CN111816256B - 核酸样本检测方法及装置、存储介质及电子设备 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种核酸样本检测方法、定量检测方法、循环扩增效率检测方法及装置，涉及生物检测技术领域。通过循环扩增反应基线期荧光值和每轮循环扩增的荧光值，获取每轮反应的荧光增长效率，并根据不同轮次荧光增长效率的变化率Ln，来获取核酸样本循环扩增效率；在绝对定量中，分别获取标准品和待测样本扩增效率，结合其各自CT值计算待测样本的拷贝数；在相对定量中分别获取标准品、样本中参照基因、目的基因各自的扩增效率，结合其CT值计算待测样本中目的基因与参照基因的拷贝数比值。
Description
技术领域
本公开涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种核酸样本检测方法、定量检测方法、循环扩增效率检测方法及装置、存储介质和电子设备。
背景技术
荧光定量qPCR技术(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是核酸检测和定量分析的革命性突破，1996年由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司推出。它通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。qPCR检测速度快、线性范围大、通量高、无污染，作为最灵敏的分子生物学检测技术，从诞生至今，qPCR已经成为生物、医学研究中应用最广泛的工具之一。
qPCR的物理基础是，荧光物质的浓度较低时其荧光强度与该物质的浓度成正比；在循环数达到阈值时，不同初始模板量N0的DNA均以固定效率指数增长到同一数量N，即N＝N0*ECT(E为扩增效率，每一轮DNA数量相对于前一轮DNA数量的比例，CT为荧光增长达到阈值时所对应的循环数)。这一方面极大提高了qPCR的检测灵敏度，但也造成了qPCR定量检测的核心问题，就是需要精确地检测扩增效率，因为扩增效率值的偏差会以指数累积放大从而影响qPCR检测结果。需要加样精确，才可通过稀释度及其与之对应的增减的ΔCT值计算出准确的扩增效率。
但是目前分子生物学实验设备远远满足不了这样的精度要求，按照百分比计算，目前微量加样的STD(Standard Deviation，标准差)>5％；而在多数情况下qPCR体系检测CT值的STD>0.2，对应扩增效率检测的波动可达±4％(如果理论值为1，对应波动为±8％)。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本公开的目的在于提供一种核酸样本检测方法、定量检测方法、循环扩增效率检测方法及装置、存储介质和电子设备，至少在一定程度上克服由于相关技术中核酸样本循环扩增效率检测不准确的问题。
本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。
根据本公开的一个方面，提供一种核酸样本循环扩增效率检测方法，包括：
获取核酸样本在循环扩增反应中的荧光基线值FB；
获取所述核酸样本在每轮循环扩增反应的荧光值Fn，其中n＝1，…，N，N为正整数；
根据所述荧光基线值FB和所述荧光值Fn获得所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln；
根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k，k为正整数；
根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得所述核酸样本的扩增效率。
根据本公开的另一方面，提供一种核酸样本检测方法，包括：
分别获取标准品的循环阈值CTC和待测样本的循环阈值CTS；
根据上述的核酸样本循环扩增效率的检测方法获得所述标准品的扩增效率EC和所述待测样本的扩增效率ES；
获取所述标准品的拷贝数XC；
根据所述标准品的拷贝数XC、循环阈值CTC、扩增效率EC和所述待测样本的循环阈值CTS、扩增效率ES获取所述待测样本的拷贝数XS。
根据本公开的另一方面，提供一种核酸样本定量检测方法，应用于含有确定比例Z的目标基因序列和参照基因序列的标准品，以及含有目标基因序列和参考基因序列的待测样品，将标准品和待测样本置于qPCR仪中，该方法包括：
分别获取标准品中目标基因序列的循环阈值CTCX、标准品中参照基因序列的循环阈值CTCY、待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX和待测样本中参照基因序列的循环阈值CTSY；
根据上述的核酸样本循环扩增效率的检测方法获得所述标准品中目标基因序列的扩增效率ECX、所述标准品中参照基因序列的扩增效率ECY和所述待测样本中目标基因序列的扩增效率ESX、所述待测样本中参照基因序列的扩增效率ESY；
根据标准品中目标基因序列的拷贝数XC、循环阈值CTCX、扩增效率ECX和所述待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX、扩增效率ESX确定所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS；
根据标准品中参考基因序列的拷贝数YC、循环阈值CTCY、扩增效率ECY和所述待测样本中参考基因序列的循环阈值CTSY、扩增效率ESY确定所述待测样本中参考基因序列的拷贝数YS；
获取所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS与参照基因序列YS的拷贝数比值R。
根据本公开的再一个方面，提供一种电子设备，包括：处理器；以及存储器，用于存储所述处理器的可执行指令；其中，所述处理器配置为经由执行所述可执行指令来执行上述的核酸样本检测方法。
根据本公开的又一个方面，提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现上述的核酸样本检测方法。
本公开的实施例所提供的核酸样本检测方法、定量检测方法、循环扩增效率检测方法及装置、存储介质和电子设备，根据荧光基线值和荧光值获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率，并基于荧光增长效率的变化率确定最优的效率检测轮次，从而获得核酸样本的扩增效率，可以准确确定核酸样本的扩增效率。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出本公开实施例中一种核酸样本循环扩增效率的检测方法的流程图；
图2示出本公开另一实施例中核酸样本循环扩增效率的检测方法流程图；
图3示出本公开实施例中一种核酸样本检测方法的流程图；
图4示出本公开实施例中一种核酸样本定量检测方法的流程图；
图5示出本公开实施例中一种核酸样本循环扩增效率检测装置结构示意图；
图6示出本公开实施例中一种核酸样本检测装置结构示意图；
图7示出本公开实施例中一种核酸样本定量检测装置结构示意图；
图8示出本公开实施例中一种电子设备的结构框图；
图9示出本公开实施例一种程序产品的示意图；
图10示出本公开一应用例中的测试数据；
图11示出本公开实施例中循环扩增反应荧光增长效率的曲线图；
图12示出本公开实施例中循环扩增反应荧光增长效率的变化率的曲线图。
具体实施方式
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。
此外，附图仅为本公开的示意性图解，并非一定是按比例绘制。图中相同的附图标记表示相同或类似的部分，因而将省略对它们的重复描述。附图中所示的一些方框图是功能实体，不一定必须与物理或逻辑上独立的实体相对应。可以采用软件形式来实现这些功能实体，或在一个或多个硬件模块或集成电路中实现这些功能实体，或在不同网络和/或处理器装置和/或微控制器装置中实现这些功能实体。
相关技术中采用En＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)计算扩增效率，其具体做法是在CT值附近选几个循环分别计算扩增效率值，统计并比较使用哪一个循环的扩增效率值计算得到的梯度稀释样本数据离散小。该方法需要用梯度稀释的数据来选择由荧光强度所获取得扩增效率，而且也只是试图改进标准品扩增效率的检测精度，检测结果波动大；另外该方法也是采用绝对荧光阈值进行CT计算加大了误差，该方法即使检测梯度标准品都无法获得线性结果。
