CN108103164B - 一种利用多重荧光竞争性pcr检测拷贝数变异的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用多重荧光竞争性PCR对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测，以多重PCR取代人工合成或质粒构建进行内参文库构建。针对目标基因或位点和拷贝数确定的内参序列设计引物，区分序列以示区分，同时在特异引物的上下游5’端分别添加上下游通用序列。第一轮扩增构建文库后，将内参文库和检测文库混合，进行通用引物的第二轮扩增。利用检测文库和内参文库的目标基因或位点的荧光比值确定目标基因或位点的拷贝数。减少了竞争性PCR需要准确定量和稀释内参文库的过程，使多重荧光竞争性PCR替代了复杂的多重连接探针扩增。

Description

一种利用多重荧光竞争性PCR检测拷贝数变异的方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别是涉及一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个样本的多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的方法。
背景技术
拷贝数变异(copy number variation，CNV)是一种与基因功能和人类疾病发生密切相关的遗传突变，因此CNV的研究具有重大的科研价值和临床意义。目前多种技术被应用于CNV检测，比如免疫荧光原位杂交、基于二代测序的CNV检测技术(CNV-seq)、基于基于芯片的比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)、数字PCR、多重可扩增探针杂交(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)和竞争性PCR。针对高通量的CNV检测，CNV-seq和aCGH是最佳的选择。但是针对大量样本的多个基因或位点，CNV-seq和aCGH由于成本问题难以适用。MLPA技术适合大量样本的多基因CNV检测，但实验优化过程、探针合成费用和非特异性杂交等问题影响了其大规模应用。基于高重复性、可操作性和低廉的价格，多重荧光竞争性PCR成为了检测大量样本的多基因或位点CNV的替代技术。多重荧光竞争性PCR检测CNV的关键点是将检测样本和拷贝数已知的内参样本共扩增，通过比较检测样本和内参样本区段之间荧光的比值，结合内参样本内区段的已知拷贝数，即可计算出检测样本区段的拷贝数。因此，多重荧光竞争性PCR检测CNV的限制主要集中在内参样本的构建和多重PCR中的非特异扩增。传统多重竞争性通过人工合成或者质粒构建完成内参样本的构建。构建完成的内参需要准确定量，并通过繁琐的稀释步骤，将内参浓度稀释到和检测样本同一个数量级。同时通过优化多重竞争性PCR反应条件和引物设计方案去减少非特异扩增，近些年有一些多重荧光竞争性PCR策略被报道，但仍待进一步提高。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用多重荧光竞争性PCR检测CNV的方法，通过多重PCR方案取代传统的人工合成或质粒构建的方案进行内参文库构建，同时结合特异发夹引物克服传统多重PCR技术中非特异性扩增的问题。
技术方案
本发明的第一个方面是提供一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的方法，包括如下步骤：
(1)针对目标基因或位点、拷贝数确定的内参序列分别设计引物，使检测样本和内参样本的扩增引物仅上游特异引物具有区分序列的差异，下游特异引物完全一致，同时特异引物的5’端具有通用序列；
(2)利用第一轮多重荧光竞争性PCR将内参样本和检测样本分别扩增2-20个循环获得内参文库和检测文库，将内参文库和检测文库混合并纯化，纯化产物作为第二轮扩增模板；
(3)利用携带荧光的通用引物进行第二轮PCR扩增，产物进行毛细管电泳检测，通过电泳结果中检测文库和内参文库的相应目标基因或位点的荧光比值，并结合拷贝数确定的内参序列的比值计算出检测文库中目标基因或位点的拷贝数。
上述方法的优选方式之一为，所说的区分序列为额外添加在检测样本所有特异引物的5’端一段特异的短片段碱基序列。
上述方法的优选方式之二为，所说的通用序列包括在特异引物的上下游5’端分别添加的上游通用序列和下游通用序列。
上述方法的优选方式之三为，所说的区分序列长度为4-16碱基。
上述方法的优选方式之四为，所说的区分序列为ACTG。
上述方法的优选方式之五为，所说的上游通用序列标记荧光。
上述方法的优选方式之六为，所说的步骤(1)的PCR扩增循环为4-10个。
上述方法的优选方式之七为，所述的第一轮PCR中上下游特异引物数为2-38对。
上述方法的优选方式之八为，所说的上、下游特异引物为发夹引物。
上述的多重荧光竞争性PCR检测CNV的方法，其包括两轮PCR扩增。作为实施方式，具体步骤如下：
(1)利用第一轮多重PCR进行内参文库的构建。内参样本的上游特异引物与检测样本的上游特异引物仅有特异的短片段的碱基，例如4-16个碱基，优选较少碱基数如4个、5个、或6个的序列(如ACTG)的差异，而下游特异引物则完全一致。在特异引物序列的上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列。
