CN113151535A - 一组菊科植物分子鉴定的叶绿体ssr标记引物及其获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物及其获取方法。该叶绿体SSR标记引物为SSR1、SSR2或SSR3中的一种或几种，其获取方法包括：1.检索并获取菊科叶绿体基因组；2.预测并获得鉴定的菊科叶绿体基因组SSR位点，开发SSR标记；3.电子PCR扩增菊科叶绿体SSR标记，并筛选多态性SSR标记；4.验证和获得用于菊科物种分子鉴定的叶绿体SSR标记。该叶绿体SSR标记引物及其获取方法，建立了菊科叶绿体SSR位点的鉴定和多态性分析的方法，提高了多态性SSR标记的筛选效率，减轻了试验工作量、提高了试验效率、节约了成本。

Description

一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物及其获取方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物及其获取方法。
背景技术
菊科是被子植物中包含物种数量最大、进化程度最高的科，全科共有1000属，25000～30000种；同时，菊科物种也具有重要的经济价值，对人类经济社会的发展具有重要意义，如，用于提取橡胶的橡胶草和银胶菊，可做蔬菜食用的生菜、茼蒿等，可做油料作物的向日葵、小葵子等，药用植物青蒿、紫菀、天名精、艾草、蒲公英等，以及重要的观赏植物菊花等。
由于菊科植物种类繁多，菊科的分类识别与鉴定一直是植物分类学家面临的重大挑战和难题，而且还有多个菊科物种的分类地位和种属归属没有完全解析出来。因此，精准、快速、高效地识别菊科植物，不仅是植物分类学家的迫切需要，而且对更好地开发和利用菊科植物资源，更好地将菊科植物资源服务于人类社会的发展需求均具有重要意义。
叶绿体是植物所特有的细胞器，其具有自身的DNA，并独立于核基因组而呈现母系遗传的特点，在植物物种遗传进化和分子鉴定方面具有重要意义。SSR标记（simplesequence repeat），又称为微卫星标记，具有多态性高、共显性、易于操作等特点，在遗传多样性鉴定、指纹图谱构建以及群体结构解析等方面具有重要应用。
然而，目前有关菊科叶绿体SSR标记及其应用还没有相关研究，其开发技术和方法也未见报道，限制了菊科植物分子鉴定技术的进一步发展。因此，基于菊科物种的叶绿体基因组数据，鉴定并开发SSR标记，筛选能够用于菊科分子鉴定用的叶绿体SSR标记，对于推动菊科植物的分类鉴定十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物及其获取方法，通过建立菊科叶绿体SSR标记开发的技术，开发多个SSR标记，并将其应用于菊科物种的分子鉴定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物，该叶绿体SSR标记引物为SSR1、SSR2或SSR3中的一种或几种；
SSR1标记的引物序列为：
上游引物序列SSR1_F：5'-ccaacgagtcacacactaagc-3'；
下游引物序列SSR1_R：5'-ctttgcattctatccagcga-3'；
SSR2标记的引物序列为：
上游引物序列SSR2_F：5'-gttttctcctcgtacggctc-3'；
下游引物序列SSR2_R：5'-ccacttcaattgtctcacgg-3'；
SSR3标记的引物序列为：
上游引物序列SSR3_F：5'-cgaaccacgctttttcta-3'；
下游引物序列SSR3_R：5'-atgctgcagttgtgattgat-3'。
一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物的获取方法，包括如下步骤：
（1）检索并获取菊科叶绿体基因组；
（2）预测并获得鉴定的菊科叶绿体基因组SSR位点，开发SSR标记；
（3）电子PCR扩增菊科叶绿体SSR标记，并筛选多态性SSR标记；
（4）验证和获得用于菊科物种分子鉴定的叶绿体SSR标记。
进一步地，该获取方法的步骤（1）中，以菊科为关键词检索叶绿体基因组公共数据库和细胞器基因组数据库，获得菊科叶绿体基因组。
进一步地，该获取方法的步骤（2）中，将步骤（1）获得的菊科叶绿体基因组进行SSR位点的预测和鉴定。SSR的预测采用MISA软件，参数设置为：1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次、2个碱基的重复元件重复次数在5次及以上、3个至6个碱基的重复元件重复次数在3次及以上；同时，两个SSR位点间的距离不少于100bp，获得SSR位点；更进一步地，步骤（2）中，进一步对鉴定的SSR位点进行批量引物设计，获得SSR标记。
