CN111192635B - 一种环状rna鉴定和表达定量的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括一系列的测序数据过滤步骤、测序数据比对步骤、环状RNA连接点鉴定步骤、差异分析步骤、基因注释步骤和富集分析步骤来进行。本发明的分析方法可以帮助发现新的circRNA信息，进一步对环状RNA鉴定和表达定量分析。

Description

一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法。

背景技术

circRNA(circular RNA，环状RNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，没有5′帽子结构和3′poly(A)结构，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内。大多数circRNA是由外显子环化而成，也有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构(lariat)。同时由于circRNA含有大量的miRNA应答原件(MREs)，能与AGO蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RISC)的催化核心，最终导致circRNA降解。根据来源，circRNA可大致分为四类：全外显子型的circRNA，内含子和外显子组合的EIcircRNA，内含子组成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRNA。

现有的基于芯片的circRNA分析方法，依赖于已知的circRNA信息，无法发现新的circRNA。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，所述方法适用于去除rRNA并且链特异性建库，或者去除线性RNA的RNASeq测序结果分析。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

fastp使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，具体是：

同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口。最后保留长度大于50的reads；

将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制。

步骤二，测序数据比对步骤：

首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；

对于构建索引后的序列进行比对；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；

步骤三，环状RNA连接点鉴定步骤：

对于比对不上基因组的序列，使用find_circ进行环状RNA连接点鉴定，所述的环状RNA连接点鉴定具体是：

先对于hisat2比对结果进行筛选，挑选没有比对结果和比对结果中出现大片段(10bp)soft-clip的reads进行二次比对；

接着挑选出的reads从两端分别截取20bp，使用bowtie2与基因组比对；如果两个序列比对的位置是相反的，这条Reads就可能来自一个CircRNA；

接着需要对这个CircRNA进行二次判断：

将Anchor序列一直延伸，如果到连接点处为止序列都能够与参考基因组完全匹配，并且连接点处的剪切模式符合AG-GT的剪切模式，就认定这是一个CircRNA；

步骤四，差异分析步骤：

根据所述circRNA的成环连接点的支持数代表circRNA的表达量；

合并所有样品的表达量，然后使用DESeq进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的circRNA；

步骤五，基因注释步骤：

根据连接点位置进行circRNA来源基因注释；

根据circRNA连接点的坐标，使用bedtools寻找与circRNA重叠的编码RNA作为circRNA的来源基因；

根据circRNA通常调控来源基因的表达来发挥作用来推断circRNA的功能。

步骤六，富集分析步骤：

对差异表达的circRNA来源基因进行功能富集分析，所述富集分析具体为：

提取circRNA的来源基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；

根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性。获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，通常选择P<0.05的结果为最后的富集结果。

在本发明的一个优选实施例中，所述质量控制具体为：

首先根据RNASeq的测序特点，将测序数据的碱基分布的四条线区分为：

AT平行且接近或GC平行且接近或GC整体分布应该近似于正态分布或不能出现多峰；

其次所述测序数据的Duplicate水平应该与建库的PCR循环数一致。

在本发明的一个优选实施例中，所述参考基因组包括Ensembl或NCBI。

在本发明的一个优选实施例中，所述构建索引为在hisat2比对时加上circRNA的链特异性参数，所述链特异性参数当中，当采用dUTP建库方法时，对应的参数为--rna-strandness FR，其他方法当中参数采用默认值。

在本发明的一个优选实施例中，所述对于RSeQC质量控制具体为：

对于RSeQC的结果在基因区间上采用reads分布，比对结果的链信息与建库方式对应，dUTP建库的测序数据需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上，使得Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。

本发明的有益效果在于：

本发明的分析方法可以帮助发现新的circRNA信息，进一步对环状RNA鉴定和表达定量分析。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为本发明的操作示意图。

图3为本发明的结果示意图1。

图4为本发明的结果示意图2。

具体实施方式

一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

fastp使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，准确性和去除的效率更高。同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口。最后保留长度大于50的reads。

将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制：

根据RNASeq的测序特点，测序数据的碱基分布的四条线应该为：AT平行且接近，GC平行且接近；GC整体分布应该近似于正态分布，不能出现多峰；测序数据的Duplicate水平应该与建库的PCR循环数一致。

步骤二，测序数据比对步骤：

使用hisat2软件将过滤后的数据与参考基因组进行比对：

首先需要从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，常用的基因组数据库为Ensembl和NCBI，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引。circRNA通常都是链特异性文库，hisat2比对时需要加上链特异性参数，dUTP建库方法对应的参数为：--rna-strandness FR，其他参数通常使用默认值。

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制：

对于circRNA项目，因为很多lncRNA都还没有注释信息，所以RSeQC结果的reads分布，在基因间区上需要有reads分布。比对结果的链信息需要与建库方式对应，dUTP建库的测序数据，需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上。Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。

