CN107904297B

CN107904297B - 用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法

Info

Publication number: CN107904297B
Application number: CN201711457924.4A
Authority: CN
Inventors: 陈俊如; 叶雷; 袁丽娜; 凡丽娜
Original assignee: Suzhou Geneworks Technology Co ltd
Current assignee: SUZHOU GENEWORKS TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN107904297A

Abstract

本发明涉及一种用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法，包括用于针对微生物16S rRNA基因测序的引物组，用于针对微生物16S rRNA测序扩增的接头组以及利用上述引物组和接头组的测序方法。本发明的测序方法通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，使其适合于Illumina Nextseq和HiseqX测序平台，大大增加了一次测序的样本数目，有效的降低了单样本测序成本，有效的提升了微生物多样性测序数据的质量、有效率，有效的降低了测序周期，提升了微生物多样性研究的实效性。

Description

用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及基因组测序领域，特别是微生物多样性研究的测序领域。

背景技术

高通量测序技术又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing)，其以超高的通量和测序的准确度优势在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。而目前在高通量测序领域，Illumina测序平台一枝独秀，占领了超过50％的测序平台市场份额，旗下拥有不同型号和测序能力的测序仪器，例如Hiseq X、Nextseq、Miseq等，这些测序仪器的读长、通量、准确度以及测序时间均有较大差异。Illumina测序的一般流程分为文库制备、簇生成和测序三个步骤，其中构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。

微生物多样性研究主要基于微生物16S rRNA基因的扩增片段测序技术，通过对测序片段进行分型从而探究环境样本中微生物的组成和丰度。细菌的16S rRNA的序列有10个保守区和9个可变区之分，其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别；可变区具有属或种的特异性，序列则随微生物间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于微生物系统发育和分类鉴定的指标，可以利用这一特性设计引物来进行微生物物种鉴定(Soμmitesh Chakravorty et.al.,J Microbiol Methods,2007)。

目前，应用于微生物多样性研究的测序策略主要为Illumina Miseq PE300以及Illumina Hiseq2500PE250平台，这两种平台主要因为其测序读长能很好的覆盖16S rRNA基因的1个或2个高变区而得到应用，而Hiseq X和Nextseq测序平台由于其PE150读长很难覆盖16S rRNA基因的高变区，在微生物多样性研究的应用中受到限制。然而，Miseq和Hiseq2500测序平台在微生物多样性研究方面存在一些缺陷：首先，Miseq测序平台通量有限，目前Miseq测序平台的通量最大能达到15G，而Nextseq测序仪通量是其8倍，HiseqX更高，这使得相比于HiseqX和Nextseq，Miseq测序的平均成本更高；其次，由于MiseqPE300和Hiseq2500PE250的测序读长较长，这造成测序得到的序列末端碱基质量低，用于微生物多样性分析的数据有效率较低；最后，Miseq和Hiseq2500测序周期较Hiseq X和Nextseq长，影响了整个研究的周期和实效性。

因此，构建适合于Nextseq和HiseqX测序平台的微生物多样性研究的测序文库，对于有效的节约微生物多样性研究的成本，提高其测序数据有效率，并能缩减测序的周期提高研究的实效性，具有十分重要的作用。然而，如果利用现有的Miseq PE300或者Hiseq2500PE250的建库测序接头和引物直接转用到Nextseq和HiseqX测序平台，用于微生物16S rRNA基因高变区的扩增测序，会由于Nextseq和HiseqX测序平台测序读长过短，测序得到的序列无法拼接得到完整的微生物16S rRNA基因高变区序列，以致于无法进行微生物多样性研究。因此，现有技术中没有适用于Nextseq和HiseqX测序平台的，通过对16S rRNAV4区进行测序，进而微生物多样性研究测序文库的构建方法。

发明内容

发明要解决的问题

基于现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种适合于Nextseq和HiseqX测序平台的微生物多样性研究的建库测序技术。

用于解决问题的方案

首先，本发明提供一种用于针对微生物16S rRNA基因测序的引物组，其包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二引物包含如SEQID NO:4所示的序列。优选的，所述第一引物为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二引物为如SEQ ID NO:4所示的序列。

根据本发明的引物组，其还包含第三引物和第四引物，所述第三引物包含如SEQID NO:2所示的序列，所述第四引物包含如SEQ ID NO:3所示的序列。优选的，第三引物为如SEQ ID NO:2所示的序列，所述第四引物为如SEQID NO:3所示的序列。

