CN116179748B - 一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其应用。本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树基因组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认标记M21899、M3858和M641的核心引物能够分别对果桑新品种‘粤椹33’扩增出一条特异性条带、二条特异性条带和二条特异性条带，可以分别从果桑品系中鉴别出果桑新品种‘粤椹33’，可用于果桑新品种‘粤椹33’的快速鉴定和检测。本发明通过直接检测‘粤椹33’的M21899标记、M3858标记和/或M641标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为果桑新品种‘粤椹33’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。

Description

一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及到品种资源的鉴定和种质创新技术领域，具体涉及果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
桑果是一种特色优异的水果资源，是第三代水果的代表，目前已被列为“既是食品又是药品”的名单,近年来来随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，桑果的营养健康价值日益为社会所关注，桑果作为一种新兴的水果品种因其具有的独特口味，丰富的营养和较高的活性物质而日益受到人们的喜爱，已经逐渐走进普通百姓的家庭里，被市民所接受喜爱。除鲜食外，桑果被加工开发成桑果汁、桑果酒、桑果酱、桑果红色素、桑果醋等多种产品，桑果产业初具规模，并呈现出良好的多元化发展势头。
‘粤椹33’是由广东桑种(Morus atropurpurea Roxb.)资源‘7403’为母本，‘航诱10’为父本，杂交后代经过多倍体诱导，定向培育而成的果桑新品种，2018年1月授予植物新品种权(CNA20184673.4)。其特征在于：幼叶花青甙显色中到强，顶端叶着生姿态斜上，叶柄着生姿态上举；植株叶片形状全叶，心脏形，叶面皱缩程度弱，夜尖长尾，叶基深心形，叶缘粗圆齿；枝条皮色灰褐色，节间直，叶序为絮乱叶序；冬芽形状为卵圆形，冬芽着生姿态尖离，冬芽中等大小；枝条根源体平，芽褥状态平，叶痕圆形。‘粤椹33’经多地引种生产实践证明，该品种米条坐果粒数多，单芽坐果数大，桑果产量极高，盛产期亩产果量2000kg以上，适宜都市休闲采摘及观赏用开发，具有极高的推广应用价值。
‘粤椹33’是近年来新育成并获得国家植物新品种授权的果桑新品种，因其具有的产量高、品质优的特点，近年来各地已出现用其他品种假冒该品种销售现象，但因苗期外部形态特征难以区分辨别品种的真实性，难以有效的监督和仲裁，给该品种的开发利用带来了较大的影响。因此需找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分该品种的简单、快速和有效的鉴别技术非常急需。
传统的果桑新品种鉴定主要是以表型性状为基础，受环境影响较大、稳定性差、测试周期长，严重影响了新品种鉴定的有效性和权威性。分子标记技术因其具有多态性高、测试周期短、不受环境影响等特性，成为品种鉴定和保护的未来发展方向。其中简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)具有共显性、重复性好、易检测、操作简单等优点，因此，SSR分子标记在果桑品种特异性评价与保护中具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的分子标记引物组、试剂盒及其应用，其操作简单，可用于果桑新品种‘粤椹33’真实性的鉴定，当出现品种假冒或有争议时可以有效的监督和仲裁。
本发明的第一个目的是提供一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的SSR分子标记，包括SSR分子标记M21899、M3858和/或M641；
所述的SSR分子标记M21899的重复基序为(CAA)n，其中n≥5，其右侧序列如SEQIDNO.8所示，其左侧序列如SEQ ID NO.7所示；所述的SSR分子标记M3858的重复基序为(AG)n，其中n≥7，其右侧序列如SEQ ID NO.10所示，其左侧序列如SEQ ID NO.9所示；所述的SSR分子标记M641的重复基序为(CT)n，其中n≥9，其右侧序列如SEQ ID NO.12所示，其左侧序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定果桑品种‘粤椹33’的SSR分子标记的核心引物组，包括针对SSR分子标记M21899的引物、针对SSR分子标记M3858的引物和/或针对SSR分子标记M641的引物：
所述的针对SSR分子标记M21899的引物：
M21899-F：5’-ATGGTCTTGAGGAGATTAAGCAG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
M21899-R：5’-GACCCTCTCCTCTGTCTTGTTTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的引物M21899-F的5’端标记有荧光报告基团；
所述的针对SSR分子标记M3858的引物：
M3858-F：5’-AAAGGAAGGAAAACACCAGAATC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
