CN110592253A

CN110592253A - 鉴定云南茶树品种的dna组合条形码及其鉴定方法

Info

Publication number: CN110592253A
Application number: CN201910897965.8A
Authority: CN
Inventors: 陈立佼; 赵明; 马燕; 梁兴维; 何声灿; 吕才有
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明涉及鉴定云南茶树品种的DNA组合条形码及其鉴定方法，属于茶树鉴定技术领域，本发明采用DNA条形码技术鉴别云南茶树种以下品种之上的种质资源和亲缘关系，包括新鲜茶树叶片的总DNA提取、PCR扩增、PCR产物进行测序、序列比对和分子系统数的构建；将ITS2序列与BEL序列相结合作为云南茶树种质资源的DNA条形码，同时将Trnl‑F序列作为辅助序列片段，GBSS序列仅作为参考。该方法在云南茶树资源鉴别中通用性好，在茶树各材料中能给予稳定且高效的结果，进而加强云南茶树种质资源研究，为分类研究提供参考，提高资源利用率，加快育种进程。

Description

鉴定云南茶树品种的DNA组合条形码及其鉴定方法

技术领域

本发明属于茶树鉴定技术领域，具体的说，涉及鉴定云南茶树种以下品种之上的DNA组合条形码及其鉴定方法。

背景技术

茶树Camellia sinensis(L.)O.Ktze，为山茶科、山茶属植物。山茶属是山茶科中最大的属，种数超过200个种，90％以上起源于我国的西南和华南地区。自建国以来，基于全国范围内的植物资源调查及系统整理，山茶属的分类系统更加实用。与此同时，以形态学特征为依据的茶树分类系统虽取得较大的进展，但仍存在分歧，特别是近年来，随着生物化学分析，分子标记技术的广泛应用，茶树种质资源的分类逐步呈现出依靠形态学，生物化学及分子生物学等多手段相互印证的研究方法，其中，DNA分子标记技术以快速、准确的特点弥补了传统形态标记分类法的不足，成为现代茶树系统分类学研究的有力工具。众多以前无法进行的研究，比如环境因素的影响、数量性状的多重效应等，在DNA分子标记的帮助下已经陆续开展，如RAPD、ISSR、AFLP等已在茶树品种鉴别、遗传多样性分析、分类演化等研究领域得到了广泛的应用。但分子标记也有缺点，其中RAPD技术受环境影响，实验的稳定性和重复性较差；ISSR技术呈孟德尔遗传，大部分为显性标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型；AFLP技术也是显性标记，有碍群体遗传结果的分析，对DNA的纯度及内切酶的质量要求高，并且步骤复杂，成本高。

DNA条形码(DNA barcode)是生物基因组中普遍存在的、较短的、标准化的DNA序列，因其具有稳定的保守性，又包含足够的中间遗传变异，可以用于物种的分子鉴定。相比于传统的形态学鉴定，DNA条形码技术不受外界因子和个体差异影响，操作简单，易于标准化，通用性和准确性高，可实现一次性快速鉴定大量样本。目前DNA条形码技术多用于鉴草药材的真伪及其他动植物的研究，对于云南茶树种质资源的鉴定研究报道较少。茶叶作为云南重要的木本经济作物，现有的茶树品种已难以满足日益多样化的市场要求，且为了保证茶叶市场稳定，基于茶树鉴定的溯源工作也是重要的研究方向。利用DNA条形码技术鉴别云南茶树种以下品种之上的种质资源和亲缘关系，不仅可以满足市场需求，而且对进一步加强茶树种质资源研究，提高资源利用效率，进而加快茶树育种进程和保证茶树来源可靠有着十分重要的意义。

尽管目前已对常见的分类基因进行了茶组植物系统的演进研究，如叶绿体基因组体trnl-F、matK、rpL16和rpL23-trnl基因、低拷贝核基因苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、RPB2和Waxy等，但目前所得结果与已有的茶组植物分类系统关联性不稳定，茶树系统分类研究仍缺少完善的分子生物学依据。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了鉴定云南茶树品种的DNA组合条形码及其鉴定方法，DNA条形码组合包括ITS2序列、BEL序列、Trnl-F序列、GBSS序列，将ITS2序列与BEL序列相结合作为云南茶树种质资源的DNA条形码，同时将Trnl-F序列作为辅助序列片段，GBSS序列仅作为参考。该方法在云南茶树资源鉴别中通用性好，在茶树各材料中能给予稳定且高效的结果，为分类提供参考。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的鉴定云南茶树品种的DNA条形码组合为包括ITS2序列与BEL序列。

