KR101977976B1

KR101977976B1 - 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법에서 프라이머 서열을 제거하여 분석의 정확도를 높이는 방법

Info

Publication number: KR101977976B1
Application number: KR1020170101540A
Authority: KR
Inventors: 이창선; 홍창범; 오은설; 김광중
Original assignee: 주식회사 엔젠바이오
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2037-08-10
Also published as: WO2019031867A1; KR20190017161A; US20200216888A1

Abstract

본 발명은 NGS를 통해 수득하는 리드에 존재하는 프라이머 서열 정보를 제거하여 리드 데이터 분석의 정확도를 증가시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 리드와 설계한 프라이머 정보를 여러 단계에 걸쳐 다양한 기준값으로 매칭하여 리 드내 프라이머 서열 정보를 결정한 다음, 프라이머 서열만 정확하게 제거하여 리드 데이터 분석의 정확도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 제거를 통한 리드 데이터의 분석 정확도를 증가시키는 방법은, 데이터 분석의 속도가 빠르고, 민프라이머 서열만 정확하게 제거할 수 있어, 리드 데이터 분석의 효율 및 정확도를 증가시키는데 유용하다.

Description

앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법에서 프라이머 서열을 제거하여 분석의 정확도를 높이는 방법{Method for increasing read data analysis accuracy in amplicon based NGS by using primer remover}

본 발명은 NGS를 통해 수득하는 리드에 존재하는 프라이머 서열 정보를 제거하여 리드 데이터 분석의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 리드와 설계한 프라이머 정보를 여러 단계에 걸쳐 다양한 기준값으로 매칭하여 리드내 프라이머 서열 정보를 결정한 다음, 프라이머 서열만 정확하게 제거하여 리드 데이터 분석의 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

지난 십여년간 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing: NGS)은 유전학적 분석 분야에서 많은 사람들의 관심을 받고 있다. 차세대 염기서열 분석 기술은 기존의 방법과 달리 대용량의 데이터를 빠른 시간에 생산할 수 있으므로 개인 유전체 해독에 필요한 시간과 비용을 획기적으로 절감시킨 기술이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 시간이 지남에 따라 시퀀싱 플랫폼은 발전하고 분석 가격은 점점 저렴해지고 있으며 멘델성 유전질환과 희귀질환, 암등에서 차세대 염기서열 분석법을 이용해 질병의 원인 유전자를 찾는데 성공하고 있다(Buermans HPJ et al., Biochim Biophys Acta. 1842(10):1932-41, 2014). 차세대 염기서열 분석법은 검체로부터 DNA를 추출한 이후 기계적으로 조각화(fragmentation)을 시킨 이후 특정 크기를 가지는 라이브러리(library)를 제작하여 시퀀싱에 사용한다. 대용량 시퀀싱 장비를 사용하여 한 개의 염기단위로 4가지 종류의 상보적 뉴클레오타이드(nucleotide) 결합 및 분리 반응을 반복하면서 초기 시퀀싱 데이터를 생산하게 되고, 이후에 초기 데이터의 가공(Trimming), 맵핑(Mapping), 유전체 변이의 동정 및 변이 정보의 해석(Annotation) 등 생물적보학(Bioinformatics)을 이용한 분석 단계를 수행하여 질병 및 다양한 생물학적 형태(phenotype)에 영향을 미치거나 가능성이 높은 유전체 변이를 발굴하여 혁신적인 치료제 개발 및 산업화를 통한 새로운 부가가치 창출에 기여하고 있다.

이러한 차세대 염기서열 분석기법 중, 앰플리콘(amplicon) 기반의 NGS 방법은 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 설계하여 짧은 길이의 리드를 다양하게 생산한 다음, 이를 정렬하여 분석하는 기술로서, 대표적인 기술은 Emulstion PCR 방법이 있고, 이를 바탕으로 하는 기기는 Roche의 454 platform, Thermo FIsher의 SOLid platform 및 Ion Torrent platform 등이 있다. 앰플리콘 방법의 NGS는 probe 기반의 hybridization 방식에 비해 library complexity가 낮은 데 비해, 분석 속도가 빠르다는 장점이 있다(Sara Goodwin et al., Nature Reviews Genetics, Vol 17:333-51, 2016).

