CN113088562A - 一种新型的低起始量dna甲基化建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的低起始量DNA甲基化建库方法。本发明提供了一种制备甲基化测序文库的方法,依次包括如下步骤:(1)取基因组DNA,进行氧化脱氨处理;(2)进行全基因组扩增;(3)构建测序文库。步骤(1)中,采用酶化学法进行所述氧化脱氨处理,采用采用双加氧酶(TET2)进行氧化处理,采用胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)进行脱氨处理。全基因组扩增的目的为将ng级别的DNA转换为μg级别的DNA。本发明提供的方法具有如下有益效果:可以做到极低起始量的基因组DNA甲基化处理,起始量可低至单细胞级别;操作步骤简单;对DNA的损伤最小;改善了现有微量甲基化建库的GC碱基分布不均衡,覆盖度低,duplication rate高等现象。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的低起始量DNA甲基化建库方法。
背景技术
胞嘧啶第五个碳分子的DNA甲基化修饰是一种稳定的表观遗传修饰,在许多物种中从细菌到高等真核生物都存在此修饰。这种修饰就是我们常说的DNA甲基化修饰,它在胚胎发育过程的转录调节中发挥作用,例如基因组印记,转座子沉默,另外在干细胞分化期间以及X染色体失活中也起着重要的作用。而且在肿瘤研究中发现DNA甲基化水平的变化也与肿瘤的进展有关。因此,DNA甲基化检测为生物体的生理功能的研究提供了重要的手段。
基于重亚硫酸盐原理的甲基化建库测序已经成为DNA甲基化分析的金标准。基因组DNA经过重亚硫酸盐处理后,未经修饰的胞嘧啶会转化为尿嘧啶,而甲基化修饰的胞嘧啶则保持不变,经过PCR和测序后可以通过单碱基分辨率获取基因组范围内的甲基化信息。对于基于重亚硫酸盐原理的甲基化建库来说,根据DNA起始量的不同,分为常规起始量建库和微量至单细胞起始量级别的建库。常规起始量建库:需要先把DNA打断成小片段,通过AT碱基配对用连接酶加上甲基化修饰的接头(即接头上的胞嘧啶C都是经过甲基化修饰的),然后进行重亚硫酸盐处理和PCR扩增。常规起始量建库的主要流程为(流程示意图见图1):(1)基因组DNA与内参DNA混合,打断,末端修复,加A,连接甲基化接头;(2)Bisulfite(重亚硫酸盐)处理连接产物,使非甲基化的C转换成U;(3)PCR扩增转换产物,U转换为T;(4)上机测序。微量至单细胞起始量级别的建库:先采用重亚硫酸盐处理基因组DNA,此时DNA呈单链状态,片段短,且量极低,不能通过连接酶的方法加上接头测序,所以用带随机碱基和测序序列的Oligo引物以多轮扩增的方式,给DNA两端加上接头。微量至单细胞起始量级别的建库的主要流程为(流程示意图见图2):(1)Bisulfite(重亚硫酸盐)处理基因组DNA与内参DNA,使非甲基化的C转换成U;(2)前置寡核苷酸标记和预扩增;(3)外切酶消化与纯化;(4)Oligo 2标记;(5)PCR扩增U转换为T;(6)上机测序。不管是哪种起始量级别的建库,都需要进行重亚硫酸盐处理,而重亚硫酸盐处理会破坏DNA,导致片段化、丢失和偏向性。微量至单细胞起始量级别的建库虽说可以做到微量建库,但损伤大,GC覆盖度低,均一性差。
对于基于酶法的甲基化建库来说,现有技术中仅能实现常规起始量建库,DNA起始量需要达到10ng以上。基于酶法的常规起始量建库的主要流程为(流程示意图见图3):(1)基因组DNA与内参DNA混合,打断,末端修复,加A,连接甲基化接头;(2)TET2(双加氧酶)氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC);(3)APOBEC(胞嘧啶脱氨酶)处理使非甲基化的胞嘧啶C被脱氨为尿嘧啶U;(4)PCR扩增转换产物,U转换为T;(5)上机测序。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的低起始量DNA甲基化建库方法。
本发明提供了一种制备甲基化测序文库的方法,依次包括如下步骤:
(1)取基因组DNA,进行氧化脱氨处理;
(2)进行全基因组扩增;
(3)构建测序文库。
氧化脱氨处理后DNA片段长度为几Kb至十几Kb,单链状态。
步骤(1)中,采用酶化学法进行所述氧化脱氨处理。酶化学法进行所述氧化脱氨处理的优点是高转化率(C到T的转化效率),对DNA的损伤小,GC偏向性小。
所述氧化脱氨处理中,采用采用双加氧酶(TET2)进行氧化处理,采用胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)进行脱氨处理。
所述氧化脱氨处理具体采用EM-seq Conversion Module Kit。
全基因组扩增的目的为将ng级别的DNA转换为μg级别的DNA。具体可采用多重置换扩增(MDA)、简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)、连接反应介导的PCR(LM-PCR)、扩增前引物延伸反应(primer extensionpreamplification PCR,PEP-PCR)、基于引物酶的全基因组扩增(pWGA)、多次退火环状循环扩增技术(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)等。
