CN112941635A - 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 - Google Patents

一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域的方法及试剂盒，具体而言，具体为一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用；所述试剂盒包括：酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；所述第二酶液为T4 DNA连接酶；所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，所述第二缓冲液由浓度为0.1‑0.6M的Tris‑HCl、浓度为0.05‑0.1M的MgCl2、浓度为0.01‑0.05M的DTT、浓度为1‑10mM的ATP、浓度为30％‑50％的PEG6000和浓度为10‑20％的1,2丙二醇混合而成；接头、index序列和通用引物。

Description

一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域的方法及试剂盒，具体而言，具体为一 种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法。
背景技术
高通量测序技术，在有些文献中称其为下一代测序技术(Next generationSequencing，NGS)，是对传统测序(Sanger测序)一次划时代 的革命性的改变，一次测序可对几十万到几百万条DNA分子序列进 行测定。
近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序， 全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提 供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大， 或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少 (低于50ng)。
ctDNA由于携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅 存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞 DNA中出现，相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。 此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地 监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。
因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点， 具有广泛前景。虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但血液中游离 DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA， 按照每个单体型基因组DNA为3.3pg计算。一共只有3000个左右的 基因组分子。而肿瘤的ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有 0.1％-10％。
对于这些微量DNA样本，高建库转化效率是提高测序检测中对 低频变异分析效率的关键参数之一。文库转化率也就是原始DNA分 子数与两端连上接头的分子数比例。这也是建库试剂盒最核心的性能 表现。对于后续靶向捕获或生物信息分析都是非常重要的。更高的文 库转化率带来更高的库容，也就是文库分子多样性，无论对于提高样 本检测的灵敏度还是配合分子标签法提高检测的特异性都是首要条 件。针对微量DNA样本(＜50ng)，目前常用的国内外商品化的建库试 剂盒的建库转化效率偏低，如其中行业口碑很好，也是应用最广泛的 罗氏KAPA Biosystems的KAPA Hyper系列建库试剂盒官方说明书上文 库转化率为5-40％，还不能满足很多应用场景。因此，仍需要对现有 技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库转化率较低的缺陷。
发明内容
针对背景技术中提到的问题，本发明提供一种提高文库转化率的 二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种提 高文库转化率的二代测序建库试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；
所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow 片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；
所述第二酶液为T4 DNA连接酶；
所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；
(2)缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液 和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，
所述第一缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl发卡型接头、浓度 为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为0.1-1mM 的dNTP和浓度为1-10mM的dATP混合而成；
所述第二缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl、浓度为0.05-0.1M 的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为1-10mM的ATP、浓度 为30％-50％的PEG6000和浓度为10-20％的1,2丙二醇混合而成；
(3)接头、index序列和通用引物。
作为优选，所述第一酶混液中T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为 0.05～0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL，所 述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.05U/μL，所述Taq酶的工作浓 度为0.01-0.05U/μL。
作为优选，所述第一缓冲液中Tris-HCl的工作浓度为40～100mM， 所述MgCl2的工作浓度为5～20mM，所述DTT的工作浓度为1～ 10mM，所述dNTP混合液的工作浓度为0.04～0.12mM，所述dATP 的工作浓度为0.2-1.0mM。