步骤三，环状RNA连接点鉴定步骤：

对于比对不上基因组的序列，使用find_circ进行环状RNA连接点鉴定；

首先对于hisat2比对结果进行筛选，挑选没有比对结果和比对结果中出现大片段(10bp)soft-clip的reads进行二次比对。挑选出的reads从两端分别截取20bp，使用bowtie2与基因组比对。如果两个序列比对的位置是相反的，这条Reads就可能来自一个CircRNA。将Anchor序列一直延伸，如果到连接点处为止序列都能够与参考基因组完全匹配，并且连接点处的剪切模式符合AG-GT的剪切模式，就认定这是一个CircRNA。

步骤四，差异分析步骤：

根据circRNA的结构特点，每个circRNA只有一个成环连接点，所以可以用连接点reads支持数代表circRNA的表达量。合并所有样品的表达量，然后使用DESeq进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的circRNA。

步骤五，基因注释步骤：

根据连接点位置进行circRNA来源基因注释；

根据circRNA连接点的坐标，使用bedtools寻找与circRNA重叠的编码RNA作为circRNA的来源基因。根据circRNA通常调控来源基因的表达来发挥作用来推断circRNA的功能。

步骤六，富集分析步骤：

对差异表达的circRNA来源基因进行功能富集分析。

提取circRNA的来源基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性。获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，通常选择P<0.05的结果为最后的富集结果。

Claims (5)

1.一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，测序数据过滤步骤：

使用fastp软件去除测序结果中的接头和低质量序列：

fastp使用PE reads overlap信息自动识别接头序列，具体是：

同时以5个碱基长度为窗口，从3’端向5’端滑动，截去窗口内平均质量小于20的窗口；最后保留长度大于50的reads；

将去除接头和低质量序列后的测序数据采用fastqc软件进行质量控制；

步骤二，测序数据比对步骤：

首先从基因组数据库中下载对应物种的参考基因组，下载下来的基因组序列使用hisat2-build构建索引；

对于构建索引后的序列进行比对；

将比对完成的测序数据通过RSeQC进行质量控制；

步骤三，环状RNA连接点鉴定步骤：

对于比对不上基因组的序列，使用find_circ进行环状RNA连接点鉴定，所述的环状RNA连接点鉴定具体是：

先对于hisat2比对结果进行筛选，挑选没有比对结果和比对结果中出现大片段(10bp)soft-clip的reads进行二次比对；

接着挑选出的reads从两端分别截取20bp，使用bowtie2与基因组比对；如果两个序列比对的位置是相反的，这条 Reads 就可能来自一个 CircRNA；

接着需要对这个CircRNA进行二次判断：

将 Anchor 序列一直延伸，如果到连接点处为止序列都能够与参考基因组完全匹配，并且连接点处的剪切模式符合 AG-GT 的剪切模式，就认定这是一个 CircRNA；

步骤四，差异分析步骤：

根据所述circRNA的成环连接点的支持数代表circRNA的表达量；

合并所有样品的表达量，然后使用DESeq进行差异分析，保留|log2FC|>1,pvalue<0.05的作为差异表达的circRNA；

步骤五，基因注释步骤：

根据连接点位置进行circRNA来源基因注释；

根据circRNA连接点的坐标，使用bedtools寻找与circRNA重叠的编码RNA作为circRNA的来源基因；

根据circRNA调控来源基因的表达来发挥作用来推断circRNA的功能；

步骤六，富集分析步骤：

对差异表达的circRNA来源基因进行功能富集分析，所述富集分析具体为：

提取circRNA的来源基因，使用topGO软件包进行GO富集分析；

根据KEGG注释信息，使用phyper进行超几何检验，计算KEGG富集显著性；

获得的显著性P值，使用p.adjust进行多重校正，得到校正后的P值，选择P<0.05的结果为最后的富集结果。

2.如权利要求1所述的一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述质量控制具体为：

首先根据RNASeq的测序特点，将测序数据的碱基分布的四条线区分为：

AT平行且接近或GC平行且接近或GC整体分布应该近似于正态分布或不能出现多峰；

其次所述测序数据的Duplicate水平应该与建库的PCR循环数一致。

3.如权利要求1所述的一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述参考基因组包括Ensembl或NCBI。

4.如权利要求1所述的一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述构建索引为在hisat2比对时加上circRNA的链特异性参数，所述链特异性参数当中，当采用dUTP建库方法时，对应的参数为--rna-strandness FR，其他方法当中参数采用默认值。

5.如权利要求1所述的一种环状RNA鉴定和表达定量的分析方法，其特征在于，所述对于RSeQC质量控制具体为：

对于RSeQC的结果在基因区间上采用reads分布，比对结果的链信息与建库方式对应，dUTP建库的测序数据需要集中在‘1+-,1-+,2++,2--’上，使得Reads在基因结构上需要呈现出中间高，两端低的分布形状。

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