影响qPCR检测分辨率和准确度的核心因素有：加样误差大，设备精密度不足，扩增效率算法不精确，样本和标准品扩增效率有差异等。本发明人发现要突破qPCR的检测极限需要有根本性的改变。
通过对qPCR过程中荧光强度变化的分析，获取标准品与实测样本的扩增效率。
对双靶标质粒标准品进行双通道检测可以发现两个不同通道ΔCT值STD为0.02，对比其相应平均CT值，CV只有0.1％。，这表明同样拷贝数的不同孔间样本在经过若干轮次(CT值对应循环数)的扩增后，总的相对荧光的增长比例也会近乎完美的一致，对应其每一轮的荧光增长也必然如此。
荧光定量qPCR的物理基础是：荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度成正比。以使用较广泛的TaqMan探针体系为例，qPCR设备检测到的荧光值包含3个组成部分，背景荧光(含)，游离探针水解形成的荧光，DNA模板复制时累积的荧光。其中，游离探针水解形成的荧光很小，反应初期稳定，反应后期会受DNA复制过程对Taq酶的竞争而被抑制。TaqMan探针在每一次模板复制时都会释放一个荧光信号，并持续保持在反应体系中，背景荧光可以直接检测，游离探针水解造成的影响可以通过基线斜率进行修正消除(在DNA复制引起荧光显著增长时，游离探针水解影响会迅速下降，可忽略不计)。设反应体系中模板初始DNA拷贝数为C(qPCR反应体系体积固定，因此在达到阈值前荧光增加与拷贝数增加成正比)，每一轮反应检测到的荧光值为Fn，基线荧光值为FB，每个荧光分子的单位强度为μ，指数扩增阶段的PCR扩增效率为E(扩增后分子数与原模板分子数的比值，理想值2)，则：
F1＝FB+μ·C·E
F2＝FB+μ·C·E+μ·C·E2
F3＝FB+μ·C·E+μ·C·E2+μ·C·E3
Fn＝FB+μ·C·E+μ·C·E2+…+μ·C·En (1)
如果采用相对荧光法Rn＝(Fn/FB-1)进行计算
Rn/Rn-1＝(Fn/FB-1)/(Fn-1/FB-1)＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)
＝(μ·C·E+μ·C·E2+…+μ·C·En)/(μ·C·E+μ·C·E2+…+μ·C·En-1)
＝(E+E2+E3+…+En)/(E+E2+E3+…+En-1)
＝E(1+E+E2+E3+…+En-1)/(E+E2+E3+…+En-1)
＝E[1+1/(E+E2+E3+…+En-1)]＝E (2)
既然相对荧光信号增长极其稳定，上面推导的公式表明，在达到阈值线前的循环扩增反应中，扣除本底后的荧光增长效率(循环数>15)就可以看作是扩增效率，但是，事实上现有技术不能从荧光强度变化精确获取扩增效率。要精确检测标准品和待测样本间扩增效率的差异必须使用更为精确的方法。
本发明人发现：在实际的qPCR检测中，背景荧光强度值波动范围很大，甚至超过达到阈值时的荧光增长；而qPCR扩增的基线期，无法测定模板复制过程引起的微小荧光增长；由于对荧光检测的灵敏度有限，还会导致模板复制到一定阶段荧光强度开始上升但荧光强度变化波幅度较大，效率忽上忽下；在DNA复制到一定数量，开始导致荧光信号增长的最初的那个循环中，由于游离探针水解信号还存在，导致这一轮的荧光增长效率远远超过2，之后游离探针水解就随着qPCR循环开始迅速下降；荧光增长效率很快趋近于DNA复制对应的荧光增长效率；再之后随着DNA的大量增长，qPCR的效率再次下降并最终趋于趋向停滞。以上原因导致表观上荧光增长效率要么处于停滞状态，要么处于变化过程中。实际上，对于一个确定样本而言，PCR的扩增效率在达到阈值前一直是稳定的，而且每个样本其每一轮表观上的扩增效率的变化率都会在达到阈值前进入一个稳定为1的阶段，此时对应的荧光增长的变化率即为该样本的扩增效率。因此分析荧光增长效率的变化率，即可寻找合适的检测窗口。
下面，将结合附图及实施例对本示例实施方式中的核酸样本检测方法的各个步骤进行更详细的说明。
图1示出本公开实施例中一种核酸样本循环扩增效率的检测方法的流程图。
如图1所示，步骤S101，获取核酸样本在循环扩增反应中的荧光基线值FB。
步骤S102，获取核酸样本在每轮循环扩增反应的荧光值Fn，其中n＝1，…，N，N为正整数。N为循环轮次，N一般取值大于15，小于40。例如，N可以取值25，30，35，或40。
步骤S103，根据荧光基线值FB和荧光值Fn获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。在一个实施例中，通过(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2获得第n轮的循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。
步骤S104，根据核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k，k为正整数。通过分析变化率Ln确定最优荧光增长效率检测窗口k，其中，k<N。
步骤S105，根据确定的最优荧光增长效率检测窗口k，根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得核酸样本的扩增效率。
上述实施例中，根据荧光基线值FB和荧光值Fn获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率，并基于荧光增长效率的变化率确定最优的效率检测轮次，从而根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得核酸样本的扩增效率，可以准确确定核酸样本的扩增效率。
图2示出本公开另一实施例中核酸样本循环扩增效率的检测方法流程图。
如图2所示，在步骤S201，获取扩增反应基线期的荧光基线值FB。
步骤S202，依次获取核酸样本在每轮循环扩增时的荧光值F1，F2，F3…Fn，其中Fn为第n轮循环扩增时检测到的荧光值。
步骤S203，根据荧光基线值FB和荧光值Fn获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率。在一个实施例中，根据相对荧光阈值计算公式Rn＝(Fn-FB)/FB，获取核酸样本在第n轮循环扩增反应的荧光增长效率Rn/Rn-1＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)，依次获取核酸样本的一组荧光增长效率。
步骤S204确定核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率。在一个实施例中，根据公式：
Ln＝(Rn/Rn-1)/(Rn-1/Rn-2)＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2 (3)
获取核酸样本在第n轮循环的荧光值增长的变化率Ln，依次获取核酸样本的一组荧光增长效率的变化率。
步骤S205，从后向前依次查看各轮循环扩增反应的荧光值增长率的变化率，变化率由逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率，最趋近于1的第k轮循环扩增反应。从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，循环扩增的荧光值增长的变化率由逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率，最趋近于1的Ln，根据Ln获取最优的检测窗口k，即第k轮循环扩增反应。
步骤S206，根据第k轮循环扩增反应获得核酸样本的扩增效率。根据公式Ex＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)，获得核酸样本的扩增效率Ex。
上述实施例中，从后向前依次查看各轮循环扩增反应的荧光值增长率的变化率，变化率由逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率，最趋近于1的第k轮循环扩增反应，从而确定了核酸样本的扩增效率，准确率高，超出了现有技术中的扩增效率的准确率。
在一个实施例中，首先根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的指数增长期；然后确定循环扩增反应的指数增长期中荧光值增长的变化率最趋近于1的第k轮循环扩增反应，作为最优效率检测轮次k，从而确定扩增效率，准确率高。