앰플리콘 방식의 NGS data 는 리드의 앞부분 서열에 프라이머 서열이 존재하게 된다. 이 프라이머 서열은 표준서열과 동일한 서열로 디자인된 것이다. 프라이머 서열 부분과 샘플의 변이가 존재하는 부분이 겹치게 된다면 변이가 homo라 할 때, 프라이머는 표준서열과 동일하여 변이가 존재하는 부분은 hetero로 보이게 된다. 만약 hetero 변이라면 프라이머에 존재하는 서열로 인해 Variant Allele Frequency가 원래 수준보다 더 낮게 나와 hetero라 판별하기 힘들 수 있다. 즉, 프라이머 서열은 참조 유전자를 바탕으로 제작하기 때문에 실제 샘플 내의 서열과 다를 수 있다. 따라서, 프라이머를 제거하지 않으면 프라이머의 서열과 변이를 가진 실제 샘플의 서열이 혼재된 형태로 나타나게 되고, 이로 인해 유전변이의 비율(allelic frequency)에 영향을 주게 된다. 그러므로 이 부분을 제거하지 않고 분석에 이용한다면 변이탐지에 있어 False Positive로 작용하게 되는 문제점이 있다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 다양한 프로그램들이 존재하는데, 기존의 프로그램은 한 가지 기준값만을 적용하여, 프라이머 제거에 대한 정확도가 떨어질 뿐만 아니라, 프라이머 서열 결정 및 제거에 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 리드 서열 정보와 프라이머 서열 정보를 다양한 방법과 다양한 기준값으로 비교 분석을 수행할 경우, 정확하게 프라이머 서열을 결정할 수 있음과 동시에 민감도와 정확성은 유지되고, 시간 및 비용은 크게 감소하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 제거를 통해 리드 데이터의 분석 정확도를 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 서열 제거를 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계; (b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를 포함하는 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next generation sequencing, NGS)에서 프라이머 제거를 통해 리드 데이터 분석 정확도를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 앰플리콘 기반 차세대 염기 서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 서열 제거를 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,

상기 방법은 (a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계; (b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템을 제공한다.

본 발명에 따른 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 제거를 통해 리드 데이터 분석 효율의 정확도를 증가시키는 방법은, 데이터 분석의 속도가 빠르고, 프라이머 서열만 정확하게 제거할 수 있어, 리드 데이터 분석의 효율 및 정확도를 증가시키는데 유용하다.

도 1은 본 발명의 프라이머 제거 방법을 모사한 개략도이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 BRCA2 유전자에서 설계한 앰플리콘의 배열 일부를 나타낸 모식도 이고, (b)는 (a)의 리드 일부를 실제 서열로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 앰플리콘 프라이머의 조합을 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 방법과 기존에 공지된 프로그램에서 프라이머 제거 완료 시간을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 방법과 기존에 공지된 프로그램에서 프라이머 제거 완료 후, 분석에 사용할 수 있는 리드의 개수를 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 방법과 기존에 공지된 프로그램에서 프라이머 제거 완료후, 리드를 정렬하여 정확도를 분석한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서의 용어 “차세대 염기서열 분석기법” 또는 “NGS” 또는 “차세대 염기서열 분석”은 개개의 핵산 분자(예를 들어 단일 분자 시퀀싱에서) 또는 고속 대량 방식으로(예를 들어, 10, 100, 1000 이상의 분자가 동시에 시퀀싱됨) 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시(proxy) 중 하나의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 임의의 시퀀싱 방법을 지칭한다. 일 실시형태에서, 라이브러리 내 핵산 종의 상대적 존재비는 시퀀싱 실험에 의해 만들어진 데이터에서 그것의 동족 서열의 발생의 상대적인 수를 계측함으로써 추정될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews11:31-46]에 기재된다. 차세대 시퀀싱은 샘플 내 핵산의 5% 미만으로 존재하는 변이체를 검출할 수 있다.

본 발명에서 차세대 염기서열 분석 과정은 하기의 3단계로 구분될 수 있다.

(1) 타겟의 증폭

질병의 원인 유전자를 찾기 위하여 차세대 염기서열 분석법을 이용해 전장유전체(Whole-genome)를 시퀀싱하거나, 엑솜 영역만을 목표로 하여 시퀀싱할 수 있으며(Targeted sequencing), 특정 유전자를 타겟으로 수행할 수도 있다. 엑솜 영역또는 특정 타겟 유전자만을 시퀀싱하는 경우에는 비용이나 효율성 측면에서 유리하다. 또한 유전자의 변화가 암과 같은 직접적인 질병으로 나타나는 경우가 많기 때문에 엑솜 영역 또는 타겟 유전자에서의 염기서열의 변화를 검출하는 것이 원인 유전자를 찾는데 효과적이라고 할 수 있다. 엑솜 또는 타겟 유전자만을 시퀀싱하기 위해서는 엑솜 또는 타겟 유전자만 증폭할 수 있는 라이브러리가 필요하다.

타겟 유전자만을 증폭하기 위해서는 특정 타겟 유전자에 특이적인 프라이머를 이용할 수 있다.

