JP2022505050A - プーリングを介した多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法および試薬 - Google Patents

プーリングを介した多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法および試薬 Download PDF

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Abstract

プーリングを介した多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法および関連試薬が、本明細書に開示される。本技術の実施形態の一部は、多数の試料（例えば、核酸試料、患者試料、組織試料、血液試料など）の効率的な遺伝子型決定および関連する用途のために、デュプレックス配列決定を利用することを対象とする。本技術の様々な態様は、前臨床および臨床の疾患評価の両方において、比較的まれなバリアントが求められている多数の試料をスクリーニングすること、ならびにその他において、多くの用途を有する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７４６，５４３号に対する優先権およびその利益を主張し、その開示は、その全体が参照により組み込まれる。
次世代ＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）は、単一のシーケンサーのランで数兆個のＤＮＡ塩基を配列決定することを可能にする。配列決定のヌクレオチドスループットは、過去１０年間で大幅に増加しているが、ＮＧＳの大容量を利用するために数百または数千個の試料を一緒に多重化するための、費用対効果の高い技術が遅れている。試料あたりの配列決定の必要性が大きないくつかの用途の場合（例えば、全哺乳類ゲノムまたはエクソーム）、適度の多重化容量で十分である。試料あたりの配列決定の必要性が小さい試料の場合（例えば、サイズが数千または数万の塩基対のパネル）、配列決定自体によってではなく、かかる多数の試料を調製し、各々を固有のインデックス配列で個別に標識し、次いで多重化配列決定のためにプールするコストおよび労力によって、シーケンサーランを満たすコストが高くなる。例えば、比較的小さい標的遺伝子パネル内の希少な遺伝性バリアントの集団配列決定を伴う用途では、数百または数千の並列ライブラリ調製物は、負担であり、高額であり、しばしば律速となる。
本発明の技術は、概して、プーリングを介して複数の試料を効率的に遺伝子型決定するための方法および関連試薬に関する。特に、本技術の一部の実施形態は、多数の試料（例えば、核酸試料、患者試料、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、スワブ試料、スクレイプ試料、細胞培養試料、微生物試料など）の効率的な遺伝子型決定および関連する用途のために、デュプレックス配列決定を利用することを対象とする。例えば、本技術の様々な実施形態は、プールされた核酸試料（例えば、患者ＤＮＡ試料）に対してデュプレックス配列決定方法を行い、効率的（例えば、費用効率的、時間効率的）な様式で、かつ高い精度および感度で、ゲノムの全てまたは標的部分を同時に配列決定することを含む。かかる実施形態は、適度のまたは多数の元のプールされた試料のプールからのバリアントアレル（ｖａｒｉａｎｔ ａｌｌｅｌｅ）（すなわち、ＳＮＶ、ＭＮＶ、ＳＮＰ、ＭＮＰ、ＩＮＤＥＬ、変異、構造バリアント、コピー数バリアント、逆位、再編成などの遺伝的バリアント）のスクリーニング、ならびにバリアントアレルを有する個々の試料の特定を可能にする。この技術の様々な態様は、前臨床および臨床の疾患評価の両方、比較的まれなバリアントが求められている大量の試料数のスクリーニング、ならびにその他において、多くの用途を有する。
一部の実施形態では、本開示は、プールを介して複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法を提供し、複数の生体試料または生体試料の核酸誘導体を、固有の組み合わせのサブプールにプールするステップであって、各生体試料が標的二本鎖ＤＮＡ分子を含む、プールするステップと、サブプール内の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成するステップと、を含む。特定の実施形態では、エラー修正配列リードを生成することは、アダプタ分子を複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子にライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成するステップと、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子の各々について、アダプタ－ＤＮＡ分子の元の第１の鎖のコピーのセットおよびアダプタ－ＤＮＡ分子の元の第２の鎖のコピーのセットを生成するステップと、元の第１の鎖の配列および元の第２の鎖の配列の１つ以上のコピーを配列決定して、第１の鎖の配列および第２の鎖の配列を提供するステップと、第１の鎖の配列と第２の鎖の配列とを比較して、第１の鎖の配列と第２の鎖の配列との間の１つ以上の対応関係を特定するステップと、を含む。一実施形態では、方法は、エラー修正配列リードを個々の遺伝子型に逆重畳することによって、核酸の混合物中に存在する核酸のドナー源を特定することをさらに含む。例えば、本方法は、エラー修正配列リードからの１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、バリアントアレルを含有する元の生体試料を決定することと、を含むことができる。
別の実施形態では、本技術は、遺伝的バリアントについて生物源をスクリーニングするための方法を提供し、生物源に由来する複数の生体試料を、固有の組み合わせのサブプールにアリコートすることを含み、各生体試料は、標的二本鎖ＤＮＡ分子を含み、各生体試料は、２つ以上のサブプールにアリコートされる。本方法は、サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することと、エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、バリアントアレルを含有する生物源を決定することと、をさらに含む。
一実施形態では、サブプール内の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することが、配列決定の前に、１つ以上の標的ゲノム領域を選択的に富化することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、疾患原因変異を保有することが知られている遺伝子を含む。一実施形態では、疾患原因変異は、機能喪失変異、機能獲得変異、または優性阻害変異であるか、またはこれらを含む。別の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子座を含む。一実施形態では、疾患または障害は、希少な遺伝性障害である。一実施形態では、疾患または障害は、単一遺伝子障害である。別の実施形態では、疾患または障害は、２つ以上の遺伝子における変異を伴う複合障害である。一実施形態では、疾患または障害は、常染色体劣性変異に関連する。別の実施形態では、疾患または障害は、常染色体優性変異と関連する。
一部の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、癌ドライバー、癌原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および／または癌遺伝子を含む。例として、癌ドライバーは、ＡＢＬ、ＡＣＣ、ＢＣＲ、ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＨＯＬ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＳＣＡ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＭＥＳＯ、ＯＶ、ＰＡＡＤ、ＰＣＰＧ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＡＤ、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＧＣＴ、ＴＨＣＡ、ＴＨＹＭ、ＴＰ５３、ＵＣＥＣ、ＵＣＳ、および／またはＵＶＭを含む。別の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、希少な自己免疫性、代謝性または神経性の遺伝性障害または疾患に関連する遺伝子を含む。
一部の実施形態では、希少な遺伝性障害または疾患は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白皮症、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー１型、高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎疾患１および２、血友病Ａ、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型）、低リン血症性くる病、レット症候群、テイ・サックス病、ウィルソン病、および／または精子形成不全であるか、またはそれらを含む。
別の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、肥満の希少な遺伝性障害に関連する遺伝子座を含む。一部の実施形態では、肥満の希少な遺伝性障害は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠乏性肥満、アルストレム症候群、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏性肥満、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、バルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ）、および高影響ヘテロ接合性肥満であるか、またはこれらを含む。
一実施形態では、エラー修正配列リードからの１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することは、エラー修正配列を、参照ゲノムＤＮＡ配列と比較することを含む。一実施形態では、参照ゲノムＤＮＡ配列は、ヒト参照ゲノムＤＮＡ配列である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、各サブプールの複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の中の１つ以上のバリアントの頻度を決定することをさらに含むことができる。一実施形態では、方法は、バリアントアレルを含む生体試料の生物源ドナーが、バリアントアレルについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかを決定することをさらに含むことができる。
一部の実施形態では、標的二本鎖ＤＮＡ分子は、ヒトから採取された血液から抽出される。別の実施形態では、標的二本鎖ＤＮＡ分子は、組織試料（例えば、生検試料など）から抽出される。
本技術の特定の態様は、複数の生体試料の遺伝子型を決定するための方法を対象とし、複数の生体試料を複数のサブプールにアリコートするステップであって、各生体試料は標的二本鎖ＤＮＡ断片を含み、２つの生体試料は同じ組み合わせのサブプールにアリコートされない、アリコートするステップと、生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成するステップであって、生の配列決定データは、標的二本鎖ＤＮＡ断片を含む複数のサブプールされた生体試料から生成され、標的二本鎖ＤＮＡ断片は、１つ以上の遺伝的バリアントを含有する、生成するステップと、１つ以上の遺伝的バリアントを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、サブプールされた生体試料中に存在する１つ以上の遺伝的バリアントのドナー源を特定するステップと、を含む。
一部の実施形態では、本方法は、（例えば、各サブプールについて）（ａ）アリコートされた生体試料から配列決定ライブラリを調製することであって、配列ライブラリを調製することが、非対称アダプタ分子をサブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ断片にライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成することを含む、配列決定ライブラリを調製することと、（ｂ）アダプタ－ＤＮＡ分子の第１の鎖および第２の鎖を配列決定して、各アダプタ－ＤＮＡ分子について第１の鎖の配列リードおよび第２の鎖の配列リードを提供することと、（ｃ）各アダプタ－ＤＮＡ分子について、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとを比較して、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を特定して、サブプール中の複数の標的二本鎖のＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを提供することと、をさらに含む。
一実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の配列決定の前に、サブプールからのアダプタ－ＤＮＡ分子を組み合わせることをさらに含む。一実施形態では、アダプタ分子は、インデックス配列を有する。一実施形態では、各サブプールは、固有のインデックス配列を使用してタグ付けされる。一実施形態では、固有の組み合わせのサブプールを特定することは、各遺伝的バリアントに関連付けられるインデックス配列を特定することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、各遺伝的バリアントと関連付けられたインデックス配列を、各生体試料がアリコートされたサブプールの組み合わせと相互参照して、ドナー源を特定することをさらに含む。
一部の実施形態では、サブプールの数は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、または７０個のサブプールであるか、またはそれを含む。他の実施形態では、サブプールの数は、約１５～約４０個のサブプール、約３０～約５０個のサブプール、約３５～約５５個のサブプール、約４０～約６０個のサブプール、または６０個超のサブプールであるか、またはそれらを含む。
別の実施形態では、本開示は、患者の集団の中から希少なバリアントアレルを有する患者を特定するための方法を提供する。本方法は、（ａ）集団中の各患者からの生体試料を、固有の組み合わせのサブプールされた試料に分離するステップであって、各生体試料は核酸断片を含む、分離するステップと、（ｂ）インデックスバーコードを各サブプールされた試料中の複数の核酸断片に結合して、複数のインデックス化サブプールされた試料を生成するステップと、（ｃ）インデックス化サブプールされた試料を組み合わせて、バーコード化核酸分子のプールされたセットを提供するステップと、（ｄ）バーコード化核酸分子のプールされたセットを配列決定するステップと、（ｅ）複数のバーコード化核酸分子についてエラー修正配列リードを提供するステップと、（ｆ）インデックスバーコードに基づいて、エラー修正配列リードをサブプールされた試料にグループ化するステップと、（ｇ）各サブプールされた試料中のエラー修正配列リードから希少なバリアントアレルの存在を特定するステップと、（ｈ）希少なバリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、希少なバリアントアレルを含有する患者を特定するステップと、を含む。
一部の実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）～（ｈ）の前に、患者の集団中の希少なバリアントアレルの保因者の存在について、患者の集団からの患者ＤＮＡの混合物をスクリーニングすることであって、スクリーニングすることが、集団中の各患者からの生体試料を１つ以上のプールされた試料に混合することであって、プールされた試料の数の各々が、サブプールされた試料の数より少ない、混合することと、１つ以上のプールされた試料からの複数の標的ＤＮＡ分子を配列決定して、生の配列決定データを生成することと、生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成することと、デュプレックス配列決定データから１つ以上のプールされた試料中の希少なバリアントアレルの存在を特定することによって、患者の集団が、希少なバリアントアレルの保因者を含むかどうかを決定することと、を含む。一実施形態では、プールされた試料の数は、１である。別の実施形態では、プールされた試料の数は、１を超え、ステップ（ａ）～（ｈ）は、希少なバリアントアレルの特定された存在を含むプールされた試料中に表される患者の集団の中から希少なバリアントアレルを有する患者を特定することを含む。
一実施形態では、本開示は、希少なバリアントアレルについて患者ＤＮＡ試料をスクリーニングするための方法を提供し、本方法は、プールされたＤＮＡ試料の固有のサブセットに各患者ＤＮＡ試料をアリコートすることであって、プールされたＤＮＡ試料の数が、患者ＤＮＡ試料の数未満であり、プールされたＤＮＡ試料の固有のサブセットが、各特定の患者ＤＮＡ試料について固有の試料識別子を含む、アリコートすることと、各プールされたＤＮＡ試料から１つ以上の標的ＤＮＡ分子を配列決定することと、標的ＤＮＡ分子について高精度のコンセンサス配列を生成することと、高精度のコンセンサス配列から希少なバリアントアレルの存在を特定することと、希少なバリアントアレルを含むプールされたＤＮＡ試料の固有のサブセットを特定して、希少なバリアントアレルに関連する固有の試料識別子を決定することと、固有の試料識別子によって希少なバリアントアレルを含有する患者ＤＮＡ試料を特定することと、を含む。一実施形態では、患者ＤＮＡ試料は、健常な組織、腫瘍、および／または患者由来の血液試料から抽出された二本鎖ＤＮＡ分子を含む。
本開示の他の態様は、複数の試料を効率的に遺伝子型決定するための、計算システムなどのシステムを対象とする。一実施形態では、システムは、配列決定データおよび遺伝子型データに関連する情報を送信するためのコンピュータネットワークであって、情報が、生の配列決定データ、デュプレックス配列決定データ、サブプールされた試料の混合物情報、個々の試料情報、および遺伝子型情のうちの１つ以上を含む、コンピュータネットワークと、１つ以上のユーザ計算デバイスと関連付けられ、かつコンピュータネットワークと通信するクライアントコンピュータと、複数の遺伝子型プロファイルおよびユーザ結果記録を記憶するためのコンピュータネットワークに接続されたデータベースと、コンピュータネットワークと通信し、かつデュプレックス配列決定データを生成するためにクライアントコンピュータからの生の配列決定データおよび要求を受信し、元の二本鎖核酸分子を表すファミリーからの配列リードをグループ化し、個々の鎖からの代表的な配列を互いに比較して、デュプレックス配列決定データを生成するように構成された、デュプレックス配列決定モジュールと、コンピュータネットワークと通信し、かつバリアントアレルを特定し、存在する各バリアントアレルについてサブプールの特定を決定し、各サブプール内のバリアントアレルの相対的存在量を計算し、遺伝子型データを生成するように構成された、遺伝子型モジュールと、を含む。
一実施形態では、遺伝子型プロファイルは、既知の疾患関連変異を含む。別の実施形態では、遺伝子型プロファイルは、１つ以上のゲノム遺伝子座で経験的に導かれた患者遺伝子型を含む。
本開示は、非一時的コンピュータ可読記憶媒体の実施形態をさらに提供する。一実施形態では、非一時的コンピュータ可読記録媒体は、１つ以上のプロセッサによって実行されると、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つの方法を行う命令を含む。一実施形態では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、バリアントアレルを含むサブプールの組み合わせを元の試料の混合パターンと相関させて、供給源の集団の中からバリアントアレルの元の供給源を特定するための命令をさらに含む。
一実施形態では、本開示は、複数の試料を効率的に遺伝子型決定するために本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つを行うためのコンピュータシステムを提供する。一実施形態では、システムは、プロセッサ、メモリ、データベース、およびプロセッサのための命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体を有する少なくとも１つのコンピュータを含み、当該プロセッサは、本明細書に記載の方法を含む操作を行うために当該命令を実行するように構成されている。
別の実施形態では、本開示は、非一時的コンピュータ可読媒体を提供し、そのコンテンツが、少なくとも１つのコンピュータに、複数のサブプールされた試料混合物中の二本鎖核酸分子についてのデュプレックス配列決定データを提供するための方法を行わせる。一実施形態では、本方法は、ユーザ計算デバイスから生の配列データを受信することと、サブプールされた試料混合物中の複数の核酸分子に由来する複数の生の配列リードを含むサブプール特有のデータセットを作成することと、元の二本鎖核酸分子を表すファミリーからの配列リードをグループ化することであって、グループ化することが、共有された単一分子識別子配列に基づく、配列リードをグループ化することと、元の二本鎖の核酸分子からの第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとを比較して、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を特定することと、サブプールされた試料の混合物中の二本鎖核酸分子のデュプレックス配列決定データを提供することと、各サブプールされた試料の混合物中の個々の二本鎖核酸分子内に存在する１つ以上の遺伝的バリアントを特定することと、１つ以上の遺伝的バリアントを含む固有の組み合わせのサブプールされた試料混合物を分離することによって、サブプールされた試料混合物中に存在する１つ以上の遺伝的バリアントの元の生物源を決定することと、を含む。一実施形態では、本方法は、比較された第１の配列リードと第２の配列リードとの間の非相補的なヌクレオチド位置を特定することをさらに含み、本方法は、非相補的な位置において、プロセスエラーを特定し、排除し、または考慮しないことをさらに含む。
一実施形態では、元の生物源を決定するステップは、ルックアップテーブルを使用して、特定の遺伝的バリアントについて固有の組み合わせのサブプールされた試料混合物の各々において、核酸アリコートを有する元の生物源を特定することを含む。
別の実施形態では、本開示は、非一時的コンピュータ可読媒体を提供し、そのコンテンツが、少なくとも１つのコンピュータに、サブプールされた核酸混合物中に存在するバリアントアレルを検出し、特定し、定量して、バリアントアレルのドナー生物源を決定するための方法を行わせる。一実施形態では、本方法は、特定のバリアントアレルを含むサブプールされた核酸混合物の組み合わせを特定することと、各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数を合計することと、ルックアップテーブルを使用して、特定のバリアントアレルを含むサブプールされた核酸混合物の各々において核酸アリコートを有するドナー生物源を特定することと、を含む。一実施形態では、本方法は、ドナー生物源が、各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数に基づいて、特定のバリアントアレルに対してヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかを決定することをさらに含む。
一実施形態では、任意のサブプールされた核酸混合物が、２つ以上のドナー生物源からの特定のバリアントアレルを含む場合、本方法は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する２つ以上のドナー生物源間を区別することをさらに含み、ＳＮＰは、特定のバリアントアレルのバリアント配列にゲノム上近接し、ＳＮＰは、バリアント配列と完全な不均衡ではない。別の実施形態では、各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数は、特定のバリアントアレルのドナー生物源がいくつ存在するのかを知らせることができる。
さらなる実施形態では、本開示は、非一時的コンピュータ可読媒体を提供し、そのコンテンツは、少なくとも１つのコンピュータに、患者集団の中からバリアントアレルを有する患者を特定するための方法を行わせる。一実施形態では、本方法は、混合物中の個々のＤＮＡ分子内に存在するバリアントアレルを特定することと、特定されたバリアントアレルを含むサブプールの組み合わせを特定することであって、サブプールの組み合わせが複数のサブプールのサブセットである、サブプールの組み合わせを特定することと、どの患者が特定されたバリアントアレルを含むサブプールの組み合わせにＤＮＡ分子を寄与したかを決定することによって、バリアントアレルを有する患者の集団の中から患者を特定することと、を含む。一実施形態では、患者を特定するステップは、ルックアップテーブルを使用して、患者ＤＮＡ試料をサブプールの組み合わせと相関させることを含む。
本開示の多くの態様は、以下の図面を参照することによって、より良く理解することができる。図面の構成要素は、必ずしも縮尺どおりではない。むしろ、本開示の原理を明確に例示することを重視する。
［図１Ａ］本技術の一部の実施形態に使用するための核酸アダプタ分子、および本技術の実施形態に従う二本鎖核酸断片へのアダプタ分子のライゲーションから得られる二本鎖アダプタ核酸複合体を示す。［図１Ｂおよび１Ｃ］本技術の実施形態に従う、様々なデュプレックス配列決定方法のステップの概念図である。 本技術の実施形態に従う、多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法のフロー図である。 本技術の実施形態に従う、試料プールスキームのためのコストおよび性能のメトリックを示すプロットである。 パネルＡ～Ｄは、プーリングのスキーム（パネルＡ）、プーリングスキームから生成されたルックアップテーブル（パネルＢ）、サブプールインデックス化スキームから生成されたルックアップテーブル（パネルＣ）、ならびに本技術の一実施形態に従う、識別された遺伝的バリアントを有する患者を識別するためにルックアップテーブル（パネルＢおよびＣ）と共に使用することができるバリアントアレル（パネルＤ）を含有するサブプールの識別を示す。 本技術の一実施形態に従う、複数の試料の効率的な遺伝子型決定のために本明細書に開示される方法および／または試薬と共に使用するためのネットワークコンピュータシステムの概略図である。 本技術の一実施形態に従う本技術の一実施形態に従う、デュプレックス配列決定のコンセンサス配列データを提供するためのルーチンを示すフロー図である。 本技術の一実施形態に従う、バリアントアレルの元の寄与源を特定するために、核酸混合物中に存在するバリアントアレルを検出し、特定し、定量するためのルーチンを示すフロー図である。
本発明の技術は、概して、プーリングを介して多数の試料を効率的に遺伝子型決定するための方法および関連試薬に関する。特に、本技術の一部の実施形態は、多数の試料（例えば、核酸試料、患者試料、組織試料、血液試料、血漿試料、血清試料、スワブ試料、スクレイプ試料、細胞培養試料、微生物試料など）の効率的な遺伝子型決定および関連する用途のために、デュプレックス配列決定を利用することを対象とする。例えば、本技術の様々な実施形態は、プールされた核酸試料（例えば、患者ＤＮＡ試料）に対してデュプレックス配列決定方法を行い、効率的（例えば、費用効率的、時間効率的）な様式で、かつ高い精度および感度で、ゲノムの全てまたは標的部分を同時に配列決定することを含む。本明細書に提示される一部の実施形態は、バリアントアレルを有する個々の試料の特定を特定することができるように、プールされた試料のサブセットの組み合わせを使用して、固有の試料識別子として、バリアントアレルについての生物源（例えば、患者）の遺伝子型決定および／またはスクリーニングを可能にする。本明細書に提示される一部の実施形態は、人工供給源（例えば、合成オリゴヌクレオチド、遺伝子編集試料、作製された細胞集団、作製されたウイルス試料など）の効率的な遺伝子型決定および／またはスクリーニングを可能にする。本技術の様々な態様は、前臨床および臨床の疾患評価の両方において、比較的珍しいバリアントが独立した試料のより大きな集団内で求められている多くの試料数をスクリーニングし、患者に早期介入療法を提供するなど、多くの用途を有する。本技術の様々な態様はまた、生物学的研究、生物学的製造、個々の生物（すなわち、ヒト、動物、植物、真菌）、微生物集団、ウイルス集団、細菌集団、原生動物集団（コロニーなど）のハイスループットスクリーニング、および他の遺伝学の分野における多くの用途を有する。
本技術のいくつかの実施形態の具体的な詳細について、図１Ａ～図７を参照しながら、以下に記載する。実施形態は、例えば、試料をプールする／混合するための方法、および供給源の特定、ならびにかかる方法で使用するための関連試薬を含むことができる。本技術の一部の実施形態は、プールされた試料中のバリアントアレルおよびバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）の存在をスクリーニングするために、デュプレックス配列決定を利用することを対象とする。本技術の他の実施形態は、各試料の個々の標識を必要とすることなく、高いレベルの信頼性で元の供給源の特定を維持することができる一方で、多数の（一般に、１０を超える）試料（例えば、核酸試料、患者試料、組織試料、血液試料など）の効率的な遺伝子型決定のために、デュプレックス配列決定を利用することを対象とする。本技術のさらなる実施形態は、バリアントアレルを有する多数のプールされた試料の中から１つ以上の寄与試料を特定することを対象とする（例えば、バリアントアレルを含有する遺伝物質の供給源を特定する）。さらなる実施形態では、本技術は、大きな集団、または一部の実施形態では、特定の患者集団などの集団の中で、希少な疾患関連アレルまたは他の形質関連アレルの保因者を経済的かつ確実に特定するためのデュプレックス配列決定を対象とする。