所述的DNA条形码还包括Trnl-F序列、GBSS序列中的一种或多种(来源于NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/数据库中已有的序列)。

所述的鉴定云南茶树品种的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取新鲜茶树叶片的总DNA，获得茶树样品DNA；

2)利用BEL片段引物对步骤1)所提取的DNA样品进行PCR扩增；

3)将步骤2)扩增得到的PCR产物进行测序，再将测序结果与NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中已有的ITS2序列、BEL序列、Trnl-F序列或GBSS序列进行比对，构建分子系统数，鉴定茶树品种。

进一步优选，扩增ITS2片段的引物如下：

ITS2-F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’

ITS2-R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；

进一步优选，扩增BEL片段的引物如下：

BEL-1：5’-GGDGCGAKAHTGGCCYCCCGTGC-3’

BEL-3：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。

进一步优选，步骤2)中，还利用GBSS片段、叶绿素基因片段Trnl-F对步骤1)所提取的DNA样品进行PCR扩增。

进一步优选，扩增GBSS片段的引物如下：

GBSS-F：5’-TGCCACCACTGTAAGATTC-3’

GBSS-R：5’-CCTTCTTTCACAGTGTCAAC-3’；

扩增Trnl-F片段的引物如下：

Trnl-F：5’-CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT-3’

Trnl-R：5’-CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC-3’。

进一步优选，PCR扩增反应体系为25μL，即加入19μL ddH₂O，2μL dNTP Mix(200μmol/L),2.5μL 10×Taq Buffer(含20mM Mg²⁺)，引物各0.5μL(10mM)，0.5μLDNA(0.2μg/μL)，0.25μL Taq DNA Polymerase(2U/μL)模板。

进一步优选，PCR反应条件为94-95℃预变性5min；94-95℃变性30-45s，53-60℃退火30-45s，72℃延伸45-90s，循环30-40次；72℃终延伸10min。

本发明的有益效果：

本发明采用DNA条形码技术鉴别云南茶树品种和亲缘关系，将ITS2序列与BEL序列相结合作为云南茶树种质资源的DNA条形码，同时将Trnl-F序列作为辅助序列片段，GBSS序列仅作为参考。该方法在云南茶树资源鉴别中通用性好，在茶树各材料中能给予稳定且高效的结果，进而加强云南茶树种质资源研究，为分类提供参考，提高资源利用率，加快育种进程。

附图说明

图1是样品总DNA提取电泳检测图；

图2是TrnL-F基因电泳检测图；

图3是ITS2基因电泳检测图；

图4是BEL基因电泳检测图；

图5是GBSS基因电泳检测图；

图6是基于TrnL-F序列的NJ树；

图7是基于ITS2序列的NJ树；

图8是基于BEL序列的NJ树；

图9是基于GBSS序列的NJ树。

图1中，CH060为台丽1号样品；CH061为台丽2号样品；CH062为小房子1号样品；CH063为小寨子样品；CH064为台丽3号样品；CH065为补充样品；CH066为路边2号样品；M泳道为DNA2000 maker(大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。

图2中，CH001为班改1号样品；CH003为芒梗1号样品；CH005为太平掌1-1号样品；CH008为太平掌2-1号样品；CH020为景迈大寨1号样品；CH025为翁基1号样品；CH014为哎冷山1号样品；CH029为翁哇2号样品；CH033为糯干3号样品；M为DNA2000bp Marker(大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。

图3中，CH081为云槐样品；CH082为区试地样品；CH083为0319号样品；CH084为0699号样品；CH085为0467号样品；CH086为0305号样品；CH087为0351号样品；M为DNA2000bpMarker(大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。

图4中，CH025为翁基1号样品；CH029为翁哇2号样品；CH033为糯干3号样品；CH034为Y1号样品；CH035为Y2号样品；CH036为Y3号样品；M为DNA2000bp Marker(大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。

图5中，CH061为台丽2号样品；CH062为小房子1号样品；CH063为小寨子样品；CH064为台丽3号样品；CH065为补充样品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例