作为优选，所述第二缓冲液中，所述Tris-HCl的工作浓度为10～ 40mM，所述MgCl2的工作浓度为1～5mM，所述DTT的工作浓度为 1～3mM，所述ATP的工作浓度为0.5～1.5mM，所述PEG6000的工 作浓度为5％-10％w/v，所述1,2丙二醇的工作浓度为1％-4％v/v。
作为优选，所述T4 DNA连接酶的工作浓度为10～50U/μL；所述 2X QuarTaq HiFiHotStart混合液的工作浓度为1X。
作为优选，所述接头为发卡型接头，由接头序列自身退火形成具 有一个粘末端的茎环结构。
作为优选，所述接头序列为序列表的序列1所示；所述的index 序列如序列表的序列2所示；所述通用引物序列为序列表的序列3所 示。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种提 高文库转化率的的方法，包括如下步骤：
对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；
利用第一酶混液和第一缓冲液对DNA片段进行末端修复及加A， 得到修复片段；
在DNA片段进行末端修复及加A过程中，利用同样具有dATP偏 爱性DNA末端非模板依赖性加A活性的Taq酶完成DNA末端的加A；
在接头连接中添加具有连接增强作用的小分子物质；
在末端修复及加A步骤中，将DNA片段与上述的末端修复与加 A缓冲液和末端修复与加A酶混合后，于20℃-37℃孵育15-30分钟， 37℃-65℃孵育15-30分钟；
利用第二酶液、第二缓冲液以及接头对所述修复片段进行接头连 接，得到带接头片段；
利用第三酶混液和index序列、通用引物对所述带接头片段进行PCR富集，得到所述DNA文库。
作为优选，在得到所述带接头片段的步骤后，以及在对所述带接 头片段进行PCR富集之后，所述方法还包括进行磁珠纯化的步骤。
作为优选，所述连接增强剂可以为PEG6000或1,2丙二醇。
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明的提高文库转化率 的二代测序建库试剂盒及其方法将通过调整缓冲液配方将DNA末端 修复/加A一步完成，减少纯化导致的DNA损失，提高了DNA文库制 备的效率。同时整体所需时间从2个半小时左右减少到1个半小时左 右，且省去的DNA纯化步骤减少了试剂耗材消费，节约了成本，降 低了制备DNA文库所需的最低DNA质量；
本发明方法采用特殊的茎环型接头，由接头序列自身退火形成具 有一个粘末端的茎环结构，另一段封闭，不包含类似Y接头的两个游 离末端，降低接头连接过程的空间位阻和自我连接，比传统的Y型接 头显著提高连接步骤效率，进而贡献了高的文库转化率。
本发明方法在上述接头连接的步骤中通过添加具有连接增强作 用的小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心区域， 使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片 段被成功连上接头序列，进一步提高了文库的转化率。
附图说明
图1为本发明的方法中DNA文库构建流程示意图；
图2为本发明的接头的结构示意图；
图3为本发明优选的实施例中所构建的DNA文库的检测结果图；
图4为本发明的DNA文库转化率与现有技术的DNA文库转化 率的对比示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施 例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施 例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
针对背景技术部分提到的现有微量样本建库转化率低的技术问题，在 本发明一种典型的实施方式中，提供了一种高通量测序文库的构建方法， 该构建方法包括：对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；利用 第一酶混液和第一缓冲液对DNA片段进行末端修复及加A，得到修复片段； 利用第二酶液、第二缓冲液以及接头对修复片段进行接头连接，得到带接 头片段；利用第三酶混液(常规高保真Taq酶和dNTP组成的PCR混合液) 和index序列、通用引物对带接头片段进行PCR富集，得到DNA文库。
本发明的上述构建方法，该处的DNA片段是指待检测样本经过处理或 不经过处理得到的短片段DNA。如待检测的样本可以是各种原核真核微生 物基因组、动植物基因组以及人和小鼠基因组等，基因组提取后进行处理 得到小片段DNA(通常为100-1000bp)。如果待检测样本是血浆游离 DNA(cfDNA等)或其它来源的小片段DNA或cDNA等则无需再进行片段化的 处理。
在DNA片段进行末端修复及加A过程中，利用同样具有dATP偏爱性 DNA末端非模板依赖性加A活性的Taq酶完成DNA末端的加A；一方面， Taq酶仅在高温时才具有活性，而此时T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激 酶、Klenow片段早已热变性失活，另一方面，T4 DNA聚合酶、T4多聚核 苷酸激酶、Klenow片段均可在较低温度20℃完成活性，此时Taq酶几乎 没有活性，不会干扰DNA平末端化过程，因此在合适的反应条件中，以上 过程可以在一个反应体系中完成，减少了反应步骤和纯化损失。
本发明提供的使用的几种酶混合共同对片段化DNA进行末端修复与加 A，而且产物可直接用于连接反应。各种酶兼容性较好，无互相干扰的现 象，同时使用国产原料代替进口原料试剂，极大地减少了试剂盒的生产成 本。
在上述文库构建方法中，在常规的用dNTP修复的基础上，通过在末 端修复加A步骤中额外增加dATP的用量，提高了加A的效率，进而得到 更多修复后3’末端加A的修复片段，更多修复后3’末端加A的修复片 段经后续接头连接及扩增步骤，使得所构建得到的高通量测序文库具有更 多的目的片段，进而提高了低起始量样本的建库成功率。
在上述优选实施例的基础上，为了进一步提高连接效率及建库转化率， 在本发明另一种优选的实施例中，在上述接头连接的步骤中通过添加具有 连接增强作用的小分子物质，利用这些小分子物质刺激连接酶的活性中心 区域，使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片 段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而 得到了目的扩增片段量更多的高通量测序文库。
在上述优选的实施例中，连接增强剂的作用是增加连接酶的连接活性， 因而，任何具有上述活性的试剂均适用于本发明。在本发明中，上述小分 子物质作为连接增强剂优选但不仅限于PEG6000和1,2丙二醇。
在上述文库构建方法中，为了进一步提高建库转化率及有效文库库容， 在本发明的又一种优选的实施例中，在上述接头连接的步骤中通过添加发 卡型接头，非游离末端的接头对于提高文库转化率非常关键同时PCR 过程中预先的37度切开，不增加操作步骤；利用其自身的结构特点， 能大大降低接头的自我连接，提高建库效率及有效文库库容。
