링-자동 폴딩): 상기 회전 바퀴형 복제에 의한 생성물에 대해 어닐링을 수행하여 설계한 머리핀 구조를 형성하였다. 어닐링 과정: 80℃, 5min, 0.1℃/s로 65℃까지 하강, 65℃, 5min, 0.1℃/s로 42℃까지 하강, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s로 4℃까지 하강한 후 4℃에서 보존한다.
6) 단계 6(제한 핵산내부가수분해효소 절단-목적 단편의 긴 외가닥 단량체 방출): 상기 반응 생성물에 제한 핵산내부가수분해효소 완충액 150ul 10x, 앞에서 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 20ul를 첨가하고, 부피가 1500ul 되도록 ddH2O를 첨가하며, 제한 핵산내부가수분해효소를 최적 반응 온도에서 60min 동안 방치한 후 열변성 불활성화를 수행하였다. 반응 조생성물은 도 5에 나타낸 바와 같다.
7) 단계 7(정제, 농축)：제한 핵산내부가수분해효소로 절단한 생성물은 목적 단편의 외가닥 DNA 생성물의 머리핀 구조를 포함하였다. 상기 목적 서열의 길이가 300nt보다 크므로, 아라로오스 겔 전기영동을 통해 겔을 절단한 후 회수하고 정제하였다. 정제 후의 최종 생성물은 도 6과 같다. 여기서, 레인 1은 정제 후의 생성물이고, 머리핀 구조와 이중 가닥 DNA의 오염은 모두 효과적으로 제거되었다(순도 97%, 서열 정확도 100%). 대용량 염기서열 분석법(NGS)에 의해 검출한 서열은 도 11과 같고, SEQ ID NO: 2와 일치하다.
실시예 3:
본 실시예에서, 상기 공정을 통해 길이가 2350nt인 긴 외가닥 DNA(SEQ ID NO: 3) 10ug를 제조하였다(순도 93%, 서열 정확도100%).
테스트 샘플의 DNA 서열 길이는 2350nt이었다.
본 실시예에 따른 긴 외가닥 DNA의 제조 과정은 다음과 같다.
1) 단계 1(서열 분석 과정): 생물정보학 소프트웨어 분석을 통해 서열에 BspQI 효소 절단 부위가 포함되어 있지 않는 것을 확인하고, 이 효소를 최종의 절단 효소로 선택하였다.
2) 단계 2(프라이머 설계 과정): 목적 서열의 양단에 각각 서열 5’-AACTATACTGCTCTTCA-3’와 5’-CCTTGAAGAGCAACTATA-3’를 부가한 후 유전자 합성을 수행하였다. PCR 증폭 프라이머는 정방향 프라이머 Pf: 5’-AACTATACUGCTCTTCA-3’와 역방향 프라이머 Pr: 5’-TATAGTUGCTCTTCAAGG-3’이고, 프라이머 합성을 수행하였다.
3) 단계 3(주형 증폭 제조-자동 환형성): 우라실로 수식한 프라이머(Pf, Pr)를 이용하여 합성 단편(양단에 링커 구비)을 증폭하였다. PCR 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00009
PCR 반응 과정은 다음과 같다.
Figure pct00010
30 사이클
PCR 생성물의 전기영동도는 도 7에 나타낸 바와 같다.
이후, 상기 PCR 생성물을 회수하고 자동 환형성 반응을 수행하였다. USER 효소와 T4 DNA 리가아제로 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA를 제조하는 자동 환형성 반응 시스템은 다음과 같다.
Figure pct00011
반응 조건: 37℃, 30min, 20℃, 30min, 온도를 4℃로 하강하고 보존한다.
4) 단계 4(회전 바퀴형 복제): 단계 3에서 제조한 노치를 가진 환형 DNA 샘플 100ng에 대해 1.5ml의 원심관에서 회전 바퀴형 복제를 수행하였다(반응 조건: 30℃에서 4~8 시간 배양한 후, 80℃ 20min으로 효소를 불화성화). 회전 바퀴형 복제의 반응 시스템(최종 반응 시스템은 4ml, 1 ml/튜브)은 다음과 같다.
Figure pct00012
5) 단계 5(어닐링-자동 폴딩): 상기 회전 바퀴형 복제에 의한 생성물의 온도를 하강시키고 어닐링을 수행하여 설계한 머리핀 구조를 형성하였다. 어닐링 과정: 80℃, 5min, 0.1℃/s로 65℃까지 하강, 65℃, 5min, 0.1℃/s로 42℃까지 하강, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s로 4℃까지 하강한 후 4℃에서 보존한다.