(2) 대용량 병렬 DNA 시퀀싱

차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing: NGS)은 기존의 모세관 서열확인법(capillary sequencing)에 비해서 빠르면서 한 번에 더 많은 양의 서열확인을 수행할 수 있고, 기존의 모세관 서열확인법에 사용하는 벡터를 이용한 시료의 증폭 과정이 생략되기 때문에 이 과정에서 발생하는 실험적인 오류를 피할 수 있다는 장점이 있다.

3곳의 회사에서 제작한 NGS 시스템이 주로 사용되고 있다. 2004년에 출시된 로슈(Roche)사의 454 GS FLX는 처음 소개된 NGS 장비로, 이 장치는 피로시퀀싱(pyrosequencing) 방법과 유화제-중합효소반응(emulsionpolymerase chain reaction)을 사용하여 서열확인을 수행하고, 실험의 최종단계에서 나오는 빛의 세기에 따라서 특정 염기를 확인할 수 있다. 7시간 가동시켰을 때 100Mb 정도의 서열을 확인할 수 있는데, 기존의 ABI 3730 기기가 같은 시간에 440kb의 서열을 확인할 수 있는 것에 비해서 월등히 높은 성능을 나타낸다.

일루미나(Illumina)사의 Illimina Genome Analyzer는 합성에 의한 서열확인(sequencing by synthesis)이라는 개념을 도입한 것으로, 유리판 위에 한 가닥만으로 이루어진 DNA 조각을 부착한 후에, 이 조각들을 중합반응을 거쳐서 군집(cluster)을 이루게 한다. 이 과정을 거칠 때 검사하려는 DNA 조각에 붙은 염기의 종류를 확인하면서 서열 분석을 수행하는데, 약 4 일 정도의 작업으로 32-40 개의 염기길이를 가지는 단편이 4-5천만 개가 생산이 된다.

라이프 테크놀로지(Life Technologies)사의 SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation) 기기는 1 μm 크기의 자성 구슬에 검사하려는 DNA 조각을 부착시킨 후에 유화제-중합효소연쇄반응을 이용하여 서열확인을 수행한다. 서열 확인을 할 때는 8-mer의 단편들을 반복해서 붙이는 방식을 사용하는데, 이 8-mer의 4, 5번째에 실제 서열확인에 사용될 염기가 위치하고 있다. 그 뒤에 붙은 나머지 부위에는 형광물질이 연결되어 있어서 어느 염기가 검사하려는 DNA 조각에 상보적으로 결합하는 지를 표시해 준다. 한 번의 결합 주기마다 8-mer를 모두 5번 붙이고, 같은 작업을 5번 시행하면 총 25염기로 이루어진 DNA 조각의 서열을 확인할 수 있다. SOLiD 기기의 특징은 두 개의 염기를 이용한(two-base encoding) 서열확인으로, 이 방법은 하나의 염기의 서열을 결정할 때 같은 부위를 두 번의 서열확인을 통해서 확인하는 것이다. 자성구슬에 부착된 부착제(adaptor)쪽으로 한 번의 결합 주기마다 한 염기씩 서열을 이동시키면서 서열확인을 수행한다. 이 과정을 통해서 서열확인 실험에서 발생하는 오류를 제거할 수 있는 장점이 있다.

(3) 염기서열 데이터의 분석

질병의 원인 유전자를 찾기 위해서는 기존의 유전자 염기서열로부터 어떤 변화가 일어났는지 조사해야 하기 때문에 개인(환자)의 염기서열 데이터(sequence reads)를 레퍼런스 염기서열(reference Genome)과 비교하는 작업을 하게 된다. 이 작업을 맵핑(Mapping)이라고 한다. 맵핑을 통해 개인과 레퍼런스 염기서열의 차이를 알아낸 후 이를 적당한 선택 기준을 정해 신뢰할 수 있는 염기서열 변이 정보만 추출(Variant Calling)하게 된다. 이 변이 정보는 단일염기서열변이(SNV: Single Nucleotide Variation), 짧은 삽입/결실(Short Indel), 복제수 변이(copy number varation, CNV) 및 융합 유전자 등을 포함하는 구조변이(structural variation, SV)이다. 그런 다음 염기서열 변이 정보를 기존 데이터베이스와 비교하여 이미 밝혀진 변이인지 새롭게 발견된 변이인지 판단한다. 그리고 그 변이가 아미노산의 변화를 가져올 것인지 아닌지, 또한 단백질 구조에 있어서 어떤 영향을 줄 것인지 예측하게 된다. 이 과정을 주석달기(Annotation)라고 한다. 추출한 단일염기서열변이와 짧은 삽입/결실에 관한 정보는 정보의 품질을 더 높이기 위하여 데이터베이스에 등재하거나 전장유전체연관분석(Genome Wild Association Study; GWAS)과 통합 연구를 통해 질병의 원인 변이를 찾는 연구를 수행할 수도 있다.