在上述优选实施例的基础上，为了进一步提高建库转化率及有效文库 库容，在本发明另一种优选的实施例中，在得到带接头片段的步骤后，以 及在对带接头片段进行PCR富集之后，该方法还包括进行磁珠纯化的步骤。
在接头连接的步骤，为了使修复片段尽可能多地连上接头序列，通常 使用过量的接头序列，因而在接头连接步骤之后，会有部分过剩的未连上 修复片段的接头序列。
在对连上接头的连接片段进行扩增之前，增加磁珠纯化的步骤，有助 于将大部分多余的未连上片段的接头去除，减少后续对扩增步骤的不利影 响，提高目的片段的有效扩增，进而提高所得文库中的目的片段的含量。
在PCR扩增步骤，也会适量增加引物的使用量，在扩增之后，会有部 分未使用的引物序列。增加纯化步骤，去除多余的引物序列，减少后续对 测序不利的影响。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。本发明的 流程示意图如图1所示。下面实例以人基因组DNA的单一PCR产物片段 (100bp)作为实验材料，模拟ctDNA样本进行实验，具体实验步骤如下：
(1)样本准备：用Qbuit精确测定PCR产物片段的浓度。按测定的 浓度计算10ng所需要添加的片段体积，剩下用水(NFW)补足至42μL。
(2)末端修复及加A：利用第一酶混液和第一缓冲液对DNA片段进行 末端修复及加A，得到修复片段。具体反应体系如下表1所示
表1
组分 体积(μL)
DNA 42
第一缓冲液 6.8
第一酶混液 1.2
总计 50.0
其中，第一酶混液组分为：T4多聚核苷酸激酶0.1U/μL，T4 DNA聚 合酶0.05U/μL，Klenow片段0.01U/μL，Taq酶0.01U/μL。
第一缓冲液组分为：Tris-HCl 70mM，MgCl2 10mM，DTT 5mM，dNTP 0.08mM， dATP0.6mM。
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置 30℃孵育30分钟；65℃孵育30分钟。取出反应管进行下一步反应。
(3)接头连接：向经步骤(2)处理过的修复片段及所在反应液中加 入连接试剂，将接头与DNA片段连接起来。这一步骤中使用的试剂包括第 二酶液和第二缓冲液。反应体系如下表2所示
表2
Figure BDA0002873948750000091
Figure BDA0002873948750000101
其中，第二酶液组分为：T4 DNA连接酶27U/μL。
第二缓冲液组分为：Tris-HCl 26mM，MgCl2 3mM，DTT 1.8mM，ATP 1mM， PEG60007％(w/v)，1,2丙二醇2％(v/v)。
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置 25℃15min。反应结束后取出反应管进行下一步纯化过程。
该步骤中使用的接头为发卡型接头，其结构示意图如图2所示，其序 列为(序列表的序列1)：
Figure BDA0002873948750000102
接头引物中，下划线标注dUTP碱基。
接头引物中，方框标注的两个区段反向互补、形成茎环结构的双链区， 它们之间的区段(不含方框标注区)形成茎环结构的单链环状区。
P为磷酸基团修饰；*为硫代磷酸键修饰。
(4)带接头片段纯化：连接完成后的反应体系使用0.8X磁珠进行纯 化。然后分别经过80％乙醇漂洗、NFW洗脱得到纯化后的带接头片段。
(5)PCR扩增：利用第三酶混液和index序列、通用引物对纯化后的 带接头片段进行PCR富集，得到DNA文库。具体见表3
表3
Figure BDA0002873948750000103
Figure BDA0002873948750000111
其中，第三酶混液的工作浓度为1X。
Index序列(序列表的序列2)为：
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGAT*C3’
通用引物(序列表的序列3)为：
5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG*A 3’
其中，引物序列中的“*”是指前后两个核苷酸中间的连接键具有硫 代磷酸酯修饰。“YYYYYYYY”代表Index，实际应用中用于引入样本Index。
接着，按照表4的PCR程序进行PCR扩增
Figure BDA0002873948750000112
Figure BDA0002873948750000121
用于高效连接的特殊茎环型接头在这个步骤利用表3的QU试剂 进行37度切割后进行PCR扩增实现了37度孵育15分钟。
(6)PCR后纯化：反应完成后，将PCR管拿出，瞬时离心，将所有液 体收集到管底，用等体积的磁珠进行纯化，纯化完毕后用21ul无核酸酶 水进行洗脱即可出库。
(7)文库质检：使用
Figure BDA0002873948750000122
dsDNA HS Assay Kit检测文库的浓度， 使用Qsep100生物分析仪检测文库片段大小，均按照说明书要求进行操作。 经质检，如表5和图3可以看出，本发明的方法构建的文库总量高、文库 转化率高。
表5
Figure BDA0002873948750000123
可见，本发明通过改进酶体系和缓冲液体系，改变关键步骤的处 理方法，使得微量起始建库转化率得到很大提高。该方法有效解决了 部分珍贵的、难获得的样本总量过低无法建库测序，或者建库转化率 低，文库质量较差的问题，提高了二代测序的适用范围，使得其应用 范围更广。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这 些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权 利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；
所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；
所述第二酶液为T4 DNA连接酶；
所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；
(2)缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，
所述第一缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl发卡型接头、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为0.1-1mM的dNTP和浓度为1-10mM的dATP混合而成；
所述第二缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为1-10mM的ATP、浓度为30％-50％的PEG6000和浓度为10-20％的1,2丙二醇混合而成；
(3)接头、index序列和通用引物。
