CN106834471A - Dna条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法 - Google Patents
Dna条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药材基原植物物种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别畲药食凉茶及其近缘易混种的方法及应用。DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，该方法包括1）DNA样品提取；2）PCR扩增含有ITS2序列的片段；3）PCR扩增产物的拼接；4）多个物种ITS2序列的比对；5）基于ITS2序列构建系统进化树。本发明提供的食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法和ITS2制备方法可以有效解决食凉茶及其近缘种的物种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。本发明方法适用性广，操作简易，易于掌握，准确性高。能够成功实现对食凉茶基原物种及其近缘易混种的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及中药材基原植物物种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别畲药食凉茶及其近缘易混种的方法及应用。
背景技术
畲医药是祖国医药学宝库中的一个重要组成部分，也是世界优秀文化遗产的一部分，是畲族人民在特定的历史条件下和特殊的地理环境中，为求生存与繁衍，长期与疾病作斗争的过程中总结经年累月防病治病的经验，逐步形成的具有民族特色的医药。作为畲族特有药材，食凉茶在民间使用历史悠久，其基原物种为蜡梅属植物柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius Hu)或浙江蜡梅(Chimonanthus zhejiangensis M.C.Liu)的干燥叶，是畲族应用最广的药材之一。蜡梅属植物为我国特产，分布在浙江、福建、江西等地，日本、朝鲜、欧洲、北美等地也有引种栽培。食凉茶被2005年版《浙江省中药炮制规范》作为常用畲药收载，而且是以畲民俗称首次收载的新品种[5]。研究资料表明，食凉茶中主要含有挥发油、黄酮等，可用来治疗伤风感冒、脾虚食滞、脘痛吞酸等常见病。在药理和临床应用方面，发现食凉茶有抑菌抗炎、解热镇痛、镇咳祛痰等作用，对咽喉炎有显著疗效，对气管炎、高血压也有一定的疗效。食凉茶使用历史悠久、疗效确切、副作用较少，是值得研究开发的药茶多用品种。
蜡梅属植物形态非常接近，传统形态鉴定比较困难，导致蜡梅属植物的系统分类、起源和进化都存在争议，因此在实际生产和临床应用中误用、混用近缘易混种现象时有发生。目前，关于食凉茶的研究多数集中在药理、化学成分等方面，但对于其基原物种的鉴定研究甚少，仅竺叶青等从传统形态学方面对腊梅属植物进行了系统分类、鉴定，未见有利用现代分子生物学技术进行物种鉴定。由于食凉茶基原物种的化学成分以及药理作用与蜡梅属其他物种如：蜡梅(Chimonanthus praecox(L.)Link)、山蜡梅(Chimonanthus nitensOliv.)、西南蜡梅(Chimonanthus campanulatus R.H.Chang et C.S.Ding)和夏蜡梅属美国蜡梅(Calycanthus floridus L.)、夏蜡梅(Calycanthus chinensis Cheng et S.Y.)存在明显差异，混用乱用严重影响了食凉茶的临床疗效与用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。
随着分子生物学技术和生物信息学的发展，基于DNA条形码技术进行鉴定和分类的研究已成为生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点。DNA条形码技术是利用一段或几段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定，类似于超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品。DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。本文利用DNA条形码技术，基于ITS2序列对食凉茶基原物种及其近缘种进行准确鉴别，确保蜡梅属药材临床用药的准确性和安全性，为畲医畲药的开发与研究提供技术保障。
发明内容
本发明目的是提供利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其该方法包括以下的步骤：
1)提取食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片的基因组DNA；
2)以ITS2-F引物和ITS3-R为引物PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2-F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3-R引物的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示；
3)对PCR扩增所得的ITS2序列进行检测，测序，拼接；
4)基于K2P模型，构建测序拼接后的ITS2序列的系统发育树，以ITS2序列作为条形码鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。