在准确确定核酸样本扩增效率后，核酸样本扩增效率的检测方法可以应用于核酸样本定量检测中。通过在准确获得qPCR的循环扩增效率后引入全新的定量计算公式来实现核酸样本定量检测。
图3示出本公开实施例中一种核酸样本检测方法的流程图。
如图3所示，步骤S301，分别获取标准品的循环阈值CTC和待测样本的循环阈值CTS。
步骤S302，根据核酸样本循环扩增效率的检测方法获得标准品的扩增效率EC和待测样本的扩增效率ES。可以采用如图1和图2中实施例中的核酸样本循环扩增效率的检测方法获得标准品的扩增效率EC和待测样本的扩增效率ES，或者本公开中其他实施例中的方法。
步骤S303，获取标准品的拷贝数XC。
步骤S304，根据标准品的拷贝数XC、循环阈值CTC、扩增效率EC和待测样本的循环阈值CTS、扩增效率ES获取待测样本的拷贝数XS。
在一个实施例中，根据公式：
获取待测样本的拷贝数XS。
图4示出本公开实施例中一种核酸样本定量检测方法的流程图。该方法应用于含有确定比例Z的目标基因序列和参照基因序列的标准品，Z可以表示为F：M，其中，F、M为正整数，以及含有目标基因序列和参考基因序列的待测样品，将标准品和待测样本置于qPCR仪中。在一些实施例中，Z也可以表示成分数或小数。在一个实施例中，标准品中目标基因序列和参照基因序列的确定比例Z为1:1。在一些实施例中，标准品中目标基因序列和参照基因序列的确定比例Z为2:1，3：1、1：2或1：3等。
如图4所示，步骤S401,分别获取标准品中目标基因序列的循环阈值CTCX、标准品中参照基因序列的循环阈值CTCY和待测样本中参照基因序列的循环阈值CTSY。
步骤S402，根据核酸样本循环扩增效率的检测方法获得标准品中目标基因序列的扩增效率ECX、标准品中参照基因序列的扩增效率ECY和待测样本中目标基因序列的扩增效率ESX、待测样本中参照基因序列的扩增效率ESY。
步骤S403，根据标准品中目标基因序列的拷贝数XC、循环阈值CTCX、扩增效率ECX和待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX、扩增效率ESX确定待测样本中目标基因序列的拷贝数XS。
在一个实施例中，根据公式：
获取待测样本中目标基因序列的拷贝数XS。
步骤S404，根据标准品中参考基因序列的拷贝数YC、循环阈值CTCY、扩增效率ECY和待测样本中参考基因序列的循环阈值CTSY、扩增效率ESY确定待测样本中参考基因序列的拷贝数YS。
在一个实施例中，根据公式：
获取待测样本中参照基因序列的拷贝数YS
步骤S405，获取待测样本中目标基因序列的拷贝数XS与参照基因序列YS的拷贝数比值R。
本方法的方案能够精确进行qPCR定量检测，具体包括：
1、发现了qPCR仪所测CT值的精密度极高，对应荧光强度的变化亦是如此，因而可以利用荧光强度的变化对qPCR进行准确分析。
2、在分析荧光强度变化的过程中利用荧光增长的变化率恰当的解决了游离探针水解及平台期扩增效率下降对qPCR扩增效率检测的干扰。
3、不再依赖梯度稀释计算扩增效率，而是直接通过更精密的而检测手段直接获取扩增效率，从而构建了全新的qPCR计算体系，大大提高了qPCR检测的精密度和准确度。
以下的实施例，用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。
[实施例1]
1、对核酸样本进行循环扩增
实验使用上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96S荧光定量PCR仪进行PCR实验及结果分析，该实施例中荧光探针标记采用HEX染料。
2、通过qPCR依次获得核酸样本4个复孔(A1、A2、A3、A4)的每轮循环的Fn及FB值
按表1配置反应体系混合液(25uL/管)
表1荧光定量PCR反应体系
| 试剂 | 用量(uL/管) |
| 10*Buffer(Mg2+) | 2.5 |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 1 |
| Taq Hot Start(1unit/uL) | 1 |
| H F(10uM)(SEQ ID NO:2) | 0.4 |
| H R(10uM)(SEQ ID NO:3) | 0.4 |
| H P(HEX荧光通道)(10uM)(SEQ ID NO:4) | 0.2 |
| RNase free dH2O | 14.5 |
| 核酸样本模板 | 5 |
进行荧光定量PCR反应，按表2设置PCR反应条件。
表2荧光定量PCR反应条件
得到荧光定量PCR扩增结果,依次获取核酸样本(4个复孔：A1、A2、A3、A4)的每一组荧光值F1，F2，F3…Fn，其中Fn为第n轮循环扩增时HEX通道检测到的荧光值,如表3所示，获取扩增反应基线期的荧光基线值FB,如表4所示。
表3实施例1中核酸样本每轮循环的Fn值
表4实施例1中核酸样本的FB值
3、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表5所示，根据此Ln获取的循环数为20；根据公式EX＝(F20-FB)/(F19-FB)获得核酸样本每个复孔的扩增效率E，其平均值即为核酸样本扩增效率值E＝1.956297，如表6。
表5实施例1中核酸样本复孔的Ln值
/>
表6实施例1中核酸样本循环扩增效率值
| 效率值(E) | |
| A1 | 1.962945 |
| A2 | 1.960603 |
| A3 | 1.945877 |
| A4 | 1.955765 |
| 平均值 | 1.956297 |
【实施例2】
1、获得实施例1中核酸样本的Rn、Rn/Rn-1
根据相对荧光阈值计算公式Rn＝(Fn-FB)/FB，获取核酸样本在第n轮循环的荧光值增长效率Rn/Rn-1＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)，依次获取核酸样本每一组复孔(A1、A2、A3、A4)的荧光值增长效率，如表7所示。
表7实施例2中核酸样本复孔每轮循环的Rn及Rn/Rn-1值
/>
/>
/>
2、根据公式Ln＝(Rn/Rn-1)/(Rn-1/Rn-2)，获取标准品在第n轮循环的荧光值增长的变化率Ln，依次获取核酸样本的一组荧光值增长的变化率，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，根据Ln获取相应的循环数为20；根据公式EX＝(R20/R20-1)，获得核酸样本每一组复孔的扩增效率E，如表8所示。其平均值即为核酸样本扩增效率值E＝1.956297，如表9所示，与实施例1所得核酸样本扩增效率完全一致。
表8实施例2中核酸样本复孔的Ln、n及E值
/>
表9实施例2中核酸样本循环扩增效率值
| 效率值(E) | |
| A1 | 1.962945 |
| A2 | 1.960603 |
| A3 | 1.945877 |
| A4 | 1.955765 |
| 平均值 | 1.956297 |
【实施例3】
1、标准品及待测样本的准备
将目的基因片段插入T载体，挑取单克隆，测序，将在大肠杆菌中扩增制备的经验证的标准品质粒进行qPCR检测。使用如上制备的标准品质粒，分别用1×TE和4×TE缓冲液进行等比例稀释，1×TE组作为标准品，4×TE组作为待测样本。
2、对标准品及待测样本进行循环扩增
实验使用上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96S荧光定量PCR仪进行PCR实验及结果分析。
3、按表1配置反应体系混合液(25uL/管)进行荧光定量PCR反应，按表2设置PCR反应条件。
4、得到荧光定量PCR扩增结果,依次获取标准品(4个复孔：A1、A2、A3、A4)的每一组荧光值F1，F2，F3…Fn，其中Fn为第n轮循环扩增时检测到的荧光值(HEX通道),如表10所示，获取扩增反应基线期的荧光基线值FB,如表11所示。
表10实施例3中标准品每轮循环的Fn值(HEX通道)
/>
表11实施例3中标准品的FB值(HEX通道)
5、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表12所示，根据此Ln获取的循环数为21；根据公式ECX＝(F21-FB)/(F20-FB)获得标准品每个复孔的扩增效率E，其平均值即为标准品扩增效率值E＝1.900359。同时，在qPCR仪上读取各复孔对应的CT值，如表13。
