CN109457048A - 一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于果树病毒检测技术领域，具体涉及一种Small‑RNA高通量测序技术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。采用以下步骤：从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E‑value≤1e‑50为标准，得到初选序列库，去除同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small‑RNA深度测序；获得small RNA测序序列；处理后的序列进行组装；组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。本发明测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。

Description

一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法
技术领域
本发明属于果树病毒检测技术领域，具体涉及一种Small-RNA高通量测序技 术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。
背景技术
高通量测序技术现已广泛应用于真核生物、原核生物、病毒等的基因组、转 录组、基因表达调控研究，具体的分析技术包括：1.De novo重头测序，2.DNA 重测序，3.RNA转录组、表达谱测序，4.MicroRNA发现及分析，5.甲基化测序， 6.DNA-蛋白质互作研究，7.目的区域捕获测序，8.外显子测序。
甜樱桃因其果实早熟、酸甜可口，而深受大众喜爱，种植效益高，成为近年 来发展较快的果树树种之一。但是甜樱桃为无性繁殖，新品种的推广和苗木繁育 主要通过嫁接进行，长期的无性繁殖使得甜樱桃品种和砧木树体内的病毒数量不 断增加，病毒病的危害越来越严重，对我国的甜樱桃产业的发展造成了重大危害。 据报道全世界能够危害甜樱桃的病毒种类高达40余种，我国发现10余种。因此， 亟需一种快速、准确判定甜樱桃树体内病毒情况的方法。目前常用的甜樱桃树体 病毒检测方法有物理学方法(电镜法)、血清学方法(酶联免疫ELISA)和聚合 酶链式反应(PCR)法，但这些方法的使用范围是有限的，如物理学方法需要利用 电子显微镜技术来判断是否有病毒以及病毒种类，这种方法需要专门的操作人员 熟练使用电子显微镜，而且材料处理繁琐、耗时、难度大；血清学需要病毒在甜 樱桃树体内得以表达并翻译成蛋白质，这种方法需要提前预知树体内的病毒种 类，获得病毒的蛋白质序列，而且血清学检测结果灵敏度低、准确性差；近年来 大家常用的PCR法必须基于已知病毒的核苷酸序列才能进行，检测病毒的范围 比较固定，难于发现新病毒，而且病毒在植物体内转录表达才能被检测到，受植 物细胞活性影响很大，如秋季的叶片和冬季的芽中几乎检测不到病毒的表达。总 的来说，在对未知病原物缺乏了解的情况下，这些检测方法就无法应用。因此， 检测已知或未知的甜樱桃病毒需要一个更为有效的方法来筛选疑似感染病毒的 样品。
发明内容
本发明采用Small-RNA测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确 的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。 为实现上述目的，本发明采用以下方案：
一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，采用以下步骤：
(1)从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初 选序列库，去除初选序列库中同源性≥97％的序列即为甜樱桃病毒数据库；
(2)提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small-RNA 深度测序；
(3)获得small RNA测序序列；
(4)步骤(3)处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找 高度同源序列：首先，用blastn将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选 出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到 90％的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配碱基以内，e＝0.01；
(5)将步骤(4)组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。
优选地，步骤(2)所述的提取甜樱桃叶片中的总RNA的方法为：利用多糖多酚 植物总RNA提取试剂盒，提取甜樱桃叶片中总RNA。
优选地，步骤(2)所述的Small-RNA深度测序通过HiSeq2000高通量进行。
优选地，步骤(3)所述的获得small RNA测序序列的方法为检测small RNA测 序质量，并去除低质量、未插入3'接头、5'接头序列，再除去带Poly A尾巴和3' 接头的数据，最后选取不小于18nt的序列。
有益效果