M3858-R：5’-TTTTCTTATCTCCCAAACACCAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
所述的引物M3858-F的5’端标记有荧光报告基团。
所述的针对SSR分子标记M641的引物：
M641F：5’-GTTAGGAACTGGACAGTGGCTTT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
M641-R：5’-GGGGTTGTGTTTAGAGACTTTGA-3’(如SEQ ID NO.6所示)；
所述的引物M641-F的5’端标记有荧光报告基团。
优选，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
本发明的第三个目的是提供一种果桑品种‘粤椹33’的快速检测试剂盒，包括上述的SSR分子标记的核心引物组。
优选，所述的快速检测试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和ddH2O。
本发明的第四个目的是提供一种利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹33’的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测果桑样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的引物对M21899-F/M21899-R、M3858-F/M3858-R和/或M641-F/M641-R进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)中的PCR扩增产物进行分型，对分型结果进行条带判别；若以引物对M21899-F/M21899-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有106bp一条特异性条带，以引物对M3858-F/M3858-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有160bp和170bp两条特异性条带，以引物对M641-F/M641-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108bp和122bp两条特异性条带，则表明待测果桑样品为‘粤椹33’，否则，则表明待测果桑样品为非‘粤椹33’。
优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，包括：50ng/μL DNA模板0.5μL、10×PCR buffer 2μL、25mM MgCl2 2μL、10mM dNTPs 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL和ddH2O 13.8μL。
优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。
本发明的第五个目的是提供上述的SSR分子标记或SSR分子标记的核心引物组或快速检测试剂盒在鉴定果桑品种‘粤椹33’中的应用。
本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树转录组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认SSR分子标记M21899的核心引物M21899-F/M21899-R能够对果桑新品种’粤椹33’扩增得到的PCR扩增产物只有106bp一条特异性条带，以引物对M3858-F/M3858-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有160bp和170bp两条特异性条带，以引物对M641-F/M641-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108bp和122bp两条特异性条带，则表明待测果桑样品为‘粤椹33’，否则，则表明待测果桑样品为非‘粤椹33’，可以分别从果桑品系(尤其是广东桑种)中鉴别出果桑新品种‘粤椹33’，可用于果桑新品种‘粤椹33’的快速鉴定和检测。本发明通过大量实验数据得到了扩增出‘粤椹33’特异性条带的特异性引物，通过直接检测‘粤椹33’的M21899标记和/或M3858标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为果桑新品种‘粤椹33’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。
附图说明
图1为SSR分子标记M21899核心引物扩增‘粤椹33’及41个亲缘、表型相近的果桑品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹33、S2为7403(母本)、S3为航诱10(父本)、S4为Tang10、S5为Lbai4、S6为Dlong、S7为Zcun、S8为Lxi、S9为Jkou、S10为Ckmen、S11为Lun40、S12为Kqing10、S13为Shi11、S14为Yu2、S15为Yu711、S16为Xiang7920、S17为Nsang10、S18为Nsang12、S19为Nsang14、S20为Gxuan04-19、S21为Gxuan04-107、S22为97-68、S23为Gxuan04-111、S24为Bei-7-3、S25为Lbai1、S26为Lbai3、S27为Lbai5、S28为Lbai6、S29为2016-25、S30为2016-27、S31为2016-35、S32为2016-32、S33为2016-36、S34为Wkeng2、S35为Ysang69、S36为Ysang78、S37为Ysang162、S38为Lkeng1、S39为Bdsang、S40为Gyin17-1、S41为Lxin1、S42为Qingao1、