다만, 기존의 방법으로는 앰플리콘 방식의 리드에서 프라이머 정보를 제거하는데 그 정확도가 떨어지면서 시간이 오래 걸리는 단점이 있었으며, 본원 발명에서는 프라이머 서열 정보를 높은 정확도로 결정하여 제거하는 방법을 개발한 것이다.

본 발명에서의 용어 "획득하다" 또는 "획득하는"이 본 명세서에서 사용되며, 물리적 독립체 또는 값을 "직접적으로 획득하거나" 또는 "간접적으로 획득함으로써" 물리적 독립체 또는 값, 예를 들어 수치적 값의 소유를 얻는 것을 지칭한다. "간접적으로 획득하는"은 물리적 독립체 또는 값을 얻기 위한 처리를 수행하는 것(예를 들어, 합성 또는 분석 방법을 수행하는 것)을 의미한다. "간접적으로 획득하는 것"은 다른 관계자 또는 공급원(예를 들어 물리적 독립체 또는 값을 직접적으로 획득한 제3자 연구소)으로부터 물리적 독립체 또는 값을 수용하는 것을 지칭한다.

물리적 독립체를 간접적으로 획득하는 것은 물리적 물질, 예를 들어 출발 물질에서 물리적 변화를 포함하는 처리를 수행하는 것을 포함한다. 대표적인 변화는 2 이상의 출발 물질로부터 물리적 독립체를 만드는 것, 물질을 전단(shearing) 또는 단편화하는 것, 물질을 분리시키거나 정제하는 것, 2 이상의 별개의 독립체를 혼합물로 합하는 것, 공유 또는 비공유 결합을 파괴하거나 또는 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 값을 간접적으로 획득하는 것은 샘플 또는 다른 물질에서 물리적 변화를 포함하는 처리를 수행하는 것, 예를 들어 물질, 예를 들어 샘플, 분석물 또는 시약에서 물리적 변화를 포함하는 분석 과정을 수행하는 것(때때로, 본 명세서에서 "물리적 분석"으로서 지칭됨), 분석 방법, 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함하는 방법을 수행하는 것: 물질, 예를 들어 분석물 또는 이것의 단편 또는 다른 유도체를 다른 물질로부터 분리시키거나 또는 정제하는 것; 분석물 또는 이것의 단편 또는 다른 유도체를 다른 물질, 예를 들어 완충제, 용매 또는 반응물과 합하는 것; 또는, 예를 들어 분석물의 제1 원자와 제2 원자 사이의 공유 또는 비공유 결합을 파괴하거나 또는 형성함으로써 분석물 또는 이것의 단편 또는 다른 유도체의 구조를 변화시키는 것; 또는, 예를 들어 시약의 제1과 제2 원자 사이의 공유 또는 비공유 결합을 파괴하거나 형성함으로써 시약 또는 이것의 단편 또는 다른 유도체의 구조를 변화시키는 것을 포함한다.

본 발명에서의 용어 "서열을 획득하는 것" 또는 "리드를 획득하는 것"은 본 명세서에서 사용되며, 서열 또는 리드를 "직접적으로 획득하거나" 또는 "간접적으로 획득함으로써" 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열의 소유를 얻는 것을 지칭한다. 서열 또는 리드를 "직접적으로 획득하는 것"은 시퀀싱 방법(예를 들어, 차세대 시퀀싱(NGS) 방법)을 수행하는 것과 같이 서열을 얻기 위한 과정을 수행하는 것(예를 들어, 합성 또는 분석 방법을 수행하는 것)을 의미한다. 서열 또는 리드를 "간접적으로 획득하는"은 다른 관계자 또는 공급원(예를 들어 서열을 직접적으로 획득한 제3자 연구소)으로부터 서열을 수용하거나 또는 서열의 정보 또는 지식을 수용하는 것을 지칭한다. 획득한 서열 또는 리드는 완전한 서열일 필요는 없으며, 예를 들어 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 시퀀싱 또는 피험체에서 존재하는 것과 같은 본 명세서에 개시된 변경 중 하나 이상을 확인하는 정보 또는 지식을 얻는 것은 서열을 획득하는 것을 구성한다.

