CN111192637B - 一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法 - Google Patents

一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括一系列的测序数据过滤步骤、测序数据比对步骤、转录拼接步骤、基因比对步骤、lncRNA过滤步骤以及lncRNA分析步骤。本发明可以发现新的lncRNA，且本发明的方法提高了对lncRNA的注释准确性。

Description

一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法。
背景技术
非编码RNA是一类不翻译蛋白的功能性RNA分子，其中常见的具调控作用的非编码RNA包括siRNA、miRNA、piRNA以及长链非编码RNA。大量研究表明非编码RNA在表观遗传学的调控中扮演了越来越重要的角色。人们对lncRNA(Long noncoding RNAs，lncRNAs)的认识还处在初级阶段，lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，有文献研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。
lncRNA因为不具有polyA尾，所以通常使用rRNA探针去除总RNA中的核糖体序列的方式富集lncRNA。现有的基于芯片的lncRNA分析方法，依赖于已知的lncRNA信息，无法发现新的lncRNA。
其他基于高通量测序的lncRNA分析方法，多使用旧的比对和注释软件，对lncRNA的注释准确性有限。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，所述方法适用于去除rRNA并且链特异性建库的RNASeq测序结果分析。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，包括如下步骤：
步骤一，测序数据过滤步骤：
首先使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：
所述fastp软件使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口，最后保留长度大于50的reads；
接着将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：
所述质量控制为根据RNASeq的测序特点提供质量控制标准；
步骤二，测序数据比对步骤：
使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：
首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；
对于构建索引后的序列进行比对；
将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；
步骤三，转录拼接步骤
使用stringtie进行转录拼接，重构样品的转录本序列；
首先需要对每个样品单独使用stringtie拼接，然后使用stringtie merge将所有样品的转录本进行合并；合并后的转录本为最后重构出来的转录本序列。
步骤四，基因比对步骤：
重构的转录本序列与参考基因组注释进行对比：
区分mRNA，已知lncRNA和新发现的lncRNA。
步骤五，lncRNA过滤步骤：
对新发现的lncRNA进行过滤，然后进行编码潜能预测，去除有编码潜能的结果；
对于新发现的lncRNA首先需要去除；
剩下的lncRNA使用PFAM、PELK和CNCI预测编码潜能，只有在3个软件中都预测为noncoding的序列才保留下来。
步骤六，lncRNA分析步骤：
使用stringtie对转录本进行表达定量，然后用DESeq进行差异分析，对差异表达的lncRNA的顺式和反式靶基因进行预测和功能富集分析。
在本发明的一个优选实施例中，所述质量控制标准为：
所述测序数据的碱基分布的四条线为：AT平行且接近或GC平行且接近或GC整体分布应该近似于正态分布或不能出现多峰；
测序数据的Duplicate水平与建库的PCR循环数一致。
在本发明的一个优选实施例中，所述基因组数据库包括Ensembl或和NCBI。
在本发明的一个优选实施例中，所述构建索引为在hisat2比对时加上链特异性参数，所述链特异性参数当中，当采用dUTP建库方法时，对应的参数为--rna-strandness FR，其他方法当中参数采用默认值。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二当中的比对为：
模式生物的比对率为不低于80％，多重比对率为不高于10％；如果比对率低，通常需要检查测序样品是否有污染；如果多重比对率高，通常需要检查测序数据的核糖体比例。
在本发明的一个优选实施例中，所述对于RSeQC质量控制具体为：
对于RSeQC的结果在基因区间上采用reads分布，比对结果的链信息与建库方式对应，dUTP建库的测序数据需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上，使得Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。
在本发明的一个优选实施例中，所述区分mRNA为：
使用gffcompare将重构的转录本与参考的基因组信息进行对比，根据对比结果的标签判断转录本的类型：“＝”和“c”为已知转录本，“j”、“e”、“o”、“m”、“n”和“k”为已知基因的新转录本，“x”、“i”和“u”为新发现的转录本。
在本发明的一个优选实施例中，所述需要去除的新发现的lncRNA为：
外显子数小于1的或长度小于200的或reads覆盖度小于3的或只在一个样品中发现的lncRNA。
在本发明的一个优选实施例中，所述富集分析具体包括如下步骤：
1.使用stringtie-e-B参数进行转录本的表达定量；