图2为SSR分子标记M21899核心引物扩增27个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹33、S2为粤椹大10、S3为粤椹74、S4为粤椹28、S5为粤椹123、S6为粤椹143、S7为粤椹145、S8为粤椹201、S9为红果2号、S10为嘉陵30号、S11为云桑1号、S12为云桑2号、S13为红果1号、S14为红果3号、S15为红果4号、S16为台湾长果桑、S17为46C019、S18为72C002、S19为白珍珠、S20为白玉王、S21为黑珍珠、S22为桂花蜜、S23为白椹2号、S24为东光大白、S25为东光小白、S26为红玛瑙、S27为绿椹子。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段和功效，以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1果桑新品种‘粤椹33’特异性引物序列的筛选获得
1、SSR引物选择
利用MISA软件对桑树基因组数据库中的基因组序列进行检索，检索出基因组序列中SSR位点，检索的SSR基序重复单元长度为2～6个核苷酸，分别设置2个、3个、4个、5个、6个核苷酸的最少搜索重复次数为6、5、5、4、4次，且SSR位点侧翼序列的长度≥150bp，根据搜索到的SSR位点用Primer3v2.3.4(http://primer3.sourcego-rge.net)软件设计SSR引物，设计标准为：引物长度为18-25bp，退火温度为57-63℃，GC含量为40-70％，PCR产物的长度为100-300bp，随机选取能与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对的SSR位点合成出300对引物，每对引物由一个上游引物A和一个下游引物B组成。引物序列由深圳华大基因科技有限公司合成。
2、果桑品种DNA的提取
以果桑新品种‘粤椹33’、母本‘7403’、父本‘航诱10’及39个亲缘、表型相近的广东桑种种质资源与创制果桑品系，共42个(序号1-42，其中包括具有‘粤椹33’亲本血统的8个创制果桑品系，这8个果桑品系与‘粤椹33’亲缘关系较近；其余31份种质资源与‘粤椹33’表型相近)进行初步筛选。初步筛选所用的种质资源与创制果桑品系具体见表1(取自国家桑树种质资源圃-华南分圃)。
表1初步筛选所用的41个亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品系
序号 品种 序号 品种 序号 品种
1 粤椹33 15 Yu711 29 2016-25
2 7403(母本) 16 Xiang7920 30 2016-27
3 航诱10(父本) 17 Nsang10 31 2016-35
4 Tang10 18 Nsang12 32 2016-32
5 Lbai4 19 Nsang14 33 2016-36
6 Dlong 20 Gxuan04-19 34 Wkeng2
7 Zcun 21 Gxuan04-107 35 Ysang69
8 Lxi 22 97-68 36 Ysang78
9 Jkou 23 Gxuan04-111 37 Ysang162
10 Ckmen 24 Bei-7-3 38 Lkeng1
11 Lun40 25 Lbai1 39 Bdsang
12 Kqing10 26 Lbai3 40 Gyin17-1
13 Shi11 27 Lbai15 41 Lxin1
14 Yu2 28 Lbai6 42 Qingao1
具体筛选步骤如下：
利用改良的CTAB法提取果桑新品种‘粤椹33’及同为广东桑种的其他41个亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品系(见表1)的DNA，DNA提取具体步骤如下：
(1)配制CTAB提取液(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)的配方为：2％CTAB，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)；
(2)将1g材料(尽量选取幼嫩材料)放入研钵中，液氮研磨至粉末；
(3)将研磨后的材料加入10mL离心管中，加入4mL CTAB提取液和80μLβ-巯基乙醇(已在65℃中预热)混匀后65℃水浴45min，中间混匀3～4次；
(4)加入1mL 5M KAc，冰浴20min；
(5)加入4mL氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀乳化10min；
(6)室温下12000rpm离心10min，离心后将上清液转移至一新的10mL离心管中；
(7)取上清液并加入1/10～1/5体积的3M NaAc(pH 5.2)翻转混匀，加入等体积的异丙醇，混匀至出现DNA沉淀；
(8)沉淀中加入1mL 75％乙醇漂洗3～4次，并用无水乙醇漂洗1次；DNA沉淀，晾干；
(9)加入100μL含10μg/ml RNase A的TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA；
(10)用电泳法检测质量，用分光光度计法检测DNA浓度，调节DNA浓度为50ng/μL，保存于-20℃。
3、PCR扩增
以步骤2提取的桑树基因组DNA为模版，利用SSR荧光标记检测技术进行PCR扩增，引物包括一个5’端标记有荧光报告基团(FAM、HEX、TAMRA、或ROX，本发明中使用HEX荧光标记)的上游引物和一个下游引物，所述上游引物为在步骤1设计合成的上游引物，所述下游引物为步骤1设计合成的下游引物。5’端标记有荧光报告基团的上游引物引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。