実施形態の多くは、デュプレックス配列決定に関して本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものに加えて、エラー修正配列決定リードを生成することが可能な他の配列決定モダリティは、本技術の範囲内である。例えば、一本鎖コンセンサス配列決定および／または一本鎖および二重鎖コンセンサス配列決定の組み合わせの多くの実施形態が企図される。かかる技術の非包括的なリストは、Ｓａｌｋ ｅｔ．ａｌ．（２０１８），Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒａｒｅ ａｎｄ ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，１９，２６９－２８５ （ＰＭＩＤ ２９５７６６１５）、およびＳａｌｋ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．Ｒ．，２０１９，Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｉｓｋ，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ．，（ＰＭＩＤ ３１５９５５５３）に記載または引用されており、両者は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。これに加えて、本技術の他の実施形態は、本明細書に記載されるものとは異なる構成、構成要素または手順を有していてもよい。したがって、当業者は、本技術が、追加の要素を有する他の実施形態を含んでいてもよく、かつ本技術が、図１Ａ～図７を参照しながら以下に示され、記載される特徴の一部を含まない他の実施形態を含んでいてもよいことを、理解するであろう。
Ｉ．特定の定義
本開示がより容易に理解されるために、まず、特定の用語を以下に定義する。以下の用語および他の用語についてのさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。
本出願では、文脈から別段明確でない限り、「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る。本出願で使用される場合、「または」という用語は、「および／または」を意味すると理解され得る。本出願では、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体によって示されるか、あるいは１つ以上のさらなる構成要素またはステップと共に示されるかにかかわらず、項目化された構成要素またはステップを包含すると理解され得る。範囲が本明細書で提示される場合、その両端が含まれる。本出願で使用される場合、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびこの用語の変形語、例えば、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の付加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しない。
約：「約」という用語は、ある値を参照して本明細書で使用される場合、参照される値の文脈で、類似する値を指す。一般に、その文脈に精通している当業者は、その文脈で、「約」に包含される適切な程度の分散を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、「約」という用語は、参照される値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内の範囲の値を包含し得る。１桁の整数値の分散について、正方向または負方向のいずれかにおける１個の数値のステップが、その値の２５％を超える場合、「約」は、正方向または負方向のいずれかにおいて少なくとも１、２、３、４または５の整数値を含むことが当業者によって一般的に受け入れられており、状況に応じて０を超えても超えなくてもよい。この非限定的な例は、当業者にとって明らかであろう一部の状況において、３セントが約５セントとみなされ得るという仮説である。
アレル本明細書で使用される場合、「アレル」という用語は、特定の遺伝子座の２つ以上の既存の遺伝的バリアントのうちの１つを指す。
類似体：本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、１つ以上の特定の構造特徴、要素、構成要素または部分が参照物質と共通する物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を指す。典型的には、「類似体」は、参照物質と有意な構造類似性を示すが（例えば、コアまたはコンセンサス構造が共通する）、特定の別個の様式では違いもある。一部の実施形態では、類似体は、参照物質から、例えば、参照物質の化学操作によって、生成可能な物質である。一部の実施形態では、類似体は、参照物質を生成する合成プロセスと実質的に類似した合成プロセス（例えば、複数のステップが共通する）の遂行を通して生成可能な物質である。一部の実施形態では、類似体は、参照物質を生成するために使用されるものとは異なる合成プロセスの遂行を通して生成されるか、または生成され得る。
本明細書で使用される場合、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、いずれかの性別の、および発生の任意の段階の、ヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、発生の任意の段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物としては、限定されないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または寄生虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、および／またはクローンであってもよい。
生体試料：本明細書で使用される場合、「生体試料」または「試料」という用語は、典型的には、本明細書に記載されるように、１つ以上の目的の生物源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られるか、あるいは目的の生物源に由来する試料を指す。一部の実施形態では、目的の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。他の実施形態では、目的の供給源は、細菌、ウイルス、原生動物または真菌などの微生物を含む。さらなる実施形態では、目的の供給源は、合成組織、生物、細胞培養物、核酸または他の物質であってもよい。さらにさらなる実施形態では、目的の供給源は、植物系生物であってもよい。さらに別の実施形態では、試料は、例えば、水試料、土壌試料、考古学試料、または非生物源から収集された他の試料などの環境試料であってもよい。他の実施形態では、試料は、多生物試料（例えば、混合生物試料）であってもよい。なおさらなる実施形態では、試料は、細胞混合物または組織混合物を含んでいてもよい。他の実施形態では、試料は、マルチキメラ生物または組織、移植組織またはマルチキメラ細胞培養物に由来してもよい。さらなる実施形態では、試料は、胎児ＤＮＡを含み得る。さらに他の実施形態では、試料は、犯罪現場または他の法執行の調査（例えば、加害者、被害者、または行方不明者を特定するためなどの法医学的ケースで）から収集され得る。他の実施形態では、試料は、戦争またはテロ調査または歴史的研究（例えば、犠牲者または行方不明者を特定するために）から収集されてもよい。他の実施形態では、試料は、考古学的研究から収集されてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、生体組織または生物流体であるか、あるいはそれを含む。一部の実施形態では、生体試料は、単離されたＤＮＡまたは他の核酸であってもよく、あるいは骨髄、血液、血球、幹細胞、腹水、組織試料、生検試料、または穿刺吸引試料、細胞を含有する体液、遊離浮遊核酸、タンパク質に結合した核酸、リボタンパク質に結合した核酸、痰、唾液、尿、脳脊髄液、腹腔液、胸水、糞便、リンパ液、婦人科系体液、皮膚スワブ、膣スワブ、パップスメア、口腔スワブ、鼻スワブ、導管洗浄または気管支肺泡洗浄などの洗液または洗浄液、膣液、吸引物、擦過物、骨髄標本、組織生検標本、胎児組織または体液、外科標本、糞便、他の体液、分泌液、および／または排泄物、ならびに／あるいはこれらからの細胞などを含んでいてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、得られる細胞は、試料が得られる個体由来の細胞であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、細胞小器官または小胞あるいはエクソソームなどの細胞誘導体。特定の実施形態では、生体試料は、対象から得られる液体生検である。一部の実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、一部の実施形態では、一次生体試料は、生検（例えば、穿刺吸引または組織生検）、手術、体液（例えば、血液（または血漿もしくは血清）、リンパ液、糞便など）の採取などからなる群から選択される方法によって得られる。一部の実施形態では、文脈から明らかになるように、「試料」という用語は、一次試料を処理することによって（例えば、その１つ以上の構成要素を除去することによって、かつ／または１つ以上の薬剤をそれに加えることによって）得られる調製物を指す。例えば、半透過性膜を使用して濾過すること。かかる「処理された試料」は、例えば、試料から抽出されるか、あるいは一次試料を、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、特定の構成要素の単離および／または精製などの技術に供することによって得られる、核酸またはタンパク質を含んでいてもよい。
癌疾患：一実施形態では、疾患または障害は、一般的に、転移し得る異常な細胞の調節障害性の増殖を特徴とするものとして、当業者によく知られている「癌疾患」である。本技術の１つ以上の態様を使用して検出可能な癌疾患は、非限定的な例として、中でも、前立腺癌（すなわち、腺癌、小細胞）、卵巣癌（例えば、卵巣腺癌、漿液性癌または胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、奇形腫）、肝臓癌（例えば、ＨＣＣまたは肝細胞腫、血管肉腫）、形質細胞腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、形質細胞腫、アミロイドーシス、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症）、大腸癌（例えば、結腸腺癌、結腸粘液腺癌、カルチノイド、リンパ腫および直腸腺癌、直腸扁平上皮癌）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病および慢性白血病、Ｔ細胞白血病、セザリー症候群、全身性肥満細胞症、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病の急性転化）、骨髄異形成症候群、リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯細胞リンパ腫、リヒタートランスフォーメーション、ダブルヒットリンパ腫、移植関連リンパ腫、ＣＮＳリンパ腫、節外性リンパ腫、ＨＩＶ関連リンパ腫、有毛細胞白血病、異型有毛細胞白血病、風土病性リンパ腫、バーキットリンパ腫、移植関連リンパ増殖性腫瘍およびリンパ球性リンパ腫など）、子宮頸癌（扁平上皮子宮頸癌、明細胞癌、ＨＰＶ関連癌腫、子宮頸部肉腫など）、食道癌（食道扁平上皮細胞癌、腺癌、特定のグレードのバレット食道、食道腺癌）、黒色腫（皮膚黒色腫、ブドウ膜黒色腫、四肢末端部黒色腫、無色素性黒色腫など）、ＣＮＳ腫瘍（例えば、乏突起膠腫、星状細胞腫、多形神経膠芽腫、髄膜腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫など）、膵臓癌（例えば、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、コロイド癌腫、島細胞癌、膵神経内分泌癌など）、消化管間質腫瘍、肉腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮腫肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫、紡錘細胞腫瘍など）、乳癌（例えば、炎症性癌、大葉性癌、乳管癌など）、ＥＲ陽性癌、ＨＥＲ－２陽性癌、膀胱癌（膀胱扁平上皮癌、膀胱小細胞癌、尿路上皮癌など）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌、ＨＰＶ関連扁平上皮細胞癌、鼻咽頭癌など）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、大細胞癌、気管支原性肺癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌など）、転移性癌、口腔癌、子宮癌（平滑筋肉腫、平滑筋腫など）、精巣癌（例えば、セミノーマ、非セミノーマおよび胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍など）、皮膚癌（例えば、扁平上皮細胞癌および基底細胞癌、メルケル細胞癌、黒色腫、Ｔ細胞リンパ腫など）、甲状腺癌（例えば、乳頭癌、髄様癌、甲状腺未分化癌など）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、上皮内癌、骨癌、胆道癌、眼癌、喉頭癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、ウイルムス腫瘍など）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、芽細胞腫（例えば、腎芽細胞腫、髄芽細胞腫、血管芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など）、骨髄増殖性腫瘍（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄線維症など）、脊索腫、滑膜腫、中皮腫、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、嚢胞腺癌、胆管癌、絨毛癌、上皮癌、上衣腫、松果体腫、聴神経腫、シュワン腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、小腸の癌、褐色細胞腫、小細胞肺癌、腹膜中皮腫、副甲状腺機能亢進性腺腫、副腎癌、原発不明癌、内分泌系の癌、陰茎の癌、尿道の癌、皮膚または眼内の黒色腫、婦人科腫瘍、小児の固形腫瘍、または中枢神経系の腫瘍、原発性縦隔胚細胞腫瘍、未確定の潜在能を有するクローン性造血、くすぶり型多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症、低グレードの癌、クローナルフィールド欠損（ｃｌｏｎａｌ ｆｉｅｌｄ ｄｅｆｅｃｔｓ）、前癌性腫瘍（ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）、尿管癌、自己免疫関連癌（すなわち、潰瘍性結腸炎、原発性硬化性胆管炎、セリアック病）、遺伝性素因と関連する癌（すなわち、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＡＴＭなどでの遺伝子欠陥を有するもの）、および様々な遺伝的症候群、例えば、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２トリソミー２１など）、および子宮内で化学物質に曝露されたときに生じるもの（すなわち、ジエチルスチルベストロール［ＤＥＳ］に曝露した女性の女性子孫における明細胞癌）、を含む。
保因者：本明細書で使用される場合、「保因者（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、目的のバリアントアレル（例えば、遺伝的バリアント、変異、多型などを有するアレル）を有する対象を指す。体細胞中の両方のアレル（すなわち、母方由来および父方由来）が遺伝的バリアントを含有する場合、ヒト対象または他の二倍体生物は、ホモ接合性保因者として特定され得るか、または１つのアレルのみが遺伝的バリアントを含む場合（例えば、２つのアレルが同じ配列を有しない場合）、ヘテロ接合性保因者として特定され得る。ヒト対象または他の二倍体生物は、複合ヘテロ接合体として特定することができ、２つのアレルは各々、参照配列のものとは異なり、さらに互いに異なる遺伝的バリアントを有する。一部の実施形態では、特定のバリアントの機能的結果（すなわち、劣性）に応じて、「保因者」という用語は、ヘテロ接合状態のみを指すのにより一般的に使用されてもよく、ホモ接合体は、１つのアレルのみとは対照的に、「罹患している」または「疾患を有する」または「形質を有する」と称される。他の実施形態（優性遺伝性疾患など）では、ヘテロ接合性の対象は、保因者として説明されるのとは対照的に、より一般的には、「罹患している」または「疾患を有する」または「形質を有する」と呼ばれ得る。当業者は、この用語の一般的な使用または受け入れられている科学的または臨床的な使用は、状況によって異なる場合があり、もっぱら上記の定義に限定されないことを認識するであろう。非二倍体生物の場合、異数性、ヘテロ接合性の喪失、および１つのアレルのエピジェネティックサイレンシングまたは活性化（すなわち、Ｘ染色体不活性化（ｌｙｏｎｉｚａｔｉｏｎ））、ならびに他の固有の生物学的状況は、用語の異なる用法の潜在的な基礎として当業者によって認識されるであろう。
決定：本明細書に記載の多くの方法論は、「決定する」ステップを含む。当業者は、本明細書を読むと、かかる「決定する」ことが、例えば本明細書に明示的に言及される特定の技術を含め、当業者が利用可能な様々な技術のいずれかの使用を通して利用され得るか、または達成され得ることを理解するだろう。一部の実施形態では、決定することは、物理的な試料の操作を伴う。一部の実施形態では、決定することは、例えば、関連する分析を行うように適合されたコンピュータまたは他の処理ユニットを利用した、データまたは情報の検討および／または操作を伴う。一部の実施形態では、決定することは、供給源から関連情報および／または資料を受信することを伴う。一部の実施形態では、決定することは、試料またはエンティティの１つ以上の特徴を、比較可能な参照データベース、または、試験中のゲノムの他の場所の参照試料または参照領域の特徴と比較することを伴う。
デュプレックス配列決定（ＤＳ）：本明細書で使用される場合、「デュプレックス配列決定（Ｄｕｐｌｅｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＤＳ）」は、その最も広い意味で、個々のＤＮＡ分子、最も一般的には、二本鎖核酸分子の両方の鎖からの配列を比較することによって卓越した精度を達成する、タグに基づくエラー修正方法を指す。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成および／または３’末端形成による）、（３）ＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、および／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の生成物をコードする配列）を含み、一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、エクソン性）配列および非コード（例えば、イントロン性）配列の両方を含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１つ以上の様相（例えば、細胞型特異的発現、誘導性発現など）を制御し得るか、またはそれに影響を与え得る１つ以上の調節要素を含んでいてもよい。
相同性：本明細書で使用される場合、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、高分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「相同」であると見なされる。当業者に理解されるように、異なる配列においてどの残基が互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」かを考慮する場合、ある配列の指定された長さのギャップを別の配列に対して許容することを含め、それらの相同性の程度を決定するために配列の比較を可能にする様々なアルゴリズムが利用可能である。２つの核酸配列間の相同性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適な整列のために第１の核酸配列および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非対応配列を無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置で、ヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一であり、第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と類似のヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において類似する。２つの配列間の相同性パーセントは、ギャップの数、および２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一および類似の位置の数の関数である。２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントを決定するのに有用なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。一部の実施形態では、「相同性」は、２つの異なるコード配列間で産生されるポリペプチドの関連性の程度、または２つ以上の核酸配列によってコードされるタンパク質もしくはリボザイムもしくはアプタマーの構造的な関連性の程度を指してもよく、当業者によって理解されるであろう。
変異：本明細書で使用される場合、「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、核酸の配列または構造の変化を指す。ポリヌクレオチド配列に対する変異は、複雑な複数ヌクレオチド変化の中でも、試料中の点変異（例えば、単一塩基変異、ＳＮＰ、ＳＮＶ）、複数ヌクレオチドの変異（ＭＮＰ、ＭＮＶ）、ヌクレオチドの欠失、配列再編成、ヌクレオチドの挿入およびＤＮＡ配列の重複、逆位を含み得る。変異は、相補的な塩基の変化（すなわち、真の変異）として、または一方の鎖にはあるが、他方の鎖にはない変異（すなわち、ヘテロ二重鎖）として、二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）ＤＮＡ分子の両方の鎖上で起きてもよく、修復されるか、破壊されるか、または誤って修復されるか／真の二本鎖変異へと変換されるかのいずれかの可能性を有する。変異は、同じまたは関連する供給源および／または個体もしくは別の個体または試料からの対照試料と比較した変化を表し得る。変異は、参照配列に対する変化を表し得る。
非癌性疾患：別の実施形態では、疾患または障害は、ゲノムの変異または損傷によって引き起こされる、またはそれが寄与する非癌性疾患である。非限定的な例として、本技術の１つ以上の態様を使用して検出可能なかかる非癌型の疾患または障害には、多くの他の多因子遺伝性障害（例えば、環境要因によってより容易に誘発される傾向）の中で、特定の形態の遺伝性代謝障害、嚢胞性線維症、ヘモグロビン異常症、筋ジストロフィー、地中海貧血症、ポルフィリン症、肥大型心筋症、ならびに糖尿病、自己免疫疾患または障害、不妊症、神経変性、心血管疾患、アルツハイマー病／認知症、肥満、心臓病、高血圧、関節炎、精神疾患、他の神経障害が含まれる。当業者に経験されるように、一部の非癌性疾患は、既知の関連する遺伝的成分を有しない。
核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含み、一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、１つ以上の天然核酸残基を含むか、または１つ以上の天然核酸残基からなる。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、１つ以上の核酸類似体を含むか、または１つ以上の核酸類似体からなる。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点において核酸と異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、１つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、または１つ以上の「ペプチド核酸」からなり、骨格内のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、当該技術分野で既知であり、本技術の範囲内であると見なされる。代替的または追加的に、一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）であるか、１つ以上の天然ヌクレオシドを含むか、または１つ以上の天然ヌクレオシドからなる。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニルシチジン、Ｃ－５プロピニルウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、およびこれらの組み合わせ）であるか、１つ以上のヌクレオシド類似体を含むか、または１つ以上のヌクレオシド類似体からなる。一部の実施形態では、核酸は、天然核酸中の糖類と比較して、１つ以上の修飾された糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロで）、組換え細胞または系における複製および化学合成のうちの１つ以上によって調製される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれを超える残基長である。一部の実施形態では、核酸は、部分的または完全に一本鎖であり、一部の実施形態では、核酸は、部分的または完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、二次構造を有する分枝鎖であってもよい。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。一部の実施形態では、核酸は、例えば、リボ核酸タンパク質複合体またはトランスファーＲＮＡにおいて、機械的な機能を果たす。
ポリヌクレオチド損傷：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド損傷」または「核酸損傷」という用語は、対象のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に対する損傷（「ＤＮＡ損傷」）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列に対する損傷（「ＲＮＡ損傷」）を指し、薬剤またはプロセスによって、直接的もしくは間接的に引き起こされる（例えば、代謝物、または損傷性もしくは変異原性であるプロセスの誘発）。損傷した核酸は、対象における疾患または障害の発症を引き起こす場合がある。ポリヌクレオチド損傷は、細胞におけるＤＮＡの化学的および／または物理的な修飾をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、損傷は、非限定的な例として、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二本鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱からの損傷、乾燥からの損傷、ＵＶ曝露からの損傷、γ線からの損傷、Ｘ線からの損傷、電離放射線からの損傷、非電離放射線からの損傷、重粒子放射線からの損傷、核崩壊からの損傷、ベータ放射線からの損傷、アルファ放射線からの損傷、中性子放射線からの損傷、陽子放射線からの損傷、反物質からの損傷、宇宙放射線からの損傷、高ｐＨからの損傷、低ｐＨからの損傷、活性酸化種からの損傷、フリーラジカルからの損傷、過酸化物からの損傷、次亜塩素酸塩からの損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定からの損傷、反応性鉄からの損傷、低イオン状態からの損傷、高イオン状態からの損傷、無緩衝状態からの損傷、ヌクレアーゼからの損傷、環境曝露からの損傷、火災からの損傷、機械的ストレスからの損傷、酵素分解からの損傷、微生物からの損傷、調製の機械的剪断からの損傷、調製の酵素断片化からの損傷、インビボで自然発生した損傷、核酸抽出中に発生した損傷、配列決定ライブラリ調製中に発生した損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸修復中に導入された損傷、核酸の末端テーリング中に発生した損傷、核酸ライゲーション中に発生した損傷、配列決定中に発生した損傷、ＤＮＡの機械的取り扱いから発生した損傷、ナノポアを通過中に発生した損傷、生物における老化の一部として発生した損傷、個体の化学物質曝露の結果として発生した損傷、変異原によって生じた損傷、発癌物質によって生じた損傷、染色体切断物質によって発生した損傷、酸素曝露によるインビボでの炎症性損傷から生じた損傷、１つ以上の鎖切断による損傷、のうちの少なくとも１つ、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。
参照：本明細書で使用される場合、「参照」という用語は、比較が行われる標準または対照を指す。例えば、一部の実施形態では、目的の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値が、ある場所に存在し得るかまたは電子手段を介して遠隔的にアクセスし得る物理的またはコンピュータのデータベースにおいて、参照または対照の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値、もしくはこれらの代表と、比較される。一実施形態では、参照は、参照ゲノムまたは参照ゲノムアセンブリである。一部の実施形態では、参照または対照は、目的の試験もしくは決定と実質的に同時に試験され、かつ／または決定される。一部の実施形態では、参照または対照は、歴史的な参照または対照であり、任意選択的に、有形媒体で具現化される。典型的には、当業者に理解されるように、参照または対照は、評価されるものと同等の条件もしくは状況下で決定されるか、または特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照もしくは対照に対する信頼および／または比較を正当化するのに十分な類似性がいつ存在するかを理解するだろう。「参照試料」は、試験対象とは異なり、比較される試料と同じ方法で単離される対象からの試料を指す。参照試料の対象は、試験対象とは遺伝的に同一であってもよく、または異なっていてもよい。