表12实施例3中标准品的Ln值(HEX通道)
/>
表13实施例3中标准品效率值及CT值(HEX通道)
| 效率值(ECX) | CT值(CTCX) | |
| A1 | 1.904433 | 19.78 |
| A2 | 1.901394 | 19.77 |
| A3 | 1.891382 | 19.77 |
| A4 | 1.904225 | 19.78 |
| 平均值 | 1.900359 | 19.775 |
6、同理可得待测样本(4个复孔：B1、B2、B3、B4)的扩增效率值、CT值，如表14所示。
表14实施例3中待测样本扩增效率值、CT值(HEX通道)
7、根据公式标准品的拷贝数XC设定值8×105，计算得到待测样本的拷贝数XS以及他们的比例关系XS/XC，如表15。
表15实施例3标准品的拷贝数XC以及与待测样本的拷贝数XS的比例关系
8、标准品与待测样本是用1×TE和4×TE缓冲液分别进行等比例稀释，其理论拷贝数比例应为1。将1×TE稀释的质粒作为标准品，通过标准曲线方法得到标准品扩增效率，据此所计算待测样本的拷贝数XS为4.47×105，与标准品的拷贝数XC＝8×105比例为0.558219，偏差-44.18％，如表16。而经过本方法计算后的比例为0.966138，偏差为-3.39％，可知本方法计算的浓度值明显更精确，更接近真实值，偏差值更小，极大改善了单通道荧光定量PCR的稳定性和精确度。
表16实施例3中标准曲线方法得到的标准品效率计算待测样本拷贝数偏差
【实施例4】
1、标准品的制备
使用PCR方法制备等比例(1:1)连接的目的基因与参照基因片段后，将目标片段插入T载体，挑取单克隆，测序，在大肠杆菌中扩增制备的经验证的标准品质粒(SEQ ID NO:1)。使用如上制备的标准品质粒，分别用1×TE和4×TE缓冲液进行等比例稀释，1×TE组作为标准品，4×TE组作为待测样本。
2、对标准品及待测样本进行循环扩增
实验使用上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96S荧光定量PCR仪进行双重荧光定量PCR实验及结果分析。
3、按表17配置反应体系混合液(25uL/管)进行荧光定量PCR反应，按表2设置PCR反应条件，选取HEX为目的基因通道，FAM为参照基因通道。
表17实施例4中荧光定量PCR反应体系
| 试剂 | 用量(uL/管) |
| 10*Buffer(Mg2+) | 2.5 |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 1 |
| Taq Hot Start(1unit/uL) | 1 |
| H F(10uM)(SEQ ID NO:2) | 0.4 |
| H R(10uM)(SEQ ID NO:3) | 0.4 |
| H P(HEX荧光通道)(10uM)(SEQ ID NO:4) | 0.2 |
| R F(10uM)(SEQ ID NO:5) | 0.4 |
| R R(10uM)(SEQ ID NO:6) | 0.4 |
| R P(FAM荧光通道)(10uM)(SEQ ID NO:7) | 0.2 |
| RNase free dH2O | 13.5 |
| 模板 | 5 |
4、得到荧光定量PCR扩增结果,依次获取标准品(4个复孔：A1、A2、A3、A4)的每一组荧光值F1，F2，F3…Fn，其中Fn为第n轮循环扩增时检测到的荧光值(HEX通道),如表18所示，获取扩增反应基线期的荧光基线值FB,如表19所示。
表18实施例4中标准品每轮循环的Fn值(HEX通道)
/>
表19实施例4中标准品的FB值(HEX通道)
5、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表20所示，根据此Ln获取的循环数为23；根据公式ECX＝(F23-FB)/(F22-FB)获得标准品每个复孔的扩增效率E，其平均值即为标准品扩增效率值E＝1.9121895。同时，在qPCR仪上读取各复孔对应的CT值，如表21。
表20实施例4中标准品的Ln值(HEX通道)
/>
表21实施例4中标准品效率值及CT值(HEX通道)
| 效率值(ECX) | CT值(CTCX) | |
| A1 | 1.919766 | 21.62 |
| A2 | 1.915847 | 21.61 |
| A3 | 1.901327 | 21.61 |
| A4 | 1.911818 | 21.62 |
| 平均值 | 1.912189 | 21.615 |
6、同理可得待测样本(4个复孔：B1、B2、B3、B4)的扩增效率值、CT值，如表22所示。
表22实施例4中待测样本扩增效率值、CT值(HEX通道)
| 效率值(ESX) | CT值(CTSX) | |
| B1 | 1.847843 | 22.55 |
| B2 | 1.866513 | 22.45 |
| B3 | 1.877713 | 22.58 |
| B4 | 1.875831 | 22.55 |
| 平均值 | 1.866975 | 22.5325 |
7、根据公式获取待测样本目标基因的拷贝数XS与标准品目标基因的拷贝数XC的比例关系，如表23。
表23标准品的拷贝数XC与待测样本的拷贝数XS的比例关系(HEX通道)
8、在参照基因荧光通道(FAM通道)下，可得到该标准品4个复孔(A1、A2、A3、A4)的Fn值、FB值和扩增效率的变化率Ln，如表24、25、26。
表24实施例4中标准品复孔的Fn值(FAM通道)
/>
/>
表25实施例4中标准品的FB值(FAM通道)
表26实施例4中标准品复孔的Ln(FAM通道)
/>
9、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表26所示，根据此Ln获取的循环数为22；根据公式ECY＝(F22-FB)/(F21-FB)获得标准品每个复孔的扩增效率E，其平均值即为标准品扩增效率值E＝1.94581，如表27，同时取FAM通道标准品CT值的平均值。
表27实施例4中标准品的扩增效率值、CT值(FAM通道)
| 效率值(ECY) | CT值(CTCY) | |
| A1 | 1.950589 | 21.33 |
| A2 | 1.953393 | 21.31 |
| A3 | 1.940022 | 21.3 |
| A4 | 1.939246 | 21.32 |
| 平均值 | 1.945813 | 21.315 |
10、同理可得待测样本FAM通道(4个复孔：B1、B2、B3、B4)的扩增效率值、CT值，如表28所示。
表28实施例4中待测样本的扩增效率值、CT值(FAM通道)
/>
11、根据公式获取待测样本参照基因的拷贝数YS与标准品参照基因的拷贝数YC的比例关系，如表29。
表29实施例4中标准品的拷贝数YC与待测样本的拷贝数YS的比例关系
12、根据公式且标准品为目的基因与参照基因1:1的比例，即XC/YC＝1，如表30，可得经过本方法的待测样本实际ratio值为1.008。
表30实施例4中计算所得双通道待测样本ratio值
| XS/XC | 0.945935 |
| YS/YC | 0.938258 |
| XC/YC | 1 |
| R＝XS/YS | 1.008182 |
13、在Slan96上采用上述标准品检测待测样本，标准品采用4倍梯度稀释，3个复孔，实验条件不变。通过读取qPCR，由标准曲线方法得到待测样本(4个复孔：B1、B2、B3、B4)的ratio值，如表31，并算得平均值。根据表31，通过梯度标准曲线方法所得的待测样本ratio值平均值为1.367674，与待测样本实际比例1：1相差较多。
表31通过标准曲线方法所得待测样本的ratio值
14、将双靶标质粒稀释于1×TE作为标准品，而将同样的双靶标质粒稀释于4×TE缓冲液作为待测样品，这样标准品和待测样品的扩增效率不再一致，如果依然使用从标准曲线获得的扩增效率计算待测样品的ratio值为1.37(误差为37％)，出现了明显的偏差。通过本专利描述方法精确获取了两个荧光同道中标准品和待测样品的扩增效率及CT值，得到最终的ratio值为1.008(误差为0.8％)。
【实施例5】
1、荧光定量PCR标准品为实施例4方法制备的标准品。
