CN103484558B - 滇重楼的分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种滇重楼的分子鉴定方法，属分子标记技术领域。该方法将待鉴定样品PCR反应获得扩增产物测序后，与滇重楼条形码比对，当扩增产物的序列与滇重楼条形码所示的碱基序列的相似性达到98.2%以上，且在位点1-4的碱基为CTGA、在位点19的碱基缺失、在位点77的碱基都为C、在位点138的碱基都为C、在位点792的碱基为G、在位点1110-1113的碱基为GGCG、在位点1116的碱基为G和在位点1119-1120的碱基为CC时，该待鉴定样品为滇重楼。本发明克服了用感官审评或理化分析等方法难以鉴别滇重楼的真伪以及重楼属下不同重楼植物的技术问题，能有效、简便快速地对滇重楼植物进行鉴定。

Description

滇重楼的分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及采用PCR技术对重楼属下滇重楼植物的分子鉴别技术。
背景技术
重楼属（Paris L.）隶属于百合科（Liliaceae）重楼族（Parideae），全属共28种，均为多年生草本，分布于欧亚大陆的热带及温带地区。我国产22种（18种为我国特有），并以云贵高原至四川邛崃山区为属的分布及多样化中心；国内各省区中，云南产16种，其中6种为云南特有，其种类多样性又居全国之首（Jiet al.Phylogeny and classification of Paris(Melanthiaceae)inferredfrom DNA sequence data[J].Annals of Botany,2006,98:245-256）。
重楼属是一个有着重要经济价值的植物类群，重楼的药用在我国有着悠久的历史，但药用重楼的基源一直比较混乱，本属蚤休亚属（Paris subg.Daiswasensus,Ji et al.Phylogeny and classification of Paris(Melanthiaceae)inferred from DNA sequence data[J].Annals of Botany,2006,98:245-256）的所有种类均具有粗壮的根状茎。为澄清药用重楼基源混乱的问题，李恒对《滇南本草》等古籍文献进行考证，表明药用重楼应以滇重楼（Paris polyphylla var.yunnanensis）为正品，其它种类均为代用品（李恒.重楼属的系统发育.见：李恒（主编），重楼属植物.北京：科学出版社[M]，1998,8-65）。重楼以根状茎入药，根据形态学、解剖学等特征难以对正品及代用品进行区分，使得在药材的收购及工厂化生产中无法将两者区别开来；鉴于不同种类的重楼在药用成分甾体皂甙的种类、含量等方面存在显著的差异（陈昌祥.重楼属的植物化学.见：李恒（主编），重楼属植物.北京：科学出版社[M].1998,159-193），滇重楼及代用品的混用将给中医用药医药工业生产的质量控制带来了极大的隐患。此外，蚤休亚属的多数种类（14种）为我国特有种，其分布区范围均十分狭窄、种群数目和种群个体数目有限，大部分种类的生存和种群繁衍已受到严重的威胁，因而被《中国物种红色名录》（汪松，谢焱，2004）列为极威种（4种）、濒危种（2种）和易威种（2种），如不尽快采取保护措施还继续将这些种类作为药用重楼采集，无疑会加快它们灭绝的速度。因此，对滇重楼及其代用品的鉴定方法和手段进行研究，摸索一套在药材收购和生产中行之有效的鉴定方法，对于医药生产的质量控制及保护重楼属植物中的珍惜、濒危种类有着重要的意义。
近年来，由于DNA分子标记技术在植物学中的广泛应用，使药用植物的鉴别工作也取得了空前的发展。传统的鉴定手段人为干扰因素较多，而DNA分子标记在中药鉴别中不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，能从分子水平上客观地反映待测材料之间的差异，特别适合药材近缘品种和道地药材的鉴定，一般能够通过杂交或电泳等方式直观地体现出来。从国内外研究状况来看，由于DNA分子标记技术能客观反映物种间亲源关系和遗传多样性，近年来，不少学者都尝试把它们用于药用植物的鉴定，如Fushimi等（Fushimi H et al.18SRibosomal RNA gene sequences of three Panax cspecies and thecorrespondiing ginseng drugs[J].Biol Pharm Bull,1996,19:1350）通过变异等位基因扩增技术(MASA)对matK基因片段测序，发现人参与西洋参、竹节参间的matK基因片段上第102号核苷酸序列不同，以此来鉴别人参与西洋参、竹节参。曹晖（曹晖等.三七及其伪品的DNA测序鉴别[J].中药材,2001,24:398-402）采用PCR直接测序技术测定三七及其4种伪品的18SrRNA基因和matK基因核苷酸序列，并作序列变异分析。丁小余（丁小余等.束花石斛及其相似种的DNA分子鉴别[J].中国中药杂志,2002,27:13-18）等对束花石斛及其相似种玫瑰石斛、喇叭唇石斛、报春石斛、兜唇石斛等植物进行ITS（核糖体转录间隔区）的分析，结果显示，束花石斛及其相似种在rdna-its序列上存在着显著而稳定的差异，根据rdna-its区碱基序列差异，能准确鉴别束花石斛及其相似种植物及药材。王艇（王艇等.中药材厚朴的DNA扩增产物指纹分析研究[J].中药材,2001,24:710-715）等采用DNA指纹技术（DAF）鉴别中药材厚朴、凹叶厚朴及其常见的伪品、混淆品，获得了清晰可靠的DNA指纹图谱。