进一步地，该获取方法的步骤（3）中，先将步骤（2）获得的SSR标记的上下游引物作为探查序列，将步骤（1）获得的菊科叶绿体全基因组序列作为库文件，利用blastn算法进行DNA序列对DNA序列的比对；更进一步地，步骤（3）中，进一步将获得的比对结果，根据一个标记上、下游引物比对到的每一个物种叶绿体基因组的位置，计算其长度，得到电子PCR扩增产物的长度大小；再将每一个标记在步骤（1）获得的菊科叶绿体基因组的扩增片段大小进行比较，筛选出多态性高的3个SSR标记。
进一步地，该获取方法的步骤（4）中，选择叶绿体基因组已知和未知的菊科植物，取其幼嫩叶片并提取基因组DNA，再利用步骤（3）获得的多态性SSR标记的引物进行PCR扩增，验证其在菊科物种中的多态性。
本发明的一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物及其获取方法的有益效果为：
（1）建立了系统的菊科叶绿体SSR位点的鉴定和多态性分析的方法，且涵盖了较全面的菊科叶绿体基因组序列信息，具有较强的代表性；
（2）利用该技术体系，不仅鉴定开发了大量的菊科叶绿体SSR标记，而且大大提高了多态性SSR标记的筛选效率，减轻了试验工作量、提高了试验效率、节约了成本；
（3）筛选的3个多态性最高的SSR标记，在叶绿体基因组已知和未知的菊科植物中均可进行扩增，即，该3组SSR标记在菊科植物中具有很高的多态性，可作为菊科物种分子鉴定用的SSR分子标记；同时，对菊科物种亲缘关系的研究提供了有力工具。
附图说明
图1为本发明中叶绿体SSR标记引物获取方法的流程图；
图2为本发明中SSR1标记引物在7种菊科植物中的PCR扩增电泳图；
图3为本发明中SSR2标记引物在7种菊科植物中的PCR扩增电泳图；
图4为本发明中SSR3标记引物在7种菊科植物中的PCR扩增电泳图。
其中，7种菊科植物按序号1-7依次为天人菊、香丝草、一年蓬、茼蒿、向日葵、旋覆花和百日草。
具体实施方式
实施例1
一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物，该叶绿体SSR标记引物为SSR1、SSR2或SSR3中的一种或几种；
SSR1标记的引物序列为：
上游引物序列SSR1_F：5'-ccaacgagtcacacactaagc-3'；
下游引物序列SSR1_R：5'-ctttgcattctatccagcga-3'；
SSR2标记的引物序列为：
上游引物序列SSR2_F：5'-gttttctcctcgtacggctc-3'；
下游引物序列SSR2_R：5'-ccacttcaattgtctcacgg-3'；
SSR3标记的引物序列为：
上游引物序列SSR3_F：5'-cgaaccacgctttttcta-3'；
下游引物序列SSR3_R：5'-atgctgcagttgtgattgat-3'。
实施例2
如实施例1中所述的一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物的获取方法，如图1所示，包括如下步骤。
（1）检索并获取菊科叶绿体基因组。
具体的，以菊科（Asteraceae）为关键词检索叶绿体基因组公共数据库cpbase数据库（地址：https://rocaplab.ocean.washington.edu/tools/cpbase/）和NCBI细胞器基因组数据库（地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/organelle/），共获得136个菊科叶绿体基因组，再将该基因组序列下载并整理至一个fasta格式的文件中，用于下游的SSR位点的鉴定。
（2）预测并获得鉴定的菊科叶绿体基因组SSR位点，开发SSR标记。
具体的，将步骤（1）检索获得的136个菊科叶绿体基因组序列，利用Misa软件（下载地址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）进行SSR位点的预测和鉴定，参数设置为：1-10 2-5 3-3 4-3 5-3 6-3，即，1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次、2个碱基的重复元件重复次数在5次及以上、3个至6个碱基的重复元件重复次数在3次及以上；同时，两个SSR位点间的距离不少于100bp。