6) 단계 6(제한 핵산내부가수분해효소 절단-목적 단편의 긴 외가닥 단량체 방출): 상기 반응 생성물에 제한 핵산내부가수분해효소 완충액 150ul 10x, 앞에서 선택한 II형 제한 핵산내부가수분해효소 20ul를 첨가하고, 부피가 1500ul로 되도록 ddH2O를 첨가하며, 제한 핵산내부가수분해효소를 최적 반응 온도에서 60min 동안 방치한 후 열변성 불활성화를 수행하였다. 반응 조생성물의 전기영동도는 도 9에 나타낸 바와 같다.
7) 단계 7(정제, 농축): 제한 핵산내부가수분해효소로 절단한 생성물은 목적 단편의 외가닥 DNA생성물의 머리핀 구조를 포함하였다. 상기 목적 서열의 길이가 300nt보다 크므로, 아라로오스 겔 전기영동을 통해 겔 절단을 수행한 후 회수하고 정제하였다. 정제 후의 최종 생성물의 전기영동도는 도 9에 나타낸 바와 같다. 여기서, 레인 1은 정제 전의 조생성물이고, 레인 2는 정제 후의 생성물이며, 머리핀 구조와 이중 가닥 DNA의 오염이 모두 제거되었다(순도 95%, 서열 정확도 100%). 대용량 염기서열 분석법(NGS)에 의해 검출한 서열은 도 12와 같고, SEQ ID NO: 3과 일치하다.
상기 3개의 실시예에 따르면, 본 방법은 길이가 150~2500nt인 긴 외가닥 DNA를 생산할 수 있다. 상기 방법은 다양한 길이를 가진 서열에 모두 적용될 수 있고, 기기에 대한 요구가 낮으며, 생산 규모를 확대할 수 있다. 정제 후의 긴 외가닥 DNA는 순도가 높고, 서열 정확도가 100%이므로, CRISPR 유전자로 편집한 고효율 유전자로서 주형에 도입할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU GENSCRIPT BIOTECH CO., LTD. <120> SINGLE-CHAIN DNA SYNTHESIS METHOD <130> C18P0099 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 253 <212> DNA <213> N/A <400> 1 tcaaacgcta ctactattag tagaattgat gccacctttt cagctcgcgc cccaaatgaa 60 aatatagcta aacaggttat tgaccatttg cgaaatgtat ctaatggtca aactaaatct 120 actcgttcgc agaattggga atcaactgtt acatggaatg aaacttccag acaccgtact 180 ttagttgcat atttaaaaca tgttgagcta cagcaccaga ttcagcaatt aagctctaag 240 ccatccgcaa aaa 253 <210> 2 <211> 1350 <212> DNA <213> N/A <400> 2 tcaaacgcta ctactattag tagaattgat gccacctttt cagctcgcgc cccaaatgaa 60 aatatagcta aacaggttat tgaccatttg cgaaatgtat ctaatggtca aactaaatct 120 actcgttcgc agaattggga atcaactgtt acatggaatg aaacttccag acaccgtact 180 ttagttgcat atttaaaaca tgttgagcta cagcaccaga ttcagcaatt aagctctaag 240 ccatccgcaa aaatgacctc ttatcaaaag gagcaattaa aggtactctc taatcctgac 300 ctgttggagt ttgcttccgg tctggttcgc tttgaagctc gaattaaaac gcgatatttg 360 aagtctttcg ggcttcctct taatcttttt 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gtggtattcc taaatctcaa 720 ctgatgaatc tttctacctg taataatgtt gttccgttag ttcgttttat taacgtagat 780 ttttcttccc aacgtcctga ctggtataat gagccagttc ttaaaatcgc ataaggtaat 840 tcacaatgat taaagttgaa attaaaccat ctcaagccca atttactact cgttctggtg 900 tttctcgtca gggcaagcct tattcactga atgagcagct ttgttacgtt gatttgggta 960 atgaatatcc ggttcttgtc aagattactc ttgatgaagg tcagccagcc tatgcgcctg 1020 gtctgtacac cgttcatctg tcctctttca aagttggtca gttcggttcc cttatgattg 1080 accgtctgcg cctcgttccg gctaagtaac atggagcagg tcgcggattt cgacacaatt 1140 tatcaggcga tgatacaaat ctccgttgta ctttgtttcg cgcttggtat aatcgctggg 1200 ggtcaaagat gagtgtttta gtgtattctt tcgcctcttt cgttttaggt tggtgccttc 1260 gtagtggcat tacgtatttt acccgtttaa tggaaacttc ctcatgaaaa agtctttagt 1320 cctcaaagcc tctgtagccg ttgctaccct cgttccgatg ctgtctttcg ctgctgaggg 1380 