对于滇重楼的药材的鉴定目前主要还是利用传统的形态鉴别方式，尽管也有学者利用滇重楼中皂甙类物质进行药材品质的判断依据，但由于滇重楼的药理作用并非仅仅由单一成分决定，同时各品种所含皂甙类化学成分及含量有较大差别，因此仅用皂甙类物质鉴别药材的品质和真伪也不具客观性。分子方面，张金渝（张金渝等.多叶重楼遗传多样性的RAPD分析[J].生物多样性,2004,12:517-522）等利用RAPD技术从植物系统分类的角度对重楼属中的4种植物进行多态性分析，发现不同种类指纹图谱有明显的差异；何俊（何俊等.多叶重楼遗传多样性的ISSR分析[J].云南植物研究,2007,29:388-392）等采用ISSR技术对主要分布于云南的滇重楼不同居群进行多态性分析，发现不同居群的指纹图谱也有明显的差异，认为遗传多样性主要存在于居群间；但由于有限的采样数量和所采用分子标记的低分辨率，加之上述作者并未从分子鉴定的角度对滇重楼进行研究，因此重楼属不同种类和居群的遗传多样性和分子鉴定还有待进一步的研究。
条形码技术在零售业的发展过程中起到了举足轻重的作用，它大大节省了交易时间，提高了销售效率。类似地，在分类学上，根据对同一目标基因DNA序列的分析，来完成物种鉴定的过程被称为DNA Barcode编码过程，DNA Barcode是国际上近年来发展起来的物种鉴定新技术。利用DNA Barcode技术得到的研究结果在不同物种之间具有可比性，而且它操作的简便性和高效性将以我们无法想象的速度加快物种鉴定和进化历史研究的步伐（Schindel et al.DNA barcoding,a useful tool for taxonomists[J].Nature.2005,435:17）。
但到目前为止，还没有应用DNA Barcode技术对滇重楼进行分子鉴别，更没有滇重楼的专用条形码的报道。本发明人特别通过引物的选择开创性地利用DNA Barcode技术对重楼属下滇重楼进行分子鉴定。通过2011年和2012年两次查新检索，目前在国内外未发现有关滇重楼植物的DNA Barcode及其分子鉴定的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在难以用传统的表型特征审评或理化分析等方法鉴别不同种的重楼的技术问题，其目的是提供一种既方便又能准确地对重楼属下滇重楼植物的分子鉴定方法。
本发明所提供的滇重楼的分子鉴定方法，包括以下步骤：
（1）对待鉴定样品进行总DNA提取；
（2）PCR反应,以步骤（1）提取的总DNA为模板，用psbA/trnH引物扩增，获得扩增产物，所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH组成，所述的上游引物psbA的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物trnH的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
（3）将扩增产物测序后与滇重楼条形码比对，所述的滇重楼条形码的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，当扩增产物的序列与SEQ ID NO：3所示的碱基序列的相似性达到98.2%以上，且在位点1-4上的碱基为CTGA、在位点19上的碱基缺失、在位点77上的碱基都为C、在位点138上的碱基都为C、在位点792上的碱基为G、在位点1110-1113上的碱基为GGCG、在位点1116上的碱基为G和在位点1119-1120上的碱基为CC时，该待鉴定样品为滇重楼。
在步骤（1）所述的待鉴定样品的总DNA提取中，待测样品可以取0.5g，按照CTAB法提取总DNA，提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则将总DNA浓度稀释到200ng/μl，用于步骤（2）PCR反应。
在步骤（2）所述的PCR反应中，反应热循环程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明克服了现有技术中用感官审评或理化分析等方法难以鉴别滇重楼原料的真伪以及重楼属下不同重楼植物的技术问题。
（2）滇重楼主要分布于滇西北、滇东北、滇中等地，针对这些地区，本发明在前期全面地采集了滇重楼在主要分布的24个地区的样本（还囊括了部分西南及东南样品），排除了滇重楼序列信息位点在不同产地个体之间的变异，通过建立滇重楼的psbA-trnH片段序列标签，据此区分重楼属下的不同重楼植物，使滇重楼特有的DNA条形码更加真实有效。通过成功建立滇重楼主要分布地区的滇重楼DNA条形码，能有效的对滇重楼植物进行鉴定，确保了滇重楼的道地性。
（3）本发明通过建立的滇重楼的DNA条形码，能轻易地将滇重楼与其他植物区分开来。
（4）本发明采用叶绿体上的一段内含子区域作为目标片段，避免了因染色体基因组的复杂性带来的PCR扩增成功的不确定性，使植物的鉴定更加容易。
（5）本发明通过对重楼属下不同重楼植物及不同来源的滇重楼植物的叶绿体片段的PCR测序分析，发现滇重楼与重楼属下其它重楼植物在序列位点上存在稳定的差异，可以通过以下途径来区分重楼属下不同重楼植物，因而，本发明能准确地鉴定出滇重楼：