其次，本发明提供一种用于针对微生物16S rRNA测序扩增的接头组，所述接头组包含第一接头，所述第一接头包含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的序列。

根据本发明的接头组，其中，所述第一接头包含如SEQ ID NO:5所示的序列。优选的，所述第一接头为如SEQ ID NO:5所示的序列。

根据本发明的接头组，其还包含第二接头，所述第二接头包含如SEQ IDNO:2和SEQID NO:3所示的序列。

根据本发明的接头组，其中，所述第二接头包含如SEQ ID NO:6所示的序列。优选的，所述第二接头为如SEQ ID NO:6所示的序列。

第三，本发明提供一种用于微生物多样性研究的测序方法，所述测序方法使用前述引物组和前述接头组，进行测序。

根据本发明的用于微生物多样性研究的测序方法，其包括如下步骤：

(1)构建待测微生物的DNA文库：利用前述接头组作为扩增引物，扩增待测微生物的DNA文库；

(2)确认步骤(1)得到的DNA文库的质量，并测定所述DNA文库的浓度；

(3)测序平台测序：利用前述引物组作为扩增引物，通过测序仪测序；

可选的，所述测序方法还包括：

(4)确认测序结果的质量水平。

根据本发明的测序方法，所述测序平台为Nextseq测序平台或HiseqX测序平台。

根据本发明的的测序方法，所述待测微生物为肠道微生物或环境微生物。

发明的效果

本发明的建库测序技术通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，使其适合于Illumina Nextseq和Hiseq X测序平台，大大增加了一次测序的样本数目，有效的降低了单样本测序成本；

可选的，本发明的建库测序技术通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，有效的提升了微生物多样性测序数据的质量；

可选的，本发明的建库测序技术通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，有效的提升了微生物多样性测序数据的有效率；

可选的，本发明的建库测序技术通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，使其适合于Illumina Nextseq和Hiseq X测序平台，有效的降低了测序周期，提升了微生物多样性研究的实效性。

附图说明

图1示出了新型建库测序接头P5-505F和P7-806R结构示意图。其中，Seq-1和Seq-2区序列分别为标准P5，P7通用序列区；Seq-2和Seq-6区序列分别为Index序列区；Seq-3和Seq-7区序列分别为P5和P7接头的Linker序列；Seq-4为16S rRNA V4区正向引物505F，Seq-8为16S rRNA V4区反向引物806R；Seq-3+Seq-4区和Seq-7+Seq-8区分别为测序引物结合区。

图2示出了连接完P5-505F和P7-806R接头的文库琼脂糖电泳图。

图3示出了连接完P5-505F和P7-806R接头的文库Agilent2100检测结果。其中，X轴代表检测序列的碱基序列长度，Y轴代表检测的荧光信号值，单位为FU。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。

应当理解的是，除非另外明确地说明，否则落入所列数值和数值范围之间的所有值和范围均意图由本发明所涵盖。

实施例

以下将参考附图详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

本发明涉及到的试剂和仪器均为正常市售商品：

a.本发明所用核酸序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成

b.Fast DNA Stool Mini Kit Qiagen公司

c.KAPA Library Quantification Kit-Illumina/Universal KAPA公司

d.Qubit dsDNA HS kit Invitrogen公司

e.琼脂糖biowest公司

f.基因扩增仪ABI公司

g.Biorad电泳系统BioRad公司

h.2100BioAnalyzer Aglilent公司

i.ABI 7500荧光定量PCR仪Invitrogen公司

j.Qubit 2.0荧光定量仪Invitrogen公司

k.Illumina Nextseq测序仪

实施例1：建库引物接头及相应引物的构建

首先，设计新型的包含微生物16S rRNA基因V4区扩增通用引物的Illumina测序的P5和P7接头，分别命名为P5-505F和P7-806R。其中P5-505F接头的前29个碱基(Seq-1)以及其后8碱基的Index测序区(Seq-2)与Illumina标准P5接头的碱基序列一致，前述Index测序区后添加12碱基的Linker序列(Seq-3)，最后连接微生物16S rRNA基因V4区F端通用引物505F(Seq-4)。P7-806R接头的前24个碱基(Seq-5)以及其后8碱基的Index测序区(Seq-6)与Illumina标准P7接头的碱基序列一致，Index测序区后添加12碱基Linker序列(Seq-7)，最后连接微生物16S rRNA基因V4区R端通用引物806R(Seq-8)。P5-505F和P7-806R接头的结构如图1所示。