所述全基因组扩增的实现方式具体可为:多重置换扩增(MDA)。多重置换扩增:首先由随机6碱基引物在多个位点与模板DNA退火,然后phi29 DNA聚合酶在DNA的多个位点同时开始复制;复制合成的DNA取代模板的互补链,同时被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增。多重置换扩增是目前公认的最好的低起始量的基因组扩增技术,保真性高,均一性好。
所述全基因组扩增具体采用REPLI-g Single Cell Kit。
所述测序文库具体可为二代测序文库或三代测序文库。
构建测序文库具体采用MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装。
所述方法中,完成步骤(2)后,先进行扩增产物的打断与纯化,再进行步骤(3)。
所述打断具体可为物理打断,例如可采用Covaris E210进行打断。
所述纯合具体可采用Ampure XP磁珠。
纯化后DNA片段为250-400bp。
打断与纯化的具体步骤可为:取步骤(2)的产物(DNA含量为1μg),加入纯水至总体积为80μl,然后采用Covaris E210进行打断,然后采用Ampure XP磁珠进行二次片段筛选纯化,获得产物溶液。
打断参数具体可为:Duty/cycle(0%)10;Intensity 5;Cycle/burst 200;Time(s)55;Cycle 5。
第一次片段筛选采用0.6X(48μl),第二次片段筛选采用0.2X(16μl)。
本发明还保护一种用于制备甲基化测序文库的试剂盒,包括如下组件:
组件甲:用于对DNA进行氧化脱氨处理的试剂盒或试剂组合;
组件乙:用于全基因组扩增的试剂盒或试剂组合;
组件丙:用于构建测序文库的试剂盒或试剂组合。
组件甲包括:对DNA进行氧化脱氨处理的一种以上酶。
所述组件甲包括双加氧酶(TET2)和胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)。
组件甲具体可为EM-seq Conversion Module Kit。
所述全基因组扩增为多重置换扩增。
组件乙具体可为REPLI-g Single Cell Kit。
所述测序文库具体可为二代测序文库或三代测序文库。
组件丙具体可为MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装。
所述试剂盒还包括组件丁。
组件丁:用于将全基因组扩增的产物进行打断和纯化。
组件丁具体包括:Covaris E210进和Ampure XP磁珠。
本发明还保护以上任一所述方法在甲基化测序中的应用。
本发明还保护以上任一所述试剂盒在甲基化测序中的应用。
所述甲基化测序具体可为全基因组甲基化测序。
本发明提供的甲基化建库方法的主要流程为(流程示意图见图4):(1)基因组DNA与内参DNA混合,用TET2(双加氧酶)进行氧化处理;(2)APOBEC(胞嘧啶脱氨酶)处理使非甲基化的胞嘧啶C被脱氨为尿嘧啶U;(3)多重置换MDA扩增,获取微克级别的DNA;(4)二代常规DNA文库构建;(5)上机测序。
本发明提供的方法具有如下有益效果:可以做到极低起始量的基因组DNA甲基化处理(DNA的建库起始量降低到了pg级别),起始量可低至单细胞级别;操作步骤简单;对DNA的损伤最小;改善了现有微量甲基化建库的GC碱基分布不均衡,覆盖度低,duplicationrate高等现象。
本发明提供的方法为甲基化的研究提供了一种有利可靠的工具。
附图说明
图1为常规起始量建库的主要流程意图。
图2为微量至单细胞起始量级别的建库的主要流程意图。
图3为基于酶法的常规起始量建库的主要流程意图。
图4为本发明提供的方法的主要流程示意图。
图5为实施例2中完成步骤二的多重置换扩增反应的反应产物的电泳图。
图6为实施例2中采用Agilent 2100检测文库片段大小的结果(100pg基因组DNA)。
图7为实施例2中采用Agilent 2100检测文库片段大小的结果(10pg基因组DNA)。
图8为对比例中采用Agilent 2100检测文库片段大小的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例1、方法的建立
一、氧化脱氨处理
取基因组DNA,进行氧化脱氨处理。
氧化脱氨处理的方法:采用EM-seq Conversion Module Kit并按试剂盒说明书进行操作。EM-seq Conversion Module Kit,全称为Enzymatic Methyl-seqConversion Module,NEB公司,货号#E7125。EM-seq Conversion Module Kit中包括内参DNA。EM-seq Conversion Module Kit,采用TET2(双加氧酶)进行氧化处理,采用APOBEC(胞嘧啶脱氨酶)进行脱氨处理使非甲基化的胞嘧啶C被脱氨为尿嘧啶U。
二、全基因组扩增
取步骤一的产物,进行全基因组扩增。
全基因组扩增的方法:采用REPLI-g Single Cell Kit并按试剂盒说明书进行多重置换扩增反应。REPLI-g Single Cell Kit:QIAGEN公司,货号150343;网址链接:https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/next-generation-sequencing/genomic-services/whole-genome-amplification/single-cell-low-input/repli-g/repli-g-single-cell-kit/?clear=true#orderinginformation。
