CN102899335A - 一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法 - Google Patents

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张雨良
刘志昕
熊忠国
黄启星
史学群
王健华
余乃通
章绍延
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Abstract

本发明属于生物信息学和基因工程领域，番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1基因组序列具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。本发明还公开了一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列的克隆方法。本发明的研究结果首次证实高通量Small RNA测序可以用来进行感染番木瓜疑似病毒样品的病原鉴定、检测及病毒全基因组测序。

Description

一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法
技术领域
本发明属于生物信息学和基因工程领域中的信息比对、拼接、组装和分子克隆技术，具体涉及一种高通量Small RNA测序获得番木瓜病毒基因组序列的方法，为新病毒的发掘和功能研究提供强有力的技术支持。
背景技术
高通量测序技术现已广泛应用于真核生物、原核生物、病毒等的基因组、转录组、基因表达调控研究，具体的分析技术包括：1De novo重头测序，2DNA重测序，3RNA转录组、表达谱测序，4MicroRNA发现及分析，5甲基化测序，6DNA-蛋白质互作研究，7目的区域捕获测序，8外显子测序。目前Illumina公司最近推出一种全新测序仪Hiseq2000，主要应用于基因组测序和注释，其性能较Genome Analyzer有更多的优点，表现在测序高通量、高精确度、易用性好、低成本等。Hiseq2000既有Illumina和Solexa在边合成边测序优势，又融合了最新的光学和信息系统设计及可逆中止化合物染料技术。Hiseq2000采用了4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链的合成，确保了测序的高精确性和高顺序性。Hiseq2000具体有以下几个优点：1）Hiseq2000能够单次运行产生200Gb的数据，每天能产生25Gb；2）Hiseq2000具有最简化和直观的操作流程，启动运行只需要10分钟手工操作时间；3）操作Hiseq2000人员可以达到30倍的覆盖度对基因组测序，例如完成一个人类基因组测序只需不到1万美元费用，加快了自身推广应用。
目前Hiseq2000测序系统主要开展以下几方面测序及数据分析：
1、动植物基因组重测序：在已知物种基因组的情况下，对物种内的不同个体或某个个体的不同组织进行基因组重测序，可以在全基因组水平上发现不同个体或组织细胞之间的差异。通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点，插入缺失位点，结构变异位点，拷贝数变异等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期。
2、真菌基因组测序：真菌属于较低等的真核生物，种类繁多，在自然界中分布广泛。据估计，全世界约有150万种真菌，其中包含许多具有重要的药用价值和食用价值的有益真菌，同时也存在着大量能引发动植物病害的致病菌。因此，合理利用有益真菌，控制预防有害真菌对人类的生产和生活具有重要的意义。而真菌基因组的阐明，将为真菌特性的分析提供有用的依据。
3、转录组测序 ：转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。
4、外显子组测序：外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，它是基因行使其功能最直接的体现。通过高通量测序技术进行外显子组测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。相比于全基因组重测序，外显子组测序更加经济、高效。目前，外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中。
5、目标区域深度测序：指对感兴趣的特定基因组区域进行高通量测序，将研究者感兴趣的基因组区域定制成特异性的探针，通过这些特异性探针与基因组DNA进行杂交，富集基因组目标区域，最后将捕获到的基因组DNA进行高通量测序。
6、Small RNA深度测序：Small RNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。第二代高通量测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程，可以一次性产生上百万条Small RNA序列，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA，同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异。
HiSeq 2000深度测序所得的sRNA几乎涵盖所有RNA，包括miRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat associate sRNA、exon或intron降解片段等。通过与已知数据库进行比对、寻找样品与数据库之间在基因组位置上的overlap等方法，对sRNA进行注释。Illumina HiSeq2000测序所得49 nt序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到干净序列。
sRNA是生物体内一类重要的特殊分子，可以诱导靶标基因沉默，参与细胞生长、发育、转录、翻译及表达调控等许多生命活动的代谢过程。基于华大公司Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术的sRNA数字化分析，采用边合成边测序流程，对所测sRNA样品量少，高通量，高精确性等特点，并且一次可获得几个到几十个Million的sRNA序列，能够快速准确地鉴定被测样品中含有的全部sRNA分子，并可能发现新的未报到过的sRNA，通过生物信息学软件分析和数据处理，可对感染植物样片中病毒sRNA进行组装拼接最后成功获得该样品中病原微生物的全基因组序列，本发明的高通量Small RNA测序为在病毒功能研究和新病毒发掘等方面具有重要的研究价值。
番木瓜（Carica papaya L.）主要分布于热带和亚热带地区。番木瓜兼具食用和药用价值，有“水果之王”的美誉。然而，从上世纪末以来世界几乎所有木瓜主产区先后受到番木瓜环斑病毒的毁灭性危害，严重影响了番木瓜产业的健康发展。在中国番木瓜主要种植区海南、广东、广西等地，番木瓜环斑病毒也对番木瓜产业健康稳定发展构成了严重威胁。由于番木瓜价格高，经济效益好，近年来番木瓜种植面积不断扩大，番木瓜产量呈现上升趋势。与此同时，番木瓜病毒病已经成为制约番木瓜产业发展的最大限制因子，在部分地区甚至导致番木瓜绝产绝收，造成了巨大的经济损失。现有的番木瓜环斑病毒分子检测（即RT-PCR技术）和血清学检测（即ELISA技术）依赖于传统的经典病毒学知识背景。因此，检测已知或未知的番木瓜病毒需要一个更为有效的方法来筛选感染番木瓜疑似病毒样品。
发明内容
本发明目的在于提供一种高通量Small RNA测序获得番木瓜病毒基因组序列的方法，为新病毒的发掘和功能研究提供强有力的技术支撑。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明从一种番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组的基因序列和蛋白质序列，它具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列：
（1）SEQ ID NO.1 的信息
（a）序列特征：
*长度：10332碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
（b）分子类型：cDNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：Papaya ringspot virus HN-y1 strain
（f）序列描述：SEQ ID NO. 1。
（2）SEQ ID NO.2的信息
（a）序列特征
*长度： 3346氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）序列描述：SEQ ID NO. 2。
一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列的克隆方法，包括以下步骤：
（1）从感染番木瓜花叶病样品中提取总RNA，将sRNA片段从中分离出来；
（2）通过运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与Genbank中所有已知的病毒基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的小RNA片段；