2.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第一酶混液中T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.05～0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.05U/μL，所述Taq酶的工作浓度为0.01-0.05U/μL。
3.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液中Tris-HCl的工作浓度为40～100mM，所述MgCl2的工作浓度为5～20mM，所述DTT的工作浓度为1～10mM，所述dNTP混合液的工作浓度为0.04～0.12mM，所述dATP的工作浓度为0.2-1.0mM。
4.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液中，所述Tris-HCl的工作浓度为10～40mM，所述MgCl2的工作浓度为1～5mM，所述DTT的工作浓度为1～3mM，所述ATP的工作浓度为0.5～1.5mM，所述PEG6000的工作浓度为5％-10％w/v，所述1,2丙二醇的工作浓度为1％-4％v/v。
5.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10～50U/μL；所述2X QuarTaq HiFi HotStart混合液的工作浓度为1X。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述接头为发卡型接头，由接头序列自身退火形成具有一个粘末端的茎环结构。
7.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述接头序列为序列表的序列1所示；所述的index序列如序列表的序列2所示；所述通用引物序列为序列表的序列3所示。
8.一种提高文库转化率的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；
利用第一酶混液和第一缓冲液对DNA片段进行末端修复及加A，得到修复片段；
在DNA片段进行末端修复及加A过程中，利用同样具有dATP偏爱性DNA末端非模板依赖性加A活性的Taq酶完成DNA末端的加A；
在接头连接中添加具有连接增强作用的小分子物质；
在末端修复及加A步骤中，将DNA片段与上述的末端修复与加A缓冲液和末端修复与加A酶混合后，于20℃-37℃孵育15-30分钟，37℃-65℃孵育15-30分钟；
利用第二酶液、第二缓冲液以及接头对所述修复片段进行接头连接，得到带接头片段；
利用第三酶混液和index序列、通用引物对所述带接头片段进行PCR富集，得到所述DNA文库。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在得到所述带接头片段的步骤后，以及在对所述带接头片段进行PCR富集之后，所述方法还包括进行磁珠纯化的步骤。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述连接增强剂可以为PEG6000或1,2丙二醇。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337501A (zh) * 2021-08-06 2021-09-03 北京橡鑫生物科技有限公司 一种发卡型接头及其在双端index建库中的应用
CN114703253A (zh) * 2022-03-11 2022-07-05 上海英基生物科技有限公司 一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用
CN114736950A (zh) * 2022-02-24 2022-07-12 北京组学生物科技有限公司 Dna二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105603535A (zh) * 2016-01-27 2016-05-25 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 构建dna文库的试剂盒和方法
WO2017113148A1 (zh) * 2015-12-30 2017-07-06 安诺优达基因科技(北京)有限公司 检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒
CN107604046A (zh) * 2017-11-03 2018-01-19 上海交通大学 用于微量dna超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法
CN109576801A (zh) * 2018-12-27 2019-04-05 上海雅鉴生物科技有限公司 一种二代测序文库构建用接头以及文库构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017113148A1 (zh) * 2015-12-30 2017-07-06 安诺优达基因科技(北京)有限公司 检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒
CN105603535A (zh) * 2016-01-27 2016-05-25 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 构建dna文库的试剂盒和方法
CN107604046A (zh) * 2017-11-03 2018-01-19 上海交通大学 用于微量dna超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法
CN109576801A (zh) * 2018-12-27 2019-04-05 上海雅鉴生物科技有限公司 一种二代测序文库构建用接头以及文库构建方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337501A (zh) * 2021-08-06 2021-09-03 北京橡鑫生物科技有限公司 一种发卡型接头及其在双端index建库中的应用
CN113337501B (zh) * 2021-08-06 2022-02-18 北京橡鑫生物科技有限公司 一种发卡型接头及其在双端index建库中的应用
CN114736950A (zh) * 2022-02-24 2022-07-12 北京组学生物科技有限公司 Dna二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒
CN114703253A (zh) * 2022-03-11 2022-07-05 上海英基生物科技有限公司 一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用

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