通过上述预测，共获得14447个SSR位点，平均每个物种有106个位点；再利用Primer3.0软件（下载地址：https://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3-1.1.4-WINXP.zip/download）对获得的鉴定的SSR位点进行批量引物设计，共开发并获得8442个SSR标记，平均每个物种为62个标记。
（3）电子PCR扩增菊科叶绿体SSR标记，并筛选多态性SSR标记。
具体的，将步骤（2）获得的8442个SSR标记的上下游引物，合并整理成fasta格式的一个文本文件，然后作为探查序列，再以步骤（1）下载获得的136个菊科叶绿体全基因组序列作为库文件，利用本地blast软件中的blastn算法进行DNA序列对DNA序列的比对，参数设置为：1E-5。
将获得的比对结果，根据一个标记上、下游引物比对到的每一个物种叶绿体基因组的位置，计算其长度，得到电子PCR扩增产物的长度大小；再将每一个标记在步骤（1）获得的136个基因组的扩增片段大小进行比较，筛选其中的多态性标记。
（4）验证和获得用于菊科物种分子鉴定的叶绿体SSR标记。
具体的，根据步骤（3）电子PCR的结果，选择这136个物种中扩增片段多态性最高的3个SSR标记，即，SSR1、SSR2、SSR3，将其引物序列，交由相关单位（如，上海生工生物工程有限公司）进行合成，从而获得SSR1的引物SSR1_F、SSR1_R，SSR2的引物SSR2_F、SSR2_R，SSR3的引物SSR3_F、SSR3_R，其序列信息如实施例1所示。
选择叶绿体基因组已知的茼蒿、向日葵、天人菊3种菊科植物以及香丝草、一年蓬、旋覆花和百日草4种叶绿体基因组未知的菊科植物，取其幼嫩叶片并采用CTAB方法提取其基因组DNA，具体方法参见文献(谭秀芳等，基于叶绿体序列分析紫茎泽兰在菊科的系统发育[J]. 西北农业学报, 2011, 4:138-143)；再利用这3对SSR引物进行PCR扩增。
PCR扩增的具体方法如下：
1）PCR反应体系为：
2×PCR Mix Buffer 10.0μl；
SSR上游引物Forward primer (10 μM) 1.0μl；
SSR下游引物Reverse primer (10 μM) 1.0 μl；
模板DNA（100ng）1.0 μl；
ddH2O 补齐至20μL；
2）PCR扩增反应程序采用Touch-Down程序：
Figure 684567DEST_PATH_IMAGE001
94°C, 2min；
Figure 132866DEST_PATH_IMAGE002
[94°C, 45s；60°C, 45s (-1.0 ℃/cycle); 72°C, 45s] 10个循环；
Figure 319127DEST_PATH_IMAGE003
20×(94°C, 45s; 50°C, 45s; 72°C, 45s)；
Figure 343365DEST_PATH_IMAGE004
72°C, 5min；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
4°C保存；
3）扩增产物的检测：
PCR扩增产物采用2%的琼脂糖电泳检测，PCR扩增产物上样量为8μL，分子量标准为DL2000（宝生物工程（大连）有限公司），缓冲溶液为1×TAE，120V恒压条件下电泳1h，染色保存；
4）PCR验证实验结果
上述3对SSR引物在7种菊科物种的扩增结果如图2、图3、图4所示；由图中的PCR验证试验结果发现，除SSR2在百日草中没有进行扩增外，这3对引物在这7种菊科物种中，均扩增出不一样的DNA条带，表明其在这些物种中呈现出多态性，可作为菊科分子鉴定用的SSR标记，用于菊科物种的高效、准确和快速识别与鉴定，同时，也可以用于菊科物种的系统进化关系和群体遗传多样性分析。
实施例3
如实施例2中所提供的菊科物种分子鉴定的叶绿体SSR分子标记引物的获取方法，在菊科物种分子鉴定方面具有重要意义。
首先，该获取方法检索获得了136个菊科叶绿体基因组序列，包括了40个属，这是目前为止最全面的菊科叶绿体基因组序列信息，具有较强的代表性。
其次，该获取方法是基于生物信息学分析方法，利用成熟且已广泛应用的MISA软件和Primer3.0工具对获得的菊科叶绿体基因组中的SSR位点进行了鉴定，并设计开发了SSR引物；再进一步利用电子PCR的方法，基于Blast序列比对，对开发的SSR引物在这136个菊科叶绿体基因组中扩增效率和扩增产物大小进行比较和筛选，获得了多态性高的SSR标记；因而，利用该技术体系，不仅鉴定开发了大量的菊科叶绿体SSR标记，而且大大提高了多态性SSR标记的筛选效率，减轻了试验工作量、提高了试验效率、节约了试验成本。