（3）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤2中获得的小RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列； 
（4）运行Blast软件（默认参数）将获得的短的重叠序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比对，以此推测序列的来源物种；
（5）从Genbank数据库下载所有可疑来源物种的全长基因组序列并以此数据为基础建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；
（6）运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与特定病毒物种的基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的sRNA片段；
（7）将能够匹配到最多小RNA片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；
（8）将获知的候选病毒信息设计一个简单的标记，对小RNA片段进行标记；
（9）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=1 7和minimum coverage=5，以步骤8中获得的小RNA片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；
（10）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤9中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；
（11）人工检查步骤10中获得的重叠群序列，找出未能拼接好的gap区域；从gap区域两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的序列信息，填充gap区域，最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的病毒基因组序列，即番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列。
所述高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法，适用于番木瓜环斑病毒，也适用于与Genbank中登陆已知病毒基因组相近的病毒，该方法中只要有足够的小RNA数据，通过所述方法不但可以获得一个与Genbank中有匹配的病毒全基因组序列，还可以根据一些很短的重叠群序列通过基因克隆技术获得自然界中未知的新病毒全基因组序列。     本发明重点探讨了Small RNA测序在感染PRSV番木瓜中的应用。从检测感染PRSV番木瓜海南的76个样品中，选取主要影响海南番木瓜花叶病PRSV- y株系样品，提取total RNA，利用HiSeq2000测序平台进行Small RNA高通量测序，利用生物信息学分析鉴定出感染番木瓜环斑病毒海南y株系病毒全基因组序列，并进行RT-PCR验证结果。番木瓜环斑病毒转录本是由病毒小RNA覆盖的，同时Small RNA测序结果显示存在几个高覆盖率的峰值。番木瓜环斑病毒小RNA分子相互重叠，使重叠区域能够组装成番木瓜环斑病毒全基因组序列，即获得海南番木瓜环斑病毒y株系全基因组序列。本发明的研究结果首次证实高通量Small RNA测序可以用来进行感染番木瓜疑似病毒样品的病原鉴定、检测及病毒全基因组测序。
附图说明
图1为从GenBank中筛选高度匹配的小RNA片段；
图2 为将小RNA片段拼接成短的重叠群序列；
图3为将小RNA片段拼接成短的重叠群序列；
图4为将小RNA片段拼接成短的重叠群序列；
图5为短的重叠序列在GenBank中比对结果；
图6 为建立可用于Bowtie软件比对的病毒数据库；
图7为建立可用于Bowtie软件比对的病毒数据库；
图8为建立可用于Bowtie软件比对的病毒数据库；
图9 为sRNA片段与特定病毒物种比对结果；
图10为GenBank中匹配到小RNA片段病毒的株系分布；
图11为将小RNA片段进一步拼接成短的重叠群序列；
图12人工检查未能拼接好的gap区域。
具体实施方式
以下通过优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1  
一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列的克隆方法，包括以下步骤：
（1）从感染番木瓜花叶病样品中提取总RNA，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE胶对sRNA进行分离，Small RNA测序后对序列信息进行修剪，去除接头序列得到sRNA片段。
（2）通过运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与Genbank中所有已知的病毒基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的小RNA片段；如附图1所示。
（3）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤2中获得的小RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列； 如附图2、3、4所示。
（4）运行Blast软件（默认参数）将获得的短的重叠序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比对，以此推测序列的来源物种；如附图5所示。
（5）从Genbank数据库下载所有可疑来源物种的全长基因组序列并以此数据为基础建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；如附图6、7、8所示。
（6）运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与特定病毒物种的基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的sRNA片段；如附图9所示。
（7）将能够匹配到最多小RNA片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；如附图10所示。
（8）将获知的候选病毒信息设计一个简单的标记，对小RNA片段进行标记。
（9）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤8中获得的小RNA片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；如附图11所示。
（10）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤9中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；如附图11所示。
（11）人工检查步骤10中获得的重叠群序列，找出未能拼接好的gap区域，如附图12所示；从gap区域两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的序列信息，填充gap区域，最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的病毒基因组序列，即番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列。
Figure IDA00002141847300011
Figure IDA00002141847300031
Figure IDA00002141847300041
Figure IDA00002141847300051
Figure IDA00002141847300061
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Figure IDA00002141847300081
Figure IDA00002141847300091
Figure IDA00002141847300101
Figure IDA00002141847300111
Figure IDA00002141847300121
Figure IDA00002141847300131
Figure IDA00002141847300141
Figure IDA00002141847300151
Figure IDA00002141847300161
Figure IDA00002141847300171
Figure IDA00002141847300181
Figure IDA00002141847300191
Figure IDA00002141847300201
Figure IDA00002141847300211
Figure IDA00002141847300221
Figure IDA00002141847300231
Figure IDA00002141847300241
Figure IDA00002141847300251
Figure IDA00002141847300261
Figure IDA00002141847300281

