CN105695581B - 一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：按照多个基因的相对表达量将相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；构建标准品竞争性模板和待测样品竞争性模板，进行三轮多重竞争性PCR反应；混合第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并分析，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。本发明基于高速发展的二代测序平台，准确快速定量目标模板和内参照模板，并可以同时对多个样本进行5个目的基因表达差异分析，流程简单易行，价格低廉；当需要分析多样本间多基因表达差异时，不失为一种具有高准确度，通量适中，成本廉价的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因表达分析技术领域，特别涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法。
背景技术
在后基因组学时代，基因组学研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。研究者们通过分析基因表达水平,可从中获取基因转录基因调控信号转导通路核酸和蛋白质结构功能及其相互联系等相关信息；揭示基因在时间、空间上的表达及调控模式，为研究基因功能，阐释复杂性状提供新的方法。
分析目的基因表达量的常用技术有如下几种：传统的Northern blot分析和核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay)灵敏度低，过程繁琐，通量低(Parker,R.M.&Barnes,N.M.(1999)Methods Mol.Biol.106,247-283&Hod,Y.(1992)BioTechniques13,852–854)；基因芯片表达谱(DNA chip)具有高通量的优势，但难以避免高成本，重复性较差的缺点；通常来说，实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)和竞争性PCR(competitive PCR)被认定为灵敏度最高的定量PCR方法(Livak,K.J.,Flood,S.J.,Marmaro,J.,Giusti,W.&Deetz,K.(1995)PCR Methods Appl.4,357-362&Becker-Andre,M.&Hahlbrock,K.(1989)Nucleic Acids Res.17,9437–9446)。
然而，在面对大量样本时，Real-time PCR的实验成本让许多研究者难以接受；另一个短处是Real-time PCR很难矫正在扩增期间管与管的差异，从而影响最终稳定性(Siebert,P.D.&Larrick,J.W.(1992)Nature 359,557-558)。竞争性PCR利用目标模板与内参照模板共用同一对引物的特点,实现了同引物在同条件下的竞争性扩增，有着更高的稳定性和低廉的价格(Lorena Zentilin,Mauro Giacca(2007)NATURE PROTOCOLS 2,2092-2104)。但是目前的竞争性PCR也存在一些弊端：利用琼脂糖凝胶电泳定量产物时面临动态检测范围低，通量低，稳定性差的问题(Bustin,S.A.(2000)J.Mol.Endocrinol.25,169-193)；利用质谱定量则要引进单碱基延伸反应(base extension reaction)，增加了实验成本，并且多基因产物均一性不好，对于低丰度的基因分辨率低(Chunming Ding,CharlesR.Cantor(2003)PNAS.100,3059–3064)。
近十年来，高速发展的二代测序技术已广泛应用于全基因组和扩增子(PCR产物)测序中，与Sanger测序相比，数据量急剧上升，而成本大幅下降，2014年，Illumina公司的Hiseq X平台已经实现了1000美金一个人类基因组测序的目标，比十年前的30亿美金降低了300万倍(Watson M.(2014)Genome Biology.15(2))。在分析基因表达方面，二代测序平台也得到了应用，例如基于转录组测序的数字基因表达谱(RNA-seq)，但是该技术序列数(Reads)的测序深度很难区别许多低丰度和中等丰度基因的差异化信息(Simon J.Furney,Malin Pedersen.(2013)CANCER DISCOVERY 10,1122-9)，并且，研究者往往只需对自己感兴趣的基因进行表达差异分析，因此，一种具有高准确度，通量适中，成本低廉的基因表达分析方法亟待建立。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，该方法通过多重竞争性PCR对目标基因cDNA构建文库，再基于二代测序平台检测的中通量基因表达分析方法，以降低现有基因表达分析技术的成本，并具有较高的准确度和稳定性。