作为优选，步骤1)中所述食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法为：采集食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片，用75％乙醇擦洗叶片表面后晾干，后用变色硅胶干燥。取干燥叶片约20mg，用研磨仪研磨2min，30次/秒，后用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。
作为优选，步骤2)中所述PCR扩增反应体条件为：
正向引物：SEQ ID No.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；
反向引物：SEQ ID No.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；
反应体系：2×Taq Mix Master 12.5μL、正反向引物，2.5μM，各1.0μL、总DNA2μL，加灭菌ddH2O补至25μL；
反应程序：94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min。
作为优选，步骤3)中所述的ITS2序列进行检测方法为：采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，电泳后，PCR产物在相应的DNA条形码序列长度位置出现清晰的目的条带，阴性对照无对应条带，将PCR产物送测序公司进行DNA测序，PCR引物作为测序引物，测序结果采用Oligo 6软件进行拼接。
作为优选，食凉茶基原物种为柳叶蜡梅和浙江蜡梅中的一种，近缘易混种为蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国蜡梅和夏蜡梅中的一种。
作为优选，柳叶蜡梅ITS2序列长度为256～258bp，有3个单倍型，序列详见SEQ IDNo.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；浙江蜡梅ITS2序列长度均为256bp，有2个单倍型序列详见SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；蜡梅、山腊梅、西南蜡梅、夏蜡梅和美国蜡梅ITS2序列长度为256-260bp，只检测到一个单倍型，序列详见SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
本发明提供的食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法和ITS2制备方法可以有效解决食凉茶及其近缘种的物种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。
本发明方法适用性广，操作简易，易于掌握，准确性高。能够成功实现对食凉茶基原物种及其近缘易混种的快速、准确鉴定。
附图说明
图1食凉茶基原植物及其近缘种种间序列比对(拉丁名后字母为单倍型编号)。
图2基于ITS2序列的食凉茶基原植物及其近缘易混种的NJ树(拉丁名后为单倍型编号，Bootstrap 1000次重复)。
图3食凉茶基原植物及其同属近缘种种间序列比对(拉丁名后字母为单倍型编号)。
图4基于ITS2序列的食凉茶基原植物及其同属易混种的NJ树(拉丁名后为单倍型编号，Bootstrap 1000次重复)。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1鉴别食凉茶基原植物及蜡梅属、夏蜡梅属易混种
1提供样本
收集不同产地的食凉茶基源植物和同属易混种叶片样本共37份(详见表1)表1样品信息表
2基因组DNA提取
将表1中叶片样品用变色硅胶干燥，取叶片约20mg，用研磨仪Retsch MM400,Germany)研磨2min(30次/秒)后用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。
3PCR扩增
PCR反应体系中
正向引物：SEQ ID No.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；
反向引物：SEQ ID No.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；
反应体系：2×Taq Mix Master 12.5μL、正反向引物(2.5μM)各1.0μL、总DNA 2μL
(～30ng)，加灭菌ddH2O补至25μL；
反应程序：
4测序
PCR扩增产物进行纯化和测序(由上海铂尙生物技术有限公司完成)。测序引物为用于PCR扩增的ITS2-F引物和ITS3-R(序列信息见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。本发明进行正反向引物重复测序以确保ITS2序列的可靠性。正反向测序结果拼接后获得准确的ITS2序列。
5序列拼接
测序结果采用Oligo 6软件进行测序峰图校对和序列拼接，采用基于隐马尔科夫模型的Hidden Markov Model(HMM)注释方法去除5.8S rRNA和28S rRNA，获得完整的ITS2序列。
6序列比对
序列比对发现食凉茶基源植物柳叶蜡梅和浙江蜡梅与其近缘易混种的ITS2序列存在明显差异(图1)。柳叶蜡梅ITS2序列长度为256～258bp，有3个单倍型(A1、A2和A3；序列详见SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)；浙江蜡梅ITS2序列长度均为256bp，有2个单倍型(B1和B2；序列详见SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)；其他近缘物种蜡梅、山腊梅、西南蜡梅、夏蜡梅和美国蜡梅ITS2序列长度为256-260bp，只检测到一个单倍型(序列详见SEQID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)。食凉茶基原物种与近缘易混种变异位点数等具体情况见图1。