(2)第一轮多重PCR反应，利用多对特异引物分别对内参样本和检测样本对目标区段进行有限循环数，例如2-20个循环，优选4-10个循环的扩增，不仅将短片段碱基(如4个)的区分序列引入内参样本和检测样本从而完成内参文库构建，同时将内参文库和检测文库5’端添加上通用序列。将第一轮扩增后的检测文库和内参文库等体积混合后纯化，作为第二轮扩增的模板。
(3)利用通用引物进行第二轮扩增；通用引物序列与文库5’端通用序列一致，同时只有上游通用序列携带荧光。扩增产物经过毛细管电泳检测，计算检测样本和内参样本的荧光比值，通过与标准值的标准化后确定检测样本拷贝数。
通过上述的优选方式，在第一轮PCR反应中获得的内参样本和检测样本的上游特异引物仅有4个碱基(ACTG)差异；通用引物序列与引物5’端通用序列一致，同时只有上游通用序列携带荧光。
本发明的一个特别优选的实施方式是根据文献“Multiplex PCR with the blunthairpin primers for next generation sequencing”(Biotechnology&BioprocessEngineering,2017,22(3):347-351)的报道进行引物设计，即针对多重PCR，将引物设计为特异的上下游发夹引物，该方案可以有效减少非特异扩增。
本发明的第三个方面是提供一种基于上述方法的试剂盒，包括所说的目标基因或位点的引物、和内参序列的引物、以及荧光通用引物。
进一步地，本发明采用的具体方式，举例而言，可以包括以下步骤：
特异发夹引物的设计：针对需要检测的基因或者位点序列设计引物，一般为了保证检测准确性，每个检测基因选取相互间隔400个碱基及以上的3个区段设计引物；同时分别选取性染色体和常染色体上基因设计引物作为对照。根据NCBI数据库中的序列，使用Primer3在线软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)进行设计，根据文献根据文献“Multiplex PCR with the blunt hairpin primers for next generation sequencing”(Biotechnology&Bioprocess Engineering,2017,22(3):347-351)报道，在设计的引物上下游5’端分别添加与目标区段3’末端部分序列完全互补配对序列，构成末端完全封闭发夹引物。应注意，针对本发明的第一方面：针对内参样本和检测样本设计引物时，两者上游特异引物有4个碱基差异，即在检测样本上游引物目标区段5’端添加ACTG序列以示区分。应理解，是在检测样本或者内参样本的上游或者下游引物的目标区段5’端添加区分序列的长度、碱基排列顺序或空间结构不构成本发明的限制；比如区分序列的长度包括2个或2个碱基以上也不构成本发明的限制。
多重荧光竞争性PCR第一轮反应：针对检测基因拷贝数未知的检测样本，选取基因拷贝数已知的女性样本作为内参样本，分别用2到38对特异发夹引物进行有限的循环数。例如，PCR扩增体系具体为：40ng DNA加入到10μL Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含0.02μM每对特异引物，采用14对特异引物，200μM dNTPs，0.2mM MgCl2，1X PCR Buffer，1.0U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性4min，5个循环。
内参文库和检测文库纯化：将内参样本和检测样本进行多重PCR扩增的产物进行等体积混合，混合后文库根据AMPureXP磁珠(Beckman)纯化说明书进行纯化。
多重荧光竞争性PCR第二轮反应：将纯化后的混合文库作为模板，利用携带荧光的通用引物进行扩增。例如，PCR扩增体系具体为：4ul纯化后混合文库加入到20μLTaq酶体系中，其中Taq酶体系包含1μM通用引物，200μM dNTPs，0.2mM MgCl2，1X PCRBuffer，2.0U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：95℃变性15min；94℃变性30s，70℃复性4min，30个循环。
数据检测与分析：将荧光通用引物的产物直接在ABI 3730XL基因测序仪上进行检测，原始数据通过GeneMapper(v4.0)软件处理，基于区分序列，可以通过片段大小将内参样本和检测样本产物区分开，将所有产物荧光值导入Excel表。虽然内参文库和检测文库只有4个碱基的差异，但是仍在存在扩增差异，所以检测文库和内参文库的荧光比值需要经过标准值的标准化后才能用于拷贝数计算。标准值是利用标准样本分别作为内参样本和检测样本进行检测，因为内参样本和检测样本完全一致，所以每个区段的荧光比值应该等于1，但是扩增差异的存在导致了每个区段的荧光比值只是接近1。因此检测样本与女性内参样本的荧光比值需要与标准品的荧光比值相除，称为数据的标准化。随后标准化的检测样本的检测基因荧光值和已知拷贝数的常染色体荧光值比较即可得到检测基因拷贝数。公式表示如下：
(1)PR＝Peakts/Peakic，“PR”代表荧光比值；“Peak”代表荧光值；“ts”代表检测样本；“ic”代表内参样本