本发明的一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：
(1)按照多个基因的相对表达量将基因相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；其中，多个基因包括看家基因和目标基因；
(2)将步骤(1)中每个基因的两组逆转录引物A和B，以标准品RNA为模板分别进行A，B两组多重逆转录反应，构建标准品A，B竞争性模板；以待测样品RNA为模板进行B组多重逆转录反应，构建待测样品B竞争性模板；
(3)利用步骤(2)中的标准品A，B竞争性模板和待测样品B竞争性模板进行三轮多重竞争性PCR；
(4)混合所有步骤(3)中得到的第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并计算测定序列数，根据标准品梯度比例数据绘制标准曲线，校准待测样本数据，将看家基因归一化处理后，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。
所述步骤(1)中多个基因为8个基因，包括5个目的基因和3个看家基因。
所述步骤(1)中基因的相对表达量是通过Real-Time PCR检测，根据Ct值的高低将PCR引物分为两组。
所述步骤(1)中调整引物浓度比例满足多个基因产物均一性为差异在35倍以内。
所述调整引物浓度为将相对表达量较高的基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4倍。
所述步骤(2)中逆转录引物A和B中引入相邻两个位点单碱基突变，逆转录后得到两种单碱基差异的cDNA。
所述基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法应用于基因表达分析实验中。
所述步骤(3)中三轮多重竞争性PCR包括：
将标准品A，B竞争性模板按体积梯度比例混合，将待测样品B竞争性模板与标准品A竞争性模板等体积混合，作为第一轮多重竞争性PCR模板，混入低表达基因对应的引物，进行第一轮多重竞争性PCR反应；
将第一轮多重竞争性PCR反应得到的第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮的模板，混入高表达基因对应的引物，进行第二轮多重竞争性PCR反应；
将第二轮多重竞争性PCR产物原液作为模板，加入接头引物和测序引物，进行第三轮多重PCR反应。
所述梯度比例为2μL：16μL，6μL：12μL，9μL：9μL，12μL：6μL，16μL：2μL。
所述待测样本B竞争性模板与标准品A竞争性模板等体积比为9μL：9μL。
本发明涉及的竞争性PCR模板的构建方法，包括：针对目的基因设计各含有一个不同突变位点的两种逆转录引物，分别进行逆转录反应后，得到两种不同的单位点突变竞争性cDNA模板。
本发明涉及的三轮多重竞争性PCR方法，包括：按照Real-time PCR的Ct值对多个基因分为表达量高低两组，在组内进行对应引物浓度比例调整；向混有多个基因的不同竞争性模板管中，加入低表达基因对应的引物，进行第一轮有限PCR扩增；以第一轮PCR产物原液为模板，加入高表达基因对应的引物，进行第二轮有限PCR扩增；以第二轮PCR产物稀释液为模板，添加接头引物和测序引物，进行第三轮PCR扩增。其中，三轮的PCR循环数优选分别为10轮(cycle)，20轮，15轮。
具体而言，本发明包括：
特异性PCR引物设计：针对基因cDNA序列(http://asia.ensembl.org/)，利用Primer3在线软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)进行设计，并在上下游引物5’端分别添加上下游通用序列，进而合成引物(20bp左右)。
特异性逆转录引物A，B设计：参照cDNA序列，将上述特异性PCR引物3’端延伸14个碱基(bp)，并分别在第3、4位进行碱基颠换突变，作为A,B两种特异性逆转录引物。
接头引物设计：接头引物包含三部分序列，从5’端开始依次是二代测序接头引物、条形码(barcode)序列、通用序列。条形码序列的作用是区分不同的样本。