1、实验材料

从景谷、景迈山、元阳、昌宁、梁河、西双版纳、普洱茶树良种厂等地采集茶树品种样品共72份，具体信息见下表1。

表1茶树样本信息

2、实验时间、地点

2018年7月至2019年3月在云南农业大学龙润普洱茶学院茶叶生理生化实验室内进行。

3、试验研究仪器

主要的试验仪器为高速离心机CT15RE(日立株式会社)、电子分析天平CP214(奥豪斯仪器上海有限公司)、PCR仪EDC-810(东胜创新生物科技有限公司、凝胶成像分析仪UV-3A(珠海黑马医学仪器有限公司)、电泳仪BG-subMIDI(北京百晶生物技术有限公司)、微波炉G70F23N41P-M8(S0)(格兰仕微波炉电器有限公司)、移液枪(10μL、200μL、1000μL)、锥形瓶等。

4、主要试剂

新型快速植物基因组DNA提取试剂盒、液氮、琼脂糖凝胶、染色剂(97.5％LoadingBuffer×2.5％核酸染料)、DNA Marker(上海生物工程股份有限公司)电泳缓冲液(0.5×TEB)

5、试验方法

5.1样品采集及处理

采集新鲜的茶树叶片(通常为新梢4-5叶)，快速放置于液氮中冷却，并取出放置于-80度冰箱，直至用于DNA提取。

5.2茶树总DNA提取

采用北京百泰克生物技术有限公司提供的新型植物组基因快速提取试剂盒提取样品总DNA，并按照试剂盒说明书进行提取。

5.3PCR扩增

利用核基因ITS2、BEL、GBSS片段及叶绿体基因片段TrnL-F对所提取的DNA样品进行PCR扩增。

引物合成于上海生工生物工程股份有限公司。引物序列如下：

表2引物序列

PCR扩增反应体系为25μL，即加入19μL ddH₂O，2μL dNTP Mix(200μmol/L),2.5μL10×Taq Buffer(含20mM Mg²⁺)，引物各0.5μL(10mM)，0.5μLDNA (0.2μg/μL)，0.25μL TaqDNA Polymerase(2U/μL)模板。PCR反应条件见表2。

表3 PCR反应条件表

5.4电泳检测及测序

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，对单一、清晰的扩增条带送昆明生工生物公司进行双向测序。

5.5数据处理

测序获得到两条反向互补的序列，使用Sequencher4.1.4软件进行拼接，并对照测序色谱仔细核查每一个碱基以确保所得序列的准确性。将整理好的不同的基因片段用BioEdit v7.0.9软件进行基因片段之间的拼接。数据中的空位“gap”，作为缺失数据“missing data”处理。所有的性状均视为无序和非加权，所有拼接序列确定正反向，并整理好的序列排成记事本文件。

将所得的各序列经MEGA 7.0软件进行Clustal W计算，并计算K2P距离值，对不同序列组间和组内变异进行比较分析。

从GenBank中下载参考序列及外群序列，将获得到的序列与本研究中所整理的序列用MAFFT v6.8进行序列多重比对通过MEGA 7.0软件建立系统进化

NJ(Neighbor-Joining)树，均选择1000次重复抽样检验，以bootstrap检验法进行可信度测验，选择pairwise deletion使用K2P距离模型来评价种质内及种质间的差异。

结果与分析

1、DNA提取结果

如图1所示，所提取的茶树样品总DNA，经1％琼脂糖电泳检测，条带清晰、单一，DNA都成功提取。

2、PCR扩增效率和测序成功率

计算结果显示Trnl-F的扩增效率、测序成功率及有效序列比例最高，均为100％，ITS2序列及BEL序列相差不大，大部分都在90％左右，GBSS序列的扩增效率为56.94％，测序成功率为16.67％，有效序列比例仅为9.49％，是三个片段中总体数值最低的。将ITS2、BEL、GBSS、TrnL-F的PCR扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，于紫外光下成像获取图像，图1至图4显示了部分扩增情况，各序列的扩增效率及测序成功率见表4。