Claims (4)

1.一种番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组编码的多聚蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列的克隆方法，包括以下步骤：
（1）从感染番木瓜花叶病样品中提取总RNA，将sRNA片段从中分离出来；
（2）通过运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与Genbank中所有已知的病毒基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的小RNA片段；
（3）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤2中获得的小RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列； 
（4）运行Blast软件（默认参数）将获得的短的重叠序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比对，以此推测序列的来源物种；
（5）从Genbank数据库下载所有可疑来源物种的全长基因组序列并以此数据为基础建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；
（6）运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与特定病毒物种的基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的sRNA片段；
（7）将能够匹配到最多小RNA片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；
（8）将获知的候选病毒信息设计一个简单的标记，对小RNA片段进行标记；
（9）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=1 7和minimum coverage=5，以步骤8中获得的小RNA片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；
（10）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤9中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；
（11）人工检查步骤10中获得的重叠群序列，找出未能拼接好的gap区域；从gap区域两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的序列信息，填充gap区域，最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的病毒基因组序列，即番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列。
4.权利要求3所述高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法，适用于番木瓜环斑病毒，也适用于与Genbank中登陆已知病毒基因组相近的病毒，该方法中只要有足够的小RNA数据，通过权利要求3所述方法不但可以获得一个与Genbank中有匹配的病毒全基因组序列，还可以根据一些很短的重叠群序列通过基因克隆技术获得自然界中未知的新病毒全基因组序列。
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