引物分组：利用Real-time PCR检测多个基因在标准品中表达差异，按照Ct值高低将相应PCR引物分为两组。具体过程为：
(1)1μg DNase l处理过的标准品RNA加入到11.5μL逆转录酶体系中，其中逆转录酶体系包含2mM dNTPs,5×RT buffer 2μL,200U/μL逆转录酶0.5μL，20U/μL RNA酶抑制物和0.2μM任意一组特异性逆转录引物；反应程序为：25℃5min；42℃60min，70℃5min，逆转录完成后将cDNA置于4℃临时保存备用。上述体系和反应程序可以依照常规逆转录反应条件或试剂盒进行适当调整。
(2)将上述cDNA稀释5倍，针对每个基因分别取2.5μL作为模板，混入Real-timePCR 15μL体系，包含特异性PCR引物8pM，ddH2O 2.1μL，10μL Mix，0.4μL Rox；反应程序为95℃2min，95℃15s，62℃32s，40循环。同样，上述体系和反应程序可以依照通常的Real-timePCR反应的常规进行适当调整，例如每一步骤的温度和时间，以及循环数，使之能够达到对数线性扩增和适合的阈值等考量的要求。
(3)根据每个基因Ct值，划分为高低两组；在同一组内，将Ct值较低的基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4倍。旨在经过三轮多重竞争性PCR后，将所有目的基因Ct值控制在差值5左右，即多个基因均一性为差异在32倍(本方案实际为35倍差异)左右。
竞争性模板构建和待测样本准备：按照引物分组中(1)步骤所述，利用A组和B组特异性逆转录引物对标准品RNA分别逆转录，利用B组特异性逆转录引物对待测样本RNA逆转录。
三轮多重竞争性PCR：
(1)将标准品A,B两组逆转录产物稀释5倍后按照体积梯度比例混合，例如：2μL：16μL，6μL：12μL，9μL：9μL，12μL：6μL，16μL：2μL，将待测样本B组逆转录产物与标准品A组逆转录产物等比例体积混合，例如：9μL：9μL。混入第一组引物和PCR体系，进行第一轮PCR，每个反应具体为50μL，包含稀释后cDNA 5μL，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCR Buffer，10pM特异性PCR引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，10个循环。上述体系和反应程序可以依照常规PCR反应条件或试剂盒进行适当调整。
(2)利用第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮的模板，混入第二组引物和PCR体系，进行第二轮多重竞争性PCR反应，每个反应具体为50μL，包含5μl第一轮PCR产物，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCR Buffer，10pM特异性PCR引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，20个循环。
(3)将第二轮反应产物稀释1000倍，添加接头和测序引物，进行第三轮PCR反应，每个反应具体为50μL，包含5μl稀释后第二轮PCR产物，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCRBuffer，10pM特异性接头引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，15个循环。
每个反应的第三轮的扩增产物合并后，测序文库构建即可完成，直接用于后续的二代测序反应。由于本发明的整体方案设计，多个样本在完成三轮多重竞争性PCR之后，基本保持了各个反应中多基因之间的均一性、以及各个样本第三轮扩增产物之间的均一性，所以，发明者认为可以同时将多个，甚至数十上百个样本的扩增，直接用于后续二代平台测序。
二代测序平台测序以及数据处理：本发明使用的二代测序平台为Ion proton平台。提取数据并计算测定序列数，每个目的基因中，对于标准品的梯度比例数据，分离两种竞争性模板PCR产物序列数，RA和RB，绘制标准曲线，X轴：VB/(VA+VB)，V代表竞争性模板混合体积；Y轴：RB/(RA+RB)，R代表竞争性PCR产物序列数。使用excel2003进行回归分析，可得标准线性方程。对于待测样本的数据，分离待测样本B组竞争性PCR产物序列数R’B和标准品A组竞争性PCR产物序列数R’A，求得R’B/(R’A+R’B)。带入标准线性方程，可得到初始真实比例。利用看家基因进行不同待测样本间归一化处理，即可得到样本间目的基因相对表达量差异。