PCR反应总体系为20μL，其中，50ng/μL DNA模板0.5μL，10×PCR buffer 2.0μL，25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ddH2O 13.8μL。
PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，得到扩增产物。
4、多态性引物的筛选
上述步骤3扩增产物取2.5μL，加入1.5μL Loading Buffer混匀上样，2％的琼脂糖凝胶电泳25min后进行条带检测，筛选有扩增条带的产物用于测序分型。将上述步骤筛选到的有扩增产物条带的产物稀释到0.5ng以内，取0.5μL至含有liz500的Hidi中，用3730XLDNA测序仪(ABI，USA)进行分型，分型结果用GeneMarker(soft Genetics LLC，USA)进行条带判别。
5、数据分析
筛选结果显示，上述步骤1合成的300对引物中共筛选出136对多态性引物；进一步选择重复性、稳定性好，能够对果桑新品种‘粤椹33’扩增出特异性等位位点的核心引物，最终得到引物对M21899-F/M21899-R(M21899-F：5’-ATGGTCTTGAGGAGATTAAGCAG-3’，如SEQ IDNO.1所示，M21899-R：5’-GACCCTCTCCTCTGTCTTGTTTT-3’，如SEQ ID NO.2所示)、引物对M3858-F/M3858-R(M3858-F：5’-AAAGGAAGGAAAACACCAGAATC-3’，如SEQ ID NO.3所示，M3858-R：5’-TTTTCTTATCTCCCAAACACCAC-3’，如SEQ ID NO.4所示)和引物对M641-F/M641-R(M641-F：GTTAGGAACTGGACAGTGGCTTT-3’，如SEQ ID NO.5所示，M641-R：5’-GGGGTTGTGTTTAGAGACTTTGA-3’，如SEQ ID NO.6所示)可作为鉴定‘粤椹33’的特异性核心引物。核心引物M21899-F/M21899-R对应的SSR分子标记为M21899标记，其重复基序为(CAA)n，n≥5，该M21899标记的右侧序列如SEQ ID NO.8所示，左侧序列如SEQ ID NO.7所示。核心引物M3858-F/M3858-R对应的SSR分子标记为M3858标记，其重复基序为(AG)n，n≥7，该M3858标记的右侧序列如SEQ ID NO.10所示，左侧序列如SEQ ID NO.9所示。核心引物M641-F/M641-R对应的SSR分子标记为M641标记，其重复基序为(CT)n，n≥9，该M641标记的右侧序列如SEQ ID NO.12所示，左侧序列如SEQ ID NO.11所示。
以SSR荧光标记引物M21899-F/M21899-R为引物，果桑新品种‘粤椹33’在M21899标记的扩增产物为106bp(如SEQ ID NO.13所示)一条特异性条带；以SSR荧光标记引物M3858-F/M3858-R为引物，果桑新品种‘粤椹33’在M3858标记的扩增产物为160bp(如SEQ ID NO.14所示)、170bp(如SEQ ID NO.15所示)二条特异性条带；以SSR荧光标记引物M641-F/M641-R为引物，果桑新品种‘粤椹33’在M641标记的扩增产物为108bp(如SEQ ID NO.16所示)、122bp(如SEQ ID NO.17所示)二条特异性条带。用SSR荧光标记引物M21899-F/M21899-R一组引物对可把‘粤椹33’从其7403(母本)外的其他40个亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品系中鉴别出(图1)，指纹数据见表2；用SSR荧光标记引物M3858-F/M3858-R一组引物对可把‘粤椹33’从其航诱10(父本)外的其他40个亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品系中鉴别出，指纹数据见表2，指纹数据见表2；用SSR荧光标记引物M641-F/M641-R一组引物对即可把‘粤椹33’从其41个亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品系中鉴别出，指纹数据见表2。
表2 3对引物分别对42份亲缘、表型相近的种质资源与创制果桑品毛细管电泳条带统计
6、引物的进一步验证
对筛选得到3对鉴定‘粤椹33’的特异性核心引物M21899-F/M21899-R、M3858-F/M3858-R和M641-F/M641-R进行进一步地验证，选取26个目前全国育成的果桑新品种及在生产上具有一定面推广应用的果桑品系与‘粤椹33’同时进行扩增检测，DNA提取、扩增及检测方法同上，结果发现，这3对特异性核心引物均可以将‘粤椹33’与其他品种区分开，‘粤椹33’及其他品种的扩增特异性等位位点如表3和图2所示。
表3验证所用育成的果桑新品种、生产推广应用新品系毛细管电泳条带统计
由上述表2和表3结果可以看出，SSR分子标记M21899、M3858和M21899均具有高度的多态性，均能够快速的从41个亲缘、表型相近的果桑品系和26个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系中准确鉴定出‘粤椹33’。但考虑到未来可能会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上3对SSR分子标记的核心引物同时进行检测，若3对SSR荧光标记引物扩增得到的结果与本发明一致，则可以鉴定该品种为桑果新品种‘粤椹33’。