序列比对显示，所有地区的滇重楼在位点1-4上的碱基都为CTGA，而其余重楼为AGAC；所有地区的滇重楼在位点19上的碱基缺失，而其余重楼为A；所有地区的滇重楼在位点77上的碱基都为C，而其余重楼为T；所有地区的滇重楼在位点138上的碱基都为C，而其余重楼为T；所有地区的滇重楼在位点792上的碱基都为G，而其余重楼为T或C；所有地区的滇重楼在位点1110-1113上的碱基都为GGCG，而其余重楼为TCGA；所有地区的滇重楼在位点1116上的碱基都为G，而其余重楼为T；所有地区的滇重楼在位点1119-1120上的碱基都为CC，而其余重楼为TA、TG或GA。详细情况见表2。通过这些滇重楼的DNA条形码可以非常容易的对滇重楼进行鉴定。
（5）本发明利用高效自动化技术测序，即缩短了实验时间又降低了繁杂的人工测序劳作，易于对扩增样本进行标准化分析，提高了数据的可靠性。
序列表中SEQ ID NO：1所示的碱基序列是psbA/trnH引物的上游引物psbA的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的碱基序列是psbA/trnH引物的下游引物trnH的碱基序列
序列表中SEQ ID NO：3所示的碱基序列是滇重楼条形码。
具体实施方式
以下实施例无特别说明为常规方法。
本发明的主要仪器：
DYY一8C型电泳仪(北京六一仪器厂)；台式冷冻离心机（Beckman Coulter）；PCR仪（MJ Research(Waltham,MA,USA)PTC200-well thermal cycler）；紫外分光光度计(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝胶成像系统等。
实施例1 滇重楼条形码的构建
1、滇重楼样本的采集
滇重楼主要分布于滇西北、滇东北、滇中地区，针对这些地区，本发明在前期全面地采集了滇重楼在主要分布的24个地区的样本（还囊括了部分西南及东南样品），详见表1，排除了滇重楼序列信息位点在不同产地个体之间的变异，使滇重楼特有的DNA条形码更加真实有效。所采集的滇重楼样本均经植株形态鉴定确认是滇重楼。另外，还采集了重楼属下的其它不同种，用于区别滇重楼DNA条形码与其它种之间序列的差异。
2、样本DNA的提取
样本各0.5g，分别按照改进的CTAB法（Doyle J.DNA protocols forplants-CTAB total DNA isolation.In:Hewitt GM,Johnston A,eds.Moleculartechniques in taxonomy.Berlin:Springer,1991,283-293.）提取基因组DNA(见第二章)。提取的DNA经纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则将总DNA浓度稀释到200ng/μl，用于PCR反应。扩增反应在PCR仪上进行。如果用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，测得DNA纯度没有达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，表明DNA纯度不够，易造成扩增不成功，需重新提取DNA。
3、选择目标片段引物
选择位于叶绿体基因组上的psbA-trnH片段作为扩增的目标片段，RNA酶、dNTP、PCR reaction buffer，均购自上海生工和宝生物公司；
引物为psbA/trnH，psbA/trnH引物，所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH组成，所述的上游引物psbA的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物trnH的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
4、PCR扩增
样本DNA加入psbA/trnH引物进行扩增，反应热循环程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出；扩增反应在PCR仪上进行。PCR反应体系(25μL):ddH2O17.8μL,10×PCR buffer(Mg+2+Plus)2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)1.5μL,Tag酶(5u/μL)0.2μL,正向引物(10μmol/L)1μL,反向引物(10μmol/L)1μL,模板DNA(50ng/μL)1.0μL。
5、PCR产物纯化及测序
将扩增成功的PCR产物(出现明显PCR条带)进行纯化后（采用上海生工核酸凝胶纯化试剂盒），送上海生工测序中心使用ABI3730XL测序仪(AppliedBiosystemsCo.,USA)双向测序。
6、数据处理和分析
测序峰图采用序列拼接软件CodoncodeAligner v2.06(CodonCodeCo.,USA)校对拼接，去除低质量序列及引物区，利用clustalX v2.0(HigginsD.G)进行多序列比对并查错，得到序列表中SEQ ID NO：3所示的碱基序列,即是滇重楼条形码。
7、结果与分析
（1）PCR扩增效率和测序成功率
PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码序列的一个重要指标，实验表明，psbA-trnH片段在重楼属植物中扩增非常容易，测序成功率高，适合做为重楼属植物的条形码序列。
（2）DNA条形码序列种内种间差异分析