本发明涉及一种基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，以及其中竞争性PCR模板的构建和三轮多重竞争性PCR方法。竞争性PCR利用目标模板与内参照模板共用同一对引物的特点,实现了同引物在同条件下的竞争性扩增，有良好的准确度和灵敏度；三轮多重PCR的目的在于通过对多个基因分组，组内PCR引物比例优化，以保证产物的均一性，提高了实验效率；基于高速发展的二代测序平台，准确快速定量目标模板和内参照模板，并可以同时对多个样本进行基因表达差异分析，流程简单易行，价格低廉。当需要分析多样本间多基因表达差异时，本发明不失为一种具有高准确度，通量适中，成本廉价的方法。
有益效果
本发明通过多重竞争性PCR对多个基因cDNA构建文库，再基于二代测序平台检测的中通量基因表达分析方法，成功的实现了基因表达分析；通过引物分组调整和三轮多重竞争性PCR，保证了不同目的基因扩增子的均一性，提高了二代测序平台的测序效率，避免了序列数的浪费；经过数据分析，本发明所采用的三轮竞争性PCR定量结果准确度和稳定性较高，保证了结果的可靠性；基于蓬勃发展的二代测序平台，本发明提供的方案可准确的定量不同竞争性模板，通量可观，在以后应用中可一次性对上百个样本进行多个目的基因表达量差异分析，并且整个流程简单，成本低廉，有效的节约了研究者们的时间和费用。
附图说明
图1为实施例1中调整引物后8个基因的均一性示意图，纵坐标为相对差异；
图2为本发明竞争性模板的构建；
图3为本发明三轮多重竞争性PCR过程；
图4为实施例1中的标准曲线，横坐标为梯度比例，纵坐标为对应的实际序列数；其中，图4A-4I分别对应Apoa1、Apoe、GAPDH、PPARα、PPARβ、PPARγ、Puf60、Rpl37和看家基因平均值；
图5为实施例1中相对定量结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例为基于Ion proton二代测序平台分析小鼠肝脏组织目的基因的表达差异。
(1)本实施例根据Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org)查找在C57BL/6J近交系小鼠肝脏组织中表达的8个基因，其中GAPDH、Puf60、Rpl37为看家基因。使用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)在线软件按照一般规则对外显子区段进行引物设计。每个基因包括A，B两种特异性逆转录引物和一对PCR引物，并人工在上下游PCR引物5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，化学合成法合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)上下游特异性引物(表1)。
表1 8个基因及其特异性引物
(2)小鼠饲养和样本采集：本例选取C57BL/6J(C3H)近交系实验小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司【SYXK:(沪)2007-0005】。标准品RNA取自雄性小鼠(无具体年龄要求)肝脏组织，待测样本取自出生16周龄和7天雄性小鼠肝脏组织。RNA提取步骤按照TRIZOLReagent进行，RNA样本的质量和浓度测定采用NanoDrop2000c，A260/A280为1.8-2.0。
(3)引物分组：1μg DNase l处理过的RNA加入到11.5μL逆转录酶体系中，反应体系及步骤参考Thermo Fisher Scientific公司RevertAidFirst Strand cDNA SynthesisKit说明书，其中逆转录酶体系包含2mM dNTPs,5×RT buffer 2μL,200U/μL逆转录酶0.5μL,20U/μL RNA酶抑制物和0.4μM A组特异性逆转录引物；反应程序为：25℃5min；42℃60min，70℃5min，逆转录完成后将cDNA置于4℃临时保存备用。将上述cDNA稀释5倍，针对每个目的基因分别取2.5μL作为模板，混入Real-time PCR 15μL体系，Real-time PCR反应体系及步骤参考北京百泰克生物科技有限公司Power2×SYBR Real-time PCR Premixture200T试剂盒说明书，包含特异性PCR引物8pM，ddH2O 2.1μL，10μL Mix，0.4μL Rox；反应程序为95℃ 2min，95℃15s，62℃32s，40循环。根据每个基因Ct值，划分为高低两组；在同一组内，将Ct值较低的目的基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4倍(表2)，旨在经过三轮多重竞争性PCR后，将所有基因Ct值控制在差值5左右，即目的基因均一性为最大差异在32倍(本实验中实际为35倍)左右。