在获取鉴定‘粤椹33’特异性分子标记的过程中，本发明首先重视了引物的获取，从桑树基因组数据库中随机设计获取了300对SSR引物，以便客观的评价品种特性。引物筛选时对果桑品系做了适当选取，首先用41个亲缘、表型相近的果桑品系进行初步筛选，这些品系与‘粤椹33’在表型性状上较相似，通过表型鉴定存在一定困难，因此在这些品系中筛选得到能够对果桑新品种‘粤椹33’扩增出特异性条带的特异性核心引物具有十分重要的意义。在初步筛选获得特异性核心引物的基础上，通过选取26个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系进行验证，带型结果与前面表现一致，能够快速准确的从中鉴定出‘粤椹33’，表明这对引物其特异性和稳定性较好。
上述方法中采用特异性核心引物M21899-F/M21899-R、M3858-F/M3858-R和M641-F/M641-R为‘粤椹33’的快速、准确检测、鉴定提供了较好的保障。
上述特异性核心引物M21899-F/M21899-R、M3858-F/M3858-R和M641-F/M641-R也可直接作为快速检测试剂盒的一部分，用于快速鉴定桑果新品种‘粤椹33’。
SEQ ID NO.13
ATGGTCTTGAGGAGATTAAGCAGTTGATTAGCAGTACCAGTATTGCAGCAACAACAACAACAACGACAACTTTTTGTTTGATGAAAACAAGACAGAGGAGAGGGTC
SEQ ID NO.14
AAAGGAAGGAAAACACCAGAATCGATTAATTCGACGGTTGGATCGAGAGAGAATAATTGAATGAGAAATGAATGGAGATTGGAGAGTTGTTGGGGGGTTTTGATGAGGAGAGAAGCGAAGAGAGAGAGAGAGGGAAAGTGGTGTTTGGGAGATAAGAAAA
SEQ ID NO.15
AAAGGAAGGAAAACACCAGAATCGATTAATTCGACGGTTGGATCGAGAGAGAATAATTGAATGAGAAATGAATGGAGATTGGAGAGTTGTTGGGGGGTTTTGATGAGGAGAGAAGCGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGAAAGTGGTGTTTGGGAGATAAGAAAA
SEQ ID NO.16
GTTAGGAACTGGACAGTGGCTTTGGGATTCCACTCTCTCTCTCTCTCTCTTCGTTTCTTTTTCTTTGTTTCTCTCACTAGCTAGTTCAAAGTCTCTAAACACAACCCC
SEQ ID NO.17
GTTAGGAACTGGACAGTGGCTTTGGGATTCCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCGTTTCTTTTTCTTTGTTTCTCTCACTAGCTAGTTCAAAGTCTCTAAACACAACCCC。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
需要特别说明的是，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹33’的SSR分子标记，其特征在于，包括SSR分子标记M21899、M3858和/或M641；所述的SSR分子标记M21899的重复基序为(CAA)n，其中n≥5，其右侧序列如SEQ ID NO.8所示，其左侧序列如SEQ ID NO.7所示；所述的SSR分子标记M3858的重复基序为(AG)n，其中n≥7，其右侧序列如SEQ ID NO.10所示，其左侧序列如SEQ ID NO.9所示；所述的SSR分子标记M641的重复基序为(CT)n，其中n≥9，其右侧序列如SEQ ID NO.12所示，其左侧序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹33’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，包括针对SSR分子标记M21899的引物、针对SSR分子标记M3858的引物和/或针对SSR分子标记M641的引物：
所述的针对SSR分子标记M21899的引物：
M21899-F： 5’- ATGGTCTTGAGGAGATTAAGCAG -3’；
M21899-R：5’- GACCCTCTCCTCTGTCTTGTTTT -3’；
所述的引物M21899-F的5’端标记有荧光报告基团；
所述的针对SSR分子标记M3858的引物：
M3858-F：5’- AAAGGAAGGAAAACACCAGAATC-3’；
M3858-R：5’- TTTTCTTATCTCCCAAACACCAC-3’；
所述的引物M3858-F的5’端标记有荧光报告基团；
所述的针对SSR分子标记M641的引物：
M641-F：5’- GTTAGGAACTGGACAGTGGCTTT-3’；
M641-R：5’- GGGGTTGTGTTTAGAGACTTTGA-3’；
所述的引物M641-F的5’端标记有荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定果桑品种‘粤椹33’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
4.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹33’的快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的SSR分子标记的核心引物组。