7系统发育树(NJ树)构建
将获得的ITS2序列导入MEGA5进行比对，用比对结果构建以K2P(Kimura2-parameter)为模型的系统发育NJ树。结果显示食凉茶基原植物柳叶蜡梅和浙江蜡梅以及外形最为接近的山蜡梅、的序列聚为一支，其近缘种蜡梅、西南蜡梅、美国蜡梅以及夏蜡梅各自聚为一支，能够与食凉茶基原植物明显区分开。因此，ITS2序列作为条形码可准确鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。
实施例2鉴别食凉茶基原植物及同属易混种
1提供样本
收集不同产地的食凉茶基源植物和同属易混种叶片样本共37份(详见表2)表2样品信息表
2基因组DNA提取
将表1中叶片样品用变色硅胶干燥，取叶片约20mg，用研磨仪Retsch MM400,Germany)研磨2min(30次/秒)后用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取总DNA，65℃水浴1h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。
3测序
PCR反应体系中
正向引物：SEQ ID No.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；
反向引物：SEQ ID No.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；
反应体系：2×Taq Mix Master 12.5μL、正反向引物(2.5μM)各1.0μL、总DNA 2μL(～30ng)，加灭菌ddH2O补至25μL；
反应程序：
4PCR扩增
PCR扩增产物进行纯化和测序(由上海铂尙生物技术有限公司完成)。测序引物为用于PCR扩增的ITS2-F引物和ITS3-R(序列信息见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。本发明进行正反向引物重复测序以确保ITS2序列的可靠性。正反向测序结果拼接后获得准确的ITS2序列。
5序列拼接
测序结果采用Oligo 6软件进行测序峰图校对和序列拼接，采用基于隐马尔科夫模型的Hidden Markov Model(HMM)注释方法去除5.8S rRNA和28S rRNA，获得完整的ITS2序列。
6序列比对
序列比对发现食凉茶基源植物柳叶蜡梅和浙江蜡梅与其近缘易混种的ITS2序列存在明显差异(图1)。柳叶蜡梅ITS2序列长度为256～258bp，有2个单倍型(A1、A2和A3；序列详见SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)；浙江蜡梅ITS2序列长度均为256bp，有2个单倍型(B1和B2；序列详见SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)；其他同属近缘物种蜡梅、山腊梅和西南蜡梅ITS2序列长度为256-260bp(序列详见SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10)，只检测到一个单倍型。食凉茶基原物种同属易混种变异位点数等具体情况见图3。可见，ITS2序列作为条形码可准确鉴别食凉茶基原植物及其同属近缘种。
7系统发育树(NJ树)构建
将获得的ITS2序列导入MEGA5进行比对，用比对结果构建以K2P(Kimura2-parameter)为模型的系统发育NJ树。结果显示食凉茶基原植物柳叶蜡梅和浙江蜡梅和外形最为接近的山蜡梅的序列聚为一支，蜡梅和西南蜡梅聚为另一支，能够与食凉茶基原植物明显区分开。因此，ITS2序列作为条形码可准确鉴别食凉茶基原植物及其同属近缘种。
<110>丽水市农业科学研究院
<120>DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法
<160>12
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ATGCGATACTT GGTGTGAAT 19
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GACGCTTCTC CAGACTACAA T 21
<210>3
<211>256
<212>DNA
<213>柳叶蜡梅
<400>3
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCACCGTTCG ACCTGGAGGG TGACGCGGAG ACTGGCCGCC 60
CGTGCCGGAG AAGATCTCCG TGCGCGGTGG GCCCAAATGC AGGAACGCTG CGCGGTTGGG 120
CGCGACGAGT GGTGGCCGGA GCAGAGCTGC GGACGCCGCG CCTACCCATG CCGCGCTGCG 180
TGGAACGAGA GGGGCACGGA TTGCAGGCCG CCGATGCGAC TTGAGCGGAT CGGCGTGCAG 240
GCTCCCGAAC GACTTG 256
<210>4
<211>256
<212>DNA
<213>柳叶蜡梅
<400>4
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCACCGTTCG ACCTGGAGGG TGACGCGGAG ACTGGCCGCC 60