表2引物分组和调整结果
(4)竞争性模板构建和待测样本准备：利用A组和B组特异性逆转录引物对标准品RNA分别逆转录，逆转录反应参照(3)中所述，逆转录RNA量均为2μg；利用B组特异性逆转录引物对待测样本RNA逆转录，逆转录RNA量均为2μg。将得到的cDNA用ddH2O稀释5倍。
(5)三轮多重竞争性PCR：将标准品A,B两组逆转录产物按照体积梯度比例混合：2μL：16μL，6μL：12μL，9μL：9μL，12μL：6μL，16μL：2μL，每个比例3重复，将待测样本B组逆转录产物与标准品A组逆转录产物等比例体积混合：9μL：9μL，同样3重复。总共21管反应。
从1至21编号，其中前15号为标准品梯度比例3重复，16、17、18为待测样本(16周龄小鼠)与竞争性模板混合3重复，19、20、21为待测样本(7天小鼠)与竞争性模板混合3重复。
每一管分别混入低表达基因对应引物和PCR体系，进行第一轮PCR，每个反应具体为50μL，包含稀释后cDNA 5μL，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCR Buffer，10pM特异性PCR引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，10个循环。
利用第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮的模板，混入高表达基因对应引物和PCR体系，进行第二轮多重竞争性PCR反应，每个反应具体为50μL，包含5μl第一轮PCR产物，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCR Buffer，10pM特异性PCR引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，20个循环。
将第二轮反应产物稀释1000倍，分别添加接头引物和测序引物(编号及对应引物见表3和表4)，进行第三轮PCR反应，每个反应具体为50μL，包含5μl稀释后第二轮PCR产物，12.5pM dNTPs，50μM MgSO4/1X PCR Buffer，10pM特异性接头引物，1U Taq酶，并使用矿物油覆盖；反应程序为：94℃变性15min；94℃变性30s，60℃复性1min30s，72℃延伸30s，15个循环。
表3样本编号和接头引物对应表
表4接头引物(含测序引物)序列表
三轮扩增结束后，将21个样本的扩增产物等体积均匀混合在一起，作为构建完成的测序文库，对21个样本同时进行Ion proton平台测序。测序文库按照琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书进行纯化。纯化后的文库按照Ion proton平台商业化操作流程进行后续操作和测序。
图1所示散点为实施例1中8个基因，纵坐标为相对差异。经过real-time PCR检测，调整前，8个基因均一性很差，相对差异可达1000倍左右；经过引物的调整和三轮多重竞争性PCR后，通过统计每个基因的总序列数(reads)，可判断其相对差异下降到35倍以内，均一性得到显著改善，优化了二代测序序列数(reads)分配，提高了测序效率。
图2所示为本发明竞争性模板的构建。针对基因cDNA序列(http://asia.ensembl.org/)设计PCR特异性引物(20bp左右)，并在上下游引物5’端分别添加上下游通用序列(18bp)，进而合成PCR引物。参照目的基因cDNA序列，将上述特异性PCR引物3’端延伸14个碱基(bp)，并分别在第3、4位进行碱基颠换突变，作为A,B两种特异性逆转录引物，分别对RNA进行逆转录，得到A,B两种cDNA竞争性模板。
图3所示为本发明三轮多重竞争性PCR过程。向混有多个基因的竞争性模板管中，先加入低表达基因对应的引物(1，2)，进行第一轮有限PCR扩增；以第一轮PCR产物原液为模板，加入高表达基因对应的引物(3，4)，进行第二轮有限PCR扩增；以第二轮PCR产物(5，6)稀释液为模板，添加接头引物和测序引物(7，8)，进行第三轮有限PCR扩增。
图4(A～I)所示横坐标为理论比例梯度，纵坐标为实际平均序列数(reads)比例(3重复)。由于样本间的相对定量需要用看家基因标化，所以计算过程中采用了3个看家基因比例平均值。横坐标为梯度比例，分别为：0.8889,0.6667,0.5000,0.3333和0.1111。用excel2003或者其它数学工具回归分析，可拟合得到标准曲线方程。