5.一种利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹33’的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测果桑样品的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，分别利用权利要求2或3所述的引物对M21899-F/M21899-R、M3858-F/ M3858-R和/或M641-F/ M641-R进行PCR扩增；
（3）对步骤（2）中的PCR扩增产物进行分型，对分型结果进行条带判别；若以引物对M21899-F/M21899-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有106 bp 一条特异性条带，以引物对M3858-F/M3858-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有160 bp和170bp 两条特异性条带，以引物对M641-F/M641-R为引物扩增得到的PCR扩增产物只有108 bp和122bp 两条特异性条带，则表明待测果桑样品为‘粤椹33’，否则，则表明待测果桑样品为非‘粤椹33’。
6.根据权利要求5所述的利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹33’的方法，其特征在于，步骤（2）所述的PCR扩增，其反应体系为20 μL，包括：50 ng/μL DNA模板0.5 μL、10×PCRbuffer 2 μL、25 mM MgCl2 2 μL、10 mM dNTPs 0.5 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL、10μM上游引物0.5 μL、10 μM下游引物0.5 μL和ddH2O 13.8 μL；步骤（2）所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次；最后72℃延伸5 min。
7.权利要求2或3所述的核心引物组或权利要求4所述的快速检测试剂盒在鉴定果桑品种‘粤椹33’中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142324A (zh) * 2017-06-23 2017-09-08 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 桑树est‑ssr分子标记及其核心引物组和应用
CN112980999A (zh) * 2021-04-29 2021-06-18 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种果桑品种‘粤椹74’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用
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CN113637794A (zh) * 2021-10-13 2021-11-12 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种果桑新品种‘粤椹201’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用
CN114262748A (zh) * 2021-12-29 2022-04-01 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142324A (zh) * 2017-06-23 2017-09-08 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 桑树est‑ssr分子标记及其核心引物组和应用
CN112980999A (zh) * 2021-04-29 2021-06-18 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种果桑品种‘粤椹74’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用
CN113430300A (zh) * 2021-08-30 2021-09-24 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种果桑品种‘粤椹123’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用
CN113637794A (zh) * 2021-10-13 2021-11-12 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种果桑新品种‘粤椹201’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用
CN114262748A (zh) * 2021-12-29 2022-04-01 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用

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Assignor: SERICULTURE & AGRI FOOD Research Institute GAAS

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Denomination of invention: A Molecular Marked Primer Set, Kit and Its Application for Identification of Mulberry Variety 'Yueshu 33'

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