2、本发明测试的样本为人体石蜡包埋的乳腺癌组织。使用Qiagen公司的GeneReadDNA FFPE KIT来提取其DNA。
3、切片样本的稀释
使用同一个切片样本，分别用ATE和4×TE进行3倍梯度稀释，作为两组待测样本(以下称用ATE稀释的样本为样本一，用4×TE稀释的样本为样本二)。
4、通过qPCR获得标准品HEX通道的Fn及FB值
按表17配置反应体系混合液(25uL/管)，使用上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96S荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应，按表2设置PCR反应条件。得到荧光定量PCR扩增结果,依次获取标准品(4个重复孔：A1、A2、A3、A4)的每一组荧光值F1，F2，F3…Fn，其中Fn为第n轮循环扩增时检测到的荧光值,如表32所示，获取扩增反应基线期的荧光基线值FB,如表33所示。
表32实施例5中标准品复孔的Fn值(HEX通道)
/>
表33实施例5中标准品复孔的FB值(HEX通道)
5、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表34所示，根据Ln获取的循环数为28；根据公式ECX＝(F28-FB)/(F27-FB)获得标准品HEX通道的每个复孔的扩增效率E，其平均值即为扩增效率值E＝1.90002，如表35。
表34实施例5中标准品复孔的Ln、n及E值(HEX通道)
/>
表35实施例5中标准品的扩增效率值(HEX通道)
【实施例6】
1、实施例5的结果也可根据相对荧光阈值计算公式Rn＝(Fn-FB)/FB，获取标准品在第n轮循环的荧光值增长效率Rn/Rn-1＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)，依次获取标准品每一组复孔(A1、A2、A3、A4)的荧光值增长效率，如表36所示。
表36实施例6中标准品复孔的Rn及Rn/Rn-1值(HEX通道)
/>
2、根据公式Ln＝(Rn/Rn-1)/(Rn-1/Rn-2)，获取标准品在第n轮循环的荧光值增长的变化率Ln，依次获取待测样本的一组荧光值增长的变化率，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，根据Ln获取相应的循环数为28；根据公式ECX＝(R28/R28-1)，获得标准品HEX通道的每一组复孔的扩增效率E，如表37所示。其平均值即为扩增效率值E＝1.90002，如表38所示，与实施例5所得待测样本扩增效率完全一致。
表37实施例6中标准品复孔的Ln(HEX通道)
/>
表38实施例6中标准品的扩增效率值(HEX通道)
| 效率值(ESX) | |
| A1 | 1.89202 |
| A2 | 1.88635 |
| A3 | 1.91531 |
| A4 | 1.90641 |
| 平均值 | 1.90002 |
【实施例7】
1、根据实施例5、6得到标准品HEX通道复孔的效率值，其平均值即为扩增效率值和CT值，如表39所示。
表39实施例7中标准品的扩增效率值、CT值(HEX通道)
| 效率值(ECX) | CT值(CTCX) | |
| A1 | 1.89202 | 25.96 |
| A2 | 1.88635 | 25.88 |
| A3 | 1.91531 | 25.98 |
| A4 | 1.90641 | 26.02 |
| 平均值 | 1.90002 | 25.96 |
2、同理可得待测样本HEX通道(样本一4个复孔：B1、B2、B3、B4；样本二4个复孔：C1、C2、C3、C4)的扩增效率值、CT值，如表40所示。
表40待测样本的扩增效率值、CT值(HEX通道)
| 样本一 | 效率值(ESX1) | CT值(CTSX1) | 样本二 | 效率值(ESX2) | CT值(CTSX2) |
| B1 | 1.953229 | 21.35 | C1 | 1.934594 | 21.9 |
| B2 | 1.943532 | 21.34 | C2 | 1.912415 | 21.86 |
| B3 | 1.963330 | 21.4 | C3 | 1.923732 | 21.88 |
| B4 | 1.951536 | 21.38 | C4 | 1.949679 | 21.9 |
| 平均值 | 1.952907 | 21.3675 | 平均值 | 1.930105 | 21.885 |
3、同理在FAM通道下，可得到该标准品4个复孔(A1、A2、A3、A4)的Fn值、FB值和扩增效率的变化率Ln，如表41、42、43。
表41实施例7中标准品复孔的Fn值(FAM通道)
/>
表42实施例7中标准品复孔的FB值(FAM通道)
表43实施例7中标准品复孔的Ln、n及E值(FAM通道)
/>
/>
3、根据公式Ln＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2，从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，当循环扩增的荧光值增长的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的Ln，因该实施例选取了4个复孔，则选择上升过程中荧光值增长的变化率的平均值最趋近于1的Ln，如表43所示，根据此Ln获取的循环数为26；根据公式ECY＝(F26-FB)/(F25-FB)获得标准品FAM通道的每个复孔的扩增效率ESY，其平均值即为标准品扩增效率值E＝1.94517。同时取标准品FAM通道CT值的平均值，如表44。
表44实施例7中标准品的扩增效率值、CT值(FAM通道)
| 效率值(ECY) | CT值(CTCY) | |
| A1 | 1.930495 | 25.76 |
| A2 | 1.949305 | 25.69 |
| A3 | 1.953145 | 25.74 |
| A4 | 1.947723 | 25.74 |
| 平均值 | 1.945167 | 25.7325 |
5、同理可分别得到待测样本FAM通道的扩增效率值、CT值，如表45所示。
表45实施例7中待测样本的扩增效率值、CT值(FAM通道)
| 样本一 | 效率值(ESY1) | CT值(CTSY1) | 样本二 | 效率值(ESY2) | CT值(CTSY2) |
| B1 | 2.022218 | 25.07 | C1 | 1.932614 | 26.83 |
| B2 | 1.982623 | 25.1 | C2 | 1.927150 | 26.94 |
| B3 | 2.011193 | 25.1 | C3 | 1.938847 | 26.66 |
| B4 | 2.012436 | 25.09 | C4 | 1.937162 | 26.54 |
| 平均值 | 2.007118 | 25.09 | 平均值 | 1.933943 | 26.7425 |
6、根据公式以及/>得到标准品与待测样本中目的基因和参照基因拷贝数的比例关系YS/YC、XS/XC，根据公式/>且标准品为目的基因与参照基因1:1的比例，即XC/YC＝1，分别得到两组样本的ratio值，如表46。
表46实施例7中使用本方法计算所得待测样本的ratio值
7、通过读取qPCR仪，由标准曲线方法得到待测样本的ratio值，如表47，并算得平均值。
表47通过标准曲线方法分别所得待测样本的ratio值
8、对同一石蜡切片样本抽提核酸样本而言，其HER2的拷贝数是恒定的，但稀释在不同缓冲液中由于TE浓度不同，引起了每个通道的循环扩增效率出现不同变化，此时如果依然采用原来的传统方法进行检测，可以看到结果偏差为118％，而采用荧光增长独立检测标准品和样本中参照基因和目的基因的循环扩增效率进行检测，同一样本在不同缓冲液稀释条件下检测结果的偏差为7.11％。以上实验结果表明采用本发明检测循环扩增效率的方法，完全省却了传统qPCR制作标准曲线的繁琐步骤，同时还大大提高了qPCR检测的准确度和重复性。
图5示出本公开实施例中一种核酸样本循环扩增效率检测装置结构示意图。如图5所示，该核酸样本循环扩增效率检测装置包括：
荧光值获取模块51，用于获取核酸样本在循环扩增反应中的荧光基线值FB；获取核酸样本在每轮循环扩增反应的荧光值Fn，其中n＝1，…，N，N为正整数。