2.使用prepDE.py脚本提取转录本的reads count矩阵,将得到的表达矩阵导入到DESeq包中进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的转录本；
3.使用bedtools提取lncRNA上下游100kb范围内的编码基因作为lncRNA的顺式靶基因。计算lncRNA表达量与mRNA表达量的pearson相关性，保留相关性大于0.9的作为lncRNA的反式靶基因；
4.提取lncRNA的靶基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性；
5.获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，通常选择P<0.05的结果为最后的富集结果。
本发明的有益效果在于：
本发明可以发现新的lncRNA，且本发明的方法提高了对lncRNA的注释准确性。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的数据分布示意图。
图3为本发明的基因体百分位数示意图。
图4为本发明的分析结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明：
一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，包括如下步骤：
步骤一，测序数据过滤步骤：
使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：fastp使用PE readsoverlap信息自动识别接头序列，准确性和去除的效率更高。同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口。最后保留长度大于50的reads。
将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：
根据RNASeq的测序特点，测序数据的碱基分布的四条线应该为：AT平行且接近，GC平行且接近；GC整体分布应该近似于正态分布，不能出现多峰；测序数据的Duplicate水平应该与建库的PCR循环数一致。
步骤二，测序数据比对步骤：
使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：
首先需要从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，常用的基因组数据库为Ensembl和NCBI，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引。LncRNA通常都是链特异性文库，hisat2比对时需要加上链特异性参数，常用dUTP建库方法对于的参数为：----rna-strandness FR，其他参数通常使用默认值。
常见的模式生物的比对率通常在80％以上，多重比对率在10％以下。如果比对率低，通常需要检查测序样品是否有污染；如果多重比对率高，通常需要检查测序数据的核糖体比例。
将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制：
对于lncRNA项目，因为很多lncRNA都还没有注释信息，所以RSeQC结果的reads分布，在基因间区上需要有reads分布。比对结果的链信息需要与建库方式对应，dUTP建库的测序数据，需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上。Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。
步骤三，转录拼接步骤
使用stringtie进行转录拼接，重构样品的转录本序列；
首先需要对每个样品单独使用stringtie拼接，然后使用stringtie merge将所有样品的转录本进行合并。合并后的转录本为最后重构出来的转录本序列。
步骤四，基因比对步骤：
重构的转录本序列与参考基因组注释进行对比：区分mRNA，已知lncRNA和新发现的lncRNA；
使用gffcompare将重构的转录本与参考的基因组信息进行对比，根据对比结果的标签判断转录本的类型：“＝”和“c”为已知转录本，“j”、“e”、“o”、“m”、“n”和“k”为已知基因的新转录本，“x”、“i”和“u”为新发现的转录本。
步骤五，lncRNA过滤步骤：
对新发现的lncRNA进行过滤，然后进行编码潜能预测，去除有编码潜能的结果；
对于新发现的lncRNA首先需要去除：外显子数小于1的；长度小于200的；reads覆盖度小于3的；只在一个样品中发现的。
剩下的lncRNA使用PFAM、PELK和CNCI预测编码潜能，只有在3个软件中都预测为noncoding的序列才保留下来。
步骤六，lncRNA分析步骤：
使用stringtie对转录本进行表达定量，然后用DESeq进行差异分析，对差异表达的lncRNA的顺式和反式靶基因进行预测和功能富集分析。
使用stringtie-e-B参数进行转录本的表达定量，使用prepDE.py脚本提取转录本的reads count矩阵。将得到的表达矩阵导入到DESeq包中进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的转录本。
使用bedtools提取lncRNA上下游100kb范围内的编码基因作为lncRNA的顺式靶基因。计算lncRNA表达量与mRNA表达量的pearson相关性，保留相关性大于0.9的作为lncRNA的反式靶基因。
提取lncRNA的靶基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性。获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，通常选择P<0.05的结果为最后的富集结果。
综上，采用本发明的方法对于lncRNA的注释准确性更高，更便于后续的测序操作。