三、扩增产物打断与纯化
取步骤二的产物(DNA含量为1μg),加入纯水至总体积为80μl,然后采用CovarisE210进行打断,然后采用Ampure XP磁珠进行二次片段筛选纯化,获得产物溶液。
打断参数:Duty/cycle(0%)10;Intensity 5;Cycle/burst 200;Time(s)55;Cycle 5。
第一次片段筛选采用0.6X(48μl),第二次片段筛选采用0.2X(16μl)。
产物溶液的主带≈250-400bp。
四、常规二代测序文库构建
取步骤三的产物,进行二代测序文库的构建。
进行二代测序文库的构建的方法:采用MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装并按说明书操作。MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装:深圳华大智造科技有限公司(简称“华大智造”,英文名称为MGI),货号为1000006985。MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装构建二代测序文库的步骤依次包括末端修复与加A、加接头、PCR。
五、上机测序与结果
取步骤四制备的文库,采用华大测序平台(MGI 2000平台)进行测序。测序参数为:PE100+100+10(PE100+100:表示文库插入片段分别从左右两端第1个核苷酸开始,往内各测100个碱基;+10:表示barcode的长度共10bp,也是需要被测序的)。
实施例2、方法的应用
取Hela细胞,提取基因组DNA。
取100pg基因组DNA,按照实施例1进行操作。
取10pg基因组DNA,按照实施例1进行操作。
完成步骤二的多重置换扩增反应的反应产物的电泳图见图5。
测序结果见表1。
采用Agilent 2100检测文库片段大小,结果见图6(100pg基因组DNA)和图7(10pg基因组DNA)。
对比例、
取Hela细胞,提取基因组DNA。
取10pg基因组DNA,按照文献的方法进行甲基化文库构建(流程示意图见图2)。
文献:Smallwood S A,Lee H J,Angermueller C,et al.Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.[J].NatureMethods,2014,11(8):817。
取制备的文库,采用Illumina平台(HiSeq2500平台)进行测序。测序参数为:PE101+101+8(PE101+101:表示文库插入片段从左右两端第1个核苷酸开始往内各测101个碱基;+8:表示barcode长度为8bp,也是需要被测序的)。
测序结果见表1。
采用Agilent 2100检测文库片段大小,结果见图8。
综合比较表1以及图6至图8的结果。在相同reads数下,实施例2的基因组覆盖度有明显的提升,实施例10pg的覆盖度达到45.97%,显著高于对比例的24.64%。
表1测序结果分析
Mapping | BS | Dup | 基因组Coverage | |
实施例2(100pg) | 41.74 | 99.21 | 0.57 | 67.75 |
实施例2(10pg) | 45.79 | 99.47 | 0.46 | 45.973 |
对比例(10pg) | 49.36 | 98.2 | 27.82 | 24.64 |
Claims (10)
1.一种制备甲基化测序文库的方法,依次包括如下步骤:
(1)取基因组DNA,进行氧化脱氨处理;
(2)进行全基因组扩增;
(3)构建测序文库。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述氧化脱氨处理中,采用采用双加氧酶进行氧化处理,采用胞嘧啶脱氨酶进行脱氨处理。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述全基因组扩增的实现方式为:多重置换扩增。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:完成步骤(2)后,先进行扩增产物的打断与纯化,再进行步骤(3)。
5.一种用于制备甲基化测序文库的试剂盒,包括如下组件:
组件甲:用于对DNA进行氧化脱氨处理的试剂盒或试剂组合;
组件乙:用于全基因组扩增的试剂盒或试剂组合;
组件丙:用于构建测序文库的试剂盒或试剂组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所述组件甲包括双加氧酶和胞嘧啶脱氨酶。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于:所述全基因组扩增为多重置换扩增。
8.权利要求1至4中任一所述方法在甲基化测序中的应用。
9.权利要求5至7中任一所述试剂盒在甲基化测序中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用,其特征在于:所述甲基化测序为全基因组甲基化测序。
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PB01 | Publication | ||
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