变化率确定模块52，用于根据荧光基线值FB和荧光值Fn获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。在一个实施例中，根据(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。
检测窗口确定模块53，用于根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k，k为正整数；
扩增效率确定模块54，用于根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得所述核酸样本的扩增效率。
图6示出本公开实施例中一种核酸样本检测装置结构示意图。如图6所示，核酸样本检测装置包括：
循环阈值确定模块61，用于别获取标准品的循环阈值CTC和待测样本的循环阈值CTS。
核酸样本循环扩增效率检测装置62，用于获得所述标准品的扩增效率EC和所述待测样本的扩增效率ES。在一个实施例中，核酸样本循环扩增效率检测装置62可以采用图5中示出的核酸样本循环扩增效率检测装置。
标准拷贝数获得模块63，用于获取标准品的拷贝数XC；
样本拷贝数确定模块64，用于根据所述标准品的拷贝数XC、循环阈值CTC、扩增效率EC和所述待测样本的循环阈值CTS、扩增效率ES获取所述待测样本的拷贝数XS。
在一个实施例中，样本拷贝数确定模块用于根据公式获取待测样本的拷贝数XS。
图7示出本公开实施例中一种核酸样本定量检测装置结构示意图。如图7所示，该核酸样本定量检测装置应用于含有确定比例Z的目标基因序列和参照基因序列的标准品，以及含有目标基因序列和参考基因序列的待测样品。该核酸样本定量检测装置包括：
循环阈值确定模块71，用于分别获取标准品中目标基因序列的循环阈值CTCX、标准品中参照基因序列的循环阈值CTCY和待测样本中参照基因序列的循环阈值CTSY；
核酸样本循环扩增效率的检测装置72，用于获得所述标准品中目标基因序列的扩增效率ECX、标准品中参照基因序列的扩增效率ECY和所述待测样本中参照基因序列的扩增效率ESY。在一个实施例中，核酸样本循环扩增效率检测装置72可以采用图5中示出的核酸样本循环扩增效率检测装置。
标准拷贝数获得模块73，用于获取标准品中目标基因序列的拷贝数XC和标准品中参照基因序列的拷贝数YC；
样本拷贝数确定模块74，用于根据标准品中目标基因序列的拷贝数XC、循环阈值CTCX、扩增效率ECX和所述待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX、扩增效率ESX确定所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS；根据标准品中参考基因序列的拷贝数YC、循环阈值CTCY、扩增效率ECY和所述待测样本中参考基因序列的循环阈值CTSY、扩增效率ESY确定所述待测样本中参考基因序列的拷贝数YS。
拷贝数比值确定模块75，用于获取待测样本中目标基因序列的拷贝数XS与参照基因序列YS的拷贝数比值R。
在过一个实施例中，样本拷贝数获得模块根据公式：
确定所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS和参考基因序列的拷贝数YS。
在一个应用例中，根据公式
Ln＝(Rn/Rn-1)/(Rn-1/Rn-2)＝(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2
获取核酸样本在第n轮循环的荧光值增长的变化率Ln，依次获取核酸样本的一组荧光值增长的变化率，具体如图10和图11。从后续循环往前依次计算进入平台期前的循环反应到基线期的循环反应的荧光值增长的变化率，循环扩增的荧光值增长的变化率由逐渐下降转为逐渐上升后，选取该上升过程中荧光值增长的变化率，最趋近于1的Ln(参见图12)，根据Ln获取相应的循环数n；根据公式Ex＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)，获得核酸样本的扩增效率Ex，参见图10中的轮次19。
所属技术领域的技术人员能够理解，本发明的各个方面可以实现为系统、方法或程序产品。因此，本发明的各个方面可以具体实现为以下形式，即：完全的硬件实施方式、完全的软件实施方式(包括固件、微代码等)，或硬件和软件方面结合的实施方式，这里可以统称为“电路”、“模块”或“系统”。
下面参照图8来描述根据本发明的这种实施方式的电子设备800。图8显示的电子设备800仅仅是一个示例，不应对本发明实施例的功能和使用范围带来任何限制。
如图8所示，电子设备800以通用计算设备的形式表现。电子设备800的组件可以包括但不限于：上述至少一个处理单元810、上述至少一个存储单元820、连接不同系统组件(包括存储单元820和处理单元810)的总线830。
其中，所述存储单元存储有程序代码，所述程序代码可以被所述处理单元810执行，使得所述处理单元810执行本说明书上述“示例性方法”部分中描述的根据本发明各种示例性实施方式的步骤。例如，所述处理单元810可以执行如图1中所示的步骤S101，获取核酸样本在循环扩增反应中的荧光基线值FB。步骤S102，获取核酸样本在每轮循环扩增反应的荧光值Fn，其中n＝1，…，N，N为正整数。步骤S103，根据荧光基线值FB和荧光值Fn获得核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。步骤S104，根据核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k，k为正整数。步骤S105，根据确定的最优荧光增长效率检测窗口k，根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得核酸样本的扩增效率。
存储单元820可以包括易失性存储单元形式的可读介质，例如随机存取存储单元(RAM)8201和/或高速缓存存储单元8202，还可以进一步包括只读存储单元(ROM)8203。
存储单元820还可以包括具有一组(至少一个)程序模块8205的程序/实用工具8204，这样的程序模块8205包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。
总线830可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储单元总线或者存储单元控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。
电子设备800也可以与一个或多个外部设备700(例如键盘、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备600交互的设备通信，和/或与使得该电子设备800能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。这种通信可以通过输入/输出(I/O)接口650进行。并且，电子设备800还可以通过网络适配器860与一个或者多个网络(例如局域网(LAN)，广域网(WAN)和/或公共网络，例如因特网)通信。如图所示，网络适配器860通过总线830与电子设备800的其它模块通信。应当明白，尽管图中未示出，可以结合电子设备600使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、RAID系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。
通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员易于理解，这里描述的示例实施方式可以通过软件实现，也可以通过软件结合必要的硬件的方式来实现。因此，根据本公开实施方式的技术方案可以以软件产品的形式体现出来，该软件产品可以存储在一个非易失性存储介质(可以是CD-ROM，U盘，移动硬盘等)中或网络上，包括若干指令以使得一台计算设备(可以是个人计算机、服务器、终端装置、或者网络设备等)执行根据本公开实施方式的方法。
在本公开的示例性实施例中，还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有能够实现本说明书上述方法的程序产品。在一些可能的实施方式中，本发明的各个方面还可以实现为一种程序产品的形式，其包括程序代码，当所述程序产品在终端设备上运行时，所述程序代码用于使所述终端设备执行本说明书上述“示例性方法”部分中描述的根据本发明各种示例性实施方式的步骤。