単一分子識別子（ＳＭＩ）：本明細書で使用される場合、「単一分子識別子（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」または「ＳＭＩ」という用語（特に、「タグ」、「バーコード」、「分子バーコード」、「固有分子識別子」すなわち「ＵＭＩ」と呼ばれてもよい）は、より大きな異種の分子集団の間で個々の分子を実質的に区別することが可能な任意の物質（例えば、ヌクレオチド配列、核酸分子特徴）を指す。一部の実施形態では、ＳＭＩは、外因的に適用されるＳＭＩであってもよいか、または外因的に適用されるＳＭＩを含んでいてもよい。一部の実施形態では、外因的に適用されるＳＭＩは、縮重または半縮重した配列であってもよいか、または縮重または半縮重プライマー配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、実質的に縮重したＳＭＩは、ランダムな固有分子識別子（Ｒ－ＵＭＩ）として知られている場合がある。一部の実施形態では、ＳＭＩは、既知のコードのプール内からのコード（例えば、核酸配列）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、所定のＳＭＩコードは、定義された固有分子識別子（Ｄ－ＵＭＩ）として知られている。一部の実施形態では、ＳＭＩは、内因性ＳＭＩであってもよいか、または内因性ＳＭＩを含んでいてもよい。一部の実施形態では、内因性ＳＭＩは、標的配列の特定の剪断点、標的配列を含む個々の分子の末端に関連する特徴、または個々の分子の一端にあるか、個々の分子の一端に隣接するか、もしくは個々の分子の一端から既知の距離内の特定の配列に関連する情報であってもよいか、またはこれらの情報を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、核酸分子に対する無作為または半無作為な損傷、化学修飾、酵素修飾、または他の修飾に起因する、核酸分子における配列バリエーションに関連するものであってもよい。一部の実施形態では、修飾は、メチルシトシンの脱アミノ化であってもよい。一部の実施形態では、修飾は、核酸ニックの部位を伴っていてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、外因性の要素と内因性の要素の両方を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、物理的に隣接するＳＭＩ要素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩ要素は、分子内で空間的に明確に異なってもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、非核酸であってもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、２つ以上の異なる種類のＳＭＩ情報を含んでいてもよい。ＳＭＩの様々な実施形態は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
鎖定義要素（ＳＤＥ）：本明細書で使用される場合、「鎖定義要素」または「ＳＤＥ」という用語は、二本鎖核酸物質の特定の鎖の識別を可能にし、したがって、他の／相補鎖からの区別を可能にする任意の物質（例えば、配列決定または他の核酸照合の後に、標的二本鎖核酸から得られる２つの一本鎖核酸の各々の増幅産物を、実質的に互いに区別可能にする任意の物質）を指す。一部の実施形態では、ＳＤＥは、アダプタ配列中の実質的に非相補的な配列の１つ以上のセグメントであってもよいか、またはこのセグメントを含んでいてもよい。特定の実施形態では、アダプタ配列中の実質的に非相補的な配列のセグメントは、Ｙ字型または「ループ」形状を含むアダプタ分子によって提供されてもよい。他の実施形態では、アダプタ配列中の実質的に非相補的な配列のセグメントは、アダプタ配列中の隣接する相補的な配列の中央に、対になっていない「バブル」を形成してもよい。他の実施形態では、ＳＤＥは、核酸修飾を包含してもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、対になった鎖の、物理的に分離した反応コンパートメントへの、物理的な分離を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、化学修飾を含んでもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、修飾された核酸であってもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、核酸分子に対する無作為または半無作為な損傷、化学修飾、酵素修飾、または他の修飾に起因する、核酸分子における配列バリエーションに関連するものであってもよい。一部の実施形態では、修飾は、メチルシトシンの脱アミノ化であってもよい。一部の実施形態では、修飾は、核酸ニックの部位を伴っていてもよい。ＳＤＥの様々な実施形態は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、典型的には、哺乳動物、例えば、ヒト（一部の実施形態では、出生前のヒト形態を含む）、非ヒト動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物、限定されないが、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、カワウソ、ヌー、ウマ、羊、イヌ、ウシ、ブタ、ニワトリ、両生類、爬虫類、海洋生物、他のモデル生物、例えば、虫、ハエ、ゼブラフィッシュなど）、およびトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックげっ歯類）などを指す。一部の実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、状態に罹患している。一部の実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態にかかりやすい。一部の実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、１つ以上の症状または特徴を示す。一部の実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、症状または特徴を何ら示さない。一部の実施形態では、対象は、ある疾患、障害もしくは状態になりやすさ、またはある疾患、障害もしくは状態のリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する。一部の実施形態では、対象は、診断および／または治療が実施されるか、および／または実施された個体である。さらに他の実施形態では、対象は、任意の生きた生物源または他の核酸物質、例えば、生物、細胞および／または組織、インビボ試験用のものなど、例えば、真菌、原生動物、細菌、古細菌、ウイルス、培養物中の単離された細胞、意図的に（例えば、幹細胞移植、臓器移植）または非意図的に（すなわち、胎児または母体のマイクロキメリズム）または単離された核酸もしくはオルガネラ（すなわち、ミトコンドリア、葉緑体、遊離ウイルスゲノム、遊離プラスミド、アプタマー、リボザイム、または核酸の誘導体または前駆体（すなわち、オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド三リン酸など）を指す。さらなる実施形態では、対象は、任意の生きたまたはかつて生きていた生物源、あるいは法医学的な調査または適用で得られた他の核酸物質を指す。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または性質の全体もしくはほぼ全体の程度または度合いを示す定性的な状態を指す。生物学の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、完全に終了すること、および／または完全に終了することに向けて進むこと、または絶対的な結果を達成するか、または回避することは、もしあるとしてもまれであることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象および化学的現象に内在する潜在的に完全に終了することはないことを捕捉するために本明細書で使用される。
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、参照エンティティと有意な構造同一性を示すが、参照エンティティと比較して、１つ以上の化学部分の存在またはレベルが、参照エンティティと構造的に異なるエンティティを指す。核酸のコンテキストにおいて、バリアント核酸は、線形または三次元空間中の別の核酸に対して、指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基からなる特徴的な配列要素を有し得る。例えば、バリアントポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、核酸配列の１つ以上の差異の結果として、参照ポリヌクレオチドと異なる場合がある。一部の実施形態では、バリアントポリヌクレオチド配列は、別の配列（例えば、試料中の参照配列または他のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）配列）に対する挿入、欠失、置換または変異を含む。
バリアント頻度：本明細書で使用される場合、「バリアント頻度」という用語は、集団における特定の遺伝子座での遺伝的バリアントの相対的な頻度を指し、集団の割合またはパーセンテージとして表される。
バリアントアレル頻度本明細書で使用される場合、「バリアントアレル頻度」という用語は、集団中の特定の遺伝子座でのアレル（遺伝子または他の配列のバリアント）の相対頻度を指す（例えば、そのアレルを担持する集団中のすべての染色体の割合）。
ＩＩ．デュプレックス配列決定方法ならびに関連するアダプタおよび試薬の選択された実施形態
デュプレックス配列決定は、二本鎖核酸分子からエラー修正ＤＮＡ配列を生成するための方法であり、元々、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１４２３８９号および米国特許第９，７５２，１８８号および第ＷＯ２０１７／１００４４１号、Ｓｃｈｍｉｔｔら、ＰＮＡＳ、２０１２［１］、Ｋｅｎｎｅｄｙら、ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１３［２］、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１４［３］、およびＳｃｈｍｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５［４］に記載された。上述の特許、特許出願および刊行物は各々、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。図１Ａ～図１Ｃに示されるように、本技術の特定の態様では、デュプレックス配列決定を使用して、個々のＤＮＡ分子の両方の鎖を独立して配列決定することができ、その結果、大規模並列配列決定（ＭＰＳ）（一般的に次世代配列決定（ＮＧＳ）としても知られる）中に、誘導体配列リードを、同じ二本鎖核酸親分子に由来するものとして認識することができるだけではなく、配列決定後に区別可能なエンティティとして互いに区別できるようになる。次いで、各鎖から得られる配列リードを、二本鎖コンセンサス配列（ＤＣＳ）として知られる元の二本鎖核酸分子のエラー修正配列を得る目的のために比較する。デュプレックス配列決定のプロセスは、元の二本鎖核酸分子の両方の鎖が、ＤＣＳを形成するために使用される生成された配列決定データ中に表されることを、明示的に確認することを可能にする。
特定の実施形態では、ＤＳを組み込む方法は、１つ以上の配列決定アダプタを、第１の鎖の標的核酸配列と第２の鎖の標的核酸配列とを含む標的二本鎖核酸分子にライゲーションして、二本鎖標的核酸複合体を生成することを含んでいてもよい（例えば、図１Ａ）。
様々な実施形態では、得られる標的核酸複合体は、少なくとも１つのＳＭＩ配列を含んでいてもよく、外因的に適用される縮重または半縮重配列（例えば、図１Ａに示されるランダム化された二重鎖タグ、図１Ａで、αおよびβとして特定された配列）、標的二本鎖核酸分子の特定の剪断点に関連する内因的な情報、またはこれらの組み合わせを伴っていてもよい。ＳＭＩは、標的核酸分子を、いずれか単独で、またはそれらがライゲーションされた核酸断片の要素を区別することと組み合わせて、配列決定される集団の中の複数の他の分子から実質的に区別可能にすることができる。ＳＭＩ要素の実質的に区別可能な特徴は、二本鎖核酸分子を形成する各々の一本鎖によって独立して保有されてもよく、各々の鎖の誘導体増幅産物が、配列決定後に同じ元の実質的に固有の二本鎖核酸分子に由来するものであると認識され得る。他の実施形態では、ＳＭＩは、さらなる情報を含んでいてもよく、かつ／または上に引用した刊行物に記載されるものなど、機能性を区別するかかる分子が有用である他の方法において使用されてもよい。別の実施形態では、ＳＭＩ要素は、アダプタライゲーションの後に組み込まれてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、本質的に二本鎖である。他の実施形態では、ＳＭＩは、本質的に一本鎖である（例えば、ＳＭＩは、アダプタの一本鎖部分上にあってもよい）。他の実施形態では、ＳＭＩは、本質的に一本鎖と二本鎖の組み合わせである。
一部の実施形態では、各二本鎖標的核酸配列複合体は、さらに、標的二本鎖核酸分子を形成する２つの一本鎖核酸の増幅産物を、配列決定後に互いに実質的に区別可能にする要素（例えば、ＳＤＥ）を含んでいてもよい。一実施形態では、ＳＤＥは、配列決定アダプタ内に含まれる非対称プライマー部位を含んでいてもよいか、または他の配置において、配列非対称を、プライマー配列内ではなくアダプタ分子内に導入してもよく、その結果、第１の鎖の標的核酸配列複合体と第２の鎖の標的核酸配列複合体のヌクレオチド配列の少なくとも一部が、増幅および配列決定の後に互いに異なっている。他の実施形態では、ＳＭＩは、標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチド配列Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは異なるが、２つの増幅され配列決定された分子における少なくとも１つの標準的ヌクレオチド配列の差に変換される、２つの鎖間の別の生化学的非対称を含んでいてもよい。さらに別の実施形態では、ＳＤＥは、増幅前に２つの鎖を物理的に分離する手段であってもよく、その結果、第１の鎖の標的核酸配列および第２の鎖の標的核酸配列からの誘導体増幅産物は、これら２つの配列間の区別を維持する目的のために、互いに実質的に物理的に単離された状態を維持する。上述の第１の鎖と第２の鎖とを区別することを可能にするＳＤＥ機能を提供するための他のかかる配置および方法論、例えば、上に引用した刊行物に記載されるもの、または記載した機能目的を果たす他の方法を利用してもよい。
少なくとも１つのＳＭＩと少なくとも１つのＳＤＥとを含む二本鎖標的核酸複合体を生成した後、またはこれらの要素の片方または両方がその後に導入される場合に、複合体は、ＤＮＡ増幅（例えばＰＣＲを用いる）またはＤＮＡ増幅の任意の他の生化学的方法（例えば、ローリングサークル増幅、複数置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅または表面結合増幅）が行われてもよく、その結果、第１の鎖の標的核酸配列の１つ以上のコピーおよび第２の鎖の標的核酸配列の１つ以上のコピーが産生される（例えば、図１Ｂ）。次いで、第１の鎖標的核酸分子の１つ以上の増幅コピーおよび第２の標的核酸分子の１つ以上の増幅コピーに、好ましくは、「次世代の」大規模並列ＤＮＡ配列決定プラットフォームを用いて、ＤＮＡ配列決定を行う（例えば、図１Ｂ）。
元の二本鎖標的核酸分子に由来する第１の鎖の標的核酸分子および第２の鎖の標的核酸分子のいずれかから生成される配列リードは、関連する実質的に固有なＳＭＩを共有していることに基づいて特定され、ＳＤＥによって逆鎖の標的核酸分子から区別されてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、数学に基づくエラー修正コード（例えば、ハミングコード）に基づく配列であってもよく、それにより、特定の増幅エラー、配列決定エラーまたはＳＭＩ合成エラーは、元のデュプレックス（例えば、二本鎖核酸分子）の相補鎖に対してＳＭＩ配列の配列を関連付ける目的のために許容され得る。例えば、二本鎖外因性ＳＭＩで、ＳＭＩが標準的ＤＮＡ塩基の完全に縮重した配列の１５塩基対を含む場合、推定で４の１５乗＝１，０７３，７４１，８２４のＳＭＩバリアントが、完全に縮重したＳＭＩの集団中に存在する。２つのＳＭＩが、１０，０００個のサンプリングされたＳＭＩの集団からのＳＭＩ配列内で１個のヌクレオチドのみが異なる配列決定データのリードから回収される場合、これが偶然に発生する確率を数学的に計算することができ、この単一塩基対の違いが、上述のタイプのエラーの１つを反映していることがより確からしいかどうかの決定を行い、そのＳＭＩ配列が、実際に同じ元の二重鎖分子に由来していたことを決定することができる。ＳＭＩが少なくとも部分的に外因的に適用される配列であり、その配列バリアントが互いに完全に縮重したものではなく、少なくとも部分的には既知の配列である一部の実施形態では、その既知の配列の同一性は、一部の実施形態では、上述のタイプの１つ以上のエラーが、ある既知のＳＭＩ配列の同一性を別のＳＭＩ配列の同一性へと変換しないように設計することができ、その結果、あるＳＭＩが別のＳＭＩであると誤って解釈されてしまう確率は減少する。一部の実施形態では、このＳＭＩ設計戦略は、ハミング符号手法またはその誘導体を含む。特定されたら、第１の鎖の標的核酸分子から作られる１つ以上の配列リードを、第２の鎖の標的核酸分子から作られる１つ以上の配列リードと比較して、エラー修正標的核酸分子配列を生成する（例えば、図１Ｃ）。例えば、第１の鎖標的核酸配列と第２の鎖標的核酸配列の両方からの塩基が一致するヌクレオチド位置は、真の配列であるとみなされ、一方、この２つの鎖間で一致しないヌクレオチド位置は、技術的なエラーの可能性がある部位と認識され、この部位は、考慮に入れられないか、除外されるか、修正されるか、または別の状況で識別されてもよい。このようにして、元の二本鎖標的核酸分子のエラー修正配列を生成することができる（図１Ｃに示される）。一部の実施形態では、第１の鎖の標的核酸分子および第２の鎖の標的核酸分子から生成される各々の配列決定リードを別個にグループ化した後、第１の鎖および第２の鎖各々について一本鎖コンセンサス配列を生成することができる。次いで、第１の鎖の標的核酸分子および第２の鎖の標的核酸分子に由来する一本鎖コンセンサス配列を比較して、エラー修正標的核酸分子配列を生成することができる（例えば、図１Ｃ）。
代わりに、一部の実施形態では、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、元の二本鎖標的核酸分子において、生物学的に由来するミスマッチの可能性がある部位として認識することができる。代わりに、一部の実施形態では、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、元の二本鎖標的核酸分子において、ＤＮＡ合成に由来するミスマッチの可能性がある部位として認識することができる。代わりに、一部の実施形態では、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、損傷を受けたか、あるいは修飾されたヌクレオチド塩基が、片方または両方の鎖に存在し、酵素プロセス（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼまたは別の核酸修飾酵素または化学プロセス）によってミスマッチに変換された可能性がある部位として認識することができる。一部の実施形態では、この後者の知見を使用して、酵素プロセスまたは化学的処置の前の核酸損傷またはヌクレオチド修飾の存在を推測することができる。
一部の実施形態では、本技術の態様に従い、本明細書に記載するデュプレックス配列決定ステップから生成される配列決定リードをさらにフィルタリングして、ＤＮＡ損傷分子（例えば、貯蔵、運搬中に、組織または血液の抽出中または抽出後に、ライブライリー調製中または調製後に損傷したなど）からの配列決定リードを除外することができる。例えば、ＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）および８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）を利用して、ＤＮＡ損傷（例えば、インビトロでのＤＮＡ損傷またはインビボでの損傷）を除外するか、または修正することができる。これらのＤＮＡ修復酵素は、例えば、ＤＮＡから損傷した塩基を除去するグリコシラーゼである。例えば、ＵＤＧは、（シトシンの自発的な加水分解によって生じる）シトシンの脱アミノ化から得られるウラシルを除去し、ＦＰＧは、８－オキソ－グアニン（例えば、活性酸素種から得られる一般的なＤＮＡ損傷）を除去する。ＦＰＧは、リアーゼ活性も有し、脱塩基部位に１塩基ギャップを生成することができる。かかる脱塩基部位は、例えば、ポリメラーゼがテンプレートをコピーすることができないため、一般的に、その後にＰＣＲによって増幅することができない。したがって、かかるＤＮＡ損傷修復／除外酵素の使用は、真の変異を有していないが、配列決定および二重鎖配列（ｄｕｐｌｅｘ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）分析の後に別の状況でエラーとして検出されない可能性がある損傷ＤＮＡを効果的に除外することができる。損傷した塩基によるエラーは、デュプレックス配列決定によって多くは修正することができるが、まれに、相補的エラーが、両方の鎖上の同じ位置に起こることが理論的にあり得るため、エラーを増やす損傷を減少させることによって、アーチファクトの確率を減少させることができる。さらに、ライブラリ調製中、配列決定されるＤＮＡの特定の断片は、その供給源から、または処理ステップ（例えば、機械的なＤＮＡ剪断）から一本鎖であってもよい。これらの領域は、典型的には、当該技術分野で知られる「末端修復」ステップ中に二本鎖ＤＮＡに変換され、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド基質が、ＤＮＡ試料に添加されて、５’陥凹末端を延長する。コピーされるＤＮＡの一本鎖部分におけるＤＮＡ損傷の変異誘発性部位（すなわち、ＤＮＡ二重鎖の片方または両方の末端にある一本鎖５’オーバーハングまたは内部の一本鎖ニックまたはギャップ）は、末端平滑化反応中にエラーを生じる場合があり、一本鎖変異、合成エラーまたは核酸損傷部位を二本鎖形態にして、最終的な二重鎖コンセンサス配列において真の変異であると誤って解釈される場合があり、真の変異が元の二本鎖核酸分子内に実際には存在しなかった場合に、存在したと誤って解釈される場合がある。この状況は、「偽の二重鎖」と呼ばれ、かかる損傷を破壊／修復する酵素の使用によって減少させることができ、または防ぐことができる。他の実施形態では、この発生は、元の二重鎖分子の一本鎖部分が生成するのを破壊するか、または防ぐための戦略の使用を通して低減、または除外することができる（例えば、ニックまたはギャップが残る可能性がある機械的剪断または特定の他の酵素ではなく、元の二本鎖核酸物質を断片化するために使用される特定の酵素の使用）。他の実施形態では、元の二本鎖核酸の一本鎖部分を除外するためのプロセス（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼまたはマングビーンヌクレアーゼなどの一本鎖特異的ヌクレアーゼ）の使用を、同様の目的で利用することができる。
さらなる実施形態では、本明細書に記載のデュプレックス配列決定ステップから生成される配列決定リードをさらにフィルタリングして、偽二重鎖のアーチファクトに最もなりやすいリードの末端をトリミングすることによって、偽の変異を除外することができる。例えば、ＤＮＡ断片化は、二本鎖分子の末端に一本鎖部分を生成することができる。これらの一本鎖部分は、末端修復中に末端平滑化されてもよい（例えば、ポリメラーゼによって）。一部の例では、ポリメラーゼは、これらの末端修復した領域においてコピーの誤りを起こし、「偽の二重鎖分子」の生成を引き起こす。ライブラリ調製のこれらのアーチファクトは、配列決定されたときに真の変異であると誤って見えてしまう場合がある。これらの末端修復機構の結果としてのエラーは、より高いリスクを有する領域で生じる可能性がある変異を除外するために配列決定リードの末端をトリミングすることによって、配列決定後の分析から除外することができるか、または減少させることができ、それにより、偽の変異の数を減少させることができる。一実施形態では、配列決定リードのかかるトリミングは、自動的に達成することができる（例えば、通常の処理ステップ）。別の実施形態では、変異頻度は、断片末端領域について評価することができ、変異の閾値レベルが断片末端領域で観察される場合、ＤＮＡ断片の二本鎖コンセンサス配列リードを生成する前に、配列決定リードのトリミングを行ってもよい。
具体例として、一部の実施形態では、本明細書では、二本鎖標的核酸物質のエラー修正配列リードを生成する方法が提供され、二本鎖標的核酸物質を、少なくとも１つのアダプタ配列にライゲーションして、アダプタ－標的核酸物質複合体を形成するステップを含み、ここで、少なくとも１つのアダプタ配列は、（ａ）二本鎖標的核酸物質の各分子を固有に標識する縮重または半縮重した単一分子識別子（ＳＭＩ）配列と、（ｂ）アダプタ－標的核酸物質複合体の各鎖が、その相補鎖に対して明確に特定可能なヌクレオチド配列を有するように、アダプタ－標的核酸物質複合体の第１の鎖をタグ付けする第１のヌクレオチドアダプタ配列、およびアダプタ－標的核酸物質複合体の第２の鎖をタグ付けする第１のヌクレオチド配列と少なくとも部分的に相補的な第２のヌクレオチドアダプタ配列と、を含む。次に、本方法は、アダプタ－標的核酸物質複合体の各鎖を増幅して、複数の第１の鎖のアダプタ－標的核酸複合体アンプリコン、および複数の第２の鎖のアダプタ－標的核酸複合体アンプリコンを生成するステップを含んでいてもよい。本方法は、さらに、その第１の鎖および第２の鎖の両方を増幅して、第１の核酸産物および第２の核酸産物を提供するステップを含んでいてもよい。本方法はまた、第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定して、複数の第１の鎖の配列リードおよび複数の第２の鎖の配列リードを生成するステップと、少なくとも１つの第１の鎖の配列リードおよび少なくとも１つの第２の鎖の配列リードの存在を確認するステップと、を含んでいてもよい。本方法は、さらに、少なくとも１つの第１の鎖の配列リードと少なくとも１つの第２の鎖の配列リードとを比較することと、一致しないヌクレオチド位置を考慮しないことによって、二本鎖標的核酸物質のエラー修正配列リードを生成すること、または代わりに、比較された第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードが非相補的な１つ以上のヌクレオチド位置を有する、比較された第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードを除去することとを含んでいてもよい。
さらなる具体例として、一部の実施形態では、本明細書では、試料からＤＮＡバリアントを特定する方法が提供され、核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）の両方の鎖を、少なくとも１つの非対称アダプタ分子にライゲーションして、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第１の鎖（例えば、上鎖）に関連付けられた第１のヌクレオチド配列と、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第２の鎖（例えば、下鎖）に関連付けられた第１のヌクレオチド配列に少なくとも部分的に非相補的な第２のヌクレオチド配列と、を有するアダプタ－標的核酸物質複合体を形成するステップと、アダプタ－標的核酸物質の各鎖を増幅するステップとを含み、各々の鎖において、増幅されたアダプタ－標的核酸産物の別個でしかも関連したセットを生成する。本方法は、さらに、複数の第１の鎖のアダプタ－標的核酸産物および複数の第２の鎖のアダプタ－標的核酸産物の各々を配列決定するステップと、アダプタ－標的核酸物質複合体の各鎖からの少なくとも１つの増幅された配列リードの存在を確認するステップと、第１の鎖から得られた少なくとも１つの増幅された配列リードと、第２の鎖から得られた少なくとも１つの増幅された配列リードとを比較して、核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）の両方の鎖の配列が一致しているヌクレオチド塩基のみを有する核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）のコンセンサス配列リードを形成するステップと、を含むことができ、その結果、コンセンサス配列リード中の特定の位置で生じるバリアント（例えば、参照配列と比較して）が、真のＤＮＡバリアントとして特定される。
一部の実施形態では、本明細書では、二本鎖核酸物質から高精度のコンセンサス配列を生成する方法が提供され、個々の二重鎖ＤＮＡ分子をアダプタ分子でタグ付けして、タグ付けＤＮＡ物質を形成するステップであって、各アダプタ分子は、（ａ）二重鎖ＤＮＡ分子を固有に標識する縮重または半縮重した単一分子識別子（ＳＭＩ）、および（ｂ）各々のタグ付けＤＮＡ分子について、タグ付けＤＮＡ物質内の各々の個々のＤＮＡ分子の元の下鎖から、元の上鎖を区別する第１および第２の非相補的ヌクレオチドアダプタ配列、を含む、タグ付けＤＮＡ物質を形成するステップと、タグ付けＤＮＡ分子の元の上鎖の複製のセットおよびタグ付けＤＮＡ分子の元の下鎖の複製のセットを生成して、増幅されたＤＮＡ物質を形成するステップと、を含む。本方法は、さらに、元の上鎖の重複からの第１の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）および元の下鎖の重複からの第２の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）を作成するステップと、元の上鎖の第１のＳＳＣＳと、元の下鎖の第２のＳＳＣＳとを比較するステップと、元の上鎖の第１のＳＳＣＳおよび元の下鎖の第２のＳＳＣＳの両方の配列が相補的であるヌクレオチド塩基のみを有する高度に正確なコンセンサス配列を生成するステップとを含んでいてもよい。
さらなる実施形態では、本明細書では、二本鎖標的ＤＮＡ分子を含む複数のプールされた試料から、ＤＮＡの変異および／またはバリアントを検出および／または定量する方法が提供され、本方法は、各二本鎖標的ＤＮＡ分子の両方の鎖を少なくとも１つの非対称アダプタ分子にライゲーションして、複数のアダプタ－標的ＤＮＡ複合体を形成するステップであって、各アダプタ－標的ＤＮＡ複合体は、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第１の鎖と関連付けられた第１のヌクレオチド配列と、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第２の鎖と関連付けられた第１のヌクレオチドに少なくとも部分的に非相補的な第２のヌクレオチド配列とを有する、ステップと、各々のアダプタ標的ＤＮＡ複合体について、アダプタ標的ＤＮＡ複合体の各鎖を増幅するステップとを含み、その結果、それぞれの鎖において、増幅されたアダプタ標的ＤＮＡアンプリコンの別個でしかも関連するセットが生成される。本方法は、さらに、複数の第１の鎖のアダプタ－標的ＤＮＡアンプリコンおよび複数の第２の鎖のアダプタ－標的ＤＮＡアンプリコンの各々を配列決定するステップと、アダプタ－標的ＤＮＡ複合体の各鎖から少なくとも１つの配列リードの存在を確認するステップと、第１の鎖から得られた少なくとも１つの配列リードと第２の鎖から得られた少なくとも１つの配列リードとを比較して、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖の配列リードが、二本鎖ＤＮＡ分子の他方の鎖の配列リードと一致していない（例えば、非相補的な）ヌクレオチド塩基を検出および／または定量するステップと、を含んでいてもよく、その結果、ＤＮＡ損傷の部位を検出および／または定量することができる。一部の実施形態では、本方法は、さらに、第１の鎖アダプタ－標的ＤＮＡアンプリコンからの第１の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）および第２の鎖アダプタ－標的ＤＮＡアンプリコンからの第２の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）を作成するステップと、元の第１の鎖の第１のＳＳＣＳと、元の第２の鎖の第２のＳＳＣＳとを比較するステップと、第１のＳＳＣＳの配列と第２のＳＳＣＳの配列が非相補性であるヌクレオチド塩基を識別して、試料中の二本鎖標的ＤＮＡ分子と関連付けられたＤＮＡ損傷を検出および／または定量するステップとを含んでいてもよい。