然后，针对上述设计的测序接头P5-505F和P7-806R，设计两对Illumina测序引物，如表1所示，其能够分别与P5-505F接头和P7-806R接头的Seq-3+Seq-4区和Seq-7+Seq-8区结合。

按照图1所示的P5-505F和P7-806R接头序列合成相应的接头，引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

表1：和测序接头P5-505F和P7-806R相对应的测序引物

表2测序接头P5-505F和P7-806R所对应的序列

在表2中，n表示任意碱基，y表示t或c，m表示a或c，v表示a或c或t，w表示a或t。其中，表2中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的连续8个n区为Illumina测序Index序列。

实施例2：样本提取和PCR扩增建立文库

1)采集3个健康成人粪便样本300mg，按照Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒操作说明，提取了上述3个健康成人的人体肠道微生物的总DNA。

2)DNA质检：取2μL上述提取的人肠道微生物DNA样本于NanoDrop检测孔，测定DNA样本的OD值；1％的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的条带大小，并判断基因组DNA是否降解；OD值在1.8-2.0且基因组DNA无明显降解的样本DNA质检通过，进行下一步操作。

3)PCR扩增与测序文库构建：

a.于PCR管配置PCR反应体系25μL，加入20ng质检合格样本的DNA(体积小于11.5μL)，新型设计的P5-505F和P7-806R接头(10μM)各0.5μL，2x KAPA HiFi HotStartReadyMix，12.5μL，超纯水补至25μL，盖上盖子，震荡混匀，短时离心；

上述PCR扩增的25μL扩增体系的具体构成如下：

(a).20ng微生物DNA(根据1)DNA质检步骤中得到的DNA浓度进行计算)；

(b).上述实施例1中设计的包含扩增V4区的通用引物的接头P5-505F和P7-806R各0.5μL(10μM)；

(c).2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix，12.5uL；

(d).无菌水补至总体积25uL。

b.PCR管放入PCR仪，设定反应程序。首先，95℃ 3minutes；25循环下列反应过程：95℃ 30seconds，55℃ 30seconds，72℃ 30seconds；最后72℃ 5minutes反应后，4℃ 保存；

c.PCR产物质检：PCR反应结束后，取出所有产物，2％的琼脂糖电泳，观察是否有条带，以及条带长度是否在400bp-450bp之间；

d.PCR产物回收：检测合格的PCR产物切取目的片段区域凝胶，使用Qiagen Gelextraction kit进行样本产物纯化回收，具体步骤按照Qiagen Gel extraction kit说明书进行；

e.产物定量与文库混合：将上述回收产物进行Qubit定量，并按照各个样本的测序数据量要求将不同样本的纯化产物等量混合，Qubit定量具体步骤按照Qubit dsDNA HSkit说明书进行；

f.文库库检：将e中混合的文库取5μL进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测文库片段的特异性和大小，另外再取1μL稀释到1ng/μL，取出稀释后文库1μL用于Agilent2100精确检测文库片段大小。如图2所示，琼脂糖电泳结果表明文库片段特异性较好，片段分布在400bp-450bp间；如图3所示，Agilent2100检测结果表明文库大小为441bp；

g.文库精确定量：取1μL文库样本，梯度稀释到10000倍，按照表2配置10μL qPCR反应体系，震荡混匀，短时离心；打开ABI7500荧光定量PCR仪，放入样品，开始检测，检测结束后按照标准品浓度计算文库浓度。

表3：10μL qPCR反应体系

试剂	体积(μL)
		SYBR qPCR Master Mix	5
qPCR Primer Mix	1
		DNA	2
Rox reference Dye2	0.2
		超纯水	1.8