表4不同DNA序列扩增情况

3、序列特征分析

序列经测序后进行比对及序列特征分析，结果见表5，各序列的变异位点数从大到小依次为：GBSS>BEL>ITS2>Trnl-F，GBSS序列的群体变异最大，TrnL-F序列次之，ITS2序列最小；将所有样品按照不同采集地点进行分组，组间变异和组内变异从大到小都依次为：GBSS>ITS2>BEL>TrnL-F，除TrnL-F外，GBSS和ITS2片段组间变异和组内变异都较显著，BEL组内变异显著(>0.05)，组间变异不显著。

表5不同引物的序列特征

4、基于NJ分子系统树的鉴别分析

基于实验样品扩增结果，通过构建Neighbor-Joining树对扩增片段鉴别效率进行分析。选用了89条TrnL-F序列进行分子系统树构建，其中70条包括C.taliensis、C.sinensis var assamica、C.sinensis var pubilimba序列是研究中实验所得，其余19条序列从GenBank中下载，选取金花茶(Camellia petelotii)的2条序列作为外类群，最大似然法分析546个位点中47.81％的位点为多样性位点。构建的分子TrnL-F系统树显示(见图5)，采自景谷大部分茶树资源与C.taliensis聚在一支，而部分元阳样品及大部分梁河台地茶与C.sinensis var assamica聚类，而梁河台地茶(CH091、CH092)与C.sinensis varsinensis聚在一支，但大部分梁河野生茶、元阳样品和景迈山栽培古茶树样品没有与GenBank下载序列相聚，此外，采集自普洱茶树良种场的几个未分类鉴定的茶树近缘种与多个茶种聚类，无法明确分类。综上，TrnL-F能够区分不同采集地茶树资源的遗传差异，但在资源的物种区分度上未能提供更详细的信息。

75条ITS2序列用于构建NJ分子系统树，其中70条包括C.taliensis、C.sinensisvar assamica、C.sinensis var pubilimba序列是研究中实验所得，其余19条序列从GenBank中下载，选取核果茶属(Pyrenaria.spp)的7条序列作为外类群，最大似然法分析324个位点中26.25％的位点为多样性位点。构建的分子ITS2系统树显示(见图6),采自大部分梁河的野生茶树和台地茶与C.sinensis var assamica聚在一支，而元阳野生茶树及部分景谷茶树与C.taliensis相聚，西双版纳和景迈山栽培古茶树样品与C.sinensis varassamica相聚，但分布的比较分散，采集自普洱茶树良种场茶树近缘种也在不同分枝与C.taliensis或C.sinensis var assamica相聚,综上，ITS2能够区分茶树资源的遗传差异。

73条BEL序列用于构建NJ分子系统树，其中65条包括C.taliensis、C.sinensisvar assamica、C.sinensis var pubilimba序列是研究中实验所得，其余15条序列从GenBank中下载，选取核果茶属(Pyrenaria.spp)的7条作为外类群，最大似然法分析265个位点中95.6％的位点为多样性位点。构建的NJ分子系统树显示(见图7),采自大部分梁河台地茶、部分景迈山栽培古茶树及西双版纳古茶树与C.sinensis var assamica聚在一支，部分景谷茶树与C.taliensis相聚，而元阳野生茶树与梁河野生茶树聚在一支，西双版纳和景迈山栽培古茶树样品与C.sinensis var assamica相聚，BEL能够区分茶树资源的遗传差异，与采集自普洱茶树良种场茶树近缘种也能区分。

43条GBSS序列用于构建NJ分子系统树，其中21条包括C.taliensis、C.sinensisvar assamica、C.sinensis var pubilimba序列是研究中实验所得，其余19条序列从GenBank中下载，选取菜豆(Phaseolus vulgaris Linn)、毛果杨(Populus trichocarpa)和Mitella japonica 3条序列作为外类群。最大似然法分析411个位点中75.06％的位点为多样性位点。构建的NJ分子系统树显示(见图8)，GBSS序列能将供试茶树和茶树近缘区分，但是GBSS序列扩增成功率低，GenBank中C.taliensis和C.sinensis var sinensis的参考序列少，供试茶树多与C.sinensis var assamica相聚，GBSS序列在资源的物种区分度上能提供参考。

综上，经过评估DNA条形码的两个重要指标：PCR扩增效率和基于候选序列特征的分析，ITS2和BEL序列在云南茶树资源鉴别中显示出良好的通用性，进而将其2个片段作为DNA条形码候选序列进行分析研究。