CGTGCCGGAG AAGATCTCCG TGCGCGGTCG GCCCAAATGC AGGAACGCTG CGCGGTTGGG 120
CGCGACGAGT GGTGGCCGGA GCAGAGCTGC GGACGCCGCG CCTACCCATG CCGCGCTGCG 180
TGGAACGAGA GGGGCACGGA TGGCAGGCCG CCGATGCGAC TTGAGCGGAT CGGCGTGCAG 240
GCTCCCGAAC GACTTG 256
<210>5
<211>256
<212>DNA
<213>柳叶蜡梅
<400>5
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCCCACCGTT CGACCTGGAG GGTGACGCGG AGACTGGCCG 60
CCCGTGCCGG AGAAGATCTC CGTGCGCGGT CGGCCCAAAT GCAGGAACGC TGCGCGGTTG 120
GGCGCGACGA GTGGTGGCCG GAGCAGAGCT GCGGACGCCG CGCCTACCCA TGCCGCGCTG 180
CGTGGAACGA GAGGGGCACG GATGGCAGGC CGCCGATGCG ACTTGAGCGG ATCGGCGTGC 240
AGGCTCCCGA ACGACTTG 258
<210>6
<211>257
<212>DNA
<213>浙江蜡梅
<400>6
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCCACCGTTC GACCTGGAGG GTGACGCGGA GACTGGCCGC 60
CCGTGCCGGA GAAGATCTCC GTGCGCGGTC GGCCCAAATG CAGGAACGCT GCGCGGTTGG 120
GCGCGACGAG TGGTGGCCGG AGCAGAGCTG CGGACGCCGC GCCTACCCAT GCCGCGCTGC 180
GTGGAACGAG AGGGGCACGG ATTGCAGGCC GCCGATGCGA CTTGAGCGGA TCGGCGTGCA 240
GGCTCCCGAA CGACTTG 257
<210>7
<211>256
<212>DNA
<213>浙江蜡梅
<400>7
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCACCGTTCG ACCTGGAGGG TGACGCGGAG ACTGGCCGCC 60
CGTGCCGGAG AAGATCTCCG TGCGCGGTCG GCCCAAATGC AGGAACGCTG CGCGGTTGGG 120
CGCGACGAGT GGTGGCCGGA GCAGAGCTGC GGACGCCGCG CCTACCCATG CCGCGCTGCG 180
TGGAACGAGA GGGGCACGGA TTGCAGGCCG CCGATGCGAC TTGAGCGGAT CGGCGTGCAG 240
GCTCCCGAAC GACTTG 256
<210>8
<211>258
<212>DNA
<213>蜡梅
<400>8
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCACCCCTTC GACCCGGAGG GCGACGCGGA GACTGGCCGC 60
CCGTGCCGGA GAAGATCTCC GTGCGCGGTC GGCCCAAATG CAGGAACGCT GCGCGGTTGG 120
GCGCGACGAG TGGTGGCCGG AGCAGAGCTG CGGACGCCGC GCCTACCCAT GCCGCGCTGC 180
GTGGAACTGA GAGGGGCACG GATTGCAAGC CGCCGATGCG ACTCGAGCGG ATCGGCGTGC 240
AGGCTCCCGA ACGACTAG 258
<210>9
<211>256
<212>DNA
<213>山蜡梅
<400>9
CGCCACCCAT CGCTTCCCCC CCACCGTTCG ACCTGGAGGG TGACGCGGAG ACTGGCCGCC 60
CGTGCCGGAG AAGATCTCCG TGCGCGGTCG GCCCAAATGC AGGAACGCTG CGCGGTTGGG 120
CGCGACGAGT GGTGGCCGGA GCAGAGCTGC GGACGCCGCG CCTACCCATG CCGCGCTGCG 180
TGGAACGAGA GGGGCACGGA TTGCAGGCCG CCGATGCGAC TTGAGCGGAT CGGCGTGCAG 240
GCTCCCGAAC GACTTG 256
<210>10
<211>256
<212>DNA
<213>西南蜡梅
<400>10
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CACCCCTTCG ACCAGGAGGG CGACGCGGAG ACTGGCCGCC 60
CGTGCCGGAG AAGATCTCCG TGCGCGGTCG GCCCGAATGC AGGAACGCTG CGCGGTTGGG 120
CGCGACGAGT GGTGGCCGGA GCAGAGCTGC GGACGCCGCG CCTACCCATG CCGCGCTGCG 180
TGGAACGAGA GGGGCACGGA TTGCAGGCCG CCGATGCGAC TCGAGCGGAT CGGCGTGCAG 240
GCTCCCGAAC GACCAG 256
<210>11
<211>260