単一分子識別子配列（ＳＭＩ）
様々な実施形態に従い、提供される方法および組成物は、核酸物質の各鎖上に１つ以上のＳＭＩ配列を含む。ＳＭＩは、二本鎖核酸分子から得られる各々の一本鎖によって独立して担持されていてもよく、その結果、各鎖の誘導体増幅産物が、配列決定後に同じ元の実質的に固有の二本鎖核酸分子に由来するものとして認識され得る。一部の実施形態では、ＳＭＩは、さらなる情報を含んでいてもよく、かつ／または当業者が認識するように、機能性を区別するかかる分子が有用である他の方法において使用されてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩ要素は、核酸物質にアダプタ配列をライゲーションする前、実質的に同時、または後に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、ＳＭＩ配列は、少なくとも１つの縮重または半縮重した核酸を含んでいてもよい。他の実施形態では、ＳＭＩ配列は、縮重していなくてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩ配列は、定義されたヌクレオチド配列であってもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩは、核酸分子の断片末端（例えば、ライゲーションされた核酸物質の無作為に、または半無作為に剪断された末端）またはその近傍と関連付けられた配列であってもよい。一部の実施形態では、外因性配列は、例えば、単一のＤＮＡ分子を互いに区別することが可能なＳＭＩ配列を得るために、ライゲーションされた核酸物質（例えば、ＤＮＡ）の無作為に、または半無作為に剪断された末端に対応する配列と組み合わせて考慮されてもよい。一部の実施形態では、ＳＭＩ配列は、二本鎖核酸分子にライゲーションされるアダプタ配列の一部である。特定の実施形態では、ＳＭＩ配列を含むアダプタ配列は、二本鎖核酸分子の各鎖が、アダプタ配列にライゲーションする後にＳＭＩを含むような、二本鎖である。別の実施形態では、ＳＭＩ配列は、二本鎖核酸分子にライゲーションする前または後に一本鎖であり、相補的ＳＭＩ配列は、その逆鎖をＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長して、相補的二本鎖ＳＭＩ配列を得ることによって生成されてもよい。他の実施形態では、ＳＭＩ配列は、アダプタの一本鎖部分にある（例えば、Ｙ字型を有するアダプタのアーム）。かかる実施形態では、ＳＭＩは、二本鎖核酸分子の元の鎖に由来する配列リードのファミリーのグループ化を容易にすることができ、一部の例では、二本鎖核酸分子の元の第１の鎖と第２の鎖との間の関係を付与することができる（例えば、ＳＭＩの全てまたは一部は、ルックアップテーブルを介して関連付けられる）。複数の実施形態では、第１の鎖および第２の鎖が異なるＳＭＩで標識される場合、２つの元の鎖からの配列リードは、１つ以上の内因性ＳＭＩ（例えば、核酸分子の断片末端または断片末端付近と関連付けられる配列などの断片特異的な特徴）を使用して関連付けられてもよく、または２つの元の鎖によって共有されるさらなる分子タグ（例えば、アダプタの二本鎖部分中のバーコード）の使用によって関連付けられてもよいか、またはこれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、各ＳＭＩ配列は、約１～約３０核酸（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、またはそれ以上の縮重または半縮重した核酸）を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、ＳＭＩは、核酸物質およびアダプタ配列の片方または両方にライゲーション可能である。一部の実施形態では、ＳＭＩは、核酸物質のＴ－オーバーハング、Ａ－オーバーハング、ＣＧ－オーバーハング、脱ヒドロキシル化塩基および平滑末端のうちの少なくとも１つにライゲーションされてもよい。
一部の実施形態では、ＳＭＩの配列は、単一の核酸分子を互いに区別することが可能なＳＭＩ配列を得るために、例えば、核酸物質（例えば、ライゲーションされた核酸物質）の無作為または半無作為に剪断された末端に対応する配列と組み合わせて（またはこれに従って）考慮されてもよい。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＩは、例えば、剪断点自体を使用して、または剪断点のすぐに隣接した核酸物質中の所定の数のヌクレオチド［例えば、剪断点から２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド］を使用して、内因性ＳＭＩであってもよい（例えば、剪断点に関連するＳＭＩ（例えば、断片末端））。一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＩは、外因性ＳＭＩ（例えば、標的核酸物質にはみられない配列を含むＳＭＩ）であってもよい。
一部の実施形態では、ＳＭＩは、画像化部分（例えば、蛍光または別の光学的に検出可能な部分）であってもよいか、または画像化部分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、かかるＳＭＩは、増幅ステップを必要とすることなく、検出および／または定量を可能にする。
一部の実施形態では、ＳＭＩ要素は、アダプタ－標的核酸複合体上の異なる位置に位置する２つ以上の別個のＳＭＩ要素を含んでいてもよい。
ＳＭＩの様々な実施形態は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
鎖定義要素（ＳＤＥ）
一部の実施形態では、二本鎖核酸物質の各鎖は、さらに、標的二本鎖核酸物質を形成する２つの一本鎖核酸の増幅産物を、配列決定後に実質的に互いに区別可能にする要素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、配列決定アダプタ内に含まれる非対称プライマー部位であってもよいか、またはこの部位を含んでいてもよく、あるいは他の配置において、配列非対称性を、プライマー配列内ではなくアダプタ配列内に導入してもよく、その結果、第１の鎖の標的核酸配列複合体と標的核酸配列複合体の第２の鎖のヌクレオチド配列における少なくとも一つの位置が、増幅および配列決定の後で互いに異なっている。他の実施形態では、ＳＤＥは、標準的ヌクレオチド配列Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは異なるが、２つの増幅され配列決定された分子において少なくとも１つの標準的ヌクレオチド配列の差に変換される、２つの鎖間の別の生化学的非対称性を含んでいてもよい。さらに別の実施形態では、ＳＤＥは、増幅前に２つの鎖を物理的に分離する手段であってもよいか、またはこの手段を含んでいてもよく、その結果、第１の鎖の標的核酸配列および第２の鎖の標的核酸配列からの誘導体増幅産物は、２つの誘導体増幅産物間の区別を維持する目的で、互いに実質的に物理的に分離された状態を維持する。第１の鎖と第２の鎖を区別することを可能にするＳＤＥ機能を提供するための他のかかる配置または方法論が利用されてもよい。
一部の実施形態では、ＳＤＥは、ループ（例えば、ヘアピンループ）を形成することが可能であってもよい。一部の実施形態では、ループは、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的核酸複合体は、ループ内の切断事象を容易にするエンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ループは、非標準的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、含まれる非標準的ヌクレオチドは、鎖切断を容易にする１つ以上の酵素によって認識されてもよい。一部の実施形態では、含まれる非標準的ヌクレオチドは、ループ中の鎖切断を容易にする１つ以上の化学プロセスによって標的とされてもよい。一部の実施形態では、ループは、ループ中の鎖切断を容易にする１つ以上の酵素プロセス、化学プロセスまたは物理プロセスによって標的とされ得る、修飾された核酸リンカーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、この修飾されたリンカーは、光開裂性リンカーである。
様々な他の分子ツールが、ＳＭＩおよびＳＤＥとして機能し得る。剪断点およびＤＮＡに基づくタグ以外に、対になった鎖を物理的に近接した状態に維持する単分子コンパートメント化方法、または他の非核酸タグ付け方法は、鎖に関連する機能を果たし得る。同様に、アダプタ鎖を物理的に分離し得る様式でのアダプタ鎖の非対称化学標識は、ＳＤＥの役割を果たすことができる。近年記載されたデュプレックス配列決定の変形例は、亜硫酸水素変換を使用して、シトシンのメチル化の形態で天然に存在する鎖の非対称性を、２つの鎖を区別する配列の違いへと変換する。この実施態様は、検出され得る変異のタイプに制限があるが、天然の非対称を利用するこの概念は、修飾ヌクレオチドを直接的に検出することができる配列決定技術を出現させるという観点で注目すべきものである。ＳＤＥの様々な実施形態は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
アダプタおよびアダプタ配列
様々な配置で、ＳＭＩ（例えば、分子バーコード）、ＳＤＥ、プライマー部位、フローセル配列および／または他の特徴を含むアダプタ分子は、本明細書に開示される実施形態の多くと共に使用することが企図される。一部の実施形態では、提供されるアダプタは、以下の特性のうちの少なくとも１つを有するＰＣＲプライマー（例えば、プライマー部位）に対して相補的または少なくとも部分的に相補的な１つ以上の配列であってもよく、またはこの配列を含んでいてもよい：（１）高い標的特異性がある、（２）多重化が可能である、（３）強力かつバイアスが最小限の増幅を示す。
一部の実施形態では、アダプタ分子は、「Ｙ」字型、「Ｕ」字型、「ヘアピン」型であってもよく、バブル（例えば、非相補配列の一部）、または他の特徴を有し得る。他の実施形態では、アダプタ分子は、「Ｙ」字型、「Ｕ」字型、「ヘアピン」型、またはバブルを含み得る。特定のアダプタは、修飾ヌクレオチドまたは非標準的ヌクレオチド、制限部位、またはインビトロで構造もしくは機能を操作するための他の特徴を含んでいてもよい。アダプタ分子は、末端を有する様々な核酸物質にライゲーションしてもよい。例えば、アダプタ分子は、Ｔ－オーバーハング、Ａ－オーバーハング、ＣＧ－オーバーハング、複数ヌクレオチドオーバーハング、脱ヒドロキシル化塩基、核酸物質の平滑末端、および標的の５’が脱リン酸化されているかまたはその他の従来のライゲーションから遮断されている分子の末端、にライゲーションするのに適したものであってもよい。他の実施形態では、アダプタ分子は、ライゲーション部位の５’鎖に脱リン酸化または他のライゲーションを防ぐ修飾を含んでいてもよい。後者の２つの実施形態では、かかる戦略は、ライブラリ断片またはアダプタ分子の二量体化を防ぐのに有用な場合がある。
アダプタ配列は、一本鎖の配列、二本鎖の配列、相補的な配列、非相補的な配列、部分的に相補的な配列、非対称配列、プライマーに結合する配列、フローセル配列、ライゲーション配列またはアダプタ分子によって提供される他の配列を意味し得る。特定の実施形態では、アダプタ配列は、オリゴヌクレオチドに相補的な配列によって増幅するために使用される配列を意味し得る。
一部の実施形態では、提供される方法および組成物は、少なくとも１つのアダプタ配列（例えば、核酸物質の５’末端および３’末端の各々に１つの、２つのアダプタ配列）を含む。一部の実施形態では、提供される方法および組成物は、２つ以上のアダプタ配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アダプタ配列の少なくとも２つは、互いに（例えば、配列によって）異なる。一部の実施形態では、各アダプタ配列は、アダプタ配列が互いに（例えば、配列によって）異なる。一部の実施形態では、少なくとも１つのアダプタ配列は、少なくとも１つの他のアダプタ配列の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に非相補的である（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドによって非相補的である）。
一部の実施形態では、アダプタ配列は、少なくとも１つの非標準的ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、非標準的ヌクレオチドは、脱塩基部位、ウラシル、テトラヒドロフラン、８－オキソ－７，８－ジヒドロ－２’デオキシアデノシン（８－オキソ－Ａ）、８－オキソ－７，８－ジヒドロ－２’－デオキシグアノシン（８－オキソ－Ｇ）、デオキシイノシン、５’ニトロインドール、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシシチジン、イソ－シトシン、５’－メチル－イソシトシン、もしくはイソグアノシン、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８－オキソ－グアニン、光開裂性リンカー、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド、イソ－ｄＣ、イソｄＧ、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチド、ロック核酸、ペプチド核酸、５メチルｄＣ、５－ブロモデオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５－ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Ｉ－リンカー、５’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、５－オクタジイニルｄＵ、光開裂性スペーサー、非光開裂性スペーサー、クリックケミストリー適合性修飾ヌクレオチド、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。
一部の実施形態では、アダプタ配列は、磁気特性を有する部分（すなわち、磁気部分）を含む。一部の実施形態では、この磁気特性は、常磁性である。アダプタ配列が磁気部分を含む（例えば、磁気部分を含むアダプタ配列にライゲーションされた核酸物質）一部の実施形態では、磁場が適用される場合、磁気部分を含むアダプタ配列は、磁気部分を含まないアダプタ配列（例えば、磁気部分を含まないアダプタ配列にライゲーションされた核酸物質）から実質的に分離される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのアダプタ配列は、ＳＭＩに対して５’に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのアダプタ配列は、ＳＭＩに対して３’に位置する。
一部の実施形態では、アダプタ配列は、１つ以上のリンカードメインを介して、ＳＭＩおよび核酸物質のうちの少なくとも１つに連結されてもよい。一部の実施形態では、リンカードメインは、ヌクレオチドで構成されていてもよい。一部の実施形態では、リンカードメインは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子（例えば、本開示の他箇所に記載されるもの）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、リンカードメインは、ループであっても、またはループを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、二本鎖核酸物質の各鎖の片方または両方の末端上のアダプタ配列は、さらに、ＳＤＥを提供する１つ以上の要素を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＳＤＥは、アダプタ配列内に含まれる非対称プライマー部位であってもよいか、またはこの部位を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アダプタ配列は、少なくとも１つのＳＤＥ、および少なくとも１つのライゲーションドメイン（すなわち、少なくとも１つのリガーゼの活性に修正可能なドメイン、例えば、リガーゼの活性を通して核酸物質にライゲーションするのに好適なドメイン）であってもよいか、またはこれらを含んでいてもよい。一部の実施形態では、５’から３’まで、アダプタ配列は、プライマー結合部位、ＳＤＥおよびライゲーションドメインであってもよいか、またはこれらを含んでいてもよい。
デュプレックス配列決定アダプタを合成するための様々な方法は、例えば、米国特許第９，７５２，１８８号、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号および国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ１８／５９９０８号（２０１８年１１月８日に出願された）に既に記載されており、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
プライマー
一部の実施形態では、以下の特性：（１）高い標的特異性がある、（２）多重化が可能である、（３）強力かつバイアスが最小の増幅を示す、のうちの少なくとも１つを有する１つ以上のＰＣＲプライマーが、本技術の態様に従う様々な実施形態における使用が企図される。以前の研究および商業製品の多くは、従来のＰＣＲ－ＣＥについて、これらの基準のいくつかを満たすプライマー混合物を設計している。しかしながら、これらのプライマー混合物は、ＭＰＳと共に使用するのに常に適しているわけではないことを注記しておく。実際に、高度に多重化されたプライマー混合物を開発することは、挑戦的なことであり、時間がかかるプロセスであり得る。好都合に、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰｒｏｍｅｇａの両者は、様々な標準的および非標準的なＳＴＲおよびＳＮＰ遺伝子座の強力で効率的な増幅を示すＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのための多重互換性プライマー混合物を近年開発した。これらのキットは、ＰＣＲを使用して、配列決定前にその標的領域を増幅するため、ペアエンド配列決定データにおける各リードの５’末端は、ＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの５’末端に対応する。一部の実施形態では、提供される方法および組成物は、均一な増幅を確実にするように設計されたプライマーを含み、これは、様々な反応濃度、融解温度、および二次構造とプライマー内／プライマー間の相互作用を最小限にすること、を伴っていてもよい。ＭＰＳアプリケーション用の高度に多重化されたプライマーの最適化について、多くの技術が記載されてきた。特に、これらの技術は、当該技術分野で十分に記載されているように、しばしばａｍｐｌｉｓｅｑ法として知られている。
増幅
提供される方法および組成物は、様々な実施形態では、核酸物質（またはその一部、例えば、特定の標的領域または遺伝子座）を増幅し、増幅された核酸物質（例えば、アンプリコン産物のいくつかのメンバー）を形成する、少なくとも１つの増幅ステップを利用するか、または使用する。
一部の実施形態では、核酸物質を増幅することは、ＳＭＩ配列が少なくとも部分的に維持されるように、第１のアダプタ配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、元の二本鎖核酸物質からの第１の核酸鎖および第２の核酸鎖の各々に由来する核酸物質を増幅するステップを含む。増幅ステップは、さらに、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、目的の各鎖を増幅することを含み、かかる第２の一本鎖オリゴヌクレオチドは、（ａ）目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的であってもよいか、または（ｂ）少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドと第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、核酸物質を効果的に増幅するように配向される様式で、第２のアダプタ配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的であってもよい。
一部の実施形態では、試料中の核酸物質を増幅することは、「チューブ」（例えば、ＰＣＲチューブ）内で、エマルジョン液滴、マイクロチャンバ、および上に記載の他の例または他の既知の容器内で、核酸物質を増幅することを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、少なくとも１つの増幅するステップは、少なくとも１つの非標準的ヌクレオチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つのプライマーを含む。一部の実施形態では、非標準的ヌクレオチドは、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８－オキソ－グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、高Ｔｍ核酸バリアント、アレルを区別する核酸バリアント、本明細書の他箇所に記載の任意の他のヌクレオチドもしくはリンカーバリアント、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。
任意の用途に適した増幅反応が、一部の実施形態に適合することが企図されるが、具体例として、一部の実施形態では、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、等温増幅、エマルジョン内のポロニー増幅、表面、ビーズの表面、またはヒドロゲル内でのブリッジ増幅、およびこれらの任意の組み合わせ、であってもよいか、またはこれらを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、核酸物質を増幅することは、核酸物質の各鎖の５’末端および３’末端上のアダプタ配列の領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖ヌクレオチドの使用を含む。一部の実施形態では、核酸物質を増幅することは、目的の標的領域または標的配列（例えば、ゲノム配列、ミトコンドリア配列、プラスミド配列、合成的に生成された標的核酸など）に少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドと、アダプタ配列のある領域（例えば、プライマー部位）に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドと、の使用を含む。
一般に、安定した増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）は、反応条件に大きく依存し得る。マルチプレックスＰＣＲは、例えば、緩衝液の組成、一価または二価カチオンの濃度、洗剤濃度、クラウディング剤（すなわち、ＰＥＧ、グリセロールなど）の濃度、プライマー濃度、プライマーＴｍ、プライマー設計、プライマーＧＣ含有量、プライマー修飾ヌクレオチド特性およびサイクリング条件（すなわち、温度および伸長時間、ならびに温度変化速度）に対して感受性な場合がある。緩衝液の条件の最適化は、困難かつ時間がかかるプロセスである場合がある。一部の実施形態では、増幅反応は、既に知られている増幅プロトコルに従って、緩衝液、プライマープール濃度、およびＰＣＲ条件、のうちの少なくとも１つを使用してもよい。一部の実施形態では、新しい増幅プロトコルが作成されてもよく、かつ／または増幅反応の最適化が使用されてもよい。具体例として、一部の実施形態では、ＰＣＲ最適化キット、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）のＰＣＲ最適化キットを使用してもよく、このキットは、様々なＰＣＲ増幅（例えば、マルチプレックス、リアルタイム、ＧＣリッチおよび阻害剤耐性増幅）に部分的に最適化された、いくつかの予め配合された緩衝液を含む。これらの予め配合された緩衝液は、様々なＭｇ２＋濃度およびプライマー濃度、ならびにプライマープール比で迅速に補充することができる。これに加え、一部の実施形態では、様々なサイクリング条件（例えば、サーマルサイクリング）が、評価および／または使用されてもよい。特定の実施形態が、特定の所望の用途に適切であるかどうかを評価する際に、他の側面の中でも、特異性、ヘテロ接合性遺伝子座についてのアレルカバレッジ比、遺伝子座間のバランスおよび深度、のうちの１つ以上を評価してもよい。増幅成功の測定は、産物のＤＮＡ配列決定、ゲルまたはキャピラリー電気泳動またはＨＰＬＣまたは他のサイズ分離方法と、その後の断片の視覚化による産物の評価、二本鎖核酸結合色素または蛍光プローブを使用する融解曲線分析、質量分析法または当該技術分野で知られている他の方法を含んでいてもよい。
様々な実施形態に従って、様々な因子のいずれかが、特定の増幅ステップの長さ（例えば、ＰＣＲ反応中のサイクル数など）に影響を与えることがある。例えば、一部の実施形態では、提供される核酸物質は、品質が劣っているか、さもなければ最適ではない場合がある（例えば、分解および／または汚染されている）。かかる場合、より長い増幅ステップが役に立つことがあり、所望の産物が許容される程度に増幅されることを確実にすることができる。一部の実施形態では、増幅ステップは、各々の出発ＤＮＡ分子から平均で３～１０個の配列決定されたＰＣＲコピーを提供し得るが、他の実施形態では、第１の鎖および第２の鎖の各々の単一コピーだけが必要とされる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、多すぎるまたは少なすぎるＰＣＲコピーは、アッセイ効率を低下させ、最終的には深度が低下する可能性がある。一般に、増幅（例えば、ＰＣＲ）反応に使用される核酸（例えば、ＤＮＡ）断片の数は、同じＳＭＩ／バーコード配列を共有するリードの数を規定し得る、主要な調節可能な変数である。
核酸物質
種類
様々な実施形態に従って、様々な核酸物質のうちいずれかを使用してもよい。一部の実施形態では、核酸物質は、標準的糖－リン酸骨格内のポリヌクレオチドに対する少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸物質は、核酸物質中の任意の塩基内に少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。例えば、非限定的な例として、一部の実施形態では、核酸物質は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらを含む。
修飾
様々な実施形態に従って、核酸物質は、特定の提供される方法または組成物が使用される用途に応じて、任意の特定のステップの前に、実質的に同時に、またはその後に、１つ以上の修飾を受けてもよい。
一部の実施形態では、修飾は、核酸物質の少なくとも一部の修復であってもよいか、またはそれを含んでいてもよい。核酸修復の任意の用途に適した方法が、一部の実施形態に適合すると企図されるものの、特定の例示的な方法および組成物を以下および実施例に記載する。
非限定的な例として、一部の実施形態では、ＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）および８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）を利用して、ＤＮＡ損傷（例えば、インビトロでのＤＮＡ損傷）を修正することができる。上述のように、これらのＤＮＡ修復酵素は、例えば、ＤＮＡから損傷した塩基を除去するグリコシラーゼである。例えば、ＵＤＧは、（シトシンの自発的な加水分解によって生じる）シトシン脱アミノ化から得られるウラシルを除去し、ＦＰＧは、８－オキソ－グアニン（例えば、活性酸素種から得られる共通のＤＮＡ病変）を除去する。ＦＰＧは、リアーゼ活性も有し、脱塩基部位に１塩基ギャップを生成することができる。かかる脱塩基部位は、例えば、ポリメラーゼがテンプレートをコピーすることができないため、その後にＰＣＲによって増幅することができない。したがって、かかるＤＮＡ損傷修復酵素の使用は、真の変異を有していないが、配列決定および二重鎖配列分析の後に別の状況でエラーとして検出されない可能性がある損傷ＤＮＡを効果的に除去することができる。
上述のように、さらなる実施形態では、本明細書に記載の処理ステップから生成される配列決定リードをさらにフィルタリングして、アーチファクトに最もなりやすいリードの末端をトリミングすることによって、偽の変異を除外することができる。例えば、ＤＮＡ断片化は、二本鎖分子の末端に一本鎖部分を生成することができる。これらの一本鎖部分は、末端修復中に末端平滑化されてもよい（例えばＫｌｅｎｏｗによって）。一部の例では、ポリメラーゼは、これらの末端修復した領域においてコピーの誤りを起こし、「偽の二重鎖分子」の生成を引き起こす。これらのアーチファクトは、配列決定されたときに真の変異であると見えてしまう場合がある。これらの末端修復機構の結果としてのエラーは、生じる可能性がある変異を除外するために配列決定リードの末端をトリミングすることによって、配列決定後の分析から除外することができ、それにより、偽の変異の数を減らすことができる。一部の実施形態では、配列決定リードのかかるトリミングは、自動的に達成することができる（例えば、通常の処理ステップ）。一部の実施形態では、変異頻度は、断片末端領域について評価することができ、変異の閾値レベルが断片末端領域で観察される場合、ＤＮＡ断片の二本鎖コンセンサス配列リードを生成する前に、配列決定リードのトリミングを行うことができる。
デュプレックス配列決定の鎖比較技術によって提供される高度なエラー修正は、標準的な次世代配列決定方法と比較して、二本鎖核酸分子の配列決定エラーを数桁程度減少させる。このエラーの減少は、ほぼ全てのタイプの配列において、配列決定の精度を向上させるが、特にエラーが起こりやすいことが当該技術分野で周知である生化学的に困難な配列に対して、特によく適している場合がある。かかる種類の配列の非限定的な一例は、ヘテロポリマーまたは他のマイクロサテライト／ショートタンデムリピートである。デュプレックス配列決定のエラー修正から利益を得るエラーが起こりやすい配列の別の非限定的な例は、例えば、加熱、放射線、機械的応力、または１つ以上のヌクレオチドポリメラーゼによる複製中にエラーを起こしやすい化学付加物を生成し、また分子の末端で、またはニックおよびギャップとして一本鎖ＤＮＡを生成する様々な化学曝露によって損傷を受けた分子である。さらなる実施形態では、デュプレックス配列決定は、二本鎖核酸分子の集団の中で少数の配列バリアントを正確に検出するために使用することができる。本出願の非限定的な一例は、多数のＤＮＡ分子の中から、少数のバリアントＤＮＡ分子を検出することである（例えば、遺伝性の疾患または障害を表すバリアントアレル）。例えば、多くの患者試料は、希少な遺伝性疾患と相関するまたはその原因となるバリアントアレルについてスクリーニングされ得る。デュプレックス配列決定による希少なバリアントの検出のための別の非限定的な用途は、関連する遺伝性疾患の後期症状を提示し得る、および／またはかかる遺伝的バリアントアレルを子孫に渡すことができる遺伝的バリアントアレルの保因者の早期検出である。デュプレックス配列決定のさらなる非限定的な用途は、大規模な患者集団において、バリアントアレル頻度を決定することである。デュプレックス配列決定の別の非限定的な用途は、費用効果的な様式で疾患原因または疾患相関的な遺伝的バリアントの存在を評価するための複数の生体試料を遺伝子型決定することである。