(1)本发明在未知病毒信息的情况下，利用Small-RNA测序技术快速、准 确检测甜樱桃树体内病毒，在甜樱桃检验检疫中有着重要的应用意义。
(2)本发明从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，构建了全面的甜樱桃病 毒基因序列数据库。所述方法简便、快速，灵敏度高、准确性好，而且不需要知 道樱桃树体内病毒信息，也不受植物细胞活性影响。
附图说明
图1为Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的流程图；
图2为测序结果中病毒来源sRNAs与病毒基因组的mapping及热点区域分析；
图3为LChV-1RT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；
图4为CVA RT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；
图5为CLBV RT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比；
图6为PBNSPaV RT-PCR产物测序结果和高通量测序拼接结果对比。
具体实施方式
下面对本发明原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非限定本发明的范围。
实施例1
1.1构建甜樱桃病毒序列数据库
从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/)搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初选序列库。然后这些序列再进行 同源性分析，对同源性≥97％的序列视为重复序列，去除重复序列后即为甜樱桃 病毒数据库。
1.2高通量数据分析
一份已知病毒的样品S1的甜樱桃叶片，带有樱桃病毒A(Cherry virus A, CVA)和樱桃小果病毒1(Little cherry virus 1,LChV-1)；随机在大田中取一份 带有未知病毒的样品S2的甜樱桃叶片，将样品S1和样品S2放在冻存管中，快 速放入液氮中直接保存。按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根)步骤提 取样品中的总RNA，构建小RNA测序文库，通过HiSeq2000高通量测序平台进 行Small-RNA深度测序，得到的原始读数均超过1400万reads。去除低质量、 未插入3'接头、5'接头reads，再除去带Poly A尾巴和3'接头的数据，最后选取 不小于18nt的reads。处理后的高质量读数在1300万reads以上，高质量读数占比超过85％，序列总长度分别为460,791,072nt和345,940,499nt左右，具有很 好的深度和一致性，可进行后续的分析(表1)。
表1 2份甜樱桃样品Small RNA的深度测序分析
1.3样品中病毒序列分析
1.2处理后的序列用软件SOAP denovo进行组装，组装的大于100bp的contig 寻找高度同源序列：首先，用blastn将组装的contig比对到病毒核酸数据库中， 选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列同源性达到 90％的结果。为了分析到尽可能多的病毒sRNAs，设定如下参数：匹配长度大于 16nt，2个错配碱基以内，e＝0.01，进一步与数据库blast比对计算样品中病毒存 在情况。
比对结果发现S1样品中检测到病毒LChV-1的contig 9条，最长序列395bp， 这些序列与病毒数据库中LChV-1病毒序列同源性都超过90％。S1样品中还检测 到病毒CVA的contig 12条，最长序列357bp，这些序列与病毒数据库中CVA 病毒序列同源性都超过90％。由此推断样品S1中存在LChV-1病毒和CVA病毒， 于已知数据相同。
S2样品中检测到柑橘叶疱斑病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)的contig 7条，最长序列436bp，这些序列与病毒数据库中CLBV病毒序列同源性都超过 90％。S2样品中还检测到李树皮坏死茎纹孔伴随病毒(Plum bark necrosis stem pitting-associatedvirus,PBNSPaV)的contig 6条，最长序列409bp，这些序列与 病毒数据库中PBNSPaV病毒序列同源性都超过90％。由此推断样品S2中存在 CLBV病毒和PBNSPaV病毒。
进一步分析样品中病毒sRNAs情况，发现S1样品中检测到的病毒LChV-1 的sRNAs总读数为110,509，占高质量读数的百分比为0.58％(表2)。S1样品 中CVA的sRNAs总读数为59,217，占比为0.31％(表2)。
S2样品中检测到CLBV的sRNAs总读数为25,188，占高质量读数的百分比 为0.19％(表2)。S2样品中PBNSPaV的sRNAs总读数为59,961，占比为0.45％ (表2)。进一步证实甜樱桃样品中病毒存在的真实情况。
表2 2份甜樱桃样品中LChV-1-TA的sRNAs分析
1.4来源于病毒的sRNAs与病毒基因组的比较
从样品S1中分离得到的来源于病毒LChV-1和CVA的sRNAs能够覆盖 LChV-1和CVA的全基因组，覆盖率分别是61％，75.6％，根据病毒sRNAs在病 毒基因组中出现的频率，我们发现了一些产生病毒sRNAs的热点区域(图2)。 从图上可以看出，病毒sRNAs在LChV-1的正负链上产生的热点区域基本一致， 在正负链上各寻找到6个热点区域，分别对应的编码基因为蛋白酶、甲基转移酶、 解旋酶、RNA复制酶和未知功能的p27。