理想的DNA条形码序列应当具有明显的种间变异，同时种内变异足够小。实验表明，psbA-trnH片段在滇重楼种内变异幅度在0.0%-1.8%之间，而种间变异程度在4.0%-6.2%之间，因此该序列适合做为重楼属植物的条形码序列，且很容易将不同种重楼鉴别开来。
（3）在重楼属药用植物材鉴定中的作用
本实验中，发明人为排除滇重楼不同产地个体间存在的变异信息，找到滇重楼特有的区别与其它重楼的信息位点，便从取样策略上，广泛采集了滇重楼所分布的区域，以此来确保滇重楼条形码的准确性。通过比对发现，叶绿体上的psbA-trnH片段在滇重楼种内变异很小，即不同产地间个体的序列相似性达到（98.2%-100%），说明该片段在滇重楼种内的信息位点很稳定；而种间比较发现，滇重楼与重楼属下的其它重楼种间的序列相似性低于96%，即该片段在种间变异幅度较大，可以轻易地将不同种重楼区分开来。因此仅从序列的相似性程度就可以将滇重楼与其它重楼种区分开来。
另外，为了找到滇重楼特有的DNA条形码，发明人通过序列比对分析，找出了滇重楼内部稳定的信息位点，而这些位点恰恰区别于重楼属下的其它重楼植物，详细信息见表2。通过这些特有的信息位点，可以轻易的将滇重楼植物与重楼属下的其他重楼植物鉴别开来。
本实验通过对叶绿体基因组部分片段进行研究，结果显示，psbA-trnH片段序列两端的序列都很保守，便于通用引物的设计，序列在种内变异稳定，种间存在较大幅度变异，易于重楼属植物的鉴定，适合做滇重楼的DNA条形码，该条形码的发现对于滇重楼道地药材的保护利用具有十分重要的作用。
表1 本实验中所采集的滇重楼样本收集信息情况
表1中序号1-24是滇重楼样本，滇重楼条形码的碱基序列如SEQ ID NO：3所示的碱基序列。序号25-35是重楼属下的其它重楼，序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上的登录号见表中所示。
表2 重楼属下不同重楼样本的psbA-trnH片段信息位点统计情况
样品来源 滇重楼 重楼属下其它重楼种
位点(1-4) CTGA AGAC
位点(19) 缺失 A
位点(77) C T
位点(138) C T
位点(792) G T或C
位点(1110-1113) GGCG TCGA
位点(1116) G T
位点(1119-1120) CC TA、TG或GA
实施例2 滇重楼的分子鉴定方法
（1）对待鉴定样品进行总DNA提取：按常规的CTAB方法提取待鉴定样品的总DNA提取（Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation.In:HewittGM,Johnston A,eds.Molecular techniques in taxonomy.Berlin:Springer,1991,283-293.）。待测样品取0.5g，按照常规的CTAB法提取总DNA，提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则将总DNA浓度稀释到200ng/μl，用于步骤（2）PCR反应。如果用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，测得DNA纯度没有达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，表明DNA纯度不够，易造成扩增不成功，需重新提取DNA。
（2）PCR反应,以步骤（1）提取的总DNA为模板，用psbA/trnH引物扩增，获得扩增产物，所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH组成，所述的上游引物psbA的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物trnH的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；反应热循环程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物。PCR反应体系(25μL):ddH2O17.8μL,10×PCR buffer(Mg+2+Plus)2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)1.5μL,Tag酶(5u/μL)0.2μL,正向引物(10μmol/L)1μL,反向引物(10μmol/L)1μL,模板DNA(50ng/μL)1.0μL。
（3）将扩增产物测序后与滇重楼条形码比对，所述的滇重楼条形码的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示的碱基序列，当扩增产物的序列与SEQ ID NO：3所示的碱基序列的相似性达到98.2%以上，且在位点1-4上的碱基为CTGA、在位点19上的碱基缺失、在位点77上的碱基都为C、在位点138上的碱基都为C、在位点792上的碱基为G、在位点1110-1113上的碱基为GGCG、在位点1116上的碱基为G和在位点1119-1120上的碱基为CC时，该待鉴定样品为滇重楼；否则，则不是滇重楼。该方法简单易行，稳定可靠，只需极少量样品就可完成，具有很好的实用价值，由于药用重楼应以滇重楼（Paris polyphylla var.yunnanensis）为正品，其它种类均为代用品，本发明方法能方便地鉴定出滇重楼、能方便地将滇重楼与从形态特征易与滇重楼混淆的重楼属下的其它重楼区别开，因此，本发明方法对保护滇重楼药材的的收购及药品生产质量具有十分重要的应用价值。
                         序列表
 