ＩＩＩ．プーリングを介して多数の試料を遺伝子型決定するための方法の選択された実施形態
多くの希少な遺伝性疾患は、症状が生じた後にのみ個体で検出され、治療を遅らせ、取り返しのつかない危害をもたらす可能性がある。１つ以上の遺伝子におけるホモ接合性またはヘテロ接合性バリアントを有するこれらの患者の特定のサブセットに利益をもたらし得る既存のまたは開発されるべき薬物は、集団のかかるサブセットが特定され得る場合、早期に（例えば、症状の発症前に）投与され得る。したがって、大集団の中で希少な疾患アレルの保因者を特定する問題は、早期介入のための患者のスクリーニング、ならびに新規のバイオマーカー／候補の創薬に関連する。加えて、希少な疾患アレルの保因者の特定を使用することで、かかる疾患アレルを子孫に受け渡すことに関連するリスクについて、患者および医療提供者に通知することができる（例えば、遺伝子カウンセリング等の目的のために）。
従来のＮＧＳに基づく配列決定方法を使用して、希少な遺伝的バリアントをスクリーニングすることは、各試料を個別に調製すること、およびかかる試料を配列決定することに関連する高い金銭的コストをもたらす。例えば、各試料は、多重配列決定のために試料をプールする前に、個別にインデックスバーコード化されなければならない。したがって、ライブラリ調製および各試料の配列決定のコストは、試料の数と共に直線的に上昇することから、多数のスクリーニングは（例えば、患者集団、人種集団など）、費用対効果の低いツールになる。しかしながら、本技術に従う実施形態では、試料調製のコストは、試料の数と共に直線的に上昇しない。
本開示は、次世代ＤＮＡ配列決定を使用して多数の核酸試料をスクリーニングし、遺伝子型決定するための方法、および各試料について配列決定データを区別するための多重化ツールを本明細書に開示する。一実施形態では、方法は、元の核酸試料の未インデックス化混合物を配列決定することによって、複数の試料の中から比較的まれに発生するバリアントを特定することができる。
一部の実施形態では、提供される方法は、試料を、調製および配列決定され得るサブプールされる試料混合物にプールすることを介して、複数の生体試料を遺伝子型決定するために有用である。一部の実施形態では、提供される方法は、遺伝的バリアントについて生物源をスクリーニングするために有用である。一部の実施形態では、遺伝的バリアントは、希少な疾患に関連している。一部の実施形態では、提供される方法は、対象の集団の中から希少なバリアントアレルを有する対象を特定するために有用である。一部の実施形態では、提供される方法は、希少なバリアントアレルについて患者ＤＮＡ試料をスクリーニングするために有用である。
一実施形態では、本技術の態様に従う、複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法は、概して、複数の生体試料を固有の組み合わせのサブプールにプールするステップを含み、各生体試料は、標的二本鎖ＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、生体試料のうちの１つ以上は、異なる対象に由来し得る。二本鎖ＤＮＡ分子は、対象に由来する試料（例えば、組織試料、血液試料など）から抽出することができる。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は、非細胞ＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡまたは対象由来のエクソソームもしくは他の細胞外小胞からのＤＮＡ、から単離することができる。一部の実施形態では、人工供給源（例えば、合成オリゴヌクレオチド、遺伝子編集試料、作製された細胞集団、作製されたウイルス試料、情報保管を提供する合成ヌクレオチドなど）の遺伝子型決定および／またはスクリーニングも企図される。
一部の実施形態では、提供される方法は、サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することを含む。特定の実施例では、エラー修正配列リードは、デュプレックス配列決定を使用して生成され得る。一部の実施形態では、提供される方法は、エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、バリアントアレルを含む元の生体試料を決定することと、を含む。一部の実施形態では、バリアントアレル（例えば、プーリング前）を含有する元の生体試料は、バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって決定することができる。
ＮＧＳのデジタル性質を使用して、本技術の態様は、サブクローン混合物を分離することができる。例えば、１０人の対象から精製されたＤＮＡの比較的均等な部分を組み合わせ、１人の対象が、他の９人の個体がそうでない特定の遺伝子についてヘテロ接合変異を保有し、これを十分な深度（すなわち、冗長なゲノムコピーの数）まで配列決定した場合、この遺伝子の分子コピーの１／２＊１０＝１／２０＝５％において、このバリアントが見出されると予想されるであろう。この例では、１０人の対象のＤＮＡを一緒に混合し、単一の配列決定ライブラリを調製し、この混合物を遺伝子型決定して、１つの試料の存在を推測することが可能であろう。この例では、各々から混合された個体の数および入力されたＤＮＡが分っているため、バリアントアレルの割合自体が、変異を保有する個体の数を示す。核酸混合物を分離するための方法の例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２７５５号に記載されており、その全体が本明細書に援用される。
バリアントアレルを有する対象が事前に知られていない例では、本技術の態様は、試料を試料の固有の組み合わせのサブプールにプールすることによって、複数の生体試料（例えば、多数の試料、複数の対象からの試料など）をスクリーニングおよび／または遺伝子型決定する方法を提供する。例えば、個々の生体試料（例えば、元の供給源／対象／患者に由来する核酸試料など）は、複数のサブプールされた試料混合物にアリコートまたは細分され得る（例えば、均等にまたは不均等に）。特定の実施形態では、各個々の生体試料は、２つの個々の生体試料が、サブプールされた試料混合物の同じ組み合わせにアリコートされないように、固有の組み合わせのサブプールされた試料混合物にアリコートされる。したがって、一部の実施形態では、固有の組み合わせのサブプールされた試料混合物は、固有の試料識別子として機能し得る。一実施形態では、各個々の生体試料に由来する核酸分子は、個々の生体試料をアリコートする前に、外因性のインデックスバーコードでタグ付けする必要はない。一実施形態では、サブプールされた試料混合物は、各特定のサブプールされた試料混合物中の核酸分子に由来する配列リードが、他のサブプールされた試料混合物中の核酸分子に由来する配列リードと区別され得るように、インデックスバーコードでタグ付けされる。実施形態では、個々の生体試料の数は、サブプールされた試料混合物の数を上回る。
一部の実施形態では、個々の生体試料の異なる組み合わせを含有する複数のサブプールされた試料混合物は、バリアントアレル（例えば、遺伝子変異、疾患関連アレルなど）の存在について、デュプレックス配列決定を介して分析することができる。サブプールされた試料混合物の特定の組み合わせにおける特定のバリアントアレルを明らかにする配列決定リードは、寄与者の推論を可能にする。
多数の試料を効率的に遺伝子型決定するための方法の一実施形態を図２に示す。図２に示されるように、および方法２００の第１のステップでは、多数の患者試料が、より少数のプールされるＤＮＡ試料にプールされる（ブロック２０２）。このステップでは、各個々の核酸（例えば、ＤＮＡ）試料は、ＤＮＡプールの小さい固有のサブセット、例えば、３０個の利用可能なプールのうちの４個にアリコートされる。各個々の試料がアリコートされるプールの固有のサブセットは、その試料（例えば、特定の患者試料）についての固有の試料識別子（例えば、「バーコード」）を形成する。方法２００はまた、関連するゲノム領域（例えば、配列決定調査領域）にわたってすべての試料プールをデュプレックス配列決定でアッセイすることを含む（ステップ２０４）。患者がバリアントアレル（例えば、疾患に関連するアレルまたは変異）を有する場合、そのアレルは配列決定され、その試料の固有のプールのサブセット（例えば、割り当てられた固有の試料識別子によって特定される）のプールの各々で生成された配列リードに表される。方法２００は、一致する固有の試料識別子を照会することによって、バリアントアレル寄与試料を分離することをさらに含む（ステップ２０６）。
別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、サブプールされた試料混合物（例えば、本明細書では「サブプール」とも称される）中に存在する各バリアントアレルのバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を提供し、これを使用して、個々の対象が、特定の遺伝的バリアント（例えば、疾患関連変異）についてホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるかを決定することができる。非限定的な一例では、１０個の試料を５つの定義されたサブプールにアリコートし、各サブプールが各々５つのアリコートされた試料を有し、各プールへの寄与者が異なる場合、固有の組み合わせのサブプール内の各サブプールにおける１／５×１／２＝１０％のＶＡＦの存在は、スクリーニングされた個々の対象の集団内のヘテロ接合変異体の個々の対象の存在を示すであろう。特定の遺伝的バリアントが１０％のＶＡＦを有していると特定された固有の組み合わせのサブプールは、特定の個々の対象を推測するために、固有の試料識別子（例えば、サブプールされた試料混合ステップ中に確立されたアリコートのパターン）として使用される。見出されたバリアントアレル／変異を有するサブプール（例えば、プレートウェル、チューブ、混合容器など）のパターンが、変異を有する可能性のある個体の数を、正確に１人または１０人のサブセットに絞り込むことができるように、様々な混合スキームが適用され得ることは、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、生成されるサブプールの数および各サブプールに表される個々の生体試料の数は、回収されない変異または偽の変異に起因するエラーが、この変異に寄与する個体を不可逆的に不明瞭にしないように、それらのパターン間に「編集距離」を作成することが可能である（すなわち、パターンはいくつかのエラーを許容する）。同様に、所与のバリアントがプールされたいくつかの試料中に存在し、所与のサブプールがこれらの複数からの寄与を有する場合、所与のバリアントの希少性が低下するにつれて、この確率はより高くなり、区別がより困難になり得る。かかる「編集距離」アプローチは、ここでもさらに有用になる。
エラー修正配列リードを生成することによって、本明細書に提示される実施形態は、標準ＮＧＳに関連付けられた約１％のエラー率を伴う課題を克服する。例えば、１００人以上の個体の混合物中の低頻度（例えば、希少な）バリアントアレルは、標準的なＮＧＳ配列決定を使用した場合、生じた人工的な変異によって不明瞭になり、シグナルを歪める（例えば、エラーノイズによって真のバリアントアレルの検出が不明瞭になる）。本明細書および他箇所に記載されるように、デュプレックス配列決定などの高精度配列決定リードを提供する方法は、これらのエラーを低減または排除して、数百または数千個の試料の混合を可能にし、依然として高い感度および特異性を有する元となる供給源を確信的に検出することができる。
個々の試料中にバーコード化核酸分子を個別にインデックス化することなく、固有の試料識別子を提供するためのサブプーリングのアプローチを含む様々な実施形態は、コスト節約の閾値（例えば、１０、２０、３０など）を下回るいくつかの試料をスクリーニングおよび／または遺伝子型決定する場合、より最小限のコスト節約を有し得るが、数百または数千の試料をスクリーニングおよび／または遺伝子型決定する場合、サブプールされた試料混合物の実際のライブラリ調製に関連するコスト節約および時間節約は劇的に増加するであろう。表１は、関連する性能特性と共に、様々な固有の試料識別子（すなわち、プールの「バーコード」スキーム）を示す。
Figure 2022505050000001
例えば、生成されたサブプールされた試料混合物の数が増加するにつれて（表１、第２の列）、一意的に特定され得る個々の生体試料の数（各試料を４つのサブプールにアリコートする場合）が非線形に増加する（第３の列を参照）。サブプールあたりの平均試料数が２００未満である場合、サブプールの数を１５から約４０に増やすと、試料調製物／試料の数（第６の列を参照）が急速に減少する。各個々の試料の配列決定のコストは、調製および配列決定される試料の数と直線的にスケールするため、サブプールされた試料混合物のスキームを使用する場合、試料あたりの配列決定ライブラリ調製および配列決定に関連するコストは低下する。別の言い方をすれば、本技術に従う実施形態では、試料調製物のコストは、個々の試料の数の増加と共に直線的には増加しない。
図３は、本技術の一実施形態に従う、試料プーリングのスキームのためのコストおよび性能のメトリックを示すプロットである。非限定的な例として、図３は、固有の試料識別子間で少なくとも２の編集距離を必要としながら、４つのサブプールを各個々の試料に割り当てるプーリングスキームを示す（例えば、少なくとも２つのプールは、各試料サブプールの組み合わせ間で異なる）。試料が割り当てられるいくつかのサブプールに加えて、様々な編集距離を使用することができることを理解されたい（例えば、試料識別子またはコードの長さを変えること）。
一例として、ハミングコードまたは任意の他の公開または未公開のエラー修正コードを使用して、十分な編集距離を有する固有の試料識別子を決定することができる。一部の実施形態では、互いに少なくとも２の「編集距離」を有する固有の試料識別子。例えば、少なくとも２つのサブプールに、誤って特定された遺伝子型が存在して、不正確な試料を特定の遺伝的バリアントの保因者のものとして呼び出すこと、または２つの個体の試料のうちのどれが保因者のものであるのかを区別することができないことがあるはずである。別の実施形態では、わずか１または２よりも多い編集距離を使用することもできる。
さらなる実施形態では、試料を異なる数のプールに割り当てて、固有の試料識別子間にさらなる区別を提供することができる。表１に例示される特定の実施例では、および任意の所与のサブプールを配列決定用に２回以上調製する必要を回避するために、一実施形態では、平均２００試料／プールを有し得る。図３に示すように、より多くのサブプールを追加すると、単一の研究で調査可能な試料の数は大幅に増加するが、試料あたりの試料調製のコストは、約４０プールまでに急激に減少する。したがって、一部の実施形態では、サブプールされた試料混合物（すなわち、サブプール）の数は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、７０、またはそれ以上であり得る。例えば、サブプールされた試料混合物の数は、１５～約４０、約３０～約５０、約３５～約５５、約４０～約６０、または６０超であり得る。
一部の実施形態では、遺伝的バリアントについて生物源をスクリーニングするための方法が提供される。特定の実施例では、個々の対象（例えば患者）の大きな集団をスクリーニングして、その集団の任意のメンバーがある疾患または障害に関連する１つ以上の遺伝的バリアントの保因者であるかどうかを決定するために有用である。一実施形態では、本方法は、生物源に由来する複数の生体試料を、固有の組み合わせのサブプールにアリコートすることを含むステップを提供し、各生体試料は、標的二本鎖ＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、各生体試料は、２つ以上のサブプールにアリコートされ、その結果、固有の組み合わせのサブプールにより、試料識別子が提供される。一実施形態では、本方法は、サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成するステップと、エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定するステップと、バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、バリアントアレルを含有する生物源を決定するステップと、を提供する。
一部の実施形態では、各サブプールされた試料混合物内の標的二本鎖核酸分子の集団の高精度の配列決定リードを生成する方法が提供される。かかる方法は、各サブプールされた試料混合物内の１つ以上の標的二本鎖核酸分子をデュプレックス配列決定することと、標的二本鎖ＤＮＡ分子について高精度のコンセンサス配列を生成することと、を含む。一部の実施形態では、標的二本鎖核酸分子は、疾患または障害（例えば、癌、非癌疾患、希少な遺伝性疾患など）に関連する標的ゲノム領域または遺伝子座を含む。一部の実施形態では、提供される方法は、標的ゲノム遺伝子座の配列を含む１つ以上のエラー修正配列リードを、参照配列と比較することをさらに含む。
一部の実施形態では、複数の二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてのエラー修正配列リードの生成は、配列決定の前に１つ以上の標的ゲノム領域を選択的に富化して、複数の富化されたアダプタ－ＤＮＡ分子を提供することをさらに含む。一部の実施形態では、提供される方法は、サブプールされた試料混合物内の二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、遺伝的バリアントを有する対象に由来する、および／またはそれから抽出された二本鎖ＤＮＡ分子）の中から１つ以上の遺伝的バリアントを特定するために有用である。一部の実施形態では、提供される方法は、サブプールされた試料混合物内の二本鎖ＤＮＡ分子の中から１つ以上の遺伝的バリアントを特定するステップを含む。
一部の実施形態では、デュプレックス配列決定方法によって分析される１つ以上の標的ゲノム領域は、ゲノムの標的ゲノム遺伝子座であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、提供される方法は、１つ以上のエラー修正配列リードが、標的ゲノム遺伝子座に希少なまたは疾患関連の遺伝的バリアントを含むかどうかを決定するステップを含む。したがって、提供される方法は、目的の特定の遺伝的バリアントの保因者について、対象の集団を評価またはスクリーニングするのに有用であり得る。例えば、１つ以上の標的ゲノム領域は、疾患原因変異を有することが知られている遺伝子を含む。一部の実施形態では、疾患原因変異は、機能喪失変異、機能獲得変異、または優性阻害変異であるか、それらを含む。別の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム領域は、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子座を含む。一実施形態では、疾患または障害は、希少な遺伝性障害である。一実施形態では、疾患または障害は、単一遺伝子障害である（例えば、変異が、単一の遺伝子に見出される）。別の実施形態では、疾患または障害は、２つ以上の遺伝子における変異を伴う複合障害である。一実施形態では、疾患または障害は、常染色体劣性変異に関連する。別の実施形態では、疾患または障害は、常染色体優性変異と関連する。
一部の実施形態では、対象（例えば、数百または数千の対象）の集団を効率的にスクリーニングするための方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、提供される方法は、標的ゲノム遺伝子座の配列を含むエラー修正配列リードの中の遺伝的バリアントの頻度を決定するステップを含む。一部の実施形態では、遺伝的バリアントの保因者が、遺伝的バリアントについてホモ接合であるかまたはヘテロ接合であるかを決定するための方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、集団の中の遺伝的バリアントの頻度、例えば、表された集団における特定の遺伝的バリアントの保因者の頻度、を決定するための方法が、本明細書に提供される。
一部の実施形態では、提供される方法は、１つ以上の標的ゲノム遺伝子座からの配列を含む二本鎖ＤＮＡ分子に由来する第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を分析することと、その対応関係を参照ゲノム配列と比較することと、１つ以上の標的ゲノム遺伝子座を含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子の中の１つ以上のバリアントの頻度を決定することと、を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的ゲノム遺伝子座（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）の遺伝的バリアントを遺伝子型決定および／またはスクリーニングするための方法が、本明細書に提供される。
一部の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、癌原遺伝子、および／または癌ドライバーであるか、それらを含む。一部の実施形態では、癌ドライバーは、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｅｎｓｕｓ（ＣＧＣ）またはＣＯＳＭＩＣデータベース（癌に因果関係のある遺伝子）からの既知の癌ドライバーである。一部の実施形態では、癌ドライバー遺伝子は、ＡＢＬ、ＡＣＣ、ＢＣＲ、ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＨＯＬ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＳＣＡ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＭＥＳＯ、ＯＶ、ＰＡＡＤ、ＰＣＰＧ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＡＤ、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＧＣＴ、ＴＨＣＡ、ＴＨＹＭ、ＴＰ５３、ＵＣＥＣ、ＵＣＳ、および／またはＵＶＭ、であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、バリアントが、分子の集団中の複数の富化されたタグ付けＤＮＡ分子の中の１つ以上の癌ドライバーにおいて検出される場合、本方法は、複数の富化されたタグ付けＤＮＡ分子の中のバリアントのバリアント頻度を決定するステップをさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、標的ゲノム領域は、希少な遺伝性障害または疾患に関連する既知の遺伝子もしくは遺伝子座であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、希少な遺伝性障害または疾患についてヒト患者をスクリーニングするための方法が提供される。希少な遺伝性障害または疾患のいくつかの非限定的な例としては、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、いくつかの形態の白皮症、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー１型、家族性高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎疾患１および２、血友病ＡおよびＢ、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型）、低リン血症性くる病、レット症候群、テイ・サックス病、ウィルソン病、ウェルナー症候群、致死性家族性不眠症、ならびに／または精子形成不全の遺伝的形態が挙げられる。一部の実施形態では、希少な遺伝性障害または疾患ならびに関連する標的ゲノム遺伝子座は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／に見出されるものであるか、またはこれらを含み、これらは、参照により本明細書に援用される。
一実施形態では、標的ゲノム領域は、肥満の希少な遺伝性障害と関連するゲノム遺伝子座であるか、またはそれを含む。例えば、肥満の希少な遺伝性障害は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠乏性肥満、アルストレム症候群、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏性肥満、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、バルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ）、および高影響ヘテロ接合性肥満であるか、またはこれらを含む。
別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、非ヒト（例えば、非動物）試料のハイスループットスクリーニングに有用であり得る。一実施形態では、本明細書で使用される方法は、植物（例えば、遺伝子編集された植物細胞、植物ハイブリッド、デザイナー植物種）に由来する試料のスクリーニングに有用であり得る。別の実施形態では、変異誘発植物細胞は、所望の遺伝子修飾について迅速かつ効率的にスクリーニングすることができる。
別の実施形態では、遺伝的バリアントが、個々の生体試料（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の保因者）の間で２回以上生じることが予想されるのに十分一般的である場合、バリアントを含む異なるハプロタイプを、同じ配列決定リード上の他のバリアントから一意的に特定することができる。この実施形態では、遺伝的バリアントは、（ａ）ゲノム上で、一塩基多型（ＳＮＰ）の近位にあり、かつ（ｂ）ＳＮＰと完全な連鎖不均衡ではないであろう。したがって、２つの個体が同じ疾患アレルを共有するが、近位ＳＮＰについてそれらの遺伝子型が異なる場合、それらは、一意的に特定され得る。例えば、疾患バリアントおよびＳＮＰの両方にまたがる任意の配列決定リードを使用して、バリアントの２つの事例を区別することができる。
リスクがあるアレルが、研究内の複数の生体試料において生じることが予想されるのに十分一般的であるさらなる実施形態では、サブプール中のバリアントアレルのバリアント頻度を使用して、サブプール中にいくつの試料がバリアントアレルを有するかを推定することができ、それによって、いくつかのプール中で重複する複数の保因者の逆重畳を可能にする。
一部の実施形態では、より少ないサブプールを作成することができ、かつ／またはより複雑でない固有の試料識別子（例えば、プールの「バーコード」）を使用することができる。特定の実施例では、多くの個々の試料は、同じ固有の試料識別子（例えば、「一意的ではない」特定可能な／標識された識別子）を割り当てることができる。試料のデュプレックス配列決定後、疾患アレル保因者は、一意的に特定されないが、個々の配列決定スキーム（例えば、サンガー配列決定、ＮＧＳなど）で調べることができる、元の試料の短いリストに保因者を効率的に絞り込むことができる。したがって、一部の実施形態では、かかる方法は、後続の配列決定アッセイで求められるために、非常に大きな試料集団を、より合理的な数の試料に効果的かつ効率的に絞り込むことができる。
一部の実施形態では、試料または試料のグループに逆多重化インデックスを付け加えることは、サブプーリングのプロセスの前に使用することができ、同じ試料識別子を有するが依然として互いに区別可能な試料をプールすることを可能にする。
一実施形態では、任意の特定の疾患アレルがプール中に存在していたかどうかを特定するために、多数の試料（例えば、数百、数千など）を単一のプール中で配列決定することができる。一実施形態では、かかるステップは、試料のサブプールを配列決定する前に取ることができる。例えば、「単一プール」の実施形態は、次いで、本明細書の他の実施形態に記載されるより高価な（例えば、コスト、時間など）研究を実行するためのゲーティング機構として使用され得る。特に、単一プールの研究が、研究集団において発見されるリスクのあるアレル保因者が存在することを示す場合にのみ、サブプーリングスタディを実行することを選択してもよい。
またさらなる実施形態では、各試料がより多くのプールにアリコートされ、各プールがより低い深度で配列決定される場合、配列決定コストを低減することができる。より低い深度で配列決定する場合、いくつかのバリアントアレルは、それが存在するプール中で配列決定されなくてもよい。しかしながら、各試料が、配列決定の前により多くの数のサブプール中に表される場合、特定されるバリアントアレルは、依然として、元の寄与試料に特定され得る。例えば、各試料を８つのサブプールにアリコートすることができ、各サブプールは、バリアントが約３０％の時間に検出されないことが予想されるように深度まで配列決定される。この実施例では、編集距離が４である一意の試料識別子を使用して、ほとんどのバリアントを単一の元の試料に関連付けることができる。一部の実施形態では、各元の試料は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のサブプールにアリコートすることができる。
試薬を用いたキット
本技術の態様は、さらに、デュプレックス配列決定方法の様々な態様を実施するためのキットを包含する（本明細書では「ＤＳキット」とも呼ばれる）。一部の実施形態では、キットは、核酸抽出、核酸ライブラリ調製、増幅（例えば、ＰＣＲによる）および配列決定について、本明細書に開示される方法または方法ステップのうちの１つ以上を実施するための説明書と共に、様々な試薬を含んでいてもよい。一実施形態では、キットは、配列決定データ（例えば、生の配列決定データ、配列決定リードなど）を分析するためのコンピュータプログラム製品（例えば、コンピュータ上で実行するためのコード化されたアルゴリズム、１つ以上のアルゴリズムを実行するためのクラウドベースのサーバへのアクセスコード）をさらに含み、本技術の態様に従って、例えば、試料に関連するバリアントアレル、変異などを決定する。キットには、ＤＮＡ標準、ならびに陽性および陰性対照の他の形態が含まれ得る。