tgacgatccc gcaaaagcgg cctttaactc cctgcaagcc tcagcgaccg aatatatcgg 1440 ttatgcgtgg gcgatggttg ttgtcattgt cggcgcaact atcggtatca agctgtttaa 1500 gaaattcacc tcgaaagcaa gctgataaac cgatacaatt aaaggctcct 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sequence <220> <223> left adapter <400> 4 aactatactg ctcttca 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> right adapter <400> 5 ccttgaagag caactata 18 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer with U modification <400> 6 aactatacug ctcttca 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer with U modification <400> 7 tatagtugct cttcaagg 18

Claims (18)

  1. (1) 제1 가닥, 및 제1 가닥과 역상보 관계인 제2 가닥으로 구성된 주형 이중 가닥 DNA 분자를 획득하는 단계;
    (여기서, 제1 가닥의 서열 구조는
    5’ 좌측 매칭 서열-목적 외가닥 DNA 서열-우측 매칭 서열 3’ (I)이며,
    그중, 좌측 매칭 서열의 서열 구조는 XnTXqXA이고, 우측 매칭 서열의 서열 구조는 XBXq’Xn-m이며,
    식에서, Xn은 n개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열이며, 5’ 뉴클레오티드는 A이고, n은 적어도 4인 임의의 정수이며,
    Xq는 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 인식 부위 서열이고 목적 외가닥 DNA 서열에 존재하지 않으며, Xq’는 Xq의 역상보 서열이고, XA, XB는 각각 임의의 0개 내지 복수개의 뉴클레오티드이며, XqXA, XBXq’는 각각 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위를 구성하고, 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소가 XqXA 서열의 3’단 및 XB Xq’ 서열의 5’단에서 절단되는 것을 허용하며,
    Xn-m은 Xn의 5’로부터 n-m개의 뉴클레오티드 서열이고, m은 1~3의 정수이며,
    A는 아데닌 뉴클레오티드이고, T는 티민 뉴클레오티드)
    (2) 주형 이중 가닥 DNA 분자를 주형으로 하고 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 PCR 증폭을 수행함으로써 목적 외가닥 DNA 서열을 가진 제1 가닥 및 상기 제1 가닥과 역상보 관계인 제2 가닥을 포함하는 DNA 이중 가닥 분자를 획득하는 단계;
    (여기서, 상기 정방향 프라이머는 XnUXqXA의 서열을 포함하고, 상기 역방향 프라이머는 Xn-m’XqXB’의 서열을 포함하며, 그중 Xn, Xq, XA, XB는 (1)에 기재된 바와 같고, Xn-m’는 상기 Xn-m의 역상보 서열을 가지되 U로 3’단의 T를 대체하며, XB’는 상기 XB의 역상보 서열이고, U는 우라실 뉴클레오티드)
    (3) 우라실 특이적 절단 시약을 이용하여 DNA 이중 가닥 분자의 두 가닥에 포함되는 U 부위에서 각각 절단함으로써 DNA 이중 가닥 분자의 2개의 말단에 점착성 말단을 형성하는 단계;
    (4) 리가아제 존재 하에 DNA 이중 가닥 분자의 2개의 점착성 말단을 상호 연결시켜 제1 가닥이 노치를 구비하는 환형 이중 가닥 DNA를 형성하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 획득한 노치를 가진 환형 이중 가닥 DNA에 대해 회전 바퀴형 복제를 수행하는 단계;
    (여기서, 복제는 DNA 이중 가닥 분자의 센스 제1 가닥의 노치를 기점으로 하고, 제2 가닥을 주형으로 함으로써 복수개의 직렬 연결된 서열 구조를 포함하는 레플리콘을 획득한 것이며,
    상기 서열 구조는
    5’-XnTXqXA-목적 외가닥 DNA서열-XBXq ’-3’ (II)임)
    (6) 레플리콘을 어닐링함으로써, 레플리콘의 인접한 2개의 목적 외가닥 DNA 서열 사이에 머리핀 구조를 형성하는 단계;
    (여기서, 상기 머리핀 구조는 Xq’XnTXq의 서열로 구성되는 것이 바람직함)