<212>DNA
<213>夏蜡梅
<400>11
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCCCACCCAT TCGGACGGGA GGGTGATGCG GAGACTGGCC 60
GCCCGTGCCG GAGACGATCT CCGTGCGCGG TCGGCCCAAA TGAAGGATCG CTGCGCGGTT 120
GGGCGCGACG AGTGGTGGCC GGAGCACAGC TGCGGACGCC GCGCCTACCC ATGCCGCGCT 180
GCGTGGAATG AGAGGGGCAC GGATTGCAGG CCCGTCGATG CGACCTGCGC GGATCGGCGT 240
GCCGGCTCCC GAACGACTAG 260
<210>12
<211>259
<212>DNA
<213>美国蜡梅
<400>12
CGCCACCCAT CGCTCCCCCC CCCACCCATT CGACCCGGAG GGGTGACGCG GAGACTGGCC 60
GCCCGTGCCG GAGACGATCT CCGTGCGCGG TCGGCCCAAA TGAAGGAACG CTGCGCGGTT 120
GGGCGCGACG AGTGGTGGCC GGAGCACAGC TGCGGACGCC GCGCCTACCC ATGCCGCGCT 180
GCGTGGAATG AGAGGGGCAC GGACTGCAGG CCGTCGATGC GACTTGCGCG GATCGGCGTG 240
CCGGCTCCCG AACGACGAG 259
Claims (6)
1.DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）提取食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片的基因组DNA；
2）以ITS2-F引物和ITS3-R为引物PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2-F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3-R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
3）对PCR扩增所得的ITS2序列进行检测，测序，拼接；
4）基于K2P模型，构建测序拼接后的ITS2序列的系统发育树，以ITS2序列作为条形码鉴别食凉茶基原植物及其近缘种。
2.根据权利要求1所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于步骤1）中所述食凉茶基原物种及其近缘易混种DNA提取方法为：采集食凉茶基原物种及其近缘易混种叶片，用75%乙醇擦洗叶片表面后晾干，后用变色硅胶干燥；
取干燥叶片约20 mg，用研磨仪研磨 2 min，30 次/秒，后用植物 DNA 提取试剂盒提取总DNA，65 ℃ 水浴 1 h，其余步骤按照试剂盒说明书进行。
3.根据权利要求1所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于步骤2）中所述PCR扩增反应体条件为：
正向引物：SEQ ID No.1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3′；
反向引物：SEQ ID No.2：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT -3′；
反应体系：2 ×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物，2.5 μM，各 1.0 μL、总 DNA 2μL，加灭菌 ddH2O 补至 25 μL；
反应程序：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃ 10min。
4.根据权利要求1所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于步骤3）中所述的ITS2序列进行检测方法为：采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，电泳后，PCR产物在相应的DNA条形码序列长度位置出现清晰的目的条带，阴性对照无对应条带，将PCR产物送测序公司进行DNA测序，PCR引物作为测序引物，测序结果采用Oligo6软件进行拼接。
5.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于食凉茶基原物种为柳叶蜡梅和浙江蜡梅中的一种，近缘易混种为蜡梅、山蜡梅、西南蜡梅、美国蜡梅和夏蜡梅中的一种。
6.根据权利要求5所述的DNA条形码鉴别畲药食凉茶基原物种及其近缘易混种的方法，其特征在于柳叶蜡梅ITS2序列长度为256～258 bp，有3个单倍型，序列详见SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No. 5；浙江蜡梅ITS2序列长度均为256 bp，有2个单倍型序列详见SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；蜡梅、山腊梅、西南蜡梅、夏蜡梅和美国蜡梅ITS2序列长度为256-260 bp，只检测到一个单倍型，序列详见SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
Priority Applications (1)
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