病毒sRNAs在CVA的正负链上产生的热点区域明显不一致(图2)。正义 链上有3个区域，分别是1116-1142-nt，1690-1711-nt，1801-1860-nt，负义链上 有3个热点区域，为2029-2056-nt，2404-2426-nt，2459-2479-nt，其中正义链上 1116-1142-nt对应的序列为甲基转移酶区域，其余的热点区域并未找到同源性较 高的功能域。
样品S2中来源于病毒CLBV和PBNSPaV的sRNAs也覆盖了病毒的全基因 组，覆盖率分别是70.8％和53.4％。同时也发现了CLBV和PBNSPaV在基因组 中产生sRNAs的热点区域(图2)。病毒sRNAs在CLBV的正负链上产生的热 点区域大体一致，在正链上有2个热点区域，在负链上有1个热点区域，但是这 些热点区域集中在CLBV的5’端的甲基转移酶区域(图2)。
病毒sRNAs在PBNSPaV的正负链上产生的热点区域完全不一致，在正链上 有3个热点区域，而在负链上有6个热点区域，另外，在PBNSPaV的3’端的 外壳蛋白区域，不管正链还是负链都产生了较多的热点区域(图2)。
1.5 RT-PCR验证
①根据高通量测序所得病毒序列的保守区域，设计特异引物，S1样品中 LChV-1的引物序列为Left primer：5'-TGACGGACCCTCGCATAAAT-3'；Right primer：5'-CGAACTTTGCATCCCTCGTT-3'；Tm 59℃，PCR产物899bp。CVA 的引物序列为Left primer：5'-ATTGGCTTTGCTGGTTCTGG-3'；Right primer： 5'-TCTCACCTTGTATGGCAGCA-3'；Tm 59℃，PCR产物865bp。S2样品中CLBV 的引物序列为Left primer：5'-ATTTCCCAAAGATACGCCGC-3'；Right primer： 5'-CACCACAACGTTCCACAACT-3'；Tm 59℃，PCR产物1102bp。PBNSPaV的 引物序列为Left primer：5'-TGAAAGAGTTGAACGGTGCG-3'；Right primer：5'-CTCATCCATTGCCTCAACGG-3'；Tm 59℃，PCR产物793bp。
②用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒步骤提取RNA提取样品的总 RNA，进行反转录得c DNA。
③以样品为模板利用上述①引物，利用FastPfu Fly DNA Polymerase(全式金)进行序列扩增。PCR反应体系如表3所示：
表3
PCR反应条件如表4所述：
表4
④将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将PCR扩增得到的PCR片段 切胶回收后，进行测序。
⑤PCR片段测序结果与高通量测序结果进行比对分析。
将PCR产物测序结果与高通量测序结果用DNAMAN进行序列比对分析， 结果一致(图3-6)。说明利用高通量测序结果可以准确的检测甜樱桃树体内病 毒。

Claims (4)

1.一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初选序列库，去除初选序列库中同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；
（2）提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small-RNA深度测序；
（3）获得small RNA测序序列；
（4）步骤（3）处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找高度同源序列：首先，用blastn 将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到90%的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配碱基以内，e=0.01；（5）将步骤（4）组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。
2.根据权利要求1所述的检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述的提取甜樱桃叶片中的总RNA的方法为：利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，提取甜樱桃叶片中总RNA。
3.根据权利要求1所述的检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述的Small-RNA深度测序通过HiSeq2000高通量进行。
4.根据权利要求1所述的检测甜樱桃病毒的方法，其特征在于，步骤（3）所述的获得small RNA测序序列的方法为检测small RNA测序质量，并去除低质量、未插入3'接头、5'接头序列，再除去带Poly A尾巴和3'接头的数据，最后选取不小于18nt的序列。
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