서열 또는 리드를 직접적으로 획득하는 것은 물리적 물질, 예를 들어 출발 물질, 예컨대 조직 또는 세포 샘플,예를 들어 생검 또는 분리된 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA) 샘플에서 물리적 변화를 포함하는 과정을 수행하는 것을 포함한다. 대표적인 변화는 2 이상의 출발 물질, 물질을 전단 또는 단편화하는 것, 예컨대 게놈 DNA 단편으로부터 물리적 독립체를 제조하는 것(예를 들어, 조직으로부터 핵산 샘플을 분리시키는 것); 2 이상의 별개의 독립체를 혼합물로 합하는 것, 공유 또는 비-공유 결합을 파괴하거나 또는 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것은 상기 기재한 바와 같은 샘플 또는 다른 물질에서 물리적 변화를 포함하는 과정을 수행하는 것을 포함한다.

본 발명에서의 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 의미한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합특성을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확히 기재된 서열뿐만 아니라 암묵적으로 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오소로그, SNP 및 상보적 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, MoI. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 작은 비코딩 RNA, 마이크로 RNA(miRNA), 피위상호작용(Piwi-interacting) RNA 및 유전자 또는 유전자좌에 의해 코딩된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명에서의 용어 “기준 에러 값(%)”은 프라이머 서열과 리드 서열 간의 분석에 사용되는 수치를 의미한다. 예를 들면, 기준 에러 값보다 높은 상태로 리드서열과 매칭되는 프라이머 서열은 에러인 것으로 분류하고, 기준 에러 값보다 낮은 상태로 리드 서열과 매칭되는 프라이머 서열은 정상으로 분류하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어 “페어드 엔드 리드(paired-end read)”는 '페어드 엔드'란 동일한 DNA 분자의 양 말단을 의미한다. 한 쪽 말단을 시퀀싱하고, 이를 뒤집어 다른 말단을 시퀀싱했을 경우, 염기서열이 규명된 이들 두 말단을 '페어드 엔드 리드'라 한다. 예를 들어 Illumina 시퀀싱은 약 500bps의 리드를 생성하고, 이 리드의 양쪽 끝 75bps의 염기 서열을 읽어낸다. 이때 두 리드(제1리드와 제2리드)를 읽는 방향은 3’와 5’로 각각 반대가 되며, 서로의 페어드 엔드 리드가 된다.

본 발명에서의 용어 “제1리드”, “제2리드”, “pair1”, “pair 2”는 페어드 엔드 리드 시퀀싱(Paired-End Read Sequencing)을 통해 얻어진 5' 방향의 제1리드(pair1)와 3'방향의 제2리드(pair2)를 의미한다.

본 발명에서는 리드 서열에서 프라이머 서열 정보를 다양한 기준 값과 다양한 방법으로 제거할 수 있는 지 확인하고자 하였다(도 1).

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 앰플리콘 기반 NGS를 통해 BRCA 1,2 유전자에 대한 리드를 획득한 다음, 미리 설계한 프라이머 서열정보와 리드 서열을 매칭하여 100% 매칭되는 리드 서열을 추출하고, 기준 에러 값 5%로 설정하여 상기 두 종류의 서열을 다시 매칭하여 95% 매칭되는 리드 서열을 추출한 다음, 추출되지 않은 리드 서열에서 리드 내부 프라이머 서열 정보로 리드의 프라이머 서열 정보를 결정하여 획득한 리드의 프라이머 서열 정보를 결정하고, 프라이머 서열을 리드 내에서 제거하였으며, 그 시간(도 4), 남은 리드 개수(도 5) 및 그 정확도(도 6)를 비교한 결과, 기존의 공지된 프로그램에 비해 본원 발명의 방법이 모든 측면에서 뛰어나다는 것을 확인하였다

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계; (b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를 포함하는, 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next genratin sequencing)에서 프라이머 제거를 통해 리드 데이터 분석 정확도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 리드는 fastq 파일 형식으로 저장되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 있어서, 상기 (b) 단계는 (i) 프라이머 서열과 상기 리드 서열에서 완벽하게 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; (ii) 프라이머 서열과 상기 (i) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 기준 에러 값(%) 만큼 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; 및 (iii) 프라이머 서열과 상기 (ii) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 리드 내부 프라이머 서열 정보로 리드의 프라미어 서열 정보를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 (i) 단계에서 완벼하게 매칭된다는 것은 프라이머 서열정보와 리드 서열정보가 100% 매칭된다는 것을 의미할 수 있으며, 상기 매칭은 아호이 코라식(ahoi-corasick) 알고리즘을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계의 리드 서열은 5‘ 부분이 프라이머 전체 길이의 1 내지 65%가 제거된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 20%가 제거된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계의 리드 서열은 5‘ 부분이 프라이머 길이가 21 내지 36bp 일 경우에는 1bp 내지 13bp 제거 된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5bp가 제거된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계의 서열 비교는 리드 서열의 5‘ 부분 20bp 내지 70bp 와 프라이머 서열을 비교하여 일치하는 지 확인하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 50bp를 비교하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계의 서열 비교는 리드 서열의 5‘ 부분 10 내지 50% 까지의 서열을 프라이머 서열과 비교하여 일치하는 지 확인하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 30% 까지의 서열을 비교하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (ii) 단계의 기준 에러 값(%)은 리드 서열에서 프라이머 서열을 정확하게 결정할 수 있는 값이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하네는 0.1% 내지 10% 일 수 있고, 가장 바람직하게는 5% 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계의 리드 내부 프라이머 서열 정보는 리드 서열 내부에 존재하는 다른 리드의 프라이머 서열에 해당하는 정보인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본원 발명에서 리드는 서로 겹치게 설계되기 때문에 리드의 내부에 다른 리드의 프라이머 해당하는 부분의 서열 정보가 존재하게 되는 것이다(도 2).