参考图9所示，描述了根据本发明的实施方式的用于实现上述方法的程序产品900，其可以采用便携式紧凑盘只读存储器(CD-ROM)并包括程序代码，并可以在终端设备，例如个人电脑上运行。然而，本发明的程序产品不限于此，在本文件中，可读存储介质可以是任何包含或存储程序的有形介质，该程序可以被指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用。
所述程序产品可以采用一个或多个可读介质的任意组合。可读介质可以是可读信号介质或者可读存储介质。可读存储介质例如可以为但不限于电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。可读存储介质的更具体的例子(非穷举的列表)包括：具有一个或多个导线的电连接、便携式盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦式可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式紧凑盘只读存储器(CD-ROM)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。
计算机可读信号介质可以包括在基带中或者作为载波一部分传播的数据信号，其中承载了可读程序代码。这种传播的数据信号可以采用多种形式，包括但不限于电磁信号、光信号或上述的任意合适的组合。可读信号介质还可以是可读存储介质以外的任何可读介质，该可读介质可以发送、传播或者传输用于由指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用的程序。
可读介质上包含的程序代码可以用任何适当的介质传输，包括但不限于无线、有线、光缆、RF等等，或者上述的任意合适的组合。
可以以一种或多种程序设计语言的任意组合来编写用于执行本发明操作的程序代码，所述程序设计语言包括面向对象的程序设计语言—诸如Java、C++等，还包括常规的过程式程序设计语言—诸如“C”语言或类似的程序设计语言。程序代码可以完全地在用户计算设备上执行、部分地在用户设备上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户计算设备上部分在远程计算设备上执行、或者完全在远程计算设备或服务器上执行。在涉及远程计算设备的情形中，远程计算设备可以通过任意种类的网络，包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，连接到用户计算设备，或者，可以连接到外部计算设备(例如利用因特网服务提供商来通过因特网连接)。
序列表
<110> 上海康派尼恩医疗科技有限公司
<120> 核酸样本检测方法及装置、存储介质及电子设备
<130> LZ2000230CN01
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2431
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 测试序列1
<400> 1
atagggcgga gggaagctca tcagtggggc cacgagctga gtgcgtcctg tcactccact 60
cccatgtccc ttgggaaggt ctgagactag ggccagaggc ggccctaaca gggctctccc 120
tgagcttcgg ggaggtgagt tcccagagaa cggggctccg cgcgaggtca gactgggcag 180
gagatgccgt ggaccccgcc cttcggggag gggcccggcg gatgcctcct ttgccggagc 240
ttggaacaga ctcacggcca gcgaagtgag ttcaatggct gaggtgaggt accccgcagg 300
ggacctcata acccaattca gactactctc ctccgcccat tggccaaacc ttacgatggg 360
atcccagccc gggagatccc tgacctgctg gaaaaggggg agcggctgcc ccagcccccc 420
atctgcacca ttgatgtcta catgatcatg gtcaaatgtg cgtggctgag ctgtgctggc 480
tgcctggagg agggtgggag gtcctgggtg gaggagccca caaggggcat gaaaggggac 540
caggatgtat gtagacccag gagccctagt atgttaggag cctcaaaacc ttcttgtatc 600
ccttttacag tcaaagtcca aagccactct tgaggaacac tcttgtacaa aattaagctg 660
ggcacagtgg ctcatgcctg taatcccagt acttttggag gctgaggtgg gaggatccct 720
tgaagccagg agttcaagac cagcctgggc aacatagtga gatcctatct ctacaaaaaa 780
taaaaaaatt atctgggtgt ggtggtgtgt gccagtagtc ccagctactc aggagaggct 840
gaggcaggaa gatcacttga gcctagttta aggttgcagt aagctatgat tgcaccactg 900
aaatccagcc tgggtgacag agcgaaacct catctcaaaa aaataaaaaa gcaaacaaaa 960
agaaaaaaaa aattaaaagg gaaactagaa gagatgccaa aggttctggc tgaagacccc 1020
agagtctggt gctacttctc taccacctga gggctttggg ctgtcccttg ggactgtcta 1080
gaccagactg gagggggagt gggaggggag aggcagcaag cacacagggc ctgggactag 1140
catgctgacc tccctcctgc cccaggttgg atgattgact ctgaatgtcg gccaagattc 1200
cgggagttgg tgtctgaatt ctcccgcatg gccagggacc cccagcgctt tgtggtcatc 1260
caggtactgg gcctctgtgc cccatccctg cctgtggcta agagcaccct cctgcagagg 1320
gtgggaagga gagatgagtc cagtatgcca ggcccctcac ggaaggctgc atgctgggct 1380
ggggaggggc caccatcctg cctctccttc ctccacagaa tgaggacttg ggcccagcca 1440
gtcccttgga cagcaccttc taccgctcac tgctggagga cgatgacatg ggggacctgg 1500
tggatgctga ggagtatctg gtaccccagc agggcttctt ctgtccagac cctgccccgg 1560
gcgctggggg catggtccac cacaggcacc gcagctcatc taccagggtc agtgccctcg 1620
gtcacactgt gtggctgtct gcttacctcc cccaaccccg gtggactagg gtccctttct 1680
ctgatgttcc ctcaactgtc acctctcaag gaaaccccat tatccctaca aaaaattctt 1740
actgccttcc aacccctgtg accccattct ctccacggtg actgtgtcat accccaaagg 1800
tgacctctgt ttttctcctg tgaccctgtc accttccatg gagtccccat cccagatccg 1860
tgagtgaccc ccatcatgac tttctttctt gtccccagag tggcggtggg gacctgacac 1920