Claims (9)

1.一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，测序数据过滤步骤：
首先使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：
所述fastp软件使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口，最后保留长度大于50的reads；
接着将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：
所述质量控制为根据RNASeq的测序特点提供质量控制标准；
步骤二，测序数据比对步骤：
使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：
首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；
对于构建索引后的序列进行比对；
将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；
步骤三，转录拼接步骤：
使用stringtie进行转录拼接，重构样品的转录本序列；
首先需要对每个样品单独使用stringtie拼接，然后使用stringtie merge将所有样品的转录本进行合并；合并后的转录本为最后重构出来的转录本序列；
步骤四，基因比对步骤：
重构的转录本序列与参考基因组注释进行对比：
区分mRNA，已知lncRNA和新发现的lncRNA；
步骤五，lncRNA过滤步骤：
对新发现的lncRNA进行过滤，然后进行编码潜能预测，去除有编码潜能的结果；
对于新发现的lncRNA首先需要去除；
剩下的lncRNA使用PFAM、PELK和CNCI预测编码潜能，只有在3个软件中都预测为noncoding的序列才保留下来；
步骤六，lncRNA分析步骤：
使用stringtie对转录本进行表达定量，然后用DESeq进行差异分析，对差异表达的lncRNA的顺式和反式靶基因进行预测和功能富集分析。
2.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述质量控制标准为：
所述测序数据的碱基分布的四条线为：AT平行且接近或GC平行且接近或GC整体分布应该近似于正态分布或不能出现多峰；
测序数据的Duplicate水平与建库的PCR循环数一致。
3.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述基因组数据库包括Ensembl或和NCBI。
4.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，构件索引为在hisat2比对时加上链特异性参数，所述链特异性参数当中，当采用dUTP建库方法时，对应的参数为--rna-strandness FR，其他方法当中参数采用默认值。
5.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述步骤二当中的比对为：
模式生物的比对率为不低于80%，多重比对率为不高于10%；如果比对率低，需要检查测序样品是否有污染；如果多重比对率高，需要检查测序数据的核糖体比例。
6.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，对于RSeQC质量控制具体为：
对于RSeQC的结果在基因区间上采用reads分布，比对结果的链信息与建库方式对应，dUTP建库的测序数据需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上，使得Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。
7.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述区分mRNA为：
使用gffcompare将重构的转录本与参考的基因组信息进行对比，根据对比结果的标签判断转录本的类型：“=”和“c”为已知转录本，“j”、“e”、“o”、“m”、“n”和“k”为已知基因的新转录本，“x”、“i”和“u”为新发现的转录本。
8.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述需要去除的新发现的lncRNA为：
外显子数小于1的或长度小于200的或reads覆盖度小于3的或只在一个样品中发现的lncRNA。
9.如权利要求1所述的一种lncRNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述富集分析具体包括如下步骤：
1.使用stringtie -e -B 参数进行转录本的表达定量；
2.使用prepDE.py脚本提取转录本的reads count矩阵,将得到的表达矩阵导入到DESeq包中进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的转录本；
3.使用bedtools提取lncRNA上下游100kb范围内的编码基因作为lncRNA的顺式靶基因；
计算lncRNA表达量与mRNA表达量的pearson相关性，保留相关性大于0.9的作为lncRNA的反式靶基因；
4.提取lncRNA的靶基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性；
5.获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，选择P<0.05的结果为最后的富集结果。
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