一部の実施形態では、ＤＳキットは、試料調製（例えば、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ断片化）、核酸ライブラリ調製、増幅および配列決定の様々な態様を行うのに好適な試薬または試薬の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、ＤＳキットは、任意選択的に、１つ以上のＤＮＡ抽出試薬（例えば、緩衝液、カラムなど）および／または組織抽出試薬を含んでいてもよい。任意選択的に、ＤＳキットは、さらに、例えば、物理的手段（例えば、音響剪断または超音波処理を容易にするための管、ネブライザユニットなど）または酵素的手段（例えば、無作為または半無作為のゲノム剪断のための酵素および適切な反応酵素）によって、二本鎖ＤＮＡを断片化するための１つ以上の試薬またはツールを含んでいてもよい。例えば、キットは、標的の消化のために、酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイド、ならびに／または他のエンドヌクレアーゼ）、二本鎖フラグメンターゼカクテル、ＤＮＡの断片を主に二本鎖にするため、および／または一本鎖ＤＮＡを破壊するための一本鎖ＤＮａｓｅ酵素（例えば、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ）のうちの１つ以上を含む二本鎖ＤＮＡを酵素的に断片化するためのＤＮＡ断片化試薬と、かかる酵素反応を容易にするための適切な緩衝液および溶液とを含んでいてもよい。
一実施形態では、ＤＳキットは、デュプレックス配列決定プロセスのステップを行うのに好適な試料から核酸配列ライブラリを調製して、試料中の二本鎖核酸分子のエラー修正（例えば、高精度の）配列を生成するためのプライマーおよびアダプタを含む。例えば、キットは、単一分子識別子（ＳＭＩ）配列を含むアダプタ分子の少なくとも１つのプール、またはユーザがこれを作成するためのツール（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アダプタ分子のプールは、試料中の複数の核酸分子が、アダプタ分子の結合後に、実質的に固有に標識され得るように、いずれか単独でまたはライゲーションされる断片の固有の特徴と組み合わせて、好適な数の実質的に固有のＳＭＩ配列を含む。当業者は、分子タグ化において、「好適な」数のＳＭＩ配列を伴うものが、様々な特定の因子（入力ＤＮＡ、ＤＮＡ断片化の種類、断片の平均サイズ、ゲノム内で配列決定される配列の複雑性対反復性など）に応じて、数桁程度変化することを理解するだろう。任意選択的に、アダプタ分子は、さらに、１つ以上のＰＣＲプライマー結合部位、１つ以上の配列決定プライマー結合部位、または両方を含む。別の実施形態では、ＤＳキットは、ＳＭＩ配列またはバーコードを含むアダプタ分子を含まないが、その代わりに、従来のアダプタ分子（例えば、Ｙ字型の配列決定アダプタなど）を含み、様々な方法ステップは、分子配列リードを関連付けるために、内因性ＳＭＩを利用してもよい。一部の実施形態では、アダプタ分子は、インデックスアダプタであり、および／またはインデックス配列を含む。他の実施形態では、インデックスは、キットに供給されるプライマーを使用して、ＰＣＲによる「尾部付加（ｔａｉｌｉｎｇ ｉｎ）」を通して、特定の試料に付加される。
一実施形態では、ＤＳキットは、非相補領域および／またはいくつかの他の鎖定義要素（ＳＤＥ）を各々有するアダプタ分子のセット、またはユーザがこれを生成するためのツール（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド）を含む。別の実施形態では、キットは、アダプタ分子の少なくとも１つのセットを含み、アダプタ分子の少なくともサブセットが、それぞれ、少なくとも１つのＳＭＩと少なくとも１つのＳＤＥとを含むか、またはこれらを生成するためのツールを含む。デュプレックス配列決定プロセスステップを行うのに好適な試料から核酸配列決定ライブラリを調製するためのプライマーおよびアダプタのさらなる特徴が、上に記載され、米国特許第９，７５２，１８８号、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／５９９０８号（２０１８年１１月８日出願）に開示され、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
これに加えて、キットは、さらに、例えば、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能）と共に使用するためのＳＹＢＲ（商標）ｇｒｅｅｎはたはＳＹＢＲ（商標）ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能）など、あるいは好適な蛍光分光計またはリアルタイムＰＣＲ機もしくはデジタルドロップレットＰＣＲ機で使用するためのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能）などのＤＮＡ結合色素などのＤＮＡ定量材料を含んでいてもよい。他のプラットフォームでのＤＮＡ定量に適した他の試薬も企図される。さらなる実施形態は、核酸サイズ選択試薬（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁気ビーズ、ゲル、カラム）、ベイト／プレイハイブリダイゼーションを用いた標的ＤＮＡ捕捉のためのカラム、ｑＰＣＲ試薬（例えば、コピー数決定のための）、および／またはデジタルドロップレットＰＣＲ試薬のうちの１つ以上を含むキットを含む。一部の実施形態では、キットは、任意選択的に、ライブラリ調製酵素（リガーゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡインテロゲーションのための逆転写酵素）、ｄＮＴＰ、緩衝液、捕捉試薬（例えば、ビーズ、表面、コーティングされた管、カラムなど）、インデックスプライマー、増幅プライマー（ＰＣＲプライマー）および配列決定プライマーのうちの１つ以上を含んでいてもよい。一部の実施形態では、キットは、エラーを起こしやすいＤＮＡポリメラーゼおよび／または高忠実度ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ損傷の種類を評価するための試薬を含んでいてもよい。特定の条件（例えば、高ＧＣリッチゲノム／標的）におけるＰＣＲまたはライゲーション反応のために、さらなる添加剤および試薬が企図される。
一実施形態では、キットは、さらに、試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを妨害するＤＮＡ配列のエラーを修復するＤＮＡエラー修正酵素を含む（疾患を引き起こす変異の修復と対比して）。非限定的な例として、酵素は、以下の、単機能性ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＳＭＵＧ１）、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ｎ－グリコシラーゼ／ＡＰ－リアーゼＮＥＩＬ１タンパク質（ｈＮＥＩＬ１）、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）、８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）、ヒト脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ１）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｎｄｏＩＩＩ）、エンドヌクレアーゼＩＶ（ＥｎｄｏＩＶ）、エンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｎｄｏＶＩＩＩ）、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥｎｄｏＩ）、Ｔ４ピリミジン二量体グリコシラーゼ（Ｔ４ＰＤＧ）、ヒト一本鎖選択的ヒトアルキルデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）などのうちの１つ以上を含み、これらを利用して、ＤＮＡ損傷（例えば、インビトロまたはインビボでのＤＮＡ損傷）を修正することができる。これらのＤＮＡ修復酵素のいくつかは、例えば、ＤＮＡから損傷した塩基を除去するグリコシラーゼである。例えば、ＵＤＧは、（シトシンの自発的な加水分解によって生じる）シトシン脱アミノ化から得られるウラシルを除去し、ＦＰＧは、８－オキソ－グアニン（例えば、活性酸素種から得られる共通のＤＮＡ病変）を除去する。ＦＰＧは、リアーゼ活性も有し、脱塩基部位に１塩基ギャップを生成することができる。かかる脱塩基部位は、例えば、ポリメラーゼがテンプレートをコピーすることができないため、その後にＰＣＲによって増幅することができない。したがって、かかるＤＮＡ損傷修復酵素および／またはここに列挙され、当該技術分野で既知の他のものを使用して、真の変異を有していないがそれ以外はエラーとして検出されない可能性がある損傷ＤＮＡを、効果的に除去することができる。
キットは、さらに、適切な対照、例えば、ＤＮＡ増幅対照、核酸（テンプレート）定量対照、配列決定対照、類似の生物源（例えば、健常な対象）に由来する核酸分子を含んでいてもよい。一部の実施形態では、キットは、細胞の対照集団を含んでいてもよい。したがって、キットは、対照を提供する好適な試薬（試験化合物、核酸、対照配列決定ライブラリなど）を含むことができ、希少な遺伝的バリアント（例えば、試料調製ステップに添加するか、または含めることができる疾患関連バリアント／変異を含む核酸分子）を含む試料について、プロトコルの確実性を決定する期待されるデュプレックス配列決定の結果を与える。一部の実施形態では、キットは、参照配列情報を含んでいてもよい。一部の実施形態では、キットは、細胞の集団中または無細胞ＤＮＡ試料中の１つ以上のＤＮＡバリアントを特定するのに有用な配列情報を含んでいてもよい。一実施形態では、キットは、試料を運搬するための容器、試料を安定化するための保管材料、試料を凍結するための材料、対象試料中のＤＮＡバリアントを検出するための分析用の細胞試料など、を含む。別の実施形態では、キットは、核酸汚染対照標準（例えば、試験生物または対象生物とは異なる生物におけるゲノム領域に対して親和性を有するハイブリダイゼーション捕捉プローブ）を含んでいてもよい。
キットは、さらに、ＰＣＲおよび配列決定緩衝液、希釈剤、対象試料抽出ツール（例えば、シリンジ、スワブなど）を含む、商業およびユーザの観点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器と、使用説明書を含む添付文書とを含んでいてもよい。これに加えて、ラベルが、上に記載のような使用のための指示書と共に、容器上に提供されてもよく、かつ／あるいはこの指示書および／または他の情報が、キットに含まれる添付書類、および／またはそれに提供されるウェブサイトアドレスを介して含まれていてもよい。キットは、例えば、試料管、プレートシーラー、マイクロ遠心分離管開口具、ラベル、磁気粒子分離器、フォームインサート、アイスパック、ドライアイスパック、断熱材など、実験器具も含んでいてもよい。
キットは、さらに、電子計算デバイス（例えば、ラップトップ／デスクトップコンピュータ、タブレットなど）にインストール可能な、またはネットワーク（例えば、リモートサーバ）を介してアクセス可能なコンピュータプログラム製品を含んでいてもよく、計算デバイスまたはリモートサーバは、デュプレックス配列決定分析ステップを含む操作を行うための命令を実行するように構成された１つ以上のプロセッサを備える。例えば、プロセッサは、生の配列決定リードまたは未分析配列決定リードを処理して、デュプレックス配列決定データを生成するための命令を実行するように構成されていてもよい。さらなる実施形態では、コンピュータプログラム製品は、対象または試料の記録（例えば、特定の対象または試料もしくは試料群に関する情報）と、ＤＮＡの標的化領域に関する経験的に導き出された情報と、を含むデータベースを含んでいてもよい。コンピュータプログラム製品は、コンピュータ上で実行されるとき、本明細書に開示される方法のステップを行う、非一時的コンピュータ可読媒体に具現化される（例えば、図４～６を参照）。
キットは、さらに、データ（例えば、配列決定データ、レポート、他のデータ）をアップロードし、ダウンロードするためのリモートサーバ（クラウドベースのサーバを含む）にアクセスするための命令および／またはアクセスコード／パスワードなど、またはローカルデバイスにインストールされるソフトウェアを含んでいてもよい。全ての計算作業は、リモートサーバで行われ、インターネット接続などを介してユーザ／キットユーザによってアクセスされてもよい。
検出および治療の方法
多くの希少な遺伝性疾患または障害は、症状が生じた後にのみ検出され、これは晩年になるか、または取り返しのつかない危害が生じた後にのみ生じ得るが、希少なアレル（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｌｅｌｅ）の存在についての個々の遺伝子検査は高額であり、一般に実用的ではない。しかしながら、本技術は、早期介入が可能となるように、疾患を引き起こす変異を検出し、アレルの保因者を特定する方法を提供する。例えば、疾患関連遺伝的バリアントを有する患者で、かかる疾患を発症するリスクがある患者は、疾患の発症を予防または遅延するために、疾患の重症度を低減するために、および／または疾患に関連するいくつかの症状を低減するために、予防的および／または治療的に処置することができる。他の実施形態では、疾患関連バリアントの保因者であるより高いリスクにある対象（例えば、リスクのある民族のメンバー、疾患の家族歴）をスクリーニングすることができ、また、必要に応じて生殖カウンセリングを提供することもできる。
一部の実施形態では、対象が疾患関連バリアントアレルの保因者である場合、対象は、遺伝毒性の疾患または障害の発症のリスクが著しく増加している（対象が劣性形質の疾患に関連するバリアントアレルのヘテロ接合性の保因者でない限り）。次いで、対象は、疾患または障害を治療するのに好適な薬剤または他の療法で予防的に治療される。追加的に、または代替的に、対象は、対象が疾患または障害の初期段階を発症したかどうかを検出するために、順次、診断検査（例えば、血液検査、さらなる遺伝子型決定など）および／または画像診断（例えば、ＣＡＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波、血清バイオマーカー検査など）および／または好適な医学的フォローアップ検査を受ける。非限定的な例として、ウィルソン病（例えば、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子の変異、銅輸送において役割を果たすＰ型ＡＴＰａｓｅ）に関して、対象は、患者の身体状態を評価するために必要に応じて、血液検査、尿検査、肝臓超音波検査、および肝臓生検を受けるように指示される可能性が高い。ウィルソン病は治療可能であり、症候前のホモ接合性の患者は、予防的に治療されるべきである。例えば、確認された患者は、臓器が損傷する前に、重金属毒用の薬物を用いて典型的なスケジュールに入ることができる。
多くの遺伝性疾患および障害について、予防的治療（すなわち、発症のリスクを予防または低減する）を提供する方法、および／または障害の重症度を低減する方法は、熟練した臨床医によく知られた治療プロトコルを含み、その疾患または障害に合わせて調整されるであろう。
ＩＶ．実験例
以下の節は、デュプレックス配列決定および関連試薬を使用したプーリングを介して多数の試料を遺伝子型決定するための方法の一部の限定的な実施例を提供する。
実施例１
患者ＤＮＡ試料をプールし、試料を効率的に遺伝子型決定して、遺伝的バリアントを有する患者を特定するための方法が、この実施例１に記載される。［図４］パネルＡ～Ｄは、本技術の一実施形態に従う、プーリングスキーム（パネルＡ）、プーリングスキームから生成されたルックアップテーブル（パネルＢ）、サブプールのインデックス化スキームから生成されたルックアップテーブル（パネルＣ）、およびルックアップテーブル（パネルＢおよびＣ）と共に使用して、特定された遺伝的バリアントを有する患者を特定することができるバリアントアレルを含むサブプールの特定を示す。
図４のパネルＡを参照すると、患者集団の各患者から抽出された生体試料は、サブプール（例えば、患者のサブセットからプールされた試料混合物）の固有のまたは実質的に固有の組み合わせにアリコートされる。パネルＡに示される非限定的な例では、患者試料を４つのサブプールの各々にアリコートする。例示的な目的で、試料の分布パターンが、患者１、４、１２、および１５（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ１２、Ｐ１５）についてのみ示されている。加えて、番号付けられた１５人の患者および番号付けられた８つのサブプールのみが図示されているが、当業者は、患者試料の数が、示されている数（例えば、患者「ＰＮ」が図示されている）よりも多くても、少なくてもよいことを理解するであろう。同様に、当業者は、サブプールの数が、パネルＡに示されている数よりも多くても、少なくてもよいことを理解するであろう（例えば、サブプール「Ｎ」が示されている）。各試料がサブプールの固有のまたは実質的に固有の組み合わせにアリコートされるようにプーリングパターンを確立したら、パネルＢに示されるように、パターンを、ルックアップテーブルに記録することができる。この実施形態では、サブプールの組み合わせは、固有の試料識別子として機能する。例えば、患者１（Ｐ１）の固有の試料識別子は１－２－３－４であり、一方、患者４（Ｐ４）に割り当てられた固有の試料識別子は１－３－５－６である。図示された例では、患者試料は、固有の試料識別子間の編集距離が少なくとも２のサブプールにアリコートされる（例えば、少なくとも２つのプールが、各試料のサブプールの組み合わせ間で異なる）。
サブプールが集まると、配列決定ライブラリ調製ステップが実行される。一実施形態では、インデックス配列は、特定のサブプールに由来するＤＮＡ分子から生成されるすべての配列リードが、後で分析のためにグループ化され得るように、アダプタタグ化二本鎖ＤＮＡ分子に付加される。例えば、図４のパネルＣに示すように、ルックアップテーブルを生成して、そのサブプール識別番号（例えば、１、２、３、４など）を、使用された特定のインデックス配列と相関させることができる。これらのインデックス配列は、例示目的で、ＡＡＡ、ＢＢＢ、ＣＣＣなどとして特定される。当業者は、インデックスバーコードの割り当てを特定するルックアップテーブルが、使用された実際のヌクレオチド配列、またはインデックス配列のセットのうちのどれがサブプールに割り当てられたのかを特定するための他のコードを含み得ることを理解するであろう。
サブプールされた試料混合物をインデックス化した後、サブプールを一緒に組み合わせ、組み合わされた混合物中のアダプタタグ付きＤＮＡ分子を配列決定することができる。一実施形態では、デュプレックス配列決定を使用して、バリアントアレルを特定することができるように、高精度のＤＮＡ配列リードを提供することができる。配列リードがエラー修正されると、それらは、ルックアップテーブル（パネルＣ）を使用して、インデックス配列（例えば、ＡＡＡ、ＢＢＢ、ＣＣＣなど）を認識することによって、元のサブプールの割り当てに従ってグループ化することができる。
図４に例証されるように、およびこの非限定的な例では、バリアントアレル（「バリアント１」）がサブプール１、３、５、６に特定された。パネルＡのルックアップテーブルを参照すると、患者４（Ｐ４）は、サブプール１、３、５、および６の組み合わせでＤＮＡ試料を有する唯一の患者として特定される。この例では、患者４（Ｐ４）は、バリアント１の保因者として特定される。
実施例２
一例では、薬物は、疾患に関連する３つの遺伝子（遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ）のうちの１つにおける機能の喪失を有する患者を救済することが知られている。機能の喪失は、典型的には、遺伝子についての個体の母方アレルおよび父方アレルの両方で生じる機能喪失バリアントの結果として生じる。加えて、機能喪失バリアントは、これらの遺伝子全体を通していくつもの部位で発生する。
薬物から治療的に利益を受けるであろう個体の亜集団を特定するために、１，９８５個の患者試料のバイオバンクを、遺伝子Ａ、Ｂ、およびＣに対応する標的ゲノム遺伝子座における既知の機能喪失変異についてスクリーニングする。標的疾患バリアントがゲノムの数キロ塩基にまたがる可能性があるため、変異体アレルについてのＰＣＲスクリーニングは、効果的なスクリーニングツールではない。ＮＧＳは、３つ全ての疾患関連遺伝子にわたってバリアントを検出することができるが、次世代配列決定のために１，９８５個の試料を個別に調製するコストは非常に高い。
一例では、プロトコルは次のとおりである：
バイオバンク試料ＤＮＡが集められる４０の「サブプール」を作成する。
２つの試料が互いに２つを超えるサブプールを共有しないように、１，９８５個の試料の各々を４つの固有の組み合わせのサブプールにアリコートする。
得られた４０個のサブプールは、各々平均で約２００試料のアリコートを含む。
ヘテロ接合性疾患アレルを有する集団中の未知の患者の場合、かかるアレルは、その患者の試料がアリコートされた任意の特定のサブプールの１／４００の存在量で存在するであろう。
患者が遺伝子に複合ヘテロ接合性の機能喪失変異を有している場合、すなわち、遺伝子の２つの異なるバリアントについてヘテロ接合性である場合、これらのバリアントの各々は、その患者の試料がアリコートされたサブプールに１／４００の存在量で存在するであろう。
従来のＮＧＳは、約１％のエラー率を有しており、試料中のかかる低い存在量のバリアントを検出可能にするには高すぎる（例えば、１／４００の存在量を有するバリアントは、配列決定エラーと区別がつかないであろう。エラー修正配列決定方法を使用して、１／４００などの低い存在量のバリアントを検出する。一実施形態では、エラー修正配列決定方法は、デュプレックス配列決定である。別の実施形態では、他のコンセンサス配列決定方法（例えば、一本鎖コンセンサス配列決定）は、低い存在量のバリアントを検出することができる。
一例では、デュプレックス配列を使用して、１，９８５個の患者試料が４０個のサブプールの間で分配されるように、４０個のサブプールの各々を調査し、それによって、４０個の配列決定ライブラリ（各サブプールされた試料混合物につき１つ）のみを調製する必要がある。
希少なアレルを有する各患者は、そのＤＮＡが一意的にアリコートされた４つのサブプール中の遺伝的バリアントを特定することによって、特定することができる。
各試料が一意的にアリコートされる４つのサブプールは、他のすべての固有の試料識別子から区別可能な固有の試料識別子として機能する。特定の実施例では、各試料は、少なくとも２つのプールで異なる固有の試料識別子を有し得る。この設計は、様々なエラーに対して頑強である。例えば、希少なバリアントが１つのサブプールで検出されない場合、試料が誤って追加のサブプールにアリコートされている場合、試料が誤って１つの間違ったサブプールにアリコートされている場合、またはバリアントを含むＤＮＡ分子が特定のサブプールでの配列データを提供し損なう場合、試料は依然として一意的に特定可能であり得る。
この実施例の結果は、個体が２つの異なる疾患アレルを有する場合、複合ヘテロ接合性疾患の保因者を特定することができる。これらのアレルの各々は、固有の試料識別子に基づいて、個体に関連付けることができる。疾患アレルは、互いにシスまたはトランスのいずれかに当てはまり得るが、アレルがトランスで生じる可能性が高く、複合ヘテロ接合体を特定し、フォローアップの確証的な配列決定に好適であり得る。
さらに、結果は、多数の試料からのホモ接合性疾患アレルの保因者を特定することができる。例えば、個体が疾患アレルの２つのコピーを有している場合、アレルは、患者の固有の試料識別子（例えば、固有のサブプールセット）に存在すると共に、ヘテロ接合性バリアントのアレル頻度の２倍で存在する。したがって、患者試料がアリコートされたサブプールが、ヘテロ接合性バリアントの予想されるアレル頻度のおよそ２倍を示す場合、その患者は、推定のホモ接合性の保因者として特定することができ、確証的な配列決定が指示される。
Ｖ．遺伝子型の複合混合物を逆重畳するためのシステムおよび計算環境の実施形態
好適な計算環境
以下の考察は、本開示の態様が実装され得る好適な計算環境の一般的な説明を提供する。必要とされるわけではないが、本開示の態様および実施形態は、汎用コンピュータ（例えば、サーバまたはパーソナルコンピュータ）によって実行されるルーチンなどのコンピュータで実行可能な命令の一般的な観点で記載される。当業者であれば、本開示を、インターネット家電、携帯機器、ウェアラブルコンピュータ、セルラーホンまたは携帯電話、マルチプロセッサシステム、マルチプロセッサを使用した家電またはプログラム可能な家電、セットトップボックス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータなどを含む他のコンピュータシステム構成を用いて実施することができることを理解するだろう。本開示は、以下に詳細に説明するコンピュータで１つ以上の実行可能な命令を実行するように具体的にプログラミングされ、構成されているか、または構築された特殊用途のコンピュータまたはデータプロセッサで具現化されてもよい。実際に、「コンピュータ」という用語は、本明細書で一般的に使用される場合、上述のデバイスのいずれかだけではなく、任意のデータプロセッサを指す。
本開示は、分散計算環境でも実施可能であり、タスクまたはモジュールは、リモート処理デバイスによって行われ、これらは、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）、ワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）またはインターネットなどの通信ネットワークを介して接続している。分散計算環境において、プログラムモジュールまたはサブルーチンは、ローカルメモリ記憶デバイスおよびリモートメモリ記憶デバイスの両方に配置されてもよい。以下に記載される本開示の態様は、チップ（例えば、ＥＥＰＲＯＭチップ）中のファームウェアに格納されているか、またはインターネットまたは他のネットワーク（無線ネットワークを含む）によって電子的に分散される磁気および光学的に読み取り可能かつ除去可能なコンピュータディスクを含め、コンピュータ可読媒体に格納されるか、または分散されてもよい。当業者は、本開示の一部が、サーバコンピュータに存在していてもよく、一方、対応する部分がクライアントコンピュータに存在していてもよいことを理解するだろう。本開示の態様に特有のデータ構造およびデータの伝送も、本開示の範囲内に包含される。
コンピュータの実施形態（例えば、パーソナルコンピュータまたはワークステーション）は、１つ以上のユーザ入力デバイスおよびデータ格納デバイスに接続された１つ以上のプロセッサを含んでいてもよい。コンピュータは、少なくとも１つの出力デバイス（例えば、表示デバイス）および１つ以上の任意選択的なさらなる出力デバイス（例えば、プリンタ、プロッタ、スピーカ、触覚または嗅覚による出力デバイスなど）にも接続されてもよい。コンピュータは、例えば、任意要素のネットワーク接続、無線送受信機、またはこれら両方によって、外部のコンピュータに接続していてもよい。
様々な入力デバイスは、キーボードおよび／またはポインティングデバイス（例えば、マウス）を含んでいてもよい。マイクロホン、ジョイスティック、ペン、タッチスクリーン、スキャナ、デジタルカメラ、ビデオカメラ、など、他の入力デバイスが可能である。さらなる入力デバイスは、シーケンサー（例えば、超並列シーケンサー）、蛍光顕微鏡および他の実験機器などを含んでいてもよい。好適なデータ記憶デバイスは、コンピュータによってアクセス可能なデータを記憶することができる任意の種類のコンピュータ可読媒体、例えば、磁気ハードドライブおよびフロッピーディスクドライブ、光学ディスクドライブ、磁気カセット、テープドライブ、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、ベルヌーイカートリッジ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、スマートカードなどを含んでいてもよい。実際に、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）またはインターネットなどのネットワークに対する接続ポートまたはノードを含め、コンピュータ可読命令およびデータを記憶または送信するための任意の媒体を使用してもよい。
本開示の態様は、様々な他の計算環境で実施され得る。例えば、ネットワークインターフェースを備える分散計算環境は、システムに１つ以上のユーザコンピュータを含んでもよく、それらは、インターネットのワールドワイドウェブ部分内のウェブサイトを含めて、コンピュータにアクセスおよびインターネットとのデータ交換を可能にするブラウザプログラムモジュールを含んでいてもよい。ユーザコンピュータは、他のプログラムモジュール（例えば、オペレーティングシステム）、１つ以上のアプリケーションプログラム（例えば、ワードプロセシングまたはスプレッドシートアプリケーション）などを含んでいてもよい。コンピュータは、様々な種類のアプリケーションを実行するようにプログラミング可能な汎用デバイスであってもよいか、あるいはコンピュータは、特定の機能または機能群に最適化されるか、または限定される専用デバイスであってもよい。より重要なことに、ネットワークブラウザで示されるが、以下に詳細に記載されるように、ユーザにグラフィカルユーザインターフェースを提供するための任意のアプリケーションプログラムを使用してもよい。ウェブブラウザおよびウェブインターフェースの使用は、本明細書でよく知られている例としてのみ使用される。
インターネットまたはワールドワイドウェブ（「ウェブ」）に接続した少なくとも１つのサーバコンピュータは、本明細書で記載する電子メッセージ（例えば、ウェブページ、データストリーム、音声信号および電子画像）を受信し、ルーティングし、格納するための機能の多くまたは全てを実行することができる。インターネットが示されているが、イントラネットなどのプライベートネットワークが、いくつかの用途では実際に好ましい場合がある。ネットワークは、クライアントサーバアーキテクチャを有していてもよく、このとき、コンピュータは、他のクライアントコンピュータにサービスを提供するための専用コンピュータであるか、またはピアツーピアなどの他のアーキテクチャを有していてもよく、このとき、１つ以上のコンピュータは、サーバおよびクライアントとして同時に機能する。サーバコンピュータに接続するデータベースまたは複数のデータベースは、ユーザコンピュータ間で交換されるウェブページおよびコンテンツの多くを格納することができる。データベースを含むサーバコンピュータは、システムに対する悪意のある攻撃を阻止し、それに格納されるメッセージおよびデータの完全性を維持するためのセキュリティ対策（例えば、ファイアウォールシステム、セキュアソケットレイヤ（ＳＳＬ）、パスワード保護スキーム、暗号化など）を採用していてもよい。
好適なサーバコンピュータは、特に、サーバエンジン、ウェブページ管理要素、コンテンツ管理要素およびデータベース管理要素を含んでいてもよい。サーバエンジンは、基本的な処理と、オペレーションシステムレベルタスクを実行する。ウェブページ管理要素は、ウェブページの作成および表示またはルーティングを処理する。ユーザは、これに関連付けられたＵＲＬを用い、サーバコンピュータにアクセスしてもよい。コンテンツ管理要素は、本明細書に記載する実施形態の機能の大部分を処理する。データベース管理要素は、データベースに関する格納および検索タスク、データベースへのクエリ、データベースの読み込み書き出し機能、および動画、グラフィックおよび音響信号などのデータの格納を含む。