tagggctgga gccctctgaa gaggaggccc ccaggtctcc actggcaccc tccgaagggg 1980
ctggctccga tgtatttgat ggtgacctgg gaatgggggc agccaagggg ctgcaaagcc 2040
tccccacaca tgaccccagc cctctacagc ggtacagtga ggaccccaca gtacccctgc 2100
cctctgagac tgatggctac gttgcccccc tgacctgcag cccccagcct ggtatggagt 2160
ccagtctaag cagagagact gatgggcagg ggaggtggga ccttcagccc agggtccact 2220
gtgggggcag agggagtggc agagacaccg gggttccttc ccctaatggg tcaccttctc 2280
ttgacctttc agaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag 2340
agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct 2400
ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg t 2431
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物1
<400> 2
ctaagcagag agactgatgg gc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物2
<400> 3
aggtgaccca ttaggggaag g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物3
<400> 4
agcccagggt ccactgtggg gg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物4
<400> 5
cgttctctgg gaactcacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物5
<400> 6
tcctgtcact ccactcccat 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物6
<400> 7
agccctgtta gggccgcctc tgg 23
Claims (11)
1.一种核酸样本循环扩增效率检测方法，其特征在于，包括：
获取核酸样本在循环扩增反应中的荧光基线值FB；
获取所述核酸样本在每轮循环扩增反应的荧光值Fn，其中n＝1，…，N，N为正整数；
根据所述荧光基线值FB和所述荧光值Fn获得所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln；
根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k，k为正整数；
根据(Fk-FB)/(Fk-1-FB)获得所述核酸样本的扩增效率，其中，Fk和Fk-1分别表示第k和k-1轮的循环扩增反应的荧光值。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述根据所述荧光基线值FB和所述荧光值Fn获得所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln包括：
根据(Fn-FB)×(Fn-2-FB)/(Fn-1-FB)2获得所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k包括：
从后向前依次查看各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln，当循环扩增反应的荧光增长效率的变化率从逐渐下降转为逐渐上升后，选取上升过程中荧光值增长的变化率最趋近于1的第k轮循环扩增反应，作为所述最优效率检测轮次k。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述核酸样本在第n轮循环扩增反应的荧光增长效率表示为：
Rn/Rn-1＝(Fn-FB)/(Fn-1-FB)。
5.根据权利要求1或2的检测方法，其特征在于，还包括：
采用qPCR仪对所述核酸样本进行循环扩增反应；
采用qPCR仪检测所述核酸样本在循环扩增反应基线期的荧光基线值FB和在每轮循环扩增反应的荧光值Fn。
6.根据权利要求1或2的检测方法，其特征在于，所述根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的最优效率检测轮次k包括：
根据所述核酸样本在各轮循环扩增反应的荧光增长效率的变化率Ln确定循环扩增反应的指数增长期；
确定所述循环扩增反应的指数增长期中荧光值增长的变化率最趋近于1的第k轮循环扩增反应，作为所述最优效率检测轮次k。
7.一种核酸样本检测方法，其特征在于，包括：
分别获取标准品的循环阈值CTC和待测样本的循环阈值CTS；
根据权利要求1至6中任意一项所述的核酸样本循环扩增效率的检测方法获得所述标准品的扩增效率EC和所述待测样本的扩增效率ES；
获取所述标准品的拷贝数XC；
根据所述标准品的拷贝数XC、循环阈值CTC、扩增效率EC和所述待测样本的循环阈值CTS、扩增效率ES获取所述待测样本的拷贝数XS。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述根据所述标准品的拷贝数XC、循环阈值CTC、扩增效率EC和所述待测样本的循环阈值CTS、扩增效率ES获取所述待测样本的拷贝数XS包括：
根据公式获取所述待测样本的拷贝数XS。
9.一种核酸样本定量检测方法，应用于含有确定比例Z的目标基因序列和参照基因序列的标准品，以及含有目标基因序列和参考基因序列的待测样品，将标准品和待测样本置于qPCR仪中，其特征在于，该方法包括：
分别获取标准品中目标基因序列的循环阈值CTCX、标准品中参照基因序列的循环阈值CTCY、待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX和待测样本中参照基因序列的循环阈值CTSY；
根据权利要求1至6中任意一项所述的核酸样本循环扩增效率的检测方法获得所述标准品中目标基因序列的扩增效率ECX、所述标准品中参照基因序列的扩增效率ECY和所述待测样本中目标基因序列的扩增效率ESX、所述待测样本中参照基因序列的扩增效率ESY；
根据标准品中目标基因序列的拷贝数XC、循环阈值CTCX、扩增效率ECX和所述待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX、扩增效率ESX确定所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS；
根据标准品中参考基因序列的拷贝数YC、循环阈值CTCY、扩增效率ECY和所述待测样本中参考基因序列的循环阈值CTSY、扩增效率ESY确定所述待测样本中参考基因序列的拷贝数YS；
获取所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS与参照基因序列YS的拷贝数比值R。
10.根据权利要求9所述的核酸样本定量检测方法，其特征在于，所述根据标准品中目标基因序列的拷贝数XC、循环阈值CTCX、扩增效率ECX和所述待测样本中目标基因序列的循环阈值CTSX、扩增效率ESX确定所述待测样本中目标基因序列的拷贝数XS包括：
根据公式获取待测样本中目标基因序列的拷贝数XS；
所述根据标准品中参考基因序列的拷贝数YC、循环阈值CTCY、扩增效率ECY和所述待测样本中参考基因序列的循环阈值CTSY、扩增效率ESY确定所述待测样本中参考基因序列的拷贝数YS包括：
根据公式获取待测样本中参照基因序列的拷贝数YS。
11.根据权利要求9所述的核酸样本定量检测方法，其特征在于，标准品中目标基因序列和参照基因序列的确定比例Z为1:1。
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