ITS2序列长度为354bp,平均遗传距离为2.365，组内变异为2.185，组间变异为0.180，组间变异和组内变异较为显著。通过建立NJ树图分析ITS2序列能够区分茶树资源的遗传差异，ITS2片段适合用于物种来源及茶树种以下品种以上的鉴别。

BEL序列长度为260bp,平均遗传距离为0.219,组内变异为0.177,组间变异为0.041，组内变异显著(＞0.05)，组间变异不显著。通过建立NJ树图分析BEL序列能够区分茶树资源的遗传差异，与采集自普洱茶树良种场茶树近缘种也能区分。BEL片段适合作为茶树种以下品种以上的鉴定。

Trnl-F序列比对长度为598bp,平均遗传距离为0.006，组内变异为0.003，组间变异为0.002。通过相似性搜索算法BLAST对比，Trnl-F能够鉴别93.06％的云南茶树资源；通过建立NJ树图分析Trnl-F序列能够区分不同采集地茶树资源的遗传差异，但在资源的物种区分度上未能提供更详细的信息，仅作为茶树种质资源分类DNA条形码参考序列。由于GBSS序列扩增成功率低，仅在资源的物种区分度上能提供参考。

本发明将ITS2序列与BEL序列相结合作为云南茶树种质资源鉴定的DNA条形码，同时将Trnl-F序列作为辅助序列片段，GBSS序列仅作为参考。该方法在云南茶树资源鉴别中通用性好，在茶树各材料中能给予稳定且高效的结果，可加强云南茶树种质资源研究，鉴别云南茶树种以下品种以上的和亲缘关系，为分类提供参考，提高资源利用率，加快育种进程。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.鉴定云南茶树种质资源的DNA条形码组合，其特征在于：所述DNA条形码组合包括ITS2序列与BEL序列。

2.根据权利要求1所述的鉴定云南茶树种质资源的DNA组合条形码，其特征在于：所述DNA组合条形码还包括Trnl-F序列、GBSS序列中的一种或多种。

3.一种鉴定云南茶树品种的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取新鲜茶树叶片的总DNA，获得茶树样品DNA；

2）利用ITS2、BEL引物对步骤1）所提取的DNA样品进行PCR扩增；

3）将步骤2）扩增得到的PCR产物进行测序，再将测序结果与权利要求1或2所述序列进行比对，构建分子系统树，鉴定茶树种质资源。

4.根据权利要求3所述的鉴定云南茶树种质资源的鉴定方法，其特征在于：

扩增ITS2片段的引物如下：

ITS2-F：5’- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3’

ITS2-R：5’- GACGCTTCTCCAGACTACAAT -3’；

扩增BEL片段的引物如下：

BEL-1：5’- GGDGCGAKAHTGGCCYCCCGTGC -3’

BEL-3：5’- GACGCTTCTCCAGACTACAAT -3’。

5.根据权利要求3-4任一项所述的鉴定云南茶树种质资源的鉴定方法，其特征在于：步骤2）中，还利用GBSS片段、Trnl-F片段对步骤1）所提取的DNA样品进行PCR扩增。

6.根据权利要求5所述的鉴定云南茶树种质资源的鉴定方法，其特征在于：

扩增GBSS片段的引物如下：

GBSS-F：5’- TGCCACCACTGTAAGATTC -3’

GBSS-R：5’- CCTTCTTTCACAGTGTCAAC -3’；

扩增Trnl-F片段的引物如下：

Trnl-F：5’- CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT -3’

Trnl-R：5’- CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC -3’。

7.根据权利要求3任一项所述的鉴定云南茶树种质资源的鉴定方法，其特征在于：PCR扩增反应体系为 25μL，即加入19 μL ddH₂O，2μL dNTP Mix (200μmol/L), 2.5μL 10×TaqBuffer (含20 mM Mg²⁺)，引物各0.5μL（10 mM），0.5μLDNA (0.2μg /μL)，0.25μL Taq DNAPolymerase（2U/μL）模板。

8.根据权利要求3-7任一项所述的鉴定云南茶树种质资源的鉴定方法，其特征在于：PCR反应条件为94-95℃预变性5min；94-95℃变性30-45s，53-60℃退火30-45s，72℃延伸45-90s，循环30-40次；72℃终延伸10min。