本明細書に記載される機能ユニットの多くは、それらの実装独立性をより特定的に強調するために、モジュールと分類されている。例えば、モジュールは、様々な種類のプロセッサによる実行のためのソフトウェアで実装され得る。実行可能コードの識別されたモジュールは、例えば、コンピュータ命令の１つ以上の物理ブロックまたは論理ブロックを含み、この１つ以上の物理ブロックまたは論理ブロックは、例えば、オブジェクト、手順または機能として整理され得る。コンピュータ命令の特定されたブロックは、物理的に一緒に配置される必要はないが、異なる位置に格納される異なる命令を含んでいてもよく、論理的に共に結合された場合、モジュールを含み、そのモジュールの指定された目的を達成する。
モジュールはまた、カスタムＶＬＳＩ回路またはゲートアレイ、論理チップなどの既製品の半導体、トランジスタまたは他の別個の要素を含むハードウェア回路として実装されてもよい。モジュールはまた、現場でプログラム可能なゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇａｔｅ ａｒｒａｙ）、プログラム可能なアレイロジック、プログラム可能なロジックデバイスなどのプログラム可能なハードウェアデバイスにも実装され得る。
実行可能コードのモジュールは、単一の命令、または多くの命令であってもよく、異なるプログラムの中で、いくつかのメモリデバイスにわたって、いくつかの異なるコードセグメントに分散されてもよい。同様に、操作データは、本明細書ではモジュール内で特定され、示されてもよく、任意の好適な形態で具現化され、任意の好適な種類のデータ構造で具現化されてもよい。操作データは、単一のデータセットとして収集されてもよいか、または異なる記憶デバイスにわたって含む異なる位置に分散されてもよく、システムまたはネットワークに対する単なる電子信号として少なくとも部分的に存在していてもよい。
複数の試料を効率的に遺伝子型決定するためのシステム
本発明は、さらに、核酸混合物を含む生体試料を処理し、有線または無線のネットワークを介して配列決定データをサーバに送信して、試料のエラー修正配列リード（例えば、デュプレックス配列リード、デュプレックスコンセンサス配列など）、遺伝子型の特定、個々の／起因性の遺伝子型の定量などを決定するシステム（例えば、ネットワーク型コンピュータシステム、ハイスループット自動化システムなど）を含む。
以下にさらに詳細に説明するように、また、図５に示される実施形態に関して、複数の試料を効率的に遺伝子型決定するためのコンピュータ化システムは、（１）サーバと（例えば、リモートサーバ、またはローカルに格納されたサーバ）（２）配列決定データを生成および／または送信することが可能な複数のユーザ電子計算デバイスと、（３）任意選択的に、既知の遺伝子型および関連情報（任意選択的）を含むデータベースと、（４）電子計算デバイス、データベース、およびサーバとの間の電子通信を送信するための有線または無線のネットワークと、を備える。このサーバは、さらに、（ａ）遺伝子型プロファイル（例えば、バリアントアレルのプロファイル）、患者の識別、経験的に導き出された疾患関連変異および関連情報の記録を記憶するデータベースと、（ｂ）メモリに通信可能に接続された１つまたは複数のプロセッサと、プロセッサのための命令を含む１つ以上の非一時的コンピュータ可読記憶デバイスまたは媒体と、を備え、当該プロセッサは、図６～７に記載の１つ以上のステップを含む操作を行うための当該命令を実行するように構成されている。
一実施形態では、本技術は、命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体をさらに含み、命令は、１つ以上のプロセッサによって実行されると、サブプールされた試料混合物中の１つ以上のバリアントアレルの存在、サブプールされた試料混合物中の各特定されたバリアントアレルの定量、サブプールされた試料混合物中に誰の遺伝物質が存在するのかデータベースからの対象／個体の同一性、複数の不明な遺伝子型のサブプールされた試料混合物を逆重畳することなどを決定するための方法を行う。特定の実施形態では、本方法は、図６～７に記載の１つ以上のステップを含んでいてもよい。
本技術のさらなる態様は、サブプールされた試料混合物中の１つ以上のバリアントアレルの存在、サブプールされた試料混合物中の各特定されたバリアントアレルの定量、サブプールされた試料混合物中に誰の遺伝物質が存在するのかデータベースからの対象／個体の同一性、複数の不明な遺伝子型のサブプールされた試料混合物を逆重畳することなどを決定するためのコンピュータ化された方法を対象とする。特定の実施形態では、本方法は、図６～７に記載の１つ以上のステップを含んでいてもよい。
図５は、複数の生体試料を効率的に遺伝子型決定するための、本明細書に開示される方法と共に使用するためのコンピュータシステム５００（コンピュータプログラム製品５５０がそれにインストールされている）のブロック図である。図５は、様々な計算システム要素を示しているが、当業者に既知の他のまたは異なる構成要素（例えば上に記載のもの）が、本開示の態様が実装され得る好適な計算環境を提供し得ることが企図される。図６は、本技術の一実施形態に従う、デュプレックス配列決定のコンセンサス配列データを提供するためのルーチンを示すフロー図である。図７は、サブプールされた試料混合物中に存在するバリアントアレルを特定し、および／または定量し、バリアントアレルを有する対象／個体を特定するための様々なルーチンを示すフロー図である。本技術の態様に従って、図７に関して記載される方法は、例えば、サブプールされた試料混合物中に存在する遺伝子型、バリアントアレルを含むサブプールされた試料混合物内で表される独立した生物源の同一性、および集団内の既知の遺伝子型およびＶＡＦのデータセットとの試料データの比較から導き出される情報を含む、試料データを提供することができる。
図５に示されるように、コンピュータシステム５００は、複数のユーザ計算デバイス５０２、５０４と、有線または無線のネットワーク５１０と、複数の試料中に存在するバリアントアレルを分析し、バリアントアレルに寄与する個々の試料を特定する（例えば、サブプールされた試料混合物から固有の試料識別子を分離して、複数の試料の中からバリアントアレルの寄与者を特定する）ためのプロセッサを含むサーバ（「ＤｕｐＳｅｑ（商標）」サーバ）５４０と、を含み得る。複数の実施形態では、ユーザ計算デバイス５０２、５０４を使用して、配列決定データを生成および／または送信することができる。一実施形態では、計算デバイス５０２、５０４のユーザは、遺伝物質の複数の生物源を効率的に遺伝子型決定するための生体試料のデュプレックス配列決定方法のステップ（例えば、かかるソースをバリアント疾患アレルについてスクリーニングするための）など、本技術の他の態様を行うユーザであってもよい。一実施例では、計算デバイス５０２、５０４のユーザは、本技術の一実施形態に従って、試薬および／またはアダプタを含むキット（１、２）を用いた特定のデュプレックス配列決定方法のステップを行って、生体試料を調査する。
図示されるように、各ユーザ計算デバイス５０２、５０４は、少なくとも１つの中央処理ユニット５０６と、メモリ５０７と、ユーザおよびネットワークのインターフェース５０８と、を含む。一実施形態では、ユーザデバイス５０２、５０４は、デスクトップ、ラップトップ、またはタブレットコンピュータを含む。
２つのユーザ計算デバイス５０２、５０４が示されているが、任意の数のユーザ計算デバイスがシステム５００の他の構成要素に含まれていてもよいか、または接続されていてもよいことが企図される。これに加え、計算デバイス５０２、５０４はまた、試料を増幅し、配列決定するためのユーザ（１）およびユーザ（２）によって使用される複数のデバイスおよびソフトウェアの代表であってもよい。例えば、計算デバイスは、配列決定機（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（商標）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）ＰＧＭ、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンサー、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ（商標）など）、リアルタイムＰＣＲ機（例えば、ＡＢＩ ７９００、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）など）、マイクロアレイ機器など、であってもよい。
上に記載の構成要素に加えて、システム５００は、さらに、遺伝子型プロファイル、患者同一性、疾患関連変異、および関連情報を記憶するためのデータベース５３０を備えてもよい。例えば、サーバ５４０によってアクセス可能なデータベース５３０は、疾患関連変異、集団ベースの遺伝情報、および疾患関連バリアントアレル（例えば、試料プーリングパターンの情報）を有する試料の患者識別を分離するためのサブプーリングの参照チャートの記録または収集物を含んでもよい。特定の実施例では、データベース５３０は、遺伝子型プロファイル５３２を含む第三者のデータベース（例えば、既知の疾患関連変異、１つ以上のゲノム遺伝子座における患者の遺伝子型）であってもよい。例えば、疾患関連ゲノム遺伝子座の核酸配列を含む様々な遺伝子研究データベースを、特定の用途に関して照会することができる。別の実施形態では、このデータベースは、サーバ５４０とは別個にホスティングされた自立型データベース５３０（プライベート、またはプライベートではないもの）であってもよく、またはデータベースは、サーバ５４０（経験的に導かれた遺伝子型プロファイル５７２を含むデータベース５７０など）上にホスティングされていてもよい。一部の実施形態では、システム５００を使用して新しい遺伝子型プロファイルを生成するため、システム５００および関連する方法（例えば、本明細書に記載の方法、および、例えば、図６～７に記載の方法）の使用から生成されたデータをデータベース５３０および／または５７０にアップロードすることができ、そうすることで、追加の遺伝子型プロファイル５３２、５７２を将来の比較活動のために生成することができる。
サーバ５４０は、ユーザ計算デバイス５０２、５０４からの配列決定データ（例えば、生の配列決定ファイル）および関連情報を、ネットワーク５１０を介して受信し、計算し、分析するように構成されていてもよい。試料特有の生の配列決定データは、デバイス５０２、５０４にインストールされているか、もしくはネットワーク５１０を介してサーバ５４０からアクセス可能なコンピュータプログラム製品／モジュール（配列モジュール５０５）を使用して、または当該技術分野で周知である他の配列決定ソフトウェアを使用して、ローカルに計算されてもよい。次いで、生の配列データは、ネットワーク５１０を介してサーバ５４０に送信されてもよく、ユーザ結果５７４は、データベース５７０に記憶されてもよい。サーバ５４０は、データベース５７０から生の配列決定データを受信するように構成され、また、例えば、本明細書に開示されるデュプレックス配列決定技術を使用してエラー修正二本鎖の配列リードを計算的に生成するように構成された、プログラム製品／モジュール「ＤＳモジュール」５１２も含む。ＤＳモジュール５１２は、サーバ５４０上に示されているが、当業者は、ＤＳモジュール５１２が、代替的にデバイス５０２、５０４、または別のサーバ（図示せず）上にホスティングされ得ることを認識するであろう。
サーバ５４０は、少なくとも１つの中央処理ユニット（ＣＰＵ）５６０、ユーザおよびネットワークインターフェース５６２（またはサーバに接続されたインターフェースを有するサーバ専用コンピューティングデバイス）、既知および未知の生物源の遺伝子型プロファイル５７２を記憶するための複数のコンピュータファイル／記録を有する上記のようなデータベース５７０、および試験された試料についての結果を記憶するためのファイル／記録５７４（例えば、生のシーケンスデータ、デュプレックス配列決定データ、バリアントアレル分析、個々の試料特定など）を含み得る。本技術の態様に従って、サーバ５４０は、コンピュータメモリ５１１をさらに含み、それに記憶された遺伝子型コンピュータプログラム製品（遺伝子型モジュール）５５０を有する。
コンピュータプログラム製品／モジュール５５０は、非一時的コンピュータ可読媒体に具現化され、コンピュータ（例えば、サーバ５４０）上で実行されると、ゲノムバリアント（例えば、希少なバリアント）を検出し、複数の供給源の中からゲノムバリアントの個々の供給源を効率的に特定し、サブプールされた試料混合物を個々の遺伝子型に分離し、かつ／またはサブプールされた試料混合物の中のＶＡＦを定量するための、本明細書に開示される方法のステップを行う。本開示の別の態様は、コンピュータプログラム製品／モジュール５５０を含み、非一時的コンピュータ使用可能媒体を備え、それに具現化されたコンピュータ可読プログラムコードまたは命令を有し、プロセッサが遺伝子型分析（例えば、バリアントアレルの計算、特定されたバリアントアレルの定量、寄与する生物源への混合物の分離、遺伝子型の比較レポートなど）を実行することを可能にする。これらのコンピュータプログラム命令は、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置にロードされて、マシンを生成してもよく、その結果、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置で実行する命令が、本明細書に記載の機能またはステップを実装する手段を生成する。これらのコンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置に特定の様式で機能させるように命令し得るコンピュータ可読メモリまたは媒体に格納されてもよく、その結果、コンピュータ可読メモリまたは媒体に格納される命令は、分析を実施する命令手段を含む製造物品を生成する。また、コンピュータプログラムの命令を、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置にロードして、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置で行われる一連の操作ステップに、コンピュータに実装されるプロセスを生成させてもよく、その結果、コンピュータまたは他のプログラム可能な装置で実行する命令は、上に記載の機能またはステップを実装するためのステップを提供する。
さらに、コンピュータプログラム製品／モジュール５５０は、任意の好適な言語および／またはブラウザに実装されてもよい。例えば、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｊａｖａ、Ｓｃａｌａ、Ｃ言語で実装されてもよく、好ましくは、オブジェクト指向高レベルプログラミング言語、例えば、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、ＳｍａｌｌＴａｌｋ、Ｃ＋＋などを用いて実装されてもよい。アプリケーションは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）２０００、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）ＮＴなどを含むＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）環境などの環境に適するように書かれていてもよい。これに加え、アプリケーションは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（商標）、ＳＵＮ（商標）、ＵＮＩＸまたはＬＩＮＵＸ環境のために書かれていてもよい。これに加え、機能ステップは、ユニバーサルプログラミング言語またはプラットフォームに依存しないプログラミング言語を使用して実装されてもよい。かかるマルチプラットフォームプログラミング言語の例として、限定されないが、ハイパーテキストマークアップランゲージ（ＨＴＭＬ）、ＪＡＶＡ（商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（商標）、フラッシュプログラミング言語、コモンゲートウェイインターフェース／ストラクチャードクエリーランゲージ（ＣＧＩ／ＳＱＬ）、プラクティカルエクストラクションレポートランゲージ（ＰＥＲＬ）、ＡｐｐｌｅＳｃｒｉｐｔ（商標）および他のシステムスクリプト言語、プログラミングランゲージ／ストラクチャードクエリーランゲージ（ＰＬ／ＳＱＬ）などが挙げられる。Ｊａｖａ（商標）またはＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（商標）に対応するブラウザ、例えば、ＨｏｔＪａｖａ（商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（商標）またはＦｉｒｅｆｏｘ（商標）を使用してもよい。アクティブコンテンツウェブページが使用される場合、Ｊａｖａ（商標）アプレットまたはＡｃｔｉｖｅ（商標）コントロールまたは他のアクティブコントロール技術を含んでいてもよい。
システムは、多くのルーチンを呼び出す。ルーチンのいくつかが本明細書に記載されるが、当業者は、システムが実行することができる他のルーチンを特定することができる。さらに、本明細書に記載されるルーチンは、様々な様式で変更することができる。例として、図示されたロジックの順序は、並べ替えてもよく、サブステップを並列で行ってもよく、図示されたロジックを省略してもよく、他のロジックを含んでもよい、など。
図６は、試料（例えば、サブプールされた混合物からの試料）中の二本鎖核酸分子についてのデュプレックス配列決定データを提供するためのルーチン６００を示すフロー図である。ルーチン６００は、計算デバイス（例えば、クライアントコンピュータまたはコンピュータネットワークに接続するサーバコンピュータ）によって呼び出されてもよい。一実施形態では、計算デバイスは、配列データ生成部および／または配列モジュールを含む。一例として、計算デバイスは、操作者が計算デバイスと通信するユーザインターフェースに接続した後、ルーチン６００を呼び出してもよい。
ルーチン６００は、ブロック６０２で開始し、配列モジュールは、ユーザ計算デバイスから生の配列データを受信し（ブロック６０４）、サブプール中の複数の核酸分子に由来する複数の生の配列リードを含むサブプール特有のデータセットを生成する（ブロック６０６）。一部の実施形態では、サーバは、後で処理するために、データベースにサブプール特有のデータセットを記憶することができる。次に、ＤＳモジュールは、サブプール特有のデータセット中の生の配列データからデュプレックスコンセンサス配列決定データを生成するための要求を受信する（ブロック６０８）。ＤＳモジュールは、元の二本鎖核酸分子を表すファミリーからの配列リードをグループ分けし（例えば、ＳＭＩ配列に基づいて）、個々の鎖からの代表的な配列を互いに比較する（ブロック６１０）。一実施形態では、代表的な配列は、各々の元の核酸分子からの１つまたは１つより多い配列リードであってもよい。別の実施形態では、代表的な配列は、代表的な鎖内の整列およびエラー修正から生成される一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）であってもよい。かかる実施形態では、第１の鎖からのＳＳＣＳを、第２の鎖からのＳＳＣＳと比較することができる。
ブロック６１２で、ＤＳモジュールは、比較された代表的な鎖間で相補性を有するヌクレオチド位置を特定する。例えば、ＤＳモジュールは、比較された（例えば、整列された）配列リードに沿って、ヌクレオチド塩基コールが一致するヌクレオチド位置を特定する。さらに、ＤＳモジュールは、比較された代表的な鎖間で相補性を有さない位置を特定する（ブロック６１４）。したがって、ＤＳモジュールは、比較された（例えば、整列された）配列リードに沿って、ヌクレオチド塩基コールが一致しないヌクレオチド位置を特定することができる。
次に、ＤＳモジュールは、サブプールされた試料混合物中の二本鎖核酸分子についてのデュプレックス配列決定データを提供することができる（ブロック６１６）。かかるデータは、処理された配列リード各々について、二重鎖コンセンサス配列の形態であってもよい。二重鎖コンセンサス配列は、一実施形態では、元の核酸分子の各鎖からの代表的な配列が一致しているヌクレオチド位置のみを含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、一致しない位置は、二重鎖コンセンサス配列がエラー修正された高精度の配列リードであるように、除外するか、または考慮しなくてもよい。別の実施形態では、デュプレックス配列決定データは、一致しないヌクレオチド位置をさらに分析することができるように（例えば、ＤＮＡ損傷を評価することができる場合に）、一致しないヌクレオチド位置に対するレポート情報を含んでいてもよい。ルーチン６００は、次いで、ブロック６１８に続き、そこで終了してもよい。
図７は、核酸混合物中に存在するバリアントアレルを検出し、特定し、定量化して、バリアントアレルの元の寄与源を特定するためのルーチン７００を示すフロー図である。ルーチンは、図５の計算デバイスによって呼び出すことができる。ルーチン７００は、ブロック７０２で開始し、遺伝子型モジュールは、図６からのデュプレックス配列決定データ（例えば、ブロック６１６の後）を分析して、個々のＤＮＡ分子内に存在するバリアントアレルを特定し（ブロック７０４）、存在する各バリアントアレルのサブプールの特定を決定し（ブロック７０６）、各サブプール内の各バリアントアレルの総数を合計する（ブロック７０８）。次に、遺伝子型モジュールは、バリアントアレルを含むサブプールの組み合わせを元の試料の混合パターンと相関させて、供給源の集団の中からバリアントアレルの元のソースを特定する（ブロック７１０）。したがって、サブプールされた試料混合物のバリアントアレルの分析は、核酸混合物に寄与する元の生物源に関する情報を提供することができる。
次に、遺伝子型モジュールは、データベース中のサブプール特有または試料特有のデータセットに記憶され得る遺伝子型データを提供することができる（ブロック７１２）。ルーチン７００は、次いで、ブロック７１４に続き、そこで終了してもよい。
ＶＩ．さらなる実施例
１．プーリングを介して複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法であって、
複数の生体試料を固有の組み合わせのサブプールにプールすることであって、各生体試料が標的二本鎖ＤＮＡ分子を含む、プールすることと、
複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することと、
エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、
バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、バリアントアレルを含有する元の生体試料を決定することと、を含む、方法。
２．遺伝的バリアントについて生物源をスクリーニングするための方法であって、
生物源に由来する複数の生体試料を固有の組み合わせのサブプールにアリコートすることであって、各生体試料は標的二本鎖ＤＮＡ分子を含み、各生体試料は２つ以上のサブプールにアリコートされる、アリコートすることと、
複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することと、
エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、
バリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、バリアントアレルを含有する生物源を決定することと、を含む、方法。
３．エラー修正配列リードを生成することが、
複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子にアダプタ分子をライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成することと、
複数のアダプタ－ＤＮＡ分子の各々について、アダプタ－ＤＮＡ分子の元の第１の鎖のコピーのセット、およびアダプタ－ＤＮＡ分子の元の第２の鎖のコピーのセットを生成することと、
元の第１の鎖および第２の鎖の１つ以上のコピーを配列決定して、第１の鎖の配列および第２の鎖の配列を提供することと、
第１の鎖の配列と第２の鎖の配列とを比較して、第１の鎖の配列と第２の鎖の配列との間の１つ以上の対応関係を特定することと、を含む、事例１または事例２に記載の方法。
４．サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することが、配列決定の前に、１つ以上の標的ゲノム領域を選択的に富化することをさらに含む、事例１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．１つ以上の標的ゲノム領域が、疾患原因変異を有することが知られている遺伝子を含む、事例４に記載の方法。
６．疾患原因変異が、機能喪失変異、機能獲得変異、または優性阻害変異であるか、またはそれを含む、事例５に記載の方法。
７．１つ以上の標的ゲノム領域が、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子座を含む、事例１～４のいずれか一項に記載の方法。
８．疾患または障害が、希少な遺伝性障害である、事例７に記載の方法。
９．疾患または障害が、単一遺伝子障害または２つ以上の遺伝子における変異を伴う複合障害である、事例７または事例８に記載の方法。
１０．疾患または障害が、常染色体劣性変異に関連する、事例７～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．疾患または障害が、常染色体優性変異に関連する、事例７～９のいずれか一項に記載の方法。
１２．エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することが、エラー修正配列を、参照ゲノムＤＮＡ配列と比較することを含む、事例１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．各サブプールの複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の中から１つ以上のバリアントの頻度を決定することをさらに含む、事例１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．バリアントアレルを含む生体試料の生物源ドナーが、バリアントアレルについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかを決定することをさらに含む、事例１３に記載の方法。
１５．１つ以上の標的ゲノム領域が、癌ドライバー、癌原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および／または癌遺伝子を含む、事例４～１４に記載の方法。
１６．癌ドライバーが、ＡＢＬ、ＡＣＣ、ＢＣＲ、ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＨＯＬ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＳＣＡ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＭＥＳＯ、ＯＶ、ＰＡＡＤ、ＰＣＰＧ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＡＤ、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＧＣＴ、ＴＨＣＡ、ＴＨＹＭ、ＴＰ５３、ＵＣＥＣ、ＵＣＳ、および／またはＵＶＭを含む、事例１５に記載の方法。
１７．１つ以上の標的ゲノム領域が、希少な自己免疫性、代謝性または神経性の遺伝性障害または疾患に関連する遺伝子を含む、事例４に記載の方法。
１８．希少な遺伝性障害または疾患が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白皮症、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー１型、高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎疾患１および２、血友病Ａ、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型）、低リン血症性くる病、レット症候群、テイ・サックス病、ウィルソン病、および／または精子形成不全を含む、事例８に記載の方法。
１９．１つ以上の標的ゲノム領域が、肥満の希少な遺伝性障害に関連する遺伝子座を含む、事例４に記載の方法。
２０．肥満の希少な遺伝性障害が、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠乏性肥満、アルストレム症候群、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏性肥満、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、バルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ）、および高影響ヘテロ接合性肥満であるか、またはそれらを含む、事例１９に記載の方法。
２１．標的二本鎖ＤＮＡ分子が、ヒトから採取された採血から抽出される、事例１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法であって、
複数の生体試料を複数のサブプールにアリコートすることであって、各生体試料が、標的二本鎖ＤＮＡ断片を含み、２つの生体試料が、同じ組み合わせのサブプールにアリコートされない、アリコートすることと、
生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成することであって、生の配列決定データが、標的二本鎖ＤＮＡ断片を含む複数のサブプールされた生体試料から生成され、標的二本鎖ＤＮＡ断片が、１つ以上の遺伝的バリアントを含有する、生成することと、
１つ以上の遺伝的バリアントを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、サブプールされた生体試料中に存在する１つ以上の遺伝的バリアントのドナーソースを特定することと、を含む、方法。
２３．各サブプールについて、方法が、
（ａ）アリコートされた生体試料から配列決定ライブラリを調製することであって、配列ライブラリを調製することが、サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ断片に非対称アダプタ分子をライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成することを含む、配列決定ライブラリを調製することと、
（ｂ）アダプタ－ＤＮＡ分子の第１の鎖および第２の鎖を配列決定して、各アダプタ－ＤＮＡ分子について第１の鎖の配列リードおよび第２の鎖の配列リードを提供することと、
（ｃ）各アダプタ－ＤＮＡ分子について、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとを比較して、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を特定して、サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを提供することと、をさらに含む、事例２２に記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）における配列決定の前に、方法が、サブプールからのアダプタ－ＤＮＡ分子を組み合わせることをさらに含む、事例２３に記載の方法。
２５．アダプタ分子が、インデックス配列を有し、
各サブプールが、固有のインデックス配列を使用してタグ付けされ、
固有の組み合わせのサブプールを特定することが、各遺伝的バリアントと関連付けられたインデックス配列を特定することを含む、事例２３または事例２４に記載の方法。