(2)PRnd＝PRr/PRn，“PRnd”代表标准化后的检测样本的荧光比值；“PRr”代表检测样本的原始荧光比值；“PRn”代表标准样本的荧光比值
(3)拷贝数＝(PRndt/PRnda)x 2，“PRndt”代表标准化后检测样本中检测区段荧光比值；“PRnda”代表标准化后检测样本中常染色体区段荧光比值。
通过多次试验，结果显示选取女性样本作为内参样本时，男性检测样本和女性检测样本标准化的性染色体荧光和常染色体荧光值比值分别接近0.5和1，这是基于男性和女性在性染色体数目上的差异。因此，利用多重荧光竞争性PCR检测基因拷贝数时，选取常染色体区段和性染色体区段作为内参区段；同时样本的性别已知，性染色体和常染色体区段拷贝数比值可以作为警戒值去判断数据的准确性。
有益效果
本发明提供了现有技术文献中所缺乏的利用多重PCR方案构建竞争性PCR中的内参文库，代替了传统的人工合成或质粒构建的步骤，减少了实验操作和花费投入；同时在PCR扩增时，利用文献报道过的发夹引物进行多重PCR，减少多非特异扩增的形成。本发明的多重荧光竞争性PCR方案实现了针对几十个样本进行多个基因或者位点的CNV检测的能力，极大地节约了成本，有效地提高了实验效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明特异引物示意图。图中，101.内参样本上游引物，102.检测样本上游引物，103.下游引物，104.上游通用序列，105.下游通用序列，106.与上游特异引物目标区段3’末端部分序列完全互补配对序列，107.与下游特异引物目标区段3’末端部分序列完全互补配对序列，108.上游特异引物序列，109.下游特异引物序列,110.区分序列。
图2是本发明的原理示意图。图中，201.内参样本上游引物，202.检测样本上游引物，203.下游引物，204.上游荧光通用引物，205.下游通用引物，206.内参文库，207.检测文库。第一轮PCR利用发夹引物进行文库构建，并添加“ACTG”区分序列；内参文库和检测文库等体积混合后进行磁珠纯化，纯化产物作为第二轮模板。经过荧光通用引物(红色)扩增后将产物进行毛细管电泳检测，根据内参样本内已知拷贝数的信息，计算出检测样本内检测区段的拷贝数。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册,或按照试剂制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂有限公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自美国Promega公司，引物由上海百力格生物技术有限公司合成，人DNA抽提采用生工生物工程(上海)股份有限公司血液基因组DNA快速抽提试剂盒，混合文库纯化采用AMPureXP磁珠购自Beckman公司。
实施例1:
利用多重荧光竞争性PCR检测LHX和TBX 6基因的拷贝数。
序列查找和引物设计：根据NCBI的SNP数据库，查询LHX1和TBX6的序列，分别设计相互间隔400个碱基以上的3对引物；同时针对X染色体上ATP11C基因和常染色体上基因BRCA1、CCDC132、HSD17B12、MTHFR和MTRR基因上的1到2段序列设计引物。使用Primer3在线软件按照一般规则进行引物设计，并人工在设计的引物上游5’端添加ACTG碱基作为检测样本的上游引物，同时在引物上下游5’端添加上下游通用序列，并根据文献“MultiplexPCRwith the blunt hairpin primers for next generation sequencing”(Biotechnology&Bioprocess Engineering,2017,22(3):347-351)将所有特异引物构成末端完全封闭发夹引物，然后进行引物合成(表1-2)。
表1.上游特异发夹引物
Figure BDA0001554883240000071
表2.下游特异发夹引物
Figure BDA0001554883240000072
Figure BDA0001554883240000081
DNA抽提：24个人DNA采用血液基因组DNA快速抽提试剂盒，按照说明书进行抽提得到DNA，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度。24个样本的信息见表3。
表3.样本信息表
Figure BDA0001554883240000082
Figure BDA0001554883240000091
样本1、2和3作为标准品进行自身对照，同时选取女性3号样本作为所有其他检测样本的内参样本进行多重PCR。
第一轮PCR将内参样本和检测样本分别扩增。PCR扩增体系具体为：40ng DNA分别加入到各自的10μLTaq酶体系中，其中Taq酶体系包含0.02μM每对特异引物，200μM dNTPs，2mM MgCl2，1X PCR Buffer，1.0U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性4min，5个循环。
将内参文库和检测文库等体积混合，利用AMPureXP磁珠将产物进行纯化，所有纯化步骤依据操作说明书进行。