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 프라이머 서열을 결정하는 것은 제1리드와 제2리드의 서열 분석 결과를 가지고 같은 리드의 프라이머가 각각 Forward(5‘)와 Reverse(3’) 를 가지고 일치할 경우, 리드정보와 프라이머 정보를 결정하고 저장하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 3)

본 발명에 있어서, 상기 방법은 전체 리드 서열에서 (b) 단계에서 프라이머 서열을 결정한 리드와 결정하지 못한 리드의 비율을 정리하여 보고하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 차세대 염기서열 분석기법이 앰플리콘(amplicon) 기반일 경우, 앰플리콘 생산량 결과를 통해 데이터 이상 유무를 보고하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 앰플리콘 생산량 결과는 실험 샘플의 프라이머 매칭 결과를 바탕으로 예측되는 앰플리콘 생산량 결과와 실제 컨트롤 샘플 대비 실험 샘플의 앰플리콘 생산량 결과를 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 차세대 염기 서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 서열 제거를 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서, 상기 방법은 (a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계; (b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (i) 프라이머 서열과 상기 리드 서열에서 완벽하게 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; (ii) 프라이머 서열과 상기 (i) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 기준 에러 값(%) 만큼 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; 및 (iii) 프라이머 서열과 상기 (ii) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 리드 내부 프라이머 서열 정보로 리드의 프라미어 서열 정보를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: NGS 기반 리드 획득

BRCA 유전자에 변이가 있는 표준물질을 가지고 앰플리콘 기반 NGS를 수행하여 각 샘플에서, BRACA 유전자에 대한 리드를 하기의 표 1과 같은 개수만큼 획득하였다.

BRCA read raw count

Sample #	Read count	Sample #	Read count	Sample #	Read count
Sample 1	38329	Sample 9	36601	Sample 17	43909
Sample 2	42871	Sample 10	39747	Sample 18	41652
Sample 3	38410	Sample 11	35189	Sample 19	46255
Sample 4	38881	Sample 12	40638	Sample 20	43950
Sample 5	40867	Sample 13	41649	Sample 21	50263
Sample 6	36741	Sample 14	40010	Sample 22	40038
Sample 7	39031	Sample 15	31768	Sample 23	49956
Sample 8	39541	Sample 16	41566	Sample 24	49082

실시예 2: 프라이머 서열 정보와 리드 서열 ahoi - corasick 알고리즘으로 비교

획득한 리드 서열 3만개에서 5‘ 부분 5bp를 제거한 다음, 설계한 프라이머 서열 정보와 상기 리드를 각각 ahoi-corasick 알고리즘으로 비교하여 100% 매칭되는 리드(프라이머 서열 결정됨)를 각 샘플 별로 하기 표 2와 같이 추출하였다.

BRCA read 1차 분석 결과 Ahoi corasick

Sample #	Read count	Sample #	Read count	Sample #	Read count
Sample 1	36310	Sample 9	34568	Sample 17	41585
Sample 2	40414	Sample 10	37438	Sample 18	39466
Sample 3	36552	Sample 11	33268	Sample 19	43909
Sample 4	36807	Sample 12	38278	Sample 20	41498
Sample 5	38281	Sample 13	38973	Sample 21	47681
Sample 6	34406	Sample 14	37417	Sample 22	37799
Sample 7	36934	Sample 15	30169	Sample 23	47449
Sample 8	37460	Sample 16	39332	Sample 24	46518

실시예 3: 프라이머 서열 정보와 리드 서열 기준 에러 값( % ) 으로 비교

실시예 2에서 100% 매치가 되지 않아 추출되지 않은 리드를 프라이머 서열과 다시 5% 기준 에러값으로 매칭하여 95% 매칭되는 리드(프라이머 서열 결정됨)를 각 샘플 별로 하기 표 3과 같이 추출하였다.