最后，通过该获取方法，挑选了3个多态性最高的SSR标记，并合成其引物，再随机选择3种叶绿体基因组已知和4种叶绿体基因组未知的共7种菊科植物进行多态性验证，结果发现，除了SSR2标记没有在百日草中进行扩增、没有条带外，其余扩增出的条带均呈现出多态性，这不仅与电子PCR鉴定结果一致，同时还表明这3组SSR标记在菊科植物中具有很高的多态性，可作为菊科物种分子鉴定用的SSR分子标记。
因而，通过该获取方法获得的是目前第一组菊科叶绿体SSR标记，而且多态性高，对菊科物种分子鉴定及其亲缘关系研究均提供了有力工具。
Figure IDA0002941579310000011
Figure IDA0002941579310000021

Claims (8)

1.一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物，其特征在于，所述叶绿体SSR标记引物为SSR1、SSR2或SSR3中的一种或几种；
所述SSR1标记的引物序列为：
上游引物序列SSR1_F：5'-ccaacgagtcacacactaagc-3'；
下游引物序列SSR1_R：5'-ctttgcattctatccagcga-3'；
所述SSR2标记的引物序列为：
上游引物序列SSR2_F：5'-gttttctcctcgtacggctc-3'；
下游引物序列SSR2_R：5'-ccacttcaattgtctcacgg-3'；
所述SSR3标记的引物序列为：
上游引物序列SSR3_F：5'-cgaaccacgctttttcta-3'；
下游引物序列SSR3_R：5'-atgctgcagttgtgattgat-3'。
2.如权利要求1所述的一组菊科植物分子鉴定的叶绿体SSR标记引物的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）检索并获取菊科叶绿体基因组；
（2）预测并获得鉴定的菊科叶绿体基因组SSR位点，开发SSR标记；
（3）电子PCR扩增菊科叶绿体SSR标记，并筛选多态性SSR标记；
（4）验证和获得用于菊科物种分子鉴定的叶绿体SSR标记。
3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（1）中，以菊科为关键词检索叶绿体基因组公共数据库和细胞器基因组数据库，获得菊科叶绿体基因组。
4.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将步骤（1）获得的菊科叶绿体基因组进行SSR位点的预测和鉴定，其中，参数设置为：1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次、2个碱基的重复元件重复次数在5次及以上、3个至6个碱基的重复元件重复次数在3次及以上；同时，两个SSR位点间的距离不少于100bp，获得SSR位点。
5.如权利要求4所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（2）中，进一步对鉴定的SSR位点进行批量引物设计，获得SSR标记。
6.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（3）中，先将步骤（2）获得的SSR标记的上下游引物作为探查序列，将步骤（1）获得的菊科叶绿体全基因组序列作为库文件，利用blastn算法进行DNA序列对DNA序列的比对。
7.如权利要求6所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（3）中，进一步将获得的比对结果，根据一个标记上、下游引物比对到的每一个物种叶绿体基因组的位置，计算其长度，得到电子PCR扩增产物的长度大小；再将每一个标记在步骤（1）获得的菊科叶绿体基因组的扩增片段大小进行比较，筛选出多态性高的3个SSR标记。
8.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述步骤（4）中，选择叶绿体基因组已知和未知的菊科植物，取其幼嫩叶片并提取基因组DNA，再利用步骤（3）获得的多态性SSR标记的引物进行PCR扩增，验证其在菊科物种中的多态性。
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