图5所示为最终相对定量结果。空白条形代表成年鼠目的基因相对表达量，斑点条形代表幼年鼠目的基因相对表达量。根据结果显示，Apoa1、Apoe、PPARα、PPARβ、PPARγ5个基因中PPARγ在所选取的两个样本(3重复)中有显著性差异(P<0.05)，其它4个没有显著性变化。
表5本方案的序列数比例
表5中可以看出，对于PPARβ、PPARγ等基因，实际序列数(reads)比例接近理论梯度；然而对于Apoa1等基因，实际的比例与理论梯度比例有出入，因为竞争性模板扩增效率有差别，可以用标准曲线进行校正：依据其它有关竞争性PCR文献(例如Gareth P.Elvidge,Tom S.Price.(2005)Analytical Biochemistry 339:231-241)，决定系数R2(coefficientof determination)大于0.95被认为有良好的线性关系。本方案中8个基因线性回归系数均高于0.95，且接近1，所以标准曲线符合相应的数学分析要求，有良好的准确度；此外，表中较低的SD值说明了本方案的重复性较高，有力的支持了本实施例方案的稳定性。
Claims (4)
1.一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，包括：
(1)引物分组：按照多个基因的相对表达量将基因相应的特异性PCR引物分为高表达基因和低表达基因两组，并在组内调整特异性PCR引物浓度比例；其中，多个基因包括看家基因和目标基因；每个基因的相对表达量是通过Real-Time PCR检测，根据每个基因Ct值的高低将特异性PCR引物分为两组；调整引物浓度为将高表达基因特异性PCR引物浓度下调1倍至4倍，引物浓度比例满足多个基因产物均一性为差异在35倍以内；
特异性PCR引物的设计方法为：针对基因cDNA序列，利用Primer3在线软件进行设计，并在上下游引物5’端分别添加上下游通用序列，进而合成获得特异性PCR引物；
(2)竞争性模板构建和待测样本准备：针对每个基因分别设计一条特异性逆转录引物A和一条特异性逆转录引物B，利用特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B以标准品RNA为模板分别进行多重逆转录反应，构建标准品A、B竞争性模板；利用特异性逆转录引物B以待测样品RNA为模板进行B组多重逆转录反应，构建待测样品B竞争性模板；
其中，特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B的设计方法为：参照每个基因的cDNA序列，将特异性PCR引物的上游引物的3’端延伸14个碱基，分别在延伸部位的第3、4位进行碱基颠换突变，并去掉特异性PCR引物中的通用序列，由此获得特异性逆转录引物A和特异性逆转录引物B，逆转录反应后得到两种单碱基差异的cDNA；
(3)三轮多重竞争性PCR：利用步骤(2)中的标准品A、B竞争性模板和待测样品B竞争性模板进行三轮多重竞争性PCR；三轮多重竞争性PCR包括：
①将标准品A、B竞争性模板按体积梯度比例混合，将待测样品B竞争性模板与标准品A竞争性模板等体积混合，作为第一轮多重竞争性PCR模板，分别混入低表达基因对应的特异性PCR引物，进行第一轮多重竞争性PCR反应；
②将第一轮多重竞争性PCR反应得到的第一轮多重竞争性PCR产物原液作为第二轮的模板，混入高表达基因对应的特异性PCR引物，进行第二轮多重竞争性PCR反应；
③将第二轮多重竞争性PCR产物稀释作为模板，加入接头引物，进行第三轮多重竞争性PCR反应；其中，接头引物包含三部分序列，从5’端开始依次是二代测序接头引物、条形码序列、通用序列；
(4)等体积混合所有步骤(3)中得到的第三轮反应产物作为二代测序平台文库上机测序，提取数据并计算测定序列数，根据标准品梯度比例数据绘制标准曲线，校准待测样本数据，将看家基因归一化处理后，即得到不同样本间多个基因相对表达量差异。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中多个基因为8个基因，包括5个目的基因和3个看家基因。
3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法，其特征在于，所述梯度比例为2μL：16μL，6μL：12μL，9μL：9μL，12μL：6μL，16μL：2μL。
4.一种如权利要求1所述的非诊断目的的基于二代测序平台的中通量基因表达分析方法的应用，其特征在于，应用于基因表达分析实验中。
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