BRCA read 2차 분석 결과 기준 에러 값

Sample #	Read count	Sample #	Read count	Sample #	Read count
Sample 1	248	Sample 9	219	Sample 17	291
Sample 2	285	Sample 10	228	Sample 18	284
Sample 3	224	Sample 11	221	Sample 19	291
Sample 4	259	Sample 12	238	Sample 20	304
Sample 5	274	Sample 13	264	Sample 21	311
Sample 6	232	Sample 14	248	Sample 22	242
Sample 7	238	Sample 15	210	Sample 23	296
Sample 8	277	Sample 16	222	Sample 24	299

실시예 4: 리드 내부 프라이머 서열 정보 기반 프라이머 서열 결정

실시예 3에서 추출되지 않은 리드 에서, 리드 내부에 존재하는 다른 리드의 정보(도 2 a, b)를 바탕으로 각 리드의 5’ 프라이머 서열 정보를 하기 표 4와 같이 결정하였다.

BRCA read 3차 분석 결과 내부 프라이머 정보

Sample #	Read count	Sample #	Read count	Sample #	Read count
Sample 1	41	Sample 9	43	Sample 17	48
Sample 2	53	Sample 10	43	Sample 18	43
Sample 3	37	Sample 11	35	Sample 19	52
Sample 4	39	Sample 12	43	Sample 20	42
Sample 5	51	Sample 13	42	Sample 21	51
Sample 6	35	Sample 14	34	Sample 22	38
Sample 7	37	Sample 15	19	Sample 23	40
Sample 8	55	Sample 16	42	Sample 24	52

실시예 5: 프라이머 서열 최종 결정 및 프라이머 서열 제거

실시예 2 내지 4에서 결정한 프라이머 서열 정보를 바탕으로 제1리드와 제2리드에서 각각의 프라이머가 forward(5’) 및 reverse(3‘)을 제대로 가지고 매칭되는리드 정보와 프라이머 정보를 결정하고 저장한 다음, 프라이머 서열 정보를 제거하였다.

프라이머 페어 결정

	Pair1	Pair2	save
Read1	BRCA2_10_07_FOR	BRCA2_10_07_REV	O
Read2	BRCA2_10_07_FOR	BRCA2_10_09_REV	X
Read3	BRCA2_10_07_REV	BRCA2_10_07_FOR	O

실시예 6: 본원 발명의 방법과 공지 프로그램 비교

6-1. 프라이머 제거 속도 비교

24개의 샘플에 대하여(각각 3만개의 raw read 보유), 본원 발명의 방법과 공지프로그램(cutadapt, https://github.com/marcelm/cutadapt)의 프라이머 제거 완료까지의 시간을 비교한 결과, 본원 발명의 방법이 훨씬 빠르게 완료되는 것을 확인할 수 있었다(표 6, 도 4). 즉, 기존의 공지 프로그램은 평균 약 261초가 걸리는데 비하여, 본원 발명의 방법은 평균 약 72초만에 분석을 완료하여 2.6배 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.

프라이머 제거 완료 후, fastq 파일 생성까지 걸린 시간(초)

	cutadapt	본원 발명
sample1	238s	57s
sample2	294s	70s
sample3	360s	63s
sample4	234s	63s
sample5	372s	64s
sample6	224s	58s
sample7	236s	65s
sample8	242s	66s
sample9	220s	58s
sample10	234s	65s
sample11	207s	55s
sample12	244s	76s
sample13	248s	79s
sample14	243s	73s
sample15	190s	50s
sample16	258s	74s
sample17	265s	81s
sample18	260s	76s
sample19	274s	98s
sample20	264s	87s
sample21	303s	98s
sample22	241s	66s
sample23	306s	97s
sample24	303s	95s

6-2. 프라이머 제거 완료 후, 남은 리드 개수 비교

24개의 샘플에 대하여, 본원 발명의 방법과 공지 프로그램(cutadt, https://github.com/marcelm/cutadapt)의 프라이머 제거 완료 후, 분석에 사용할 수 있는 리드의 개수를 비교한 결과, 본원 발명의 방법이 분석할 수 있는 리드를 더욱 많이 남기는 것을 확인할 수 있었다(표 7, 도 5). 즉, 기존의 공지 프로그램은 평균 약 91%의 리드를 프라이머 제거 후, 남기는 데 비하여, 본원 발명은 약 95%의 리드를 남기는 것을 확인 할 수 있었다.