２６．各遺伝的バリアントと関連付けられたインデックス配列を、各生体試料がアリコートされたサブプールの組み合わせと相互参照して、ドナー源を特定することをさらに含む、例２５に記載の方法。
２７．サブプール中の複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々ついてエラー修正配列リードを生成することが、配列決定の前に１つ以上の標的ゲノム遺伝子座を選択的に富化して、複数の富化されたアダプタ－ＤＮＡ分子を提供することをとさらに含む、事例２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．サブプールの数が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、または７０個のサブプールであるか、またはそれらを含む、事例１～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．サブプールの数が、約１５～約４０個のサブプール、約３０～約５０個のサブプール、約３５～約５５個のサブプール、約４０～約６０個のサブプール、または６０個超のサブプールであるか、またはそれらを含む、事例１～２７のいずれか一項に記載の方法。
３０．患者の集団の中から希少なバリアントアレルを有する患者を特定するための方法であって、方法が、
（ａ）集団内の各患者からの生体試料を固有の組み合わせのサブプールされた試料に分離することであって、各生体試料が核酸断片を含む、分離することと、
（ｂ）インデックスバーコードを各サブプールされた試料中の複数の核酸断片に結合して、複数のインデックス化サブプールされた試料を生成することと、
（ｃ）インデックス化サブプールされた試料を組み合わせて、バーコード化核酸分子のプールされたセットを提供することと、
（ｄ）バーコード化核酸分子のプールされたセットを配列決定することと、
（ｅ）複数のバーコード化核酸分子についてエラー修正配列リードを提供することと、
（ｆ）インデックスバーコードに基づいて、エラー修正配列リードをサブプールされた試料にグループ化することと、
（ｇ）各サブプールされた試料中のエラー修正配列リードから、希少なバリアントアレルの存在を特定することと、
（ｈ）希少なバリアントアレルを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、希少なバリアントアレルを含有する患者を特定することと、を含む、方法。
３１．ステップ（ａ）～（ｈ）の前に、方法が、
患者の集団からの患者ＤＮＡの混合物を、患者の集団中の希少なバリアントアレルの保因者の存在についてスクリーニングすることを含み、スクリーニングすることが、
集団中の各患者からの生体試料を１つ以上のプールされた試料に混合することであって、プールされた試料の数が各々、サブプールされた試料の数よりも少ない、混合することと、
１つ以上のプールされた試料から複数の標的ＤＮＡ分子を配列決定して、生の配列決定データを生成することと、
生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成することと、
デュプレックス配列決定データから１つ以上のプールされた試料中の希少なバリアントアレルの存在を特定することによって、患者の集団が希少なバリアントアレルの保因者を含むかどうかを決定することと、を含む、事例３０に記載の方法。
３２．プールされた試料の数が、１である、事例３１に記載の方法。
３３．プールされた試料の数が１を超え、ステップ（ａ）～（ｈ）が、希少なバリアントアレルの特定された存在を有するプールされた試料に表される患者の集団の中から希少なバリアントアレルを有する患者を特定することを含む、事例３１に記載の方法。
３４．希少なバリアントアレルについて患者ＤＮＡ試料をスクリーニングするための方法であって、方法が、
各患者ＤＮＡ試料を固有のサブセットのプールされたＤＮＡ試料にアリコートすることであって、プールされたＤＮＡ試料の数が患者ＤＮＡ試料の数よりも少なく、固有のサブセットのプールされたＤＮＡ試料が各特定の患者ＤＮＡ試料の固有の試料識別子を含む、アリコートすることと、
各プールされたＤＮＡ試料から１つ以上の標的ＤＮＡ分子を配列決定することと、
標的ＤＮＡ分子について高精度のコンセンサス配列を生成することと、
高精度のコンセンサス配列から希少なバリアントアレルの存在を特定することと、
希少なバリアントアレルを含むプールされたＤＮＡ試料の固有のサブセットを特定して、希少なバリアントアレルに関連付けられた固有の試料識別子を決定することと、
固有の試料識別子によって、希少なバリアントアレルを含有する患者ＤＮＡ試料を特定することと、を含む、方法。
３５．患者ＤＮＡ試料が、患者由来の健常組織、腫瘍、および／または血液試料から抽出された二本鎖ＤＮＡ分子を含む、事例３４に記載の方法。
３６．複数の試料を効率的に遺伝子型決定するためのシステムであって、
配列決定データおよび遺伝子型データに関連する情報を送信するためのコンピュータネットワークであって、情報が、生の配列決定データ、デュプレックス配列決定データ、サブプールされた試料混合物の情報、個体試料の情報、および遺伝子型情報、のうちの１つ以上を含む、コンピュータネットワークと、
１つ以上のユーザ計算デバイスと関連付けられ、かつコンピュータネットワークと通信するクライアントコンピュータと、
複数の遺伝子型プロファイルおよびユーザ結果の記録を記憶するために、コンピュータネットワークに接続されたデータベースと、
コンピュータネットワークと通信し、かつデュプレックス配列決定データを生成するためにクライアントコンピュータから、生の配列決定データおよび要求を受信し、元の二本鎖核酸分子を表すファミリーからの配列リードをグループ化し、個々の鎖からの代表的な配列を互いに比較して、デュプレックス配列決定データを生成するように構成された、デュプレックス配列決定モジュールと、
コンピュータネットワークと通信し、かつバリアントアレルを特定し、存在する各バリアントアレルのサブプールの特定を決定し、各サブプール内のバリアントアレルの相対的存在量を計算して、遺伝子型データを生成するように構成された、遺伝子型モジュールと、を含む、システム。
３７．遺伝子型プロファイルが、既知の疾患関連変異を含む、事例３６に記載のシステム。
３８．遺伝子型プロファイルが、１つ以上のゲノム遺伝子座に経験的に導かれた患者遺伝子型を含む、事例３６に記載のシステム。
３９．１つ以上のプロセッサによって実行されると、事例１～３５のいずれか一つに記載の方法を行う命令を含む、非一時的コンピュータ可読記録媒体。
４０．バリアントアレルを含むサブプールの組み合わせを元の試料混合パターンに相関させて、供給源の集団の中からバリアントアレルの元の供給源を特定するための説明書をさらに含む、事例３９に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
４１．複数の試料を効率的に遺伝子型決定するために事例１～３５のいずれか一項に記載の方法を行うためのコンピュータシステムであって、システムが、プロセッサ、メモリ、データベース、およびプロセッサのための命令を含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体を有する少なくとも１つのコンピュータを含み、当該プロセッサが、事例１～３５のいずれか一項に記載の方法を含む操作を行うために当該命令を実行するように構成されている、コンピュータシステム。
４２．非一時的コンピュータ可読媒体であって、そのコンテンツが、少なくとも１つのコンピュータに、複数のサブプールされた試料混合物中の二本鎖核酸分子についてのデュプレックス配列決定データを提供するための方法を行わせ、方法が、
ユーザ計算デバイスから生の配列データを受信することと、
サブプールされた試料混合物中の複数の核酸分子に由来する複数の生の配列リードを含むサブプール特有のデータセットを作成することと、
元の二本鎖核酸分子を表すファミリーからの配列リードをグループ化することであって、グループ化が、共有される単一分子識別子配列に基づく、グループ化することと、
元の二本鎖核酸分子からの第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとを比較して、第１の鎖の配列リードと第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を特定することと、
サブプールされた試料混合物中の二本鎖核酸分子についてのデュプレックス配列決定データを提供することと、
各サブプールされた試料混合物中の個々の二本鎖核酸分子内に存在する１つ以上の遺伝的バリアントを特定することと、
１つ以上の遺伝的バリアントを含む固有の組み合わせサのブプールされた試料混合物を分離することによって、サブプールされた試料混合物中に存在する１つ以上の遺伝的バリアントの元の生物源を決定することとを含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
４３．比較された第１の配列リードと第２の配列リードとの間の非相補のヌクレオチド位置を特定することをさらに含み、当該方法が、非相補の位置において、プロセスエラーを特定すること、除外すること、または考慮しないこと、をさらに含む、事例４２に記載のコンピュータ可読媒体。
４４．元の生物源を決定することが、特定の遺伝的バリアントについての固有の組み合わせのサブプールされた試料混合物の各々において、核酸アリコートを有する元の生物源を特定するためにルックアップテーブルを使用することを含む、事例４２または事例４３に記載のコンピュータ可読媒体。
４５．非一時的コンピュータ可読媒体であって、そのコンテンツが、少なくとも１つのコンピュータに、サブプールされた核酸混合物中に存在するバリアントアレルを検出し、特定し、定量して、バリアントアレルのドナー生物源を決定するための方法を行わせ、当該方法が、
特定のバリアントアレルを含むサブプールされた核酸混合物の組み合わせを特定することと、
各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数を合計することと、
ルックアップテーブルを使用して、特定のバリアントアレルを含むサブプールされた核酸混合物の各々に核酸アリコートを有するドナー生物源を特定することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
４６．各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数に基づいて、ドナー生物源が、特定のバリアントアレルについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかを決定することをさらに含む、事例４５に記載のコンピュータ可読媒体。
４７．任意のサブプールされた核酸混合物が、２つ以上のドナー生物源からの特定のバリアントアレルを含む場合、当該方法が、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰを有する２つ以上のドナー生物源間を区別することをさらに含み、ＳＮＰが、特定のバリアントアレルのバリアント配列にゲノム上近接し、ＳＮＰが、バリアント配列と完全に不均衡ではない、事例４５または事例４６に記載のコンピュータ可読媒体。
４８．各サブプールされた核酸混合物内の特定のバリアントアレルの総数が、特定のバリアントアレルのドナー生物源がいくつ存在するのかを知らせることができる、事例４５～４７のいずれか一項に記載のコンピュータ可読媒体。
４９．非一時的コンピュータ可読媒体であって、そのコンテンツが、少なくとも１つのコンピュータに、患者集団の中からバリアントアレルを有する患者を特定するための方法を行わせ、当該方法が、
混合物中の個々のＤＮＡ分子内に存在するバリアントアレルを特定することと、
特定されたバリアントアレルを含むサブプールの組み合わせを特定することであって、サブプールの組み合わせが複数のサブプールのサブセットである、サブプールの組み合わせを特定することと、
特定されたバリアントアレルを含むサブプールの組み合わせにどの患者がＤＮＡ分子を寄与したのかを決定することによって、バリアントアレルを有する患者の集団の中から患者を特定することと、を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
５０．患者を特定するステップが、患者ＤＮＡ試料をサブプールの組み合わせと相関させるルックアップテーブルを使用することを含む、事例４９に記載のコンピュータ可読媒体。
ＶＩＩ．結論
本技術の実施形態の上述の詳細な説明は、網羅的であること、または本技術を上述の正確な形態に限定することを意図するものではない。本技術の具体的な実施形態および実施例は、例示的な目的のために上に記載されているが、関連技術分野の当業者が認識するように、本技術の範囲内で様々な等価な修正が可能である。例えば、ステップは所与の順序で提示されているが、代替的な実施形態は、異なる順序でステップを行ってもよい。本明細書に記載の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することもできる。本明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されるかのように、参照により援用される。
上の記載から、本技術の特定の実施形態は、例示のために本明細書に記載されているが、本技術の実施形態の説明を不必要に曖昧にすることを回避するために既知の構造および機能は詳細には記載または示されていないことを理解されたい。文脈が許容する場合、単数または複数の用語は、それぞれ複数または単数の用語も含み得る。
さらに、「または」という単語が、２つ以上の項目のリストに関して他の項目から排他される単一の項目のみを意味するように明示的に限定されない限り、かかるリストにおける「または」の使用は、（ａ）そのリスト内の任意の単一の項目、（ｂ）そのリスト内の全ての項目、または（ｃ）そのリスト内の項目の任意の組み合わせを含むと解釈される。加えて、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、少なくとも列挙された特徴を含むことを意味するように、全体を通して使用され、同じ特徴の任意のより多い数および／または追加のタイプの他の特徴が排除されない。特定の実施形態は例示のために本明細書には記載されているが、本技術から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることも理解されたい。さらに、本技術の特定の実施形態と関連付けられた利点は、それらの実施形態の文脈で説明されているが、他の実施形態も、かかる利点を示してもよく、全ての実施形態が必ずしも本技術の範囲内に収まるような利点を示す必要はない。したがって、本開示および関連技術は、本明細書に明示的に示されていないまたは記載されない他の実施形態を包含することができる。

Claims (35)

  1. プーリングを介して複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法であって、
    前記複数の生体試料を固有の組み合わせのサブプールにプールすることであって、各生体試料が標的二本鎖ＤＮＡ分子を含む、プールすることと、
    前記サブプール中の複数の前記標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することと、
    前記エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、
    前記バリアントアレルを含有する前記固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、前記バリアントアレルを含有する元の生体試料を決定することと、を含む、方法。
  2. 遺伝的バリアントについて生物源をスクリーニングするための方法であって、
    前記生物源に由来する複数の生体試料を固有の組み合わせのサブプールにアリコートすることであって、各生体試料が標的二本鎖ＤＮＡ分子を含み、各生体試料が２つ以上のサブプールにアリコートされる、アリコートすることと、
    前記サブプール中の複数の前記標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することと、
    前記エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することと、
    前記バリアントアレルを含有する前記固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、前記バリアントアレルを含有する前記生物源を決定することと、を含む、方法。
  3. エラー修正配列リードを生成することが、
    複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子にアダプタ分子をライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成することと、
    複数のアダプタ－ＤＮＡ分子の各々について、アダプタ－ＤＮＡ分子の元の第１の鎖のコピーのセット、およびアダプタ－ＤＮＡ分子の元の第２の鎖のコピーのセットを生成することと、
    前記元の第１の鎖および第２の鎖の１つ以上のコピーを配列決定して、第１の鎖の配列および第２の鎖の配列を提供することと、
    前記第１の鎖の配列と前記第２の鎖の配列とを比較して、前記第１の鎖の配列と第２の鎖の配列との間の１つ以上の対応関係を特定することと、を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記サブプール中の複数の前記標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを生成することが、配列決定の前に、１つ以上の標的ゲノム領域を選択的に富化することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記１つ以上の標的ゲノム領域が、疾患原因変異を有することが知られている遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 疾患原因変異が、機能喪失変異、機能獲得変異、または優性阻害変異であるか、またはそれらを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記１つ以上の標的ゲノム領域が、疾患または障害に関連することが知られている遺伝子座を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記疾患または障害が、希少な遺伝性障害である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記疾患または障害が、単一遺伝子障害または２つ以上の遺伝子における変異を伴う複合障害である、請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. 前記疾患または障害が、常染色体劣性変異と関連する、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記疾患または障害が、常染色体優性変異と関連する、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記エラー修正配列リードから１つ以上のバリアントアレルの存在を特定することが、前記エラー修正配列を参照ゲノムＤＮＡ配列と比較することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 各サブプール中の前記複数の標的二本鎖ＤＮＡ分子の中の前記１つ以上のバリアントの頻度を決定することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記バリアントアレルを含む前記生体試料の生物源ドナーが、前記バリアントアレルについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかを決定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記１つ以上の標的ゲノム領域が、癌ドライバー、癌原遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および／または癌遺伝子を含む、請求項４～１４に記載の方法。
  16. 前記癌ドライバーが、ＡＢＬ、ＡＣＣ、ＢＣＲ、ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＨＯＬ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＳＣＡ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＭＥＳＯ、ＯＶ、ＰＡＡＤ、ＰＣＰＧ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＲＡＤ、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＧＣＴ、ＴＨＣＡ、ＴＨＹＭ、ＴＰ５３、ＵＣＥＣ、ＵＣＳ、および／またはＵＶＭを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記１つ以上の標的ゲノム領域が、希少な自己免疫性、代謝性または神経性の遺伝性障害または疾患に関連する遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
  18. 前記希少な遺伝性障害または疾患が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白皮症、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー１型、高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎疾患１および２、血友病Ａ、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型）、低リン血症性くる病、レット症候群、テイ・サックス病、ウィルソン病、および／または精子形成不全を含む、請求項８に記載の方法。
  19. 前記１つ以上の標的ゲノム領域が、肥満の希少な遺伝性障害に関連する遺伝子座を含む、請求項４に記載の方法。
  20. 前記肥満の前記希少な遺伝性障害が、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠乏性肥満、アルストレム症候群、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏性肥満、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、バルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ）、および高影響ヘテロ接合性肥満であるか、またはそれらを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標的二本鎖ＤＮＡ分子が、ヒトから採取された採血から抽出される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 複数の生体試料を遺伝子型決定するための方法であって、
    前記複数の生体試料を複数のサブプールにアリコートすることであって、各生体試料が、標的二本鎖ＤＮＡ断片を含み、２つの生体試料が、同じ組み合わせのサブプールにアリコートされない、アリコートすることと、
    生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成することであって、前記生の配列決定データが、前記標的二本鎖ＤＮＡ断片を含む前記複数のサブプールされた生体試料から生成され、前記標的二本鎖ＤＮＡ断片が、１つ以上の遺伝的バリアントを含有する、生成することと、
    前記１つ以上の遺伝的バリアントを含有する固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、前記サブプールされた生体試料中に存在する前記１つ以上の遺伝的バリアントのドナー源を特定することと、を含む、方法。
  23. 各サブプールについて、前記方法が、
    （ａ）前記アリコートされた生体試料から配列決定ライブラリを調製することであって、前記配列ライブラリを調製することが、前記サブプール中の前記複数の標的二本鎖ＤＮＡ断片に非対称アダプタ分子をライゲーションして、複数のアダプタ－ＤＮＡ分子を生成することを含む、配列決定ライブラリを調製することと、
    （ｂ）前記アダプタ－ＤＮＡ分子の第１の鎖および第２の鎖を配列決定して、各アダプタ－ＤＮＡ分子について第１の鎖の配列リードおよび第２の鎖の配列リードを提供することと、
    （ｃ）各アダプタ－ＤＮＡ分子について、前記第１の鎖の配列リードと前記第２の鎖の配列リードとを比較して、前記第１の鎖の配列リードと前記第２の鎖の配列リードとの間の１つ以上の対応関係を特定して、前記サブプール中の複数の前記標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々についてエラー修正配列リードを提供することと、をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ステップ（ｂ）における配列決定の前に、前記方法が、前記サブプールからの前記アダプタ－ＤＮＡ分子を組み合わせることをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記アダプタ分子が、インデックス配列を有し、
    各サブプールが、固有のインデックス配列を使用してタグ付けされ、
    前記固有の組み合わせのサブプールを特定することが、各遺伝的バリアントと関連付けられた前記インデックス配列を特定することを含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
  26. 各遺伝的バリアントと関連付けられた前記インデックス配列を、各生体試料がアリコートされた前記組み合わせのサブプールと相互参照して、ドナー源を特定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記サブプール中の複数の前記標的二本鎖ＤＮＡ分子の各々ついてエラー修正配列リードを生成することが、配列決定の前に１つ以上の標的ゲノム遺伝子座を選択的に富化して、複数の富化されたアダプタ－ＤＮＡ分子を提供することをとさらに含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. サブプールの数が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、または７０個のサブプールであるか、またはそれらを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. サブプールの数が、約１５～約４０個のサブプール、約３０～約５０個のサブプール、約３５～約５５個のサブプール、約４０～約６０個のサブプール、または６０個超のサブプールであるか、またはそれらを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 患者の集団の中から希少なバリアントアレルを有する患者を特定するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記集団内の各患者からの生体試料を固有の組み合わせのサブプールされた試料に分離することであって、各生体試料が核酸断片を含む、分離することと、
    （ｂ）インデックスバーコードを各サブプールされた試料中の複数の前記核酸断片に結合して、複数のインデックス化サブプールされた試料を生成することと、
    （ｃ）前記インデックス化サブプールされた試料を組み合わせて、バーコード化核酸分子のプールされたセットを提供することと、
    （ｄ）バーコード化核酸分子の前記プールされたセットを配列決定することと、
    （ｅ）複数のバーコード化核酸分子についてエラー修正配列リードを提供することと、
    （ｆ）前記インデックスバーコードに基づいて、エラー修正配列リードをサブプールされた試料にグループ化することと、
    （ｇ）各サブプールされた試料中の前記エラー修正配列リードから、前記希少なバリアントアレルの存在を特定することと、
    （ｈ）前記希少なバリアントアレルを含有する前記固有の組み合わせのサブプールを特定することによって、前記希少なバリアントアレルを含有する前記患者を特定することと、を含む、方法。
  31. ステップ（ａ）～（ｈ）の前に、前記方法が、
    前記患者の集団からの患者ＤＮＡの混合物を、前記患者の集団中の希少なバリアントアレルの保因者の存在についてスクリーニングすることを含み、スクリーニングすることが、
    集団中の各患者からの生体試料を１つ以上のプールされた試料に混合することであって、プールされた試料の数が各々、サブプールされた試料の数よりも少ない、混合することと、
    前記１つ以上のプールされた試料から複数の標的ＤＮＡ分子を配列決定して、生の配列決定データを生成することと、
    前記生の配列決定データからデュプレックス配列決定データを生成することと、
    前記デュプレックス配列決定データから前記１つ以上のプールされた試料中の前記希少なバリアントアレルの存在を特定することによって、前記患者の集団が前記希少なバリアントアレルの保因者を含むかどうかを決定することと、を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記プールされた試料の数が、１である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記プールされた試料の数が１を超え、ステップ（ａ）～（ｈ）が、前記希少なバリアントアレルの特定された存在を有するプールされた試料中に表される患者の集団の中から、前記希少なバリアントアレルを有する患者を特定することを含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 希少なバリアントアレルについて患者ＤＮＡ試料をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    各患者ＤＮＡ試料を固有のサブセットのプールされたＤＮＡ試料にアリコートすることであって、前記プールされたＤＮＡ試料の数が患者ＤＮＡ試料の数よりも少なく、前記固有のサブセットのプールされたＤＮＡ試料が、各特定の患者ＤＮＡ試料の固有の試料識別子を含む、アリコートすることと、
    各プールされたＤＮＡ試料から１つ以上の標的ＤＮＡ分子を配列決定することと、
    前記標的ＤＮＡ分子について高精度のコンセンサス配列を生成することと、
    前記高精度のコンセンサス配列から希少なバリアントアレルの存在を特定することと、
    前記希少なバリアントアレルを含む固有のサブセットのプールされたＤＮＡ試料を特定して、前記希少なバリアントアレルと関連付けられた前記固有の試料識別子を決定することと、
    前記固有の試料識別子によって、前記希少なバリアントアレルを含有する前記患者ＤＮＡ試料を特定することと、を含む、方法。
  35. 前記患者ＤＮＡ試料が、前記患者由来の健常組織、腫瘍、および／または血液試料から抽出された二本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項３４に記載の方法。
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