<110>  云南农业大学
 
<120>  滇重楼的分子鉴定方法
 
<130>  /
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  psbA/trnH引物的上游引物psbA
 
<400>  1
gttatgcatg aacgtaatgc tc                                              22
 
 
<210>  2
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  psbA/trnH引物的下游引物trnH
 
<400>  2
cgcgcatggt ggattcacaa atc                                             23
 
 
<210>  3
<211>  1122
<212>  DNA
<213>  滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(4)
<223>  位点（1)…(4）在所有居群中都为ctga
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(19)
<223>  n表示缺失，位点（19）在所有居群中都缺失
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (65)..(72)
<223>  n表示缺失，位点(65)..(72) 在某些居群中缺失或为tattagtg
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (77)..(77)
<223>  位点（77）在所有居群中都为c
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (118)..(123)
<223>  n表示缺失，位点(118)…(123) 在某些居群中缺失或为aagagg
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (138)..(138)
<223>  位点（138）在所有居群中都为c
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (168)..(187)
<223>  n表示缺失，位点(168)…(187)
       在某些居群中缺失或为tataggtattttataccatt
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (210)..(214)
<223>  n表示缺失，位点(210)…(214) 在某些居群中缺失或为aattt
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (792)..(792)
<223>  位点（792）在所有居群中都为g
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (853)..(853)
<223>  n表示缺失，位点(853) 在某些居群中缺失或为g
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (888)..(888)
<223>  n表示缺失，位点(888) 在某些居群中缺失或为t
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (944)..(944)
<223>  n表示缺失，位点(944) 在某些居群中缺失或为a
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (957)..(957)
<223>  n表示缺失，位点(957) 在某些居群中缺失或为t
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (978)..(978)
<223>  n表示缺失，位点(978) 在某些居群中缺失或为a
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1110)..(1113)
<223>  位点（1110）…(1113）在所有居群中都为ggcg
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1116)..(1116)
<223>  位点（1116）在所有居群中都为g
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1119)..(1120)
<223>  位点（1119）…( 1120）在所有居群中都为cc
 