第二轮PCR选取纯化后的混合文库为模板，PCR扩增体系具体为：4μL纯化文库分别加入到各自的第二轮20μLTaq酶体系中，其中Taq酶体系包含1μM上下游接头引物，200μMdNTPs，2mM MgCl2，1X PCR Buffer，2.0U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：95℃变性15min；94℃变性30s，70℃复性4min，30个循环，
扩增结束后，将荧光通用引物的产物直接在ABI 3730XL基因测序仪上进行检测，原始数据通过GeneMapper(v4.0)软件处理，基于区分序列，可以通过片段大小将内参样本和检测样本产物区分开，将所有产物荧光值导入Excel表。将标准品1、2和3号样本的PR值求均值作为标准值(表4)，其他样本的PR值通过与标准值相除进行标准化，标准化后的PR进行后续拷贝数计算(表5)。
表4.标准荧光比值
Figure BDA0001554883240000101
表5.检测样本标准化数据
Figure BDA0001554883240000102
Figure BDA0001554883240000111
Figure BDA0001554883240000121
Figure BDA0001554883240000131
Figure BDA0001554883240000141
Figure BDA0001554883240000151
Figure BDA0001554883240000161
Figure BDA0001554883240000171
Figure BDA0001554883240000181
Figure BDA0001554883240000191
针对21个检测样本，首先进行性染色体和常染色体比较，结果显示男性性染色体和常染色体比值为0.4843±0.0630，而女性性染色体和常染色体比值为0.8421±0.1000。比值结果与样本性别值一致，说明本方案可以准确检测单拷贝的插入或缺失。针对每个基因设计了3个检测区段，通过检测区段的平均荧光比值与性染色体区段平均荧光比值的比较可以得出检测区段的拷贝数(表6)。
表6.检测样本拷贝数
Figure BDA0001554883240000192
Figure BDA0001554883240000201
Figure BDA0001554883240000211
针对21个检测样本，LHX1基因的拷贝数范围从0.9625到2.385，TBX6基因的拷贝数范围从0.8114到2.351。性染色体拷贝数范围从0.7756到2.105，根据明显界限值1.2，可以将有1拷贝差异的男女明显分开，同时男女分组中，所有样本满足平均值±3倍标准方差的条件(表7)。因此设定边界值1.2来将不同基因数据分区，同时利用标准值平均值±3倍标准方差的条件限定每区域内数据范围。在区域1内的样本为基因缺失，具有1拷贝；在区域2内的样本为正常样本，具有两拷贝。依据该数据分析21个检测样本显示：样本8和13具有LHX1缺失；样本7、10、11、12、16、18、19、20和21具有TBX6缺失。为了进一步验证数据的准确性，将样本7、13、19、20和21进行aCGH检测，aCGH的检测结果与多重荧光竞争性PCR结果完全一致，证实了多重荧光竞争性PCR检测基因拷贝数的准确性。
表7.拷贝数区域表
Figure BDA0001554883240000212
Figure BDA0001554883240000221

Claims (6)

1.一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的试剂盒，包括目标基因或位点的引物、和内参序列的引物、以及荧光通用引物，所述试剂盒采用的检测方法包括如下步骤：
(1)针对目标基因或位点、拷贝数确定的内参序列分别设计引物，在设计的引物上下游5’端分别添加与目标区段3’末端部分序列完全互补配对序列，构成末端完全封闭发夹引物，使检测样本和内参样本的扩增引物仅上游特异引物具有区分序列的差异，下游特异引物完全一致，同时特异引物的5’端具有通用序列，利用通用序列设计携带荧光的通用引物；所说的通用序列包括在特异引物的上下游5’端分别添加的上游通用序列和下游通用序列；
(2)利用第一轮多重荧光竞争性PCR将内参样本和检测样本分别扩增2-20个循环获得内参文库和检测文库，将内参文库和检测文库混合并纯化，纯化产物作为第二轮扩增模板；
(3)利用携带荧光的通用引物进行第二轮PCR扩增，产物进行毛细管电泳检测，通过电泳结果中检测文库和内参文库的相应目标基因或位点的荧光比值，并结合拷贝数确定的内参序列的比值计算出检测文库中目标基因或位点的拷贝数。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列为额外添加在检测样本所有特异引物的5’端一段特异的短片段碱基序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列长度为4-16碱基。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列为ACTG。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的上游通用序列标记荧光。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一轮PCR中上下游特异引物数为2-38对。
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