프라이머 제거 완료 후, 분석에 쓰이는 리드 개수

	cutadapt	Raw 리드 대비(%)	본원 발명	Raw 리드 대비(%)
sample1	35036	91.409%	36419	95.017%
sample2	39092	91.185%	40752	95.057%
sample3	34896	90.851%	36813	95.842%
sample4	35406	91.062%	37105	95.432%
sample5	37260	91.174%	38606	94.467%
sample6	33463	91.078%	34673	94.371%
sample7	35823	91.781%	37209	95.332%
sample8	36024	91.105%	37792	95.577%
sample9	33242	90.823%	34830	95.161%
sample10	35851	90.198%	37709	94.873%
sample11	31867	90.560%	33524	95.268%
sample12	36886	90.767%	38559	94.884%
sample13	37757	90.655%	39279	94.310%
sample14	36404	90.987%	37699	94.224%
sample15	28907	90.994%	30398	95.687%
sample16	37932	91.257%	39596	95.261%
sample17	39847	90.749%	41924	95.479%
sample18	37623	90.327%	39793	95.537%
sample19	41852	90.481%	44252	95.670%
sample20	40095	91.229%	41844	95.208%
sample21	45740	91.001%	48043	95.583%
sample22	36428	90.984%	38079	95.107%
sample23	45304	90.688%	47785	95.654%
sample24	44659	90.989%	46869	95.491%

6-3. 프라이머 제거 정확도 비교

공지 프라이머 제거 프로그램(cutadapt)에서 프라이머 제거가 완료되었다고 분류한 리드와, 본원 발명의 방법으로 프라이머 제거가 완료되었다고 분류한 리드를 참조 유전자(GrCh37/hg19)에 맵핑한 결과, 공지 프로그램에서는 프라이머 서열을 정확하게 제거하지 못한다는 것을 확인하였다(도 6).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계;
(b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및
(c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를 포함하는 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법(Next generation sequencing)에서 프라이머 제거를 통해 리드 데이터 분석의 정확도를 증가시키는 방법으로,
상기 (b) 단계는
(i) 프라이머 서열과 상기 리드 서열에서 완벽하게 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계;
(ii) 프라이머 서열과 상기 (i) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 기준 에러 값(%) 만큼 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; 및
(iii) 프라이머 서열과 상기 (ii) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 리드 내부 프라이머 서열 정보로 리드의 프라미어 서열 정보를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 (iii) 단계의 리드 내부 프라이머 서열 정보는 리드 서열 내부에 존재하는 다른 리드의 프라이머 서열에 해당하는 정보인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 리드 서열은 5‘ 부분이 1 내지 65% 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (i) 단계의 서열 비교는 리드 서열의 5‘ 부분 20bp 내지 70bp와 프라이머 서열을 비교하여 일치하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (i) 단계의 서열 비교는 아호이-코라식(ahoi-corasick) 알고리즘을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 기준 에러 값(%)은 0.1% 내지 10% 인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 프라이머 서열을 결정하는 것은 제1리드와 제2리드의 서열 분석 결과에서 리드의 프라이머가 각각 Forward(5‘)와 Reverse(3’) 를 가지고 일치할 경우, 리드정보와 프라이머 정보를 결정하고 저장하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 전체 리드 서열에서 (b) 단계에서 프라이머 서열을 결정한 리드와 결정하지 못한 리드의 비율을 정리하여 보고하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 차세대 염기서열 분석기법이 앰플리콘(amplicon) 기반일 경우, 앰플리콘 생산량 결과를 통해 데이터 이상 유무를 보고하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 앰플리콘 생산량 결과는 실험 샘플의 프라이머 매칭 결과를 바탕으로 예측되는 앰플리콘 생산량 결과와 실제 컨트롤 샘플 대비 실험 샘플의 앰플리콘 생산량 결과를 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 방법은 (a) 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석기법을 통해 리드를 획득하는 단계;
(b) 프라이머 서열과 상기 리드 서열을 분석하여 리드 서열 내 프라이머 서열을 결정하는 단계; 및
(c) 결정된 프라이머 서열을 제거하는 단계를포함하는차세대염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)에서 프라이머 서열 제거를 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로,.
상기 (b) 단계는
(i) 프라이머 서열과 상기 리드 서열에서 완벽하게 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계;
(ii) 프라이머 서열과 상기 (i) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 기준 에러 값(%) 만큼 매칭되는 리드 서열을 추출하는 단계; 및
(iii) 프라이머 서열과 상기 (ii) 단계에서 추출되지 않은 리드 서열에서 리드 내부 프라이머 서열 정보로 리드의 프라미어 서열 정보를 결정하는 단계.
를 포함하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 시스템.
삭제