<400>  3
ctgactagct gctgttgang ctccatatay aaatggataa gacttctgtc ttagtgtatt     60
 
agtgnnnnnn nntatacraa tcgttgaagg agcaatacca aaymkywtww wawrhkrnnn    120
 
nnntttggta ttgctcccat atttttwttt tatattttta taccattnnn nnnnnnnnnn    180
 
nnnnnnntat aggtaatata agcacttatn nnnnaattat aaatttataa atgattttct    240
 
tctatccttc aatacaattt tgatatgaca agkggatctt tttatcggat aactccgtcc    300
 
tcgagctcta ggtcttaact ttttcacaat agcmccccca ttgacttcag cttgactaak    360
 
aaataaattc acttccttca agcccaggtt atgagtagcg tttgatgctg caraataaac    420
 
caatttcaaa atgggataar atgcccaata aggcatgagt tccagtatca taagtgtgtc    480
 
cgcataggaa cgcccgcgaa tctgatcaat tactcttcgk gctttgaaaa cagacataca    540
 
tatatgttga gctaaaactt ttacttctgt actcgaacgc gagttctttc tccttatcat    600
 
aaggttatcc cccaccaatg aataaaaagt gccttcttta tctacttact ttattttcta    660
 
ttttgaattt tagattatat aaattcaatt aacgacgaga ttgattatcg ttccttgcat    720
 
gtcttgcgaa agttagagta ggcgcgaatt ytcccaattt atgacctacc atatgatytg    780
 
ttatataaat aggtaaatgt tcctttccmt tatgaatagc gattgtatgg ccmatcattg    840
 
tgggtataat ggntagatgc cctagaccaa gttactataa tttctttnyt cctccctcat    900
 
gttgagtttt tccatttttc ccgataaatg attagctaca aaanggattt ttttttnagt    960
 
gaacgtgtca cagcggantt actccttttt ttacattttt caaattggcm ttctatgtcc   1020
 
aatatctcga tttaagtatg aaggtaagaa taaatacaat aatgatgaat ggaaaaagaa   1080
 
aaaagagaaa atcctttagc tagataaggg gcggagagcc aa                      1122
 

Claims (3)

1.滇重楼的分子鉴定方法，包括以下步骤：
（1）对待鉴定样品进行总DNA提取；
（2）PCR反应,以步骤（1）提取的总DNA为模板，用psbA/trnH引物扩增，获得扩增产物，所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH组成，所述的上游引物psbA的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物trnH的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
（3）将扩增产物测序后与滇重楼条形码比对，所述的滇重楼条形码的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，当扩增产物的序列与SEQ ID NO：3所示的碱基序列的相似性达到98.2%以上，且在位点1-4上的碱基为CTGA、在位点19上的碱基缺失、在位点77上的碱基都为C、在位点138上的碱基都为C、在位点792上的碱基为G、在位点1110-1113上的碱基为GGCG、在位点1116上的碱基为G和在位点1119-1120上的碱基为CC时，该待鉴定样品为滇重楼。
2.根据权利要求1所述的滇重楼的分子鉴定方法，在步骤（1）所述的待鉴定样品的总DNA提取中，待测样品取0.5g，按照CTAB法提取总DNA，提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，当测得DNA纯度达到OD260/OD280在1.6-1.8之间，则将总DNA浓度稀释到200ng/μl，用于步骤（2）PCR反应。
3.根据权利要求1或2所述的滇重楼的分子鉴定方法，在步骤（2）所述的PCR反应中，反应热循环程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个热循环，最后延伸72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物。
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CN105483282B (zh) * 2016-03-02 2019-03-29 云南省农业科学院药用植物研究所 一组pcr特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法
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CN108265123B (zh) * 2018-02-26 2021-06-25 成都中医药大学 一种鉴别滇重楼正品及不同基因型的试剂盒、鉴别方法
CN110592265B (zh) * 2019-10-29 2023-11-24 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种用于茄属植物快速鉴定的dna条形码及方法
CN116287412B (zh) * 2023-03-29 2023-11-03 中国科学院昆明植物研究所 一种基于二代测序开发用于三七药材真伪检测鉴定的引物、探针及其检测方法
CN117925902B (zh) * 2024-03-21 2024-06-14 中国科学院昆明植物研究所 鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用
CN117965799A (zh) * 2024-03-28 2024-05-03 中国科学院昆明植物研究所 鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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HPLC测定不同产地滇重楼中的4种重楼皂苷;邹亮等;《华西药学杂志》;20091015(第05期);全文 *
张海珠等.滇重楼皂苷部位HPLC指纹图谱的研究.《安徽农业科学》.2009,(第21期), *
滇重楼皂苷部位HPLC指纹图谱的研究;张海珠等;《安徽农业科学》;20090720(第21期);全文 *
邹亮等.HPLC测定不同产地滇重楼中的4种重楼皂苷.《华西药学杂志》.2009,(第05期), *

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