    (7) 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소로 레플리콘을 처리하고, 각각 인접한 목적 외가닥 DNA 서열 사이의 XBXq’XnTXqXA 서열의 5’단과 3’단에서 절단하여 복수개의 목적 외가닥 DNA 서열을 방출하는 단계;를 포함하는 목적 외가닥 DNA의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소는 AlwI, BbsI, BbvI, BceAI, BCIVI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, HphI, HpyAV, FokI, FauI, HgaI에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 우라실 특이적 절단 시약은 우라실 특이적 절단 효소(USERTM)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리가아제는 T4 DNA 리가아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(3)와 단계(4)는 동일한 반응 시스템에서 우라실 특이적 절단 시약 및 리가아제가 동시에 존재하는 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    회전 바퀴형 복제는 연속 복제 능력을 가진 DNA 폴리메라아제를 사용하고, 바람직하게는 phi29 DNA 폴리메라아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소는 BspQI인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    XqXA의 서열은 GCTCTTCN이며, 여기서 N은 A, T, C 또는 G이고, 바람직하게는 A이며; XBXq’의 서열은 N1N2N3N4GAAGAGC이고, N1, N2, N3, N4는 독립적으로 A, T, C 또는 G에서 선택되며; XBXq’의 서열은 CCTTGAAGAGC인 것이 더욱 바람직하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    n은 6~10인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    n은 8인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    m은 1인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Xn의 서열이 AACTATAC이고, Xn-m의 서열이 AACTATA인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 외가닥 DNA의 길이는 150~2500nt인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 주형 이중 가닥 DNA 분자를 제조하기 전에 목적 외가닥 DNA서열을 분석하여 목적 외가닥 DNA 서열에 절단 부위가 없는 II형 제한 핵산내부가수분해효소를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. XnTXqXA로 나타낸 서열을 가진 좌측 압타머와, XBXq’Xn-m로 나타낸 서열을 가진 우측 압타머를 포함하는 목적 DNA 서열 증폭용 키트;
    (식에서, Xn은 n개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 5’ 뉴클레오티드는 A이고, n은 적어도 4인 임의의 정수이며 6~8이 바람직하고, 8이 더욱 바람직하며,
    Xq는 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 인식 부위 서열이고 목적 외가닥 DNA 서열에 존재하지 않으며, Xq’는 Xq의 역상보 서열이고, XA, XB는 각각 임의의 0개 내지 복수개의 뉴클레오티드이며, XqXA, XBXq’는 각각 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소의 절단 부위를 구성하고, 상기 II형 제한 핵산내부가수분해효소가 XA의 3’단 및 XB의 5’단에서 절단되는 것을 허용하며,
    Xn-m은 Xn의 5’로부터 n-m개의 뉴클레오티드의 서브 서열이고, m은 1~3의 정수이며,
    A는 아데닌 뉴클레오티드이고, T는 티민 뉴클레오티드).
    [청구항 15]
    제14항에 있어서,
    XnUXqXA의 서열을 가진 정방향 프라이머와, Xn-m’XqXB’의 서열을 가진 역방향 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트;
    (여기서, Xn, Xq, XA, XB는 상기 압타머와 동일하고,
    Xn-m’는 상기 Xn-m의 역상보 서열을 가지되 U로 3’단의 T를 대체하며, XB’는 상기 XB의 역상보 서열이고, U는 우라실 뉴클레오티드이며,
    정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 목적 DNA 서열을 주형으로 하여 PCR 증폭을 수행함).
  16. 폴리메라아제 연쇄 반응에 적용되는 DNA 폴리메라아제;
    DNA 리가아제(바람직하게는 T4 DNA 리가아제);
    우라실 특이적 절단 시약(바람직하게는 우라실 특이적 절단 효소);
    회전 바퀴 증폭에 적용되는 DNA 폴리메라아제(바람직하게는 phi29 DNA 폴리메라아제); 및
    II형 제한 핵산내부가수분해효소를 포함하는 외가닥 DNA 제조용 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    제14항에서 정의한 좌측 압타머와 우측 압타머, 및 제15항에서 정의한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    DNA 리가아제와 우라실 특이적 절단 시약은 동일한 용기에 배치되는 것을 특징으로 하는 키트.
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