实施例3：对制备得到的文库进行测序

1)Nextseq测序仪设置：根据Illumina Nextseq 500测序平台标准操作说明，设置PE150测序策略的仪器运行设置；

2)准备Nextseq上机试剂：按照NextSeq 500kit v2MID试剂盒说明准备上机所需试剂的配置和解冻；

3)稀释文库至上机浓度：

a.在EP管中加入与文库等体积的0.2N的NaOH，简短震荡并离心，室温孵育5min，将文库变性，最后加入与原始文库等体积的200mM Tris-HCl,pH＝7；

b.稀释变性文库：根据上述文库的浓度先将文库稀释20pM，再将文库稀释到符合上机要求浓度1.1pM；

4)测序引物准备：

a.解冻测序引物(干粉)：Seq-primer-505F,Seq-primer-806R,r-Seq-primer-806R,r-Seq-primer-505F；

b.将正向测序引物Seq-primer-505F和Seq-primer-806R稀释到30μM，反向测序引物r-Seq-primer-806R和r-Seq-primer-505F稀释到0.6μM；

5)运行测序：按照Illumina Nextseq500测序仪和NextSeq 500kit v2MID试剂盒操作说明，将稀释后的测序文库与测序引物加入测序的流动槽(Flowcell)，运行测序仪。

实施例4：结果质控

利用上述新型测序接头和测序引物，按照本发明实施例3中记载的方法，构建了3个人体肠道微生物16S rRNA基因V4区测序文库，并进行Nextseq500PE150测序。测序数据质控结果如表4所示：

表4：新型建库方法测序数据质控结果

样本

原始序列数

有效序列数

有效率

注释序列数

注释比例

平均长度

Q20

Q30

A

76193

74425

97.68％

74236

99.87％

252

99.08％

97.11％

B

72802

71781

98.60％

71619

99.77％

252

99.13％

97.33％

C

69700

68157

97.79％

68005

99.78％

252

99.06％

97.05％

1)测序质量：从表4中可以看到，测序数据的Q20和Q30均在97％以上，完全符合微生物多样性测序数据的质量要求，本次建库测序结果质量优秀；

2)数据有效率：从表4有效率值可以看到，本次测序数据拼接质控后得到的有效数据百分比超过97％，而常规的Miseq PE300和Hiseq2500 PE250测序数据的有效率分别在90％和95％左右，说明本次建库测序结果数据有效率提升；

3)物种注释结果：从表4注释比例可以看到，本次测序数据中超过99％的有效数据拥有物种注释结果，说明此建库测序方法特异性优秀，PCR获得的序列均为微生物序列。

与此同时，现有技术中常用的NextSeq接头和引物无法对16S rRNA的V4区进行测序，因此无法分析微生物的多样性。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州麦微健康科技有限公司

<120> 用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法

<130> 6684-171317I-SU

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatggtaatt gtgtgycagc mgccgcggta a 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtcagccag ccggactacn vgggtwtcta at 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attagasacc cbngtagtcc ggctggctga ct 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaccgcggc kgctgrcaca caattaccat a 31

<210> 5

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntat ggtaattgtg tgycagcmgc 60

cgcggtaa 68

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnagtcagcc agccggacta cnvgggtwtc 60

taat 64

Claims

1.一种用于针对微生物16S rRNA基因测序的引物组，其包含第一引物和第二引物，所述第一引物为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二引物为如SEQ ID NO:4所示的序列。

2.根据权利要求1所述的引物组，其还包含第三引物和第四引物，所述第三引物为如SEQ ID NO:2所示的序列，所述第四引物为如SEQ ID NO:3所示的序列。

3.一种用于针对微生物16S rRNA测序扩增的接头组，所述接头组包含第一接头，所述第一接头为如SEQ ID NO:5所示的序列。

4.根据权利要求3所述的接头组，其还包含第二接头，所述第二接头为如SEQ ID NO:6所示的序列。

5.一种用于微生物多样性研究的测序方法，其特征在于，所述测序方法使用如权利要求1-2任一项所述的引物组和权利要求3-4任一项所述的接头组，进行测序；其中，所述测序方法包括使用测序平台测序的步骤，所述测序平台为Nextseq测序平台或HiseqX测序平台。

6.根据权利要求5所述的测序方法，其包括如下步骤：

(1)构建待测微生物的DNA文库：利用权利要求3-4任一项所述的接头组作为扩增引物，扩增待测微生物的DNA文库；

(3)测序平台测序：将权利要求1-2任一项所述的引物组作为扩增引物，通过测序仪测序。

7.根据权利要求6所述的测序方法，其还包括如下步骤：

(4)确认测序结果的质量水平。

8.根据权利要求6-7任一项所述的测序方法，其特征在于，所述待